CN109669032B - 一种固定细胞的方法及细胞固定试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种固定细胞的方法，是向待固定的细胞中加入固定试剂，该固定试剂为乙二醛固定液，该乙二醛固定液是pH为6.0～8.0、乙二醛质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。本发明还提供一种细胞固定试剂，是pH为6.0～8.0、乙二醛质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。本发明的方法和固定试剂的固定效果与4％多聚甲醛相当，且能更好的使细胞维持原有形态，避免细胞固定后变粗大，安全性好，试剂稳定性好，成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种用于固定细胞的新方法及细胞固定试剂。
背景技术
4％多聚甲醛是国际通用的细胞固定试剂，固定效果好，已广泛使用了几十年，且一直没有合适的替代物。
但是，多聚甲醛的安全性和毒性很令人担忧。多聚甲醛是一种易燃物，4％多聚甲醛有刺鼻的气味，对眼睛，皮肤和呼吸道有强烈的刺激，它可能引起皮肤过敏，哮喘，呼吸困难。如果接触到眼睛，可能使眼睛严重损伤，而且有致癌的潜在危害。
实践中，目前的生物工艺的病毒清除验证中，病毒检测的方法通常是：先使细胞被病毒感染后，用细胞培养基和琼脂糖的凝胶混合物覆盖在细胞表面，在细胞培养箱里孵育一定的时间，然后固定细胞，磕掉琼脂糖凝胶，用0.5％结晶紫溶液染色。按照目前的工作需求，每天固定细胞的工作量大，需要固定细胞的数量为100～200块细胞培养6孔板，50～100块直径为15厘米的细胞培养皿。我们所使用的细胞固定试剂为4％多聚甲醛。由于4％多聚甲醛有刺鼻的气味，研究人员反映用4％多聚甲醛固定细胞，即使采取了在通风橱里操作，佩戴防毒面具等保护措施，也有头晕、头疼、胸闷、胸口痛、呼吸困难、过敏等不舒服的反应。部分研究人员发生了哮喘。个别情况中接触到眼睛，使眼睛严重损伤。更为令人担忧的是，4％多聚甲醛有致癌的潜在危害。从工作人员的健康出发，我们迫切需要一种固定效果能与4％多聚甲醛相当，且对人体健康危害小的新的固定方法及固定试剂。
因此，本领域需要研究一种多聚甲醛的替代试剂以及一种固定细胞的新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种固定细胞的方法，其固定效果能够与本领域最常用的4％多聚甲醛相当，但对人体健康危害大大降低。
为解决上述技术问题，本发明提供一种固定细胞的方法，包括：向待固定的细胞中加入乙二醛固定液；所述乙二醛固定液是pH为6.0～8.0、质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。
在一种具体的实施例中，所述乙二醛固定液是将质量百分数为40％的乙二醛水溶液(w/w)稀释在PBS溶液里，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。
在另一种具体的实施例中，所述乙二醛固定液是将质量百分数为40％的乙二醛水溶液(w/w)稀释在MilliQ超纯水里，加入适量冰醋酸，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。优选的，所述冰醋酸体积百分数终浓度为0.5～2％。
在一种具体的实施例中，所述待固定的细胞是CV-1细胞(非洲绿猴肾细胞，African green monkey kidney)，PG4细胞(莫洛尼氏肉瘤转化猫星形脑胶质细胞，Moloneymurine sarcoma virus transformed glial astrocyte from normal feline)，324K细胞(人SV-40转化的成纤维细胞，Human SV-40 transformed fibroblast)或LLC-MK2细胞(恒河猴肾细胞，Rhesus Monkey Kidney)。其中，CV-1细胞(非洲绿猴肾细胞，African greenmonkey kidney)、PG4细胞(莫洛尼氏肉瘤转化猫星形脑胶质细胞，Moloney murinesarcoma virus transformed glial astrocyte from normal feline)、324K细胞(人SV-40转化的成纤维细胞，Human SV-40 transformed fibroblast)和LLC-MK2细胞(恒河猴肾细胞，Rhesus Monkey Kidney)，分别被PrV(Pseudorabies Virus，伪狂犬病病毒)、X-MuLV(Xenotropic Murine Leukemia Virus，异嗜鼠白血病病毒)、MVM(Minute Virus of Mice，小鼠细小病毒)和Reo-3(Reovirus type 3，呼肠孤病毒)四种病毒感染后，形成不同形状的空斑。
