CN101311724A - 单群白细胞模拟离子、包含单群白细胞模拟离子的校准物及其制备方法 - Google Patents

单群白细胞模拟离子、包含单群白细胞模拟离子的校准物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了由哺乳动物总白细胞制备的可用于血液分析仪校准物的单群白细胞模拟粒子、含单群白细胞模拟粒子的校准物及其制备方法。本发明单群白细胞模拟粒子的制备方法包括获得哺乳动物总白细胞；在溶血剂存在下用白细胞处理液即含有固定剂、氧化剂和糖类的等渗盐溶液对哺乳动物总白细胞进行处理；用固定剂固定经处理的哺乳动物总白细胞；和将固定后的细胞悬浮于适于长期保存固定细胞的保存介质中。

Description

单群白细胞模拟离子、包含单群白细胞模拟离子的校准物及其制备方法
技术领域
本发明涉及血液分析领域，更具体地讲，涉及由哺乳动物总白细胞制备的单群白细胞模拟粒子、包含单群白细胞模拟粒子的校准物及其制备方法。
背景技术
血液分析仪通常在出厂前已经进行了校准，但在运输和使用过程中，血液分析仪可能会产生测量尺度的漂移，所以需要对分析仪进行校准。血液分析仪的校准参数包括白细胞WBC、红细胞RBC、血红蛋白HGB、平均红细胞体积MCV、红细胞压积HCT、血小板PLT。这些参数的参考值确定方法应溯源至标准国际参考方法。对白细胞WBC来说，国际参考方法(例如参见Clin Lab Haematol.，1994 Jun；16(2)：131-8.)仅可获得白细胞总数计数值，而不能实现白细胞的分类。因此，用于各种血液分析仪的校准物，其白细胞组分为单一的一群粒子即可，而不需要分类白细胞的模拟粒子。
现有技术中对单群白细胞模拟粒子的制备方法已有描述，这些方法可概括为以下三种：1)用早期的花粉、乳胶颗粒等制备非细胞来源的模拟粒子；2)处理动物红细胞来模拟白细胞；3)处理哺乳动物粒细胞来模拟某类白细胞。这些经加工的单群白细胞模拟粒子主要用于一些质控物的组成。现有技术中虽未提及用于校准物中白细胞组分的模拟，但事实上所用的加工处理方法完全可用于校准物中的白细胞模拟粒子的加工。
非细胞来源的模拟粒子由于在加工成本、仪器系统的兼容性等方面有难以克服的缺陷，而逐渐被加工细胞源性粒子所替代。例如，通过处理动物红细胞，可根据原始细胞体积大小，获得不同的单群白细胞模拟粒子。US 4,704,364描述了用人红细胞模拟人淋巴细胞，用火鸡红细胞模拟人单核细胞，用一种鲨鱼红细胞模拟人粒细胞。US5,320,964披露了用禽类有核红细胞模拟人淋巴细胞，用爬行类动物红细胞模拟人单核、中性粒、嗜酸粒细胞。这些方法都是将动物红细胞通过离心收集，然后用醛类化合物进行固定。这样的单群白细胞模拟粒子悬浮性、稳定性都很好，可用于某些血液分析仪配套质控物或校准物中白细胞组分的模拟。
关于处理哺乳动物粒细胞的方法在US 6,759,246中有详细的描述。通过用试剂如Bronopol、Triadine-3等处理猪、牛或其他合适的哺乳动物的粒细胞，可使粒细胞在光散射、电阻、电导、染料吸收等方面的特性与人淋巴细胞相似，从而在一些血液分析仪上被检测为淋巴细胞。此外用醛类试剂作为细胞固定剂，对模拟的淋巴细胞进行固定。该专利提到，与用哺乳动物淋巴细胞模拟的人淋巴细胞相比，粒细胞模拟的人淋巴细胞类似物在分析仪上所呈现的细胞体积大小更为稳定。此外，单群的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的模拟物也可由猪粒细胞经过加工处理后模拟，单群的单核细胞模拟物则可由牛粒细胞加工获得。
制备单群白细胞模拟物的现有技术方法仍存在一些问题。用动物红细胞模拟的某单群人白细胞粒子在阻抗法的血液分析仪上检测时，其直方图可呈标准的人新鲜血白细胞直方图分布(见图1)。但对基于前向角、侧向角光散射原理的五分类血液分析仪来说，动物有核红细胞模拟的单群白细胞所呈现的散点图却不能表现出单群聚类分布特征(见图2)。因为动物有核红细胞在形态上普遍呈椭圆形，而非球形。细胞通过流动室时的姿态不同，而导致光散射特性不呈均一性表现，如图2中的扇形拖尾分布或完全散开。而用哺乳动物粒细胞模拟的淋巴细胞或其他单群白细胞虽然可用于基于多角度光散射原理的五分类血液分析仪，但此类方法必须要通过密度梯度等分离方法分离出粒细胞，并需特殊处理及长时间的固定，在方法上很繁琐。
