CN113009138B - 一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒及方法，包括微流控芯片、纯化的重组蛋白CA153、CA125、CEA、AFP和CA199，生物素标记的CA153单克隆检测抗体、CA125单克隆检测抗体、CEA单克隆检测抗体、AFP单克隆检测抗体和CA199单克隆检测抗体；APC‑霉链亲和素偶联物、封闭液、工作液和抗体稀释液；所述微流控芯片包括反应层衬底和位于其上的微流道加样层，所述反应层衬底包括载玻片基板和组装于载玻片基板上的氧化石墨烯量子点纳米材料基底，所述氧化石墨烯量子点纳米材料基底上印刷有CA153、CA125、CEA、AFP和CA199单克隆捕获抗体条形码。本发明所公开的试剂盒及方法可以实现快速、准确、高通量和相对廉价地检测乳腺癌肿瘤标志物。

Description

一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及肿瘤标志物检测领域，特别涉及一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒及方法。
背景技术
乳腺癌是成年女性常见的恶性肿瘤，也是成年女性癌症死亡的主要原因一。乳腺癌在全球女性恶性肿瘤中新发病率占第一位，死亡率占第二位。每年约有7.9万新病例，占全部女性恶性肿瘤总数21％。全世界乳腺癌年均发病率为30.30/10万，世界人口调整率(世调率)为32.97/10万。
乳腺癌早期发现及时治疗是保证良好预后的关键，因为，在乳腺癌死亡病例中，90％合并远处转移。目前，对于乳腺癌的筛查手段主要以患者自查、医生触诊(clinicalbreastexamination，CBE)及超声筛查(ultrasonography，US)和乳腺钼靶X线检查(mammography，MAM)，前两者均属于触诊，一般在肿瘤大于2cm后才有可能被发现，而US也仅能发现0.5cm以上的肿块，MAM对年轻女性更不占有优势。因此，临床收治的乳腺癌患者全部是影像学能够发现的，约有1/3的患者已发生了淋巴结远处转移，2/3的患者属于局部晚期或晚期。
随着乳腺癌的治疗方法和临床药物的进步，乳腺癌患者的生存率得到了有效的提高，5年生存率达到90％，但是，在所有女性恶性肿瘤死亡率仍居第二位。因此，如何安全而有效地发现早期患者，进行早期非手术治疗，提高治愈率及患者生活质量，是目前国内外关注的热点。
对乳腺癌的早期筛查是提高患者生存率的关键。肿瘤标志物CEA、CA125、CA199、CA153和AFP是乳腺癌重要的标志物，它们与乳腺癌的诊断和预后有重要的关系。它们是乳腺癌的相关抗原，存在于乳腺癌细胞中，并能释放入血，检测血中CEA、CA125、CA199、CA153和AFP水平可用于检测乳腺癌。血液或者组织中肿瘤标志物的检测为癌症患者的早期诊断、临床监测、疾病治疗和康复监测提供了重要信息。由于各种疾病控制的需求不断增加，灵敏、低成本、即时检测方法已经极大地吸引了相关研究者的兴趣。
传统的肿瘤标志物检测方法主要有酶联免疫分析，放射免疫测定法、化学发光分析、质谱分析等。但是，这些方法并不能满足即时检测的要求。传统的检测方法——ELISA试剂盒，通过逐个检测，消耗大量的样品来完成多种生物标志物的检测。电化学方法具有较高的灵敏度，但其高通量检测能力有限。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒及方法，以达到可以匹配自动分析系统实现快速、准确、高通量和相对廉价地用于大规模临床检验乳腺癌肿瘤标志物的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒，包括微流控芯片、纯化的重组蛋白CA153、CA125、CEA、AFP和CA199，生物素标记的CA153单克隆检测抗体、CA125单克隆检测抗体、CEA单克隆检测抗体、AFP单克隆检测抗体和CA199单克隆检测抗体；APC-霉链亲和素偶联物、封闭液、工作液和抗体稀释液；
所述微流控芯片包括反应层衬底和位于其上的微流道加样层，所述反应层衬底包括载玻片基板和组装于载玻片基板上的氧化石墨烯量子点纳米材料基底，所述氧化石墨烯量子点纳米材料基底上印刷有CA153单克隆捕获抗体条形码、CA125单克隆捕获抗体条形码、CEA单克隆捕获抗体条形码、AFP单克隆捕获抗体条形码和CA199单克隆捕获抗体条形码。
上述方案中，所述微流道加样层的底部设有多个微流道凹槽，多个所述微流道凹槽与多个所述单克隆捕获抗体条形码垂直布置形成多个反应点阵，所述微流道加样层上还设有上下贯通的流入孔和流出孔，所述微流道凹槽的两端分别与所述流入孔和流出孔连通。
上述方案中，所述封闭液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为1-6％的牛血清蛋白溶液。
上述方案中，所述工作液是用DPBS溶液和用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为0.5-5％的牛血清蛋白溶液。