在一种具体的实施例中，所述待固定的细胞是先用细胞培养基和琼脂糖的凝胶混合物覆盖在病毒感染后的细胞表面，然后在细胞培养箱里孵育一定的时间，再用于固定。
在一种具体的实施例中，所述待固定的细胞是培养在细胞培养6孔板或直径为15厘米的细胞培养皿内。其中，对于细胞培养6孔板，每孔加入0.5～1.5mL乙二醛固定液；对于直径为15厘米的细胞培养皿，每个培养皿里加入5～10mL乙二醛固定液。
在一种具体的实施例中，所述方法还包括步骤：加入乙二醛固定液之后，在室温常压下孵育1～5小时，然后去除覆盖在细胞表面的培养基-琼脂糖凝胶混合物，再加入0.5～1mL0.5％结晶紫溶液染色。
另一方面，本发明还提供一种细胞固定试剂，所述细胞固定试剂为pH为6.0～8.0、质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。
其中，一种优选的细胞固定试剂是，将质量百分数为40％的乙二醛水溶液(w/w)稀释在PBS溶液里，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。
其中，一种优选的细胞固定试剂是，将质量百分数为40％的乙二醛水溶液(w/w)稀释在MilliQ超纯水里，加入适量冰醋酸，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。优选的，所述冰醋酸体积百分数终浓度为0.5～2％。
本发明的方法与采用世界通用的固定黄金试剂4％多聚甲醛相比较，具有以下优点：
1.1～5％乙二醛的固定效果与4％多聚甲醛相当。我们用乙二醛溶液固定324K、CV-1、PG4和LLC-MK2四种细胞，这四种细胞分别被MVM、PrV、X-MuLV和Reo-3四种病毒感染后，形成不同形状的空斑。与4％多聚甲醛相比较，所固定的细胞和形成的病毒空斑从形状，大小和数目上，均没有显著差异，说明两者的固定效果相当。
2.虽然4％多聚甲醛是国际通用的细胞固定试剂，但是在324K细胞的固定中，我们观察到采用4％多聚甲醛会使细胞变粗大，像水肿一样；而采用本发明提供的1～5％乙二醛固定液能使324K细胞维持原有的形态，未观察到细胞变粗大，固定效果相比4％多聚甲醛更好。
3.安全性高，无刺激性和致癌风险。4％多聚甲醛有刺鼻的气味，对眼睛、皮肤和呼吸道有强烈的刺激，有致癌的潜在危害。本发明使用的乙二醛水溶液没有任何气味。由于乙二醛溶液本身是不挥发的，且固定液中乙二醛浓度很低(1～5％)，实验操作都是在通风橱中进行，工作人员通过呼吸、皮肤等接触到的乙二醛非常非常有限。乙二醛溶液没有刺激性气味，本身毒性很小，我们的工作人员在使用乙二醛配制固定液或固定细胞时，即使不佩戴防毒面具，也从未有过敏或其他不适反应。所以，用乙二醛固定细胞是安全的。
4.试剂稳定性好。本发明采用的1～5％的乙二醛固定液固定细胞，该固定液经实验室配制后至少可以有效使用一个月，试剂的稳定性好。
5.使用乙二醛作细胞固定剂成本比4％多聚甲醛低很多。目前我们每天需要使用1000～2000mL 4％多聚甲醛，试剂花费是500～1000元，而使用乙二醛固定只需60～120元。
附图说明
图1为用1～5％乙二醛和4％多聚甲醛分别固定324K细胞及病毒感染后形成的空斑的效果图，图中显示细胞和病毒空斑的固定效果一致。
图2为用1～5％乙二醛和4％多聚甲醛分别固定CV-1细胞及病毒感染后形成的空斑的效果图，图中显示细胞和病毒空斑的固定效果一致。
图3为用1～5％乙二醛和4％多聚甲醛分别固定LLC-MK2细胞及病毒感染后形成的空斑的效果图，图中显示细胞和病毒空斑的固定效果一致。
图4为用1～5％乙二醛和4％多聚甲醛分别固定PG4细胞及病毒感染后形成的空斑的效果图，图中显示细胞和病毒空斑的固定效果一致。
图5为实施例3中324K细胞固定前的效果图。
图6为实施例3中324K细胞用4％多聚甲醛固定后的效果图，图中观察到324K细胞变粗大。
图7为实施例3中324K细胞用用1～5％乙二醛固定液固定后的效果图(一)，图中324K细胞维持原有的形态，未观察到细胞变粗大。
图8为实施例3中324K细胞用用1～5％乙二醛固定液固定后的效果图(二)，图中324K细胞维持原有的形态，未观察到细胞变粗大。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一1～5％乙二醛固定液的配制
A.将购买的商品试剂40％乙二醛水溶液(w/w)稀释在PBS溶液里，PBS的成分为137mM NaCl，2.7mM KCl，1～20mM Na2HPO4，1～20mM KH2PO4；调节pH至6.0～8.0，乙二醛终浓度为1～5％，得到乙二醛固定液。所配制的乙二醛固定液在2～8℃至少可以稳定存放一个月，保持固定效果不变。