本发明针对动物红细胞模拟的白细胞粒子聚类性差，而动物粒细胞模拟单群白细胞的加工方法繁琐复杂的缺点，提出一种操作简单、成本低廉、加工的粒子聚类性好、性能稳定的、可用于基于多角度光散射原理的血液分析仪(例如五分类血液分析仪)校准物的单群白细胞模拟粒子制备方法。
发明内容
本发明的一个实施方案涉及一种单群白细胞模拟粒子的制备方法，所述方法包括下述步骤：
(1)获得哺乳动物总白细胞；
(2)在白细胞处理液即含有固定剂、氧化剂和糖类的等渗盐溶液存在下，通过溶血剂的作用对哺乳动物总白细胞进行处理；
(3)在洗涤之后，用固定剂固定经处理的哺乳动物总白细胞；和
(4)将固定后的细胞悬浮于适于长期保存固定细胞的保存介质中。
在本发明进一步的实施方案中，所述哺乳动物总白细胞是通过将哺乳动物新鲜全血与溶血剂混合、溶解其中的红细胞而得到的。可以在哺乳动物新鲜全血与溶血剂混合得到的溶血混合物中直接加入白细胞处理液进行处理。
本发明的另一个实施方案涉及用上述方法制备的单群白细胞模拟粒子。
本发明的再一个实施方案涉及包含上述单群白细胞模拟粒子的校准物。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。
附图说明
图1是用不同动物有核红细胞模拟的不同类白细胞在阻抗法血液分析仪上的直方图，与人白细胞的直方图分布一致。
图2(2a，2b)是用不同动物有核红细胞模拟的不同类白细胞在五分类血液分析仪BC-5500(中国深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)上对应的散点图。模拟的白细胞与细胞碎片无分界，散点图聚类性差。
图3为猪新鲜白细胞在BC-5500五分类血液分析仪DIFF通道的散点图，呈分群分布。
图4所示为用实施例1的方法加工后的猪总白细胞在BC-5500五分类血液分析仪DIFF通道的散点图。加工后的白细胞与细胞碎片有分界，呈聚类单群分布。
具体实施方式
本文所用的术语“总白细胞”是指外周血中存在的所有类型的白细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等。该术语包括由哺乳动物新鲜全血经溶血剂处理除去其中的红细胞而制得的总白细胞，也包括用其他方法制备的总白细胞，例如用血沉棕黄层(buffy coat layer)经溶血剂处理而制得的总白细胞(见US 6,187,590B1，该专利在此引入作为参考)。
本文所用的术语“溶血剂”包括任何可溶解血液中红细胞的物质，例如以阳离子、阴离子、非离子、两性离子表面活性剂为活性成分的常规或商业用溶血剂，只要它们能够达到本发明的目的。
本文所用的术语“固定剂”包括任何可用于固定细胞的物质，例如多聚甲醛、甲醛、乙醛、乙二醛、戊二醛等醛类化合物、或甲醇、乙醇、丙酮等，或者这些固定剂的混合物。
本文所用的术语“等渗液”包括任何与血液等渗的溶液，例如常规的等渗磷酸盐溶液、等渗氯化钠溶液等。
如上所述，血液分析仪在运输和使用过程中可能会产生测量尺度的漂移，所以需要对分析仪进行校准。而用于血液分析仪校准参数的国际参考方法(例如参见Clin Lab Haematol.，1994 Jun；16(2)：131-8.)仅可获得白细胞总数计数值，而不能实现白细胞的分类。因此，用于各种血液分析仪的校准物，其白细胞组分为单一的一群粒子即可，而不需要分类白细胞的模拟粒子。
本发明人发现，利用溶血剂对白细胞产生不同程度的皱缩作用，在含有固定剂、氧化剂和糖类的等渗盐溶液存在下用溶血剂对哺乳动物(如猪、羊、牛等其他合适的动物)总白细胞进行处理，可以调节不同类白细胞的体积大小，缩小之间的体积差异，使白细胞体积、光散射特性趋于一致，从而可由哺乳动物总白细胞简便地制备出适用于基于多角度光散射原理的血液分析仪(例如五分类血液分析仪)校准物的单群白细胞模拟粒子，而无需分离出某类白细胞。
