CN108548771A - 一种用于流式检测的细胞固定液及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于流式检测的细胞固定液及其使用方法，本发明涉及一种用于流式检测的细胞固定液及其使用方法，本发明的目的是为了解决现有细胞固定后存放时间短且细胞碎片多的问题，本发明细胞固定液由多聚甲醛、戊二醛、磷酸盐缓冲液和去离子水混合而成；本发明先对细胞进行染色，染色结束后再添加固定液，放置4℃避光保存的方法。本发明较传统固定液而言固定效果更好，细胞固定后放置时间更长，存放30d后，细胞形态变化较小，分群较为明显，荧光强度无明显变化，细胞破碎较少，且毒性更低，对人体伤害较小。本发明在固定方法上较传统固定方法具有较大优势，按本发明方法固定的细胞表达率更为准确。本发明应用流式检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于流式检测的细胞固定液及其使用方法。
背景技术
实验室在做细胞流式检测时，细胞染色后通常直接上机检测，避免长时间放置。自然放置时间过长会导致细胞破碎以及抗体荧光促灭，致使细胞碎片增多，数据不准确，荧光强度下降等。但实验室样本量过多或无流式细胞仪，需要送检至第三方实验室的情况下，则不可避免的需对样本进行长时间放置。样本量过少时，频繁开机关机也会造成仪器试剂的浪费，一般会选择将样本集中起来统一检测，这时也需对样本进行一段时间放置。传统方法采用固定法，向流式管中添加含有4％多聚甲醛的溶液对样本进行固定，但固定后放置时间较短，固定后细胞碎片较多，且多聚甲醛浓度较大，对人体毒性较高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有细胞固定后存放时间短且细胞碎片多的问题，提供了一种用于流式检测的细胞固定液及其使用方法。
本发明一种用于流式检测的细胞固定液由多聚甲醛、戊二醛、磷酸盐缓冲液和去离子水混合而成；其中固定液中多聚甲醛的质量浓度为0.3-0.5％，戊二醛的质量浓度为0.3-0.5％，磷酸盐缓冲液的终浓度为0.01-0.03M。
本发明一种用于流式检测的细胞固定液的使用方法为：一、按照流式染色方法对细胞进行染色，避光孵育后对细胞进行离心，去掉上清，加入PBS重悬，再离心，去掉上清，得到染色后细胞；二、取10-107个染色后细胞加入固定液500μL，混匀后放置在4℃冰箱内，避光保存。
本发明戊二醛通过交联作用固定蛋白质的过程会伴随氢离子的释放，使样品pH值降低。为了维持pH值稳定在最佳水平，在戊二醛的固定剂中要加入足量的缓冲液，因此，在固定液中加入相应的磷酸盐缓冲液。戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类，且戊二醛固定的样本不易变脆，可以进行长时间保存，不会导致细胞破碎。多聚甲醛与戊二醛都具有固定细胞的作用，通过合理适当的调整二者的浓度配比，可以达到优势互补的作用，延长样本保存时间，降低二者的使用浓度后仍可达到理想的固定效果，进而减小对操作人员的毒性。多聚甲醛和戊二醛联合使用在组织固定中较为常见，多用于电镜检测，但使用浓度较高，将其改良后应用于细胞流式检测尚属首次。为了更好的染色固定效果，在检测细胞表面抗原实验中，本发明提出了先对细胞进行染色，染色结束后再添加固定液，放置4℃避光保存的方法。该方法较常规固定方法，即先固定再染色，具有细胞染色效果更好，长时间放置后对检测结果影响更小，对照比更高，检测值更准确等优点。
附图说明
图1为实施例一脐带间充质干细胞表面抗原流式检测第1天CD73、CD90、CD105表达率图；
图2为实施例一脐带间充质干细胞表面抗原流式检测第15天CD73、CD90、CD105表达率图；
图3为实施例一脐带间充质干细胞表面抗原流式检测第30天CD73、CD90、CD105表达率图；
图4为实施例一脐带间充质干细胞固定液固定后细胞形态和颗粒度变化图，其中a为第1天，b为第15天，c为第30天；
图5为实施例一脐血造血干细胞表面抗原流式检测第1天CD34表达率图；
图6为实施例一脐血造血干细胞表面抗原流式检测第15天CD34表达率图；
图7为实施例一脐血造血干细胞表面抗原流式检测第30天CD34表达率图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种用于流式检测的细胞固定液由多聚甲醛、戊二醛、磷酸盐缓冲液和去离子水混合而成；其中固定液中多聚甲醛的质量浓度为0.3-0.5％，戊二醛的质量浓度为0.3-0.5％，磷酸盐缓冲液的终浓度为0.01-0.03M。
