CN105115878A - 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用。包括盒体、设置在盒体内的检测试剂和微流控芯片，所述微流控芯片由PDMS基片和载玻片贴合构成，所述PDMS基片表面分布微通道，所述微通道底面设有“鱼骨型”交错式混合结构；所述PDMS基片与载玻片键合后，微通道与载玻片表面形成微流体通道，所述微通道表面负载有捕获探针。本发明还提供了所述微流控芯片的制备方法及使用试剂盒进行循环肿瘤细胞检测的方法。本发明与现有技术相比,在微通道的全部表面进行捕获探针的负载，增加了捕获效率；通过单链核苷酸修饰微流控芯片从而延长了芯片的保存时间；另外提供了不固定细胞的染色方法，为进一步细胞基因测序提供了方便。

Description

一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于稀有细胞检测领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

人外周血中的循环肿瘤细胞是存在于肿瘤患者外周血中的一类数量稀少却具有重要临床意义的稀有细胞，它是由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。血液中的循环肿瘤细胞提示了体内肿瘤的存在以及可能的转移，而临床上超过90％的癌症死亡都是由转移造成的，同时血液中的循环肿瘤细胞提供了体内除了肿瘤病灶以外的肿瘤细胞的来源，因此从血液中捕获并检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。

循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每10ml血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞，因此从外周血中快速、高效的检测循环肿瘤细胞是此领域面临的挑战。目前唯一获得美国FDA批准的循环肿瘤细胞检测试剂盒是用于CellSearch^TM系统的试剂盒，被批准应用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者的预后评估与生存期预测(CristofanilliM,BuddT,EllisMJ,etal.N.Engl.J.Med.2004,351,781-791；RiethdorfS,FritscheH,MullerV,etal.Clin.CancerRes.2007,13,920-928；CohenSJ,PuntCJA,IannottiN,etal.J.Clin.Oncol.2008,26,3213-3221)，这一系统运用标记有针对EpCAM抗体的磁性颗粒进行血液中循环肿瘤细胞的捕获，但其捕获效率较低，存在大量白细胞的非特异性吸附，且需依赖大型、昂贵的设备。

微流控芯片是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块芯片上，自动完成分析全过程。微流控芯片的基本结构是比较简单的，就是在基板(通常是PDMS)上加工出微通道，然后将盖片和基片键合到一起，以形成封闭的微流体通道。基于微流控芯片的循环肿瘤细胞富集检测方法是近年来出现的新技术，通过将识别循环肿瘤细胞的抗体修饰在盖片的表面，并通过一定的几何设计使流过芯片的细胞与负载抗体的表面有充分的接触，因此来确保循环肿瘤细胞能够被捕获，达到较高的捕获效率。已报道的用于捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片包括微柱阵列型芯片(NagrathS,etal.,Nature2007,450,1235)、具有交错式混合结构的“鱼骨型”芯片(StottSL，etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,18392；WangS.etal.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,3084)、HTMSU芯片(AdamsAA,etal.J.Am.Chem.Soc.2008,130,8633)以及Nano-Velcro芯片等。其中具有交错式混合结构的“鱼骨型”分离速度快，捕获率与富集纯度均较高，富集到的循环肿瘤细胞的活性也高于其他常规技术，因此受到临床以及技术研究领域的高度重视。

“鱼骨型”芯片由具有交错式混合结构的PDMS基片与载玻片键合而成，其中PDMS基片中的交错式混合结构是一组经过设计的周期性的凹凸结构，用于打破微流体通道内的层流，使其中的细胞能够与各壁面接触。传统的“鱼骨型”芯片存在两个缺点：(1)由于PDMS基片本身难以进行稳定的化学修饰，因此以往的“鱼骨型”芯片只将抗体负载于底部的载玻片上，因此能够捕获循环肿瘤细胞的区域只涉及微流体通道的底部；(2)载玻片上抗体的负载有两种方法，一是将抗体直接修饰与载波片上，二是先将亲和素修饰与载玻片，待实验是加入生物素标记的抗体，但无论是在载玻片上负载抗体还是亲和素都需要将“鱼骨型”芯片低温保存，且保质期一般只有几周。