因此，本发明提供一种用于血液分析仪校准物的单群白细胞模拟粒子的制备方法，所述方法包括在含有固定剂、氧化剂和糖类的等渗盐溶液存在下用溶血剂对哺乳动物总白细胞进行处理。
哺乳动物总白细胞的获得
可以使哺乳动物新鲜全血与溶血剂作用、溶解其中的红细胞，制备哺乳动物总白细胞。例如，用EDTA等渗盐溶液(如含4％EDTA的0.9％NaCl溶液)为抗凝剂，采集哺乳动物新鲜全血，于4℃保存0-5天。随保存期的延长，加工处理方法将会有所改变。
选择任何合适的溶血剂，如以阳离子、阴离子、非离子、两性离子表面活性剂为活性成分的常规或商业用溶血剂，与一定量的哺乳动物新鲜全血相作用。需根据不同类溶血剂，确定合适用量及作用温度、时间，溶血剂与哺乳动物新鲜全血的体积比可以为约2∶1至约12∶1，例如约2∶1至约10∶1，作用时间可为1-25分钟，例如约1分钟至约20分钟。例如，对作用温和的溶血剂(如0.748％NH4Cl，0.26％Tris，0.025％Saponin)来说，可增加溶血剂用量，或延长溶血剂作用时间，如溶血剂与哺乳动物新鲜全血的体积比为约3∶1至约12∶1、优选约3∶1至约10∶1，例如4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1，作用时间为约3分钟至约25分钟，优选为约5分钟至约20分钟，例如大约10分钟或大约15分钟。而对作用较强烈的溶血剂(如商业用溶血剂M-50LEO(I)(BC-5500配套试剂，产品目录号：A12-000141，中国深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)来说，则缩短作用时间及降低用量，如溶血剂与哺乳动物新鲜全血的体积比为约2∶1至约8∶1，作用约60秒至约5分钟，例如作用1、2、3、4和5分钟，优选作用约1分钟至约3分钟。本领域技术人员根据现有技术中有关用溶血剂除去全血中红细胞的技术，容易地选择合适的溶血剂的用量和作用时间。在此阶段，由于溶血剂使白细胞发生皱缩，可初步调节不同类白细胞的体积大小，缩小之间的体积差异。
也可以用其他方法获得哺乳动物总白细胞，例如用血沉棕黄层经溶血剂处理来制备总白细胞(见US 6,187,590B1)。
总白细胞体积及光散射特性的调节
在上述溶血反应混合液中，加入白细胞处理液，即含有适量固定剂、氧化剂、糖类的等渗盐溶液，继续处理总白细胞。作用温度例如控制在10℃-30℃，作用时间例如为约10分钟至约60分钟，例如为大约15、20、25、30、35、40、45或55分钟。含上述不同成分的等渗盐溶液稀释溶血剂至合适比例，例如白细胞处理液与混合物的体积为约0.5∶1至约5∶1，例如为大约1∶1、2∶1、3∶1或4∶1，优选为约1∶1至约3∶1。溶血剂可继续溶解红细胞并缩小不同类白细胞体积差异。如果采用未用溶血剂处理的其他方法获得总白细胞，则可加入适量的溶血剂，例如溶血剂的比例为总混合物的大约15％(v/v)至大约60％(v/v)。
白细胞处理液中的固定剂可包括多聚甲醛、甲醛、乙醛、乙二醛、戊二醛等醛类化合物或这些固定剂的混合物。固定剂的浓度可以参考现有技术的固定方法根据具体的固定剂来确定，例如终浓度为大约0.002％-5％。本领域技术人员可以理解，固定剂的用量应当控制在适当的范围内，浓度过大，则残留的红细胞(如果有的话)会被部分固定；而浓度过低，则可能有部分白细胞被溶血剂溶为碎片。
白细胞处理液中的氧化剂主要包括如二酰胺、H2O2、过钒酸盐等作用于细胞内某些蛋白酶巯基基团的氧化剂。有文献表明，白细胞内巯基的氧化可能参与细胞的信号转导，使巯基氧化为二硫键的试剂，能显著刺激中性粒细胞释放酶颗粒，用于降低粒细胞颗粒复杂度(例如参见Sandborg RR和Smolen JE.