本实施方式戊二醛通过交联作用固定蛋白质的过程会伴随氢离子的释放，使样品pH值降低。为了维持pH值稳定在最佳水平，在戊二醛的固定剂中要加入足量的缓冲液，因此，在固定液中加入相应的磷酸盐缓冲液。戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类，且戊二醛固定的样本不易变脆，可以进行长时间保存，不会导致细胞破碎。多聚甲醛与戊二醛都具有固定细胞的作用，通过合理适当的调整二者的浓度配比，可以达到优势互补的作用，延长样本保存时间，降低二者的使用浓度后仍可达到理想的固定效果，进而减小对操作人员的毒性。多聚甲醛和戊二醛联合使用在组织固定中较为常见，多用于电镜检测，但使用浓度较高，将其改良后应用于细胞流式检测尚属首次，本实施方式固定液可保存30d。为了更好的染色固定效果，在检测细胞表面抗原实验中，本实施方式提出了先对细胞进行染色，染色结束后再添加固定液，放置4℃避光保存的方法。该方法较常规固定方法，即先固定再染色，具有细胞染色效果更好，长时间放置后对检测结果影响更小，对照比更高，检测值更准确等优点。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：固定液中多聚甲醛的质量浓度为0.4％。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：固定液中戊二醛的质量浓度为0.4％。与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：固定液中磷酸盐缓冲液的终浓度为0.02M。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式一种用于流式检测的细胞固定液的使用方法为：一、按照流式染色方法对细胞进行染色，避光孵育后对细胞进行离心，去掉上清，加入PBS重悬，再离心，去掉上清，得到染色后细胞；二、取10-107个染色后细胞加入固定液500μL，混匀后放置在4℃冰箱内，避光保存。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：细胞为外周血或间充质干细胞。其他与具体实施方式一至五之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：一种用于流式检测的细胞固定液由多聚甲醛、戊二醛、磷酸盐缓冲液和去离子水混合而成；其中固定液中多聚甲醛的质量浓度为0.4％，戊二醛的质量浓度为0.4％，磷酸盐缓冲液的终浓度为0.02M。使用方法为：一、按照流式染色方法对细胞进行染色，避光孵育后对细胞进行离心，去掉上清，加入PBS重悬，再离心，去掉上清，得到染色后细胞；二、取染色后细胞加入固定液500μL，混匀后放置在4℃冰箱内，避光保存。
脐带间充质干细胞表面抗原流式检测，细胞染色后第1天、固定后第15天及30天流式结果对比，细胞先固定再染色和先染色再固定流式结果对比，以及在不同时间各管浓度对比。
1.按照流式染色方法对细胞进行染色，处理流程结束后用1mlPBS将样本重悬，平均分为两份，一份直接流式上机检测，检测指标为CD73、CD90、CD105，得到原始数据(图1)，并检测各管细胞浓度。
2.将另一份样本离心，去掉上清，加500ul固定液进行固定，4℃避光保存，分别在第15天和第30天进行流式检测(图2和图3)，并对各管细胞浓度进行检测，对比各项指标的数据变化(表1)。
3.按照不同染色顺序对细胞进行染色和固定，对比检测数据差异，详细操作如下：选取P5代细胞，分为3份，一份直接染色上机检测CD73、CD90、CD105表达率；一份按本发明方法进行染色和固定，15天后检测；一份按传统方法，先对细胞进行固定，固定15天后再对细胞进行染色操作，检测相同抗原表达率，对比3组数据差异(表2)。
表1
| 天数 | (CD73+CD90)管的细胞浓度 | (CD105)管的细胞浓度 |
| 第1天 | 2.53×105/ml | 2.39×105/ml |
| 第15天 | 2.48×105/ml | 2.45×105/ml |
| 第30天 | 2.42×105/ml | 2.41×105/ml |
表2
| 抗原名称 | 原始表达率 | 先染色再固定表达率 | 先固定再染色表达率 |
| CD73 | 99.28％ | 99.35％ | 57.28％ |
| CD90 | 99.56％ | 99.32％ | 62.32％ |
| CD105 | 99.24％ | 99.40％ | 68.56％ |
脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90和CD105，从图1-3中可以看出，CD73的表达率第1天为99.94％，第15天为99.89％，第30天为99.88％，CD90的表达率第1天为99.99％，第15天为99.97％，第30天为99.96％，CD105的表达率第1天为99.93％，第15天为99.94％，第30天为99.98％，因此，第1天第15天和第30天各项指标表达率数据差异不显著，从图4可知，细胞形态大小和颗粒度无明显变化。从表1中可以看出，各管浓度在第1天第15天和第30天数据差异不显著，细胞固定后破碎不明显。从表2中可以看出细胞先固定再染色后表达率数据较原始数据差异显著，先染色再固定表达率与原始表达率较为一致，无显著差异。
脐血造血干细胞表面抗原流式检测，细胞染色后第1天、固定后第15天及30天流式结果对比，细胞先固定再染色和先染色再固定流式结果对比，以及在不同时间各管浓度对比
1.按照流式染色方法对新鲜脐血细胞进行染色，处理流程结束后用1mlPBS将样本重悬，平均分为两份，一份直接流式上机检测，检测指标为CD34，得到原始表达率数据(图4)，并检测该管细胞浓度(表3)。
2.将另一份样本离心，去掉上清，加500ul固定液进行固定，4℃避光保存，分别在第15天和第30天进行流式检测，并对各管细胞浓度进行检测，对比各项指标的数据变化。
3.按照不同染色顺序对细胞进行染色和固定，对比检测数据差异，详细操作如下：选取新鲜脐血细胞，分为3份，一份按照脐血流式染色流程进行制备，然后上机检测CD34表达率；一份按本发明方法进行染色和固定，15天后检测；一份按传统方法，先对细胞进行固定，固定15天后再对细胞进行染色操作，检测相同抗原表达率，对比3组数据差异。
表3
| 天数 | 细胞浓度 |
| 第1天 | 2.18×106/ml |
| 第15天 | 2.22×106/ml |
| 第30天 | 2.15×106/ml |
表4
从上述图片中可以看出，细胞固定后在第1天、第15天和第30天检测，细胞形态变化不大，分群较为明显，第1天CD34表达率为0.36％，第15天CD34表达率为0.38％，第30天CD34表达率为0.44％，由此可知，CD34表达率数据差异不显著。从表3中可以看出，细胞浓度在第1天第15天和第30天数据差异不显著，细胞固定后破碎不明显。从表4中可以看出细胞先固定再染色后表达率数据较原始数据差异显著，先染色再固定表达率与原始表达率较为一致，无显著差异。
由以上实施例可知，本发明较传统固定液而言固定效果更好，细胞固定后放置时间更长，存放30d后，细胞形态变化较小，分群较为明显，荧光强度无明显变化，细胞破碎较少，且毒性更低，对人体伤害较小。本发明在固定方法上较传统固定方法具有较大优势，按本发明方法固定的细胞表达率更为准确。此外，本发明不需要总开机实验，人工成本降低，同时对同型对照品和质控标准品的使用量减少，降低了关键耗材的成本。
Claims (6)
1.一种用于流式检测的细胞固定液，其特征在于细胞固定液由多聚甲醛、戊二醛、磷酸盐缓冲液和去离子水混合而成；其中固定液中多聚甲醛的质量浓度为0.3-0.5％，戊二醛的质量浓度为0.3-0.5％，磷酸盐缓冲液的终浓度为0.01-0.03M。
2.根据权利要求1所述的一种用于流式检测的细胞固定液，其特征在于固定液中多聚甲醛的质量浓度为0.4％。
3.根据权利要求1所述的一种用于流式检测的细胞固定液，其特征在于固定液中戊二醛的质量浓度为0.4％。
4.根据权利要求1所述的一种用于流式检测的细胞固定液，其特征在于固定液中磷酸盐缓冲液的终浓度为0.02M。
5.如权利要求1所述的一种用于流式检测的细胞固定液的使用方法，其特征在于使用方法为：一、按照流式染色方法对细胞进行染色，避光孵育后对细胞进行离心，去掉上清，加入PBS重悬，再离心，去掉上清，得到染色后细胞；二、取10-107个染色后细胞加入固定液500μL，混匀后放置在4℃冰箱内，避光保存。
6.根据权利要求5所述的一种用于流式检测的细胞固定液的使用方法，其特征在于细胞为外周血或间充质干细胞。
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| CN201810596845.XA CN108548771A (zh) | 2018-06-11 | 2018-06-11 | 一种用于流式检测的细胞固定液及其使用方法 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2022242398A1 (zh) * | 2021-05-21 | 2022-11-24 | 深圳安侣医学科技有限公司 | 前处理试剂及制备方法和细胞染色方法及前处理方法 |
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2018
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