发明内容

本发明提供了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用，用以解决目前检测试剂盒捕获效率低、保质期短等问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：所述循环肿瘤细胞检测试剂盒，其包括盒体、设置在盒体内的检测试剂和微流控芯片，所述微流控芯片由PDMS(聚二甲基硅氧烷)基片和载玻片贴合构成，所述PDMS基片表面分布微通道，所述微通道底面设有“鱼骨型”交错式混合结构；所述PDMS基片与载玻片键合后，微通道与载玻片表面形成微流体通道，所述微通道表面负载有捕获探针。目前的微流控芯片中捕获探针均是负载在载玻片表面，而微流体通道中微通道表面积比载玻片表面积大的多，上述鱼骨型结构不仅可有效打破液体流动时的层流状态，从而使得细胞悬液有更多机会与微流体通道的各个壁面的多次接触，增加细胞悬液通过时捕获的机率，而且增加了微流体通道的表面积，也就是增加了负载捕获探针的表面积，通过计算模拟与实验证实样品从微流体通道内通过时，细胞与PDMS基片上微通道表面接触的几率远远高于载玻片，因此将捕获探针负载在PDMS基片的微通道表面可以大大提高稀有细胞的捕获效率。

进一步的，所述载玻片为聚赖氨酸修饰的载玻片。

进一步的，所述鱼骨型交错式混合结构中凹部宽度为125微米，凸部宽度为75微米，凸起高度60微米，PDMS基片高度100微米。

进一步的，所述检测试剂包括细胞识别探针、红细胞裂解液、清洗液、封闭液和染色试剂。所述细胞识别探针可特异性结合循环肿瘤细胞，并且可与捕获探针特异性结合从而被其捕获。

进一步的，所述捕获探针为第一单链多核苷酸，所述细胞识别探针为抗体/第二单链多核苷酸复合物，所述第二单链多核苷酸是与第一单链多核苷酸特异性结合，所述识别抗体是与循环肿瘤细胞上具有识别性的抗原相应的抗体。

单链多核苷酸是指20个以上核苷酸聚合成的单链化合物，所述第二单链多核苷酸与第一单链多核苷酸特异性结合是指所述第二单链多核苷酸与第一单链多核苷酸有部分互补，可实现特异性结合。

进一步的，所述识别抗体选自anti-EpCAM(EpCAM的抗体)、anti-EGFR(EGFR的抗体)、anti-HER2(HER2的抗体)和anti-MUC-1(MUC-1的抗体)中的一种以上。也就是说选取的循环肿瘤细胞上具有识别效果的抗原选自EpCAM、EGFR、HER2和MUC-1中的一种以上。

进一步的，所述清洗液为HBSS(Hank’s平衡盐溶液)，所述封闭液为10wt％山羊血清与3wt％牛血清白蛋白混合溶液。

进一步的，所述染色试剂为固定细胞染色试剂组和/或不固定细胞染色剂，所述固定细胞染色试剂组包括固定细胞染色剂、固定液和透膜液。

进一步的，所述固定液为4wt％多聚甲醛水溶液，所述透膜液为0.2wt％聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。

进一步的，所述固定细胞染色剂包括荧光素标记的anti-CD45(CD45的抗体)、荧光素标记的anti-CK(CK的抗体)和DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，并且上述三种染色剂的荧光显色各不相同。

进一步的，所述不固定细胞染色剂包括荧光素标记的第一单链多核苷酸和荧光素标记的anti-CD45，并且上述二种染色剂的荧光显色不相同。由于不固定细胞染色，不会对后续的基因组扩增产生不利的影响，因此完成CTC检测后还可以进一步测序。

本发明还提供了上述循环肿瘤细胞检测试剂盒中微流控芯片的制备方法，其包括如下步骤：首先将PDMS基片浸泡在3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液中对微通道表面进行氨基修饰，然后与载玻片进行键合，之后进一步进行微通道表面的捕获探针的负载。

进一步的，所述捕获探针的负载方法如下：将氨基修饰的捕获探针与DMSO以体积比3:2混合，混合液再与BS3(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)溶液以1:1体积比混合后通入微流体通道，室温下孵育1.5h；然后依次用0.02wt％SDS(十二烷基硫酸钠)水溶液和超纯水清洗，并用氮气吹干后即完成捕获探针的负载。