上述方案中，所述抗体稀释液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为0.5-5％的牛血清蛋白溶液。
上述方案中，所述DPBS溶液，pH为7.2-7.4，浓度为0.01-0.1mol/L。
上述方案中，所述单克隆检测抗体浓度大于100ug/ml，所述单克隆检测抗体的工作浓度稀释倍数为1:100-1:500。
上述方案中，所述APC-霉链亲和素偶联物浓度大于100ug/ml，所述的APC-霉链亲和素偶联物的工作浓度稀释倍数为1:100-1:500。
一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的方法，采用上述的一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒，包括如下步骤：
(1)将微流道加样层与印刷有CA153单克隆捕获抗体条形码、CA125单克隆捕获抗体条形码、CEA单克隆捕获抗体条形码、AFP单克隆捕获抗体条形码和CA199单克隆捕获抗体条形码的反应层衬底依靠自重贴合，形成封闭的反应腔室；
(2)从多个流入孔分别注入不同的待测样本，孵育10-40min，使待测样本中的肿瘤标志物充分与反应层衬底上的单克隆捕获抗体结合，孵育完成之后，从流出孔将多余的待测样本抽干；
(3)在含BSA质量浓度为0.5-5％的DPBS中揭片，并且用质量浓度为0.5-5％的BSA将没有吸附在反应层衬底上的肿瘤标志物冲洗干净；
(4)取混合检测抗体溶液满铺在反应层衬底上，用封口膜贴合在反应层衬底上，孵育10-40min；
(5)揭下封口膜，用质量浓度为0.5-5％的BSA冲洗，然后取APC-链霉亲和素偶联物满铺在反应层衬底上，此时，APC-链霉亲和素偶联物与带有生物素标记的肿瘤标志物检测抗体特异性结合固定在反应层衬底上，然后对肿瘤标志物进行荧光检测。
通过上述技术方案，本发明提供的一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒及方法具有如下有益效果：
本发明集成印刷有CA153单克隆捕获抗体、CA125单克隆捕获抗体、CEA单克隆捕获抗体、AFP单克隆捕获抗体和CA199单克隆捕获抗体条形码的氧化石墨烯类纳米材料衬底以及微流道加样层，多个所述微流道凹槽与多个所述单克隆捕获抗体条形码垂直布置形成多个反应点阵，可对样本同时进行多个生化或化学指标的检测，极大程度的减少传统的待测样本定量分析过程中工作液和检测样本的用量，步骤简化，灵敏度高。本发明结构简单，性能稳定，成本低，具有显著的进步性和良好的推广应用价值，且上述微流控芯片结构简单，易于集成和结合配套的自动化设备实现自动化检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例所公开的一种微流控芯片组装示意图；
图2为本发明实施例所公开的反应层衬底结构示意图；
图3为本发明实施例所公开的微流道加样层示意图；
图4a为浓度为500ng/ml的重组蛋白CEA的特异性检测柱状图；
图4b为浓度为500ng/ml的重组蛋白AFP的特异性检测柱状图；
图4c为浓度为1000u/ml的重组蛋白CA125的特异性检测柱状图；
图4d为浓度为1000u/ml的重组蛋白CA199的特异性检测柱状图；
图4e为浓度为1000u/ml的重组蛋白CA153的特异性检测柱状图；
图5a为重组蛋白CEA的标准曲线；
图5b为重组蛋白AFP的标准曲线；
图5c为重组蛋白CA125的标准曲线；
图5d为重组蛋白CA199的标准曲线；
图5e为重组蛋白CA153的标准曲线；
图6为5例血液系统疾病患者和5例健康对照者乳腺癌疾病血清肿瘤标志物CA153检测结果。
图中，1、反应层衬底；2、微流道加样层；3、载玻片基板；4、氧化石墨烯量子点纳米材料基底；5、单克隆捕获抗体条形码；6、流入孔；7、流出孔；8、微流道凹槽。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒，包括微流控芯片、纯化的重组蛋白CA153、CA125、CEA、AFP和CA199，生物素标记的CA153单克隆检测抗体、CA125单克隆检测抗体、CEA单克隆检测抗体、AFP单克隆检测抗体和CA199单克隆检测抗体；APC-霉链亲和素偶联物、封闭液、工作液和抗体稀释液；
微流控芯片包括反应层衬底1和位于其上的微流道加样层2，反应层衬底1包括载玻片基板3和组装于载玻片基板3上的氧化石墨烯量子点纳米材料基底4，氧化石墨烯量子点纳米材料基底4上印刷有CA153单克隆捕获抗体条形码、CA125单克隆捕获抗体条形码、CEA单克隆捕获抗体条形码、AFP单克隆捕获抗体条形码和CA199单克隆捕获抗体条形码5。
微流道加样层2的底部设有多个微流道凹槽8，多个微流道凹槽8与多个单克隆捕获抗体条形码5垂直布置形成多个反应点阵，微流道加样层2上还设有上下贯通的流入孔6和流出孔7，微流道凹槽8的两端分别与流入孔6和流出孔7连通。
微流控加样层2采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制备。