“The effects of heavy metalcations and sulfhydryl reagents on degranulation from digitonin-permeabilized neutrophils.”Biochim Biophys Acta.1989 Mar 6；1010(3)：330-7；Rokutan K等“Phagocytosis and stimulation of therespiratory burst by phorbol diester initiate S-thiolation of specificproteins in macrophages.”J Immunol.1991 Jul 1；147(1)：260-4；和ChaiYC等“S-thiolation of individual human neutrophil proteins includingactin by stimulation of the respiratory burst：evidence against a role forglutathione disulfide.”Arch Biochem Biophys，1994 Apr；310(1)：273-81)。本发明运用该类试剂，主要用于改变哺乳动物粒细胞的光散射强度，缩小粒细胞与淋巴细胞、单核细胞的复杂度差异，从而缩小其光散射特性差异。氧化剂的用量依据具体使用的氧化剂来确定，例如H2O2的终浓度大约0.01％-0.1％，二酰胺的终浓度为大约0.2mM-0.6mM。白细胞处理液中的糖类可包括葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、甘露醇等单糖或二糖，用于调节反应体系渗透压及维持白细胞光散射特性。糖类的终浓度通常为大约0.5％-3％，也可以使用其它合适的终浓度。
总白细胞的固定和保存
溶解红细胞及调整总白细胞体积大小、光散射特性后，可以按照常规方法对经加工的总白细胞进行固定并且保存在适当的保存介质中。
例如，在溶解红细胞及调整总白细胞体积大小、光散射特性后，可以通过离心收集总白细胞。用等渗盐溶液置换溶血反应混合液，继续用合适浓度的醛类固定剂进行固定，如使用甲醛终浓度4％-10％，戊二醛终浓度0.1％-1.0％的醛类化合物。固定时间可以控制在30-120min，反应温度在10℃-30℃。如果温度升高，则可适当缩短固定时间。反之，则可延长固定时间。
用等渗盐溶液离心洗涤白细胞模拟粒子，洗尽残留的固定剂及血小板、红细胞碎片。最终将已固定的单群白细胞模拟粒子悬浮在保存介质中。需要组合成全血校准物时，将其与红细胞、血小板按合适比例组合。
本发明方法的优点在于方法简单。本发明直接处理哺乳动物总白细胞，而不需要分离出单独的某类细胞进行处理、固定。避免了分离的复杂过程及减少分离步骤造成的细胞量损失。同时，明显缩短了固定时间，而不影响粒子稳定性。本发明的另一优点是成本低廉。用此方法加工的哺乳动物总白细胞不仅聚类性好，而且物料来源丰富，非常廉价。
本发明还提供一种用本发明的方法制备的单群白细胞模拟粒子。
本发明也提供包含本发明单群白细胞模拟粒子的校准物，所述校准物可用于本发明的再一个目标是提供包含上述单群白细胞模拟粒子的校准物，本发明的校准物可用于基于多角度光散射原理的血液分析仪，例如五分类血液分析仪。
实施例
实施例1
抗凝采集猪新鲜全血，其中经测定RBC：3.0-8.0X1012/L，WBC：10.0-40.0X109/L。取1V(体积)新鲜全血与8V商业用溶血剂M-50LEO(I)(BC-5500配套试剂，产品目录号：A12-000141，中国深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)作用3min。加入9V白细胞处理液：含6％甲醛、0.06％H2O2、2％乳糖的等渗盐溶液(0.9％NaCl溶液)，于室温作用30min。离心并吸弃上清，继续用0.9％的NaCl溶液离心洗涤白细胞5次，收集总WBC沉淀。用含戊二醛的等渗NaCl溶液重悬总白细胞，使戊二醛的终浓度为0.2％，继续室温固定30min。最后再用0.9％的NaCl溶液离心洗涤白细胞3-5次。洗涤后的白细胞模拟粒子最终悬浮在保存介质中，于4℃保存。
实施例2