本发明还提供了所述循环肿瘤细胞检测试剂盒在循环肿瘤细胞(CTC)检测中的应用，其包括如下步骤：

1)血液样本前处理：肿瘤患者的血液样本经红细胞裂解液裂解，重悬于清洗液中以获得包含白细胞与循环肿瘤细胞的细胞悬液，然后与细胞识别探针孵育，再通过离心除去多余细胞识别探针，最后重悬于清洗液中以获得待检样本；

2)循环肿瘤细胞捕获：将待检样本通入微流控芯片中，表面结合了细胞识别探针的细胞与负载在微流体通道表面的捕获探针特异性结合，然后用清洗液清洗微流体通道以除去非特异性吸附的细胞，从而完成对循环肿瘤细胞的捕获；

3)循环肿瘤细胞染色：对捕获的循环肿瘤细胞在固定、透膜后进行CK(骨架蛋白)、CD45(白细胞表面特异性抗原)、细胞核染色或在细胞不固定的情况下对CD45和第二单链多核苷酸进行染色；

4)循环肿瘤细胞计数：在显微镜下观察分析荧光图像，将CK+/CD45-/DAPI+的细胞或CD45-/第二单链多核苷酸+的细胞鉴定循环肿瘤细胞并计数。

进一步的，所述步骤3)中所述CK、CD45、细胞核的染色通过固定细胞染色剂染色，所述固定细胞染色剂包括FITC标记的anti-CK、APC标记的anti-CD45和核染色剂DAPI溶液，对循环肿瘤细胞的CK(骨架蛋白)、CD45(白细胞表面特异性抗原)和细胞核染色。三者荧光显色不同，可以对标记物加以识别，区分循环肿瘤细胞、白细胞和无核红细胞等其他背景信号。

进一步的，所述步骤3)中所述第二单链多核苷酸和CD45的染色通过不固定细胞染色剂染色，所述不固定细胞染色剂包括Cy3标记的第一单链多核苷酸和APC标记的anti-CD45。两者荧光显色不同，可以对标记物加以识别，排除白细胞的干扰。

应理解，在本发明范围内中，上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，限于篇幅，在此不再一一累述。

检测过程大致为样本与细胞识别探针共孵育，细胞识别探针负载到循环肿瘤细胞上形成细胞悬液，将其以一定的流速通过微流体通道表面，因微通道表面负载有捕获探针，取向自由，捕获探针与细胞识别探针特异性结合从而捕获到循环肿瘤细胞，再进一步对捕获的循环肿瘤细胞进行染色计数实现循环肿瘤细胞的检测。

本发明提供的技术方案能够对PDMS基片以及载玻片同时进行负载，且芯片具有很长保质期。其方法是通过化学修饰使PDMS基片与载玻片构成的微流体通道表面形成氨基，然后修饰上第一单链多核苷酸，并将与第一单链多核苷酸互补的第二单链多核苷酸标记在循环肿瘤细胞的识别抗体上，待实验室将抗体/第二单链多核苷酸复合物通过微流体通道，通道表面的第一单链多核苷酸就能够转化为抗体，从而进行循环肿瘤细胞的捕获。试剂盒中的芯片上由于只负载单链多核苷酸因而能够较长期的保存。

与现有技术相比，本发明存在以下优点：

1.微通道表面负载捕获探针，另外表面具有周期性凹凸结构，能够增加细胞与微流体通道表面碰撞几率，这样大大提高了细胞的捕获效率；

2.由于修饰了多核苷酸的微流控芯片在低温或者室温且一定的真空条件或者氮气保护下可长期保存，与现有修饰抗体或亲和素的芯片相比保存更容易，保存时间更长；

3.循环肿瘤细胞的捕获与检测集成到一个试剂盒中，配合自动化的设备，使得循环肿瘤细胞的捕获与检测能够自动化完成。

4.两种细胞染色的方式以区分循环肿瘤细胞与其他细胞(主要是白细胞)，一种是传统的对细胞先固定、后透膜、再进行免疫荧光染色的方式，另一种是在不固定细胞的前提下直接对细胞进行染色，即活细胞染色，这一方式尤其适用于要对循环肿瘤细胞基因检测的情形。