B.将购买的商品试剂40％乙二醛水溶液(w/w)用MilliQ超纯水稀释，加入适量冰醋酸，调节pH至6.0～8.0，乙二醛终浓度为1～5％，冰醋酸终浓度为0.5～2％。所配制的乙二醛固定液在2～8℃至少可以稳定存放一个月，保持固定效果不变。
实施例二
试验组：固定液为实施例一中A所配制的乙二醛固定液。
对照组：固定液为4％多聚甲醛固定液。
根据检测需要，将CV-1、PG4、324K和LLC-MK2四种细胞培养在细胞培养6孔板或直径为15厘米的细胞培养皿里。这四种细胞分别被PrV、X-MuLV、MVM和Reo-3四种病毒感染后，用细胞培养基和琼脂糖的凝胶混合物覆盖在细胞表面，再将细胞放置于细胞培养箱里孵育3～9天。下一步，将固定液加入细胞，对细胞进行固定。对于细胞培养6孔板，每孔加入0.5～1.5mL乙二醛固定液；对于直径为15厘米的细胞培养皿，每个培养皿里加入5～10mL乙二醛固定液。
加入固定液之后，在室温常压下孵育1～5小时，轻轻磕碰细胞板或细胞培养皿，去除覆盖在细胞表面的培养基-琼脂糖凝胶混合物，加入0.5～1mL 0.5％结晶紫溶液染色。
在染色1～2分钟后，去除结晶紫溶液，用清水清洗多余的结晶紫。
将细胞板或细胞培养皿晾干，在显微镜下观察空斑的形状和大小，用白光透射仪数空斑的数量。将试验组与对照图的结果相比较，实验结果如图1-4所示。
实验结果：由图1-4可知，各试验组和其对照组所固定的细胞和所形成的病毒空斑从形状、大小和数目上，二者均没有显著差异，说明1～5％乙二醛固定液和4％多聚甲醛的固定效果相当。
采用实施例一中B所配制的乙二醛固定液和4％多聚甲醛重复试验，观察到的实验结果与上述实验一致。
实施例三
将324K细胞培养在细胞培养6孔板里。分别用1～5％乙二醛固定液和4％多聚甲醛在室温下固定细胞1-5小时，弃去固定液。用0.5～1mL 0.5％结晶紫溶液染色3～5分钟，弃去结晶紫溶液，用PBS溶液清洗多余的结晶紫。未固定的324K细胞作为对照，弃去培养基，用PBS溶液清洗后，用0.5％结晶紫溶液染色3～5分钟，弃去结晶紫溶液，用PBS溶液清洗多余的结晶紫。分别观察324K细胞用1～5％乙二醛固定液或4％多聚甲醛固定后与固定前的区别，实验结果如图5-8所示。
实验结果：由图5-8可知，使用4％多聚甲醛固定后，细胞不能维持原有的形态，相比固定前和1～5％乙二醛固定液固定，4％多聚甲醛固定后的细胞明显变粗大；1～5％乙二醛固定液固定后的细胞能够维持原有的形态，细胞形态与固定前无明显区别。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种用于病毒空斑法的细胞固定方法，其特征在于，向待固定的细胞中加入固定试剂，所述固定试剂为乙二醛固定液，所述乙二醛固定液是pH为6.0 ~ 8.0、乙二醛质量百分浓度为1 ~ 5%的乙二醛溶液；
所述乙二醛固定液是将质量百分数为40%的乙二醛水溶液稀释在PBS溶液里；
或所述乙二醛固定液是将质量百分数为40%的乙二醛水溶液稀释在MilliQ超纯水里，加入适量冰醋酸；
所述待固定的细胞是CV-1细胞，PG4细胞，324K细胞或LLC-MK2细胞；其中，CV-1细胞、PG4细胞、324K细胞和LLC-MK2细胞分别被PrV、X-MuLV、MVM和Reo-3四种病毒感染。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冰醋酸体积百分数终浓度为0.5 ~ 2%。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待固定的细胞是先用细胞培养基和琼脂糖的凝胶混合物覆盖在病毒感染后的细胞表面，然后在细胞培养箱里孵育一定的时间，再用于固定。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待固定的细胞是培养在细胞培养6孔板或直径为15厘米的细胞培养皿内。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，对于细胞培养6孔板，每孔加0.5 ~ 1.5mL乙二醛固定液。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，对于直径为15厘米的细胞培养皿，每个培养皿里加入5 ~ 10mL乙二醛固定液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：加入乙二醛固定液之后，在室温常压下孵育1 ~ 5小时，然后去除覆盖在细胞表面的培养基-琼脂糖凝胶混合物，再加入0.5 ~ 1 mL 0.5% 结晶紫溶液染色。
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