抗凝采集猪新鲜全血，其中经测定RBC：3.0-8.0X1012/L，WBC：10.0-40.0X109/L。取1V新鲜全血与5V溶血剂(0.748％NH4Cl，0.26％Tris，0.025％皂苷)作用15min。然后加入6V白细胞处理液：含0.005％的戊二醛、0.6mM二酰胺和2％蔗糖的等渗氯化钠溶液，室温作用40min。离心并吸弃上清，继续用0.9％的NaCl溶液离心洗涤白细胞5次，收集总WBC沉淀。用含戊二醛的等渗NaCl溶液重悬总白细胞，使戊二醛的终浓度为0.3％，继续室温固定20min。最后用0.9％的NaCl溶液离心洗涤白细胞3-5次。洗涤后的白细胞模拟粒子最终悬浮在保存介质中，于4℃保存。
结果
将按照上述实施例的方法获得的单群白细胞模拟粒子在五分类血液分析仪BC-5500进行分析。图3显示了与猪新鲜白细胞在BC-5500五分类血液分析仪DIFF通道的散点图，呈分群分布。图4显示了用实施例1的方法加工后的猪总白细胞在BC-5500五分类血液分析仪DIFF通道的散点图。与猪新鲜白细胞的散点图相比，经加工后的白细胞与细胞碎片有分界，呈聚类单群分布。其他实施例的结果与实施例1类似。
由上可见，采用本发明的方法可使哺乳动物总白细胞的光散射特性趋于一致，将哺乳动物总白细胞加工成光散射均一性好的单群白细胞模拟粒子，最终在五分类血液分析仪如BC-5500的散点图上呈单群聚类分布。
此外，按照本发明方法制备的单群白细胞模拟粒子于4℃保存90天后，仍可保持其光散射特性。这表明其稳定性满足校准物白细胞组分粒子的性能要求。
虽然以上通过具体的实施例对本发明进行了描述，但本领域技术人员理解，本发明并不限于这些具体的实施方案。在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明的具体实施方式作出修改和改进。

Claims (16)

1.单群白细胞模拟粒子的制备方法，所述方法包括下述步骤：
(1)获得哺乳动物总白细胞；
(2)在白细胞处理液即含有固定剂、氧化剂和糖类的等渗盐溶液存在下，通过溶血剂的作用对哺乳动物总白细胞进行处理；
(3)在洗涤之后，用固定剂固定经处理的哺乳动物总白细胞；知
(4)将固定后的细胞悬浮于适于长期保存固定细胞的保存介质中。
2.权利要求1的方法，其中步骤1中的哺乳动物总白细胞是通过将哺乳动物新鲜全血与溶血剂混合、溶解其中的红细胞而得到的。
3.权利要求2的方法，其中在哺乳动物新鲜全血与溶血剂混合得到的溶血混合物中加入白细胞处理液进行处理。
4.权利要求2或3的方法，其中步骤(1)中溶血剂与哺乳动物新鲜全血的体积比为2∶1-12∶1。
5.权利要求4的方法，其中步骤(1)中溶血剂与哺乳动物新鲜全血的体积比为2∶1-10∶1。
6.权利要求4或5的方法，其中步骤(2)中白细胞处理液与溶血反应混合液的体积比为0.5∶1-5∶1。
7.权利要求6的方法，其中步骤(2)中白细胞处理液与溶血反应混合液的体积比为1∶1-3∶1。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中白细胞处理液中的固定剂为醛类固定剂。
9.权利要求8的方法，其中所述固定剂选自多聚甲醛、甲醛、乙醛、乙二醛和戊二醛。
10.权利要求8或9的方法，其中白细胞处理液中醛类固定剂的终浓度为0.002％-5％(v/v)。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中氧化剂为氧化细胞内蛋白酶巯基基团的氧化剂。
12.权利要求11的方法，其中所述氧化剂选自二酰胺、H2O2和过钒酸。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述糖类选自葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖和甘露醇。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中在对哺乳动物总白细胞进行处理之后，用固定剂固定经过处理的哺乳动物总白细胞。
15.用权利要求1-14中任一项的方法制备的用于血液分析仪校准物的单群白细胞模拟粒子。
16.血液分析仪校准物，其包含权利要求15的单群白细胞模拟粒子。
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