附图说明

图1是本发明所述循环肿瘤细胞检测试剂盒一具体实施方式结构示意图；

图2是本发明所述微流控芯片一具体实施方式的结构示意图；

图3是本发明所述PDMS基片一具体实施方式的结构示意图；

图4是图3的A部放大图；

图5是本发明所述微流体通道内一具体实施方式的结构示意图；

图6是计算机模拟细胞通过微流体通道时与各表面接触几率示意图；

图7是本发明所述循环肿瘤细胞检测过程一具体实施方式示意图。

图中所示：

1-盒体，2-微流控芯片，3-试剂瓶组，21-PDMS基片，22-载玻片，23-微通道，24-交错式混合结构，25-微流体通道，26-捕获探针，41-循环肿瘤细胞，42-白细胞，43-细胞识别探针，44-待检样本。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

如图1所示，所述循环肿瘤细胞检测试剂盒，其包括盒体1、设置在盒体1内的微流控芯片2和试剂瓶组3；所述试剂瓶组包括细胞识别探针、红细胞裂解液、清洗液、封闭液、固定液、透膜液和固定细胞染色剂。

如图2所示，所述微流控芯片2由PDMS基片21和载玻片22贴合构成，如图3所示，所述PDMS基片21表面分布微通道23，所述微通道23为单通道，并且呈连续S型排布9排，所述微通道23的底面具有周期性交错式混合结构24，如图4所示，所述交错式混合结构24为鱼骨型结构。

如图5所示，所述PDMS基片21与载玻片22键合后，所述微通道23与载玻片22表面形成微流体通道25，所述微通道23的三个内表面均负载有捕获探针26，所述捕获探针26为第一单链多核苷酸，所述鱼骨型交错式混合结构24中凹部宽度为125微米，凸部厚度为75微米。鱼骨结构高度60微米，凸部以上微通道高度40微米。

所述细胞识别探针为识别抗体/第二单链多核苷酸复合物，所述第二单链多核苷酸可与第一单链多核苷酸特异性结合，所述识别抗体为anti-EpCAM、anti-EGFR、anti-HER2和anti-MUC-1。

所述第一单链多核苷酸和第二单链多核苷酸序列如表1，由生工生物提供。

如图6所示，经过计算模拟，在细胞通过“鱼骨型”芯片微流体通道的时候，细胞与载玻片表面(微流体通道下表面)接触的几率远低于微通道的表面(微流体通道上表面)及“鱼骨型”结构的各个表面。图6中的每个点代表了细胞在流经芯片微通道是其中心与相应的微通道表面距离小于细胞半径(假设为8微米)的位置，也就是细胞能够被芯片所捕获的位置。因此将捕获探针设法负载于PDMS基片的微通道表面(包括了微流体通道上表面和“鱼骨型”结构的各个表面)将有助于大大提高捕获效率。

表1第一单链多核苷酸和第二单链多核苷酸序列表

名称	序列
		第一单链多核苷酸	TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT
第二单链多核苷酸	NH2-AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

实施例2

与实施例1的区别在于，所述试剂瓶组包括细胞识别探针试剂瓶31、红细胞裂解液试剂瓶32、清洗液试剂瓶33、封闭液试剂瓶34和不固定细胞染色剂瓶。

另外，所述载玻片22为聚赖氨酸修饰的载玻片，来源于ThermoScientific公司，所述捕获探针26除了修饰微通道23表面，还修饰了载玻片22的表面。

所述不固定细胞染色剂不固定细胞染色剂包括Cy3标记的第一单链多核苷酸和APC标记的anti-CD45。依次选择CY5和TRITC的滤玻片在荧光显微镜下观察，Cy3标记的第一单链多核苷酸显红色，APC标记的anti-CD45显绿色。

实施例3所述微流控芯片的制备方法

实施例1和实施例2中所述微流控芯片2的制备方法如下：将PDMS基片21运用等离子清洗机氧气处理15s后，在4％的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中浸泡1小时使表面产生氨基，再用超纯水清洗去除多余的试剂。

氮气吹干后，将氨基修饰后的PDMS基片21贴合到洁净的载玻片22上，并置于烘箱中80℃处理2小时，待恢复至室温后进行一步负载捕获抗探针26。具体方法为：将500μL氨基修饰的第一单链多核苷酸与DMSO以体积比3:2混合，混合液再与BS3(双琥珀酰亚胺辛二酸酯钠盐)水溶液以1:1体积比混合后通入芯片，室温下孵育1.5h，然后依次用0.02％SDS溶液和超纯水清洗，并用氮气吹干后获得备用的微流控芯片2。

实施例4用实施例1制备试剂盒检测循环肿瘤细胞

如图7所示，循环肿瘤细胞检测过程如下：

(1)血液样本的预处理

将2毫升全血离心(200g，5min，4℃)，弃去上层的富血小板血浆，加入12mL红细胞裂解液，翻转仪上翻转10min，再次离心(500g，5min，4℃)，弃去上清，用清洗液HBSS清洗剩余细胞，再次离心(500g，5min，4℃)，弃去上清，重悬于2毫升清洗液中，获得白细胞42与循环肿瘤细胞41的细胞悬液。

分别将2μL浓度为1mg/mL的细胞识别探针43(识别抗体/第二单链多核苷酸复合物)，其中识别抗体为anti-EpCAM、anti-EGFR、anti-HER2和anti-MUC-1，加入到2mL细胞悬液中，并置于翻转仪上孵育40min，反应结束后向其中加入10mL清洗液离心、清洗以除去未被结合的细胞，然后用2mL清洗液重悬得到待检样本44。

(2)循环肿瘤细胞在通道中的捕获

运用恒流注射泵将300μL的封闭液(10wt％山羊血清与3wt％牛血清白蛋白混合溶液)以300μL/h的流速向实施例1或2中的微流体通道25中灌注进行封闭，避免细胞的非特异性吸附，再将2mL上述处理后的待检样本44以1mL/h的流速通入微流体通道25，在流动过程中微流体通道25表面(包括微通道23表面和载玻片22表面均负载了捕获探针26)负载的捕获探针26动态捕获循环肿瘤细胞，结束后用清洗液HBSS以3mL/h的流速清洗芯片10分钟以除去非特异性吸附的细胞。

(3)循环肿瘤细胞的染色

将4wt％多聚甲醛水溶液的固定液以1mL/h的流速通入微流体通道25，与捕获到的细胞动态孵育15分钟，此时被捕获到芯片表面的循环肿瘤细胞的形态被固定。最后用PBS缓冲液以2mL/h的流速清洗芯片10分钟以除去多余的固定液。

通过恒流注射泵以1mL/h的流速往微流体通道25中灌注0.2wt％TritonX-100细胞透膜液，以增加循环肿瘤细胞膜对染色剂的通透性，15分钟后，以300μL/h的流速灌注300μL封闭液(10wt％山羊血清与3wt％牛血清白蛋白混合溶液)，对经固定透膜的细胞进行封闭，减少染色剂的非特异性结合，降低荧光信号的背景噪声。

接下来将50μL的FITC标记的anti-CK和APC标记的anti-CD45按体积比1:1配置的混合液以1mL/h的流速灌注到微流体通道25中，常温孵育2小时后，用PBS缓冲液以2mL/h的流速清洗芯片10分钟，去除多余的染色试；以1mL/h的流速将50μL20μg/mL的核染色剂DAPI溶液通入微流体通道25中，用2mL/h的流速，再通入PBS缓冲液清洗通道10分钟，完成循环肿瘤细胞的染色。

(4)循环肿瘤细胞的鉴定

将步骤3)经染色处理的微流控芯片2在荧光显微镜下观察，依次选择CY5、FITC和DAPI的滤玻片，观察通道表面荧光颜色，显蓝色则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态学特征的为循环肿瘤细胞，DAPI+/CK-/CD45+的为白细胞，DAPI-的为无核红细胞或其他背景信号，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检测结果。

实施例5用实施例2检测循环肿瘤细胞

与实施例4的区别在于，第3步和第4步，具体如下：

(3)循环肿瘤细胞的染色

将50μL的Cy3标记的第一单链多核苷酸和APC标记的anti-CD45的混合液以1mL/h的流速灌注到微流体通道25中，参见图6，负载在细胞上的细胞识别探针43上仍有很多第二单链多核苷酸未被结合，因此可与荧光标记的第一单链多核苷酸结合而实现对捕获到的循环肿瘤细胞的染色，常温孵育1小时后，用清洗液HBSS以2mL/h的流速清洗芯片10分钟，去除多余的染色剂。

(4)循环肿瘤细胞的鉴定

将步骤3)染色处理的微流控芯片2在荧光显微镜下观察，依次选择CY5和TRITC的滤玻片，观察通道表面荧光颜色，荧光显红色则第二单链多核苷酸+，显绿色则CD45+，不显绿色则CD45-，当第二单链多核苷酸+/CD45-且在明场下满足一定细胞形态学特征的为循环肿瘤细胞，进行CTC检测后，可通过显微操作仪提取循环肿瘤细胞并进一步对其进行基因测序。

实施例6对比实验

对比例：与实施例2的区别在于，微流控芯片2中捕获探针按传统方法仅负载在载玻片上。

将600个结肠癌肿瘤细胞HCT116用染料VybrantDiI(LifeTehnologies)染色后掺入6毫升健康人血液中混匀后平均分成6份，每份样本1毫升。血液样本分别用实施例2、对比例的方法捕获肿瘤细胞，每个实验重复3次。捕获结束后直接用荧光显微镜计数芯片中的HCT116细胞来计算捕获效率和实验偏差。

结果表明：按照实施例2方法的捕获率为84,7±3.5％，高于按照对比例方法的捕获率(62.0±6.6％)，且具有统计学意义(P<0.01)。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，包括盒体、设置在盒体内的检测试剂和微流控芯片，所述微流控芯片由PDMS基片和载玻片贴合构成，所述PDMS基片表面分布微通道，所述微通道底面设有“鱼骨型”交错式混合结构；所述PDMS基片与载玻片键合后，微通道与载玻片表面形成微流体通道，所述微通道表面负载有捕获探针。

2.根据权利要求1所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述载玻片为聚赖氨酸修饰的载玻片。

3.根据权利要求1所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述鱼骨型交错式混合结构中凹部宽度为125微米，凸部宽度为75微米，凸起高度60微米，所述凸部以上微通道高度40微米。

4.根据权利要求1所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括细胞识别探针、红细胞裂解液、清洗液、封闭液和染色试剂。

5.根据权利要求4所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针为第一单链多核苷酸，所述细胞识别探针为抗体/第二单链多核苷酸复合物，所述第二单链多核苷酸是与第一单链多核苷酸特异性结合，所述识别抗体是与循环肿瘤细胞上具有识别性的抗原相应的抗体。

6.根据权利要求5所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述识别抗体选自anti-EpCAM、anti-EGFR、anti-HER2和anti-MUC-1中的一种以上。

7.根据权利要求4所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述染色试剂为固定细胞染色试剂组和/或不固定细胞染色剂，所述固定细胞染色试剂组中包括固定细胞染色剂、固定液和透膜液。

8.根据权利要求7所述一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述固定细胞染色剂包括荧光素标记的anti-CD45、荧光素标记的anti-CK和DAPI，并且上述三种染色剂的荧光显色各不相同；所述不固定细胞染色剂包括荧光素标记的第一单链多核苷酸和荧光素标记的anti-CD45，并且上述二种染色剂的荧光显色不相同。

9.权利要求1-8任一所述循环肿瘤细胞检测试剂盒中微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：首先将PDMS基片浸泡在3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液中对微通道表面进行氨基修饰，然后与载玻片进行键合，之后进一步进行微通道表面的捕获探针的负载。

10.权利要求1-7任一所述检测试剂盒在循环肿瘤细胞检测的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)血液样本前处理：肿瘤患者的血液样本经红细胞裂解液裂解，重悬于清洗液中以获得包含白细胞与循环肿瘤细胞的细胞悬液，然后与细胞识别探针孵育，再通过离心除去多余细胞识别探针，最后重悬于清洗液中以获得待检样本；

2)循环肿瘤细胞捕获：将待检样本通入微流控芯片中，表面结合了细胞识别探针的细胞与负载在微流体通道表面的捕获探针特异性结合，然后用清洗液清洗微流体通道以除去非特异性吸附的细胞，从而完成对循环肿瘤细胞的捕获；

3)循环肿瘤细胞染色：对捕获的循环肿瘤细胞在固定、透膜后进行CK、CD45和细胞核染色或在细胞不固定的情况下对CD45和第二单链多核苷酸进行染色；

4)循环肿瘤细胞计数：在显微镜下观察分析荧光图像，将CK+/CD45-/DAPI+的细胞或CD45-/第二单链多核苷酸+的细胞鉴定循环肿瘤细胞并计数。