封闭液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为3％的牛血清蛋白(BSA)溶液。
工作液是用DPBS溶液和用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液。
抗体稀释液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液。
DPBS溶液，是用于维持蛋白活性的一种平衡盐溶液。它可以在有限时间内维持蛋白结构和生理学上的完整性。pH为7.2-7.4，浓度为0.05mol/L。
单克隆检测抗体浓度大于100ug/ml，单克隆检测抗体的工作浓度稀释倍数为1:100-1:500，优选1:200。
APC-霉链亲和素偶联物浓度大于100ug/ml，的APC-霉链亲和素偶联物的工作浓度稀释倍数为1:100-1:500，优选1:200。
一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的方法，采用上述的一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒，包括如下步骤：
(1)微流控芯片组装：
将微流道加样层2与印刷有CA153单克隆捕获抗体条形码、CA125单克隆捕获抗体条形码、CEA单克隆捕获抗体条形码、AFP单克隆捕获抗体条形码和CA199单克隆捕获抗体条形码的反应层衬底依靠自重贴合，形成封闭的反应腔室；
(2)标本采集：
提取血液中的血清：在受试者同意的情况下，采用非抗凝管抽取一定量的血液后，放在室温下，无菌环境中，静置5个小时左右，取最上层淡黄色液体。将此液体在4℃环境下低温离心，3000rpm，10min；取上层液体，放入EP管中，-80℃保存。
(3)特异性检测
特异性是生物传感器最重要的性能参数之一，反映了生物传感器的抗干扰能力。为了测试本发明试剂盒的特异性，将重组蛋白CEA、AFP、CA125、CA199和CA153梯度稀释至相同浓度(重组蛋白CEA和AFP浓度为500ng/ml，重组蛋白CA125、CA199和CA153浓度为1000u/ml)，加载每个稀释至工作用浓度的重组蛋白抗原的微流道凹槽8垂直于反应层衬底上捕获抗体条形码，并跨越所有抗体条形码。
使每个稀释至工作用浓度的重组蛋白抗原充分与反应层衬底上的特定肿瘤标志物捕获抗体结合，孵育20min完成之后，从流出孔7将多余的液体抽干，然后在含质量浓度为1％的BSA的DPBS中揭片，并且用质量浓度为1％的BSA冲洗反应层衬底，取混合检测抗体溶液200ul满铺在反应层衬底上，用封口膜贴合在反应层衬底上，孵育20min。揭下封口膜，用质量浓度为1％的BSA冲洗，用移液枪取APC-链霉亲和素偶联物200ul满铺在反应层衬底上，此时，APC-链霉亲和素偶联物与带有生物素标记的肿瘤标志物检测抗体特异性结合固定在反应层衬底上。
通过GenePix 4400微阵列扫描仪检测光学信号的强度，(其检测波长为635nm)，并给出检测结果。总的检测时间为30min，每个标准品分别使用3个微流控芯片体系检测条带测定3次取其结果的平均值，绘制柱状图。
(4)标准曲线制作
将重组蛋白CEA和AFP做梯度稀释，即50000pg/ml、5000pg/ml、500pg/ml、50pg/ml、5pg/ml；将重组蛋白CA125、CA199和CA153做梯度稀释，即1000u/ml、100u/ml、10u/ml、1u/ml、0.1u/ml，作为标准品。每个浓度的抗原和待测样本同时进行下列操作：用移液器取2μL样本，通过芯片的流入孔6注入到微流控芯片中。
使待测样本中的肿瘤标志物充分与反应层衬底上的特定肿瘤标志物捕获抗体结合，孵育20min完成之后，从流出孔7将多余的液体抽干，然后在含质量浓度为1％的BSA的DPBS中揭片，并且用质量浓度为1％的BSA冲洗反应层衬底，取混合检测抗体溶液200ul满铺在反应层衬底上，用封口膜贴合在反应层衬底上，孵育20min。揭下封口膜，用质量浓度为1％的BSA冲洗，用移液枪取APC-链霉亲和素偶联物200ul满铺在反应层衬底上，此时，APC-链霉亲和素偶联物与带有生物素标记的肿瘤标志物检测抗体特异性结合固定在反应层衬底上。
通过GenePix 4400微阵列扫描仪检测光学信号的强度，(其检测波长为635nm)，并给出检测结果。总的检测时间为30min，每个标准品分别使用3个微流控芯片体系检测孔测定3次取其结果的平均值，绘制标准曲线。
(5)结果判断
①配制至工作用浓度的重组蛋白抗原CEA、AFP、CA125、CA199和CA153作为横坐标，荧光值以10为底取对数为纵坐标作图，绘制柱状图，见图4a、图4b、图4c、图4d、图4e。
②配制浓度以10为底取对数作为横坐标，荧光值以10为底取对数为纵坐标作图，绘制标准曲线，拟合公式为lg[f(x)]＝a+blgx，见图图5a、图5b、图5c、图5d、图5e。
③选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量GenePix 4400微阵列扫描仪的随机软件得出样本阈值荧光值和校对样本荧光值，根据标准曲线得到的荧光值与浓度的关系式，将测量的荧光值带入，得到乳腺癌肿瘤标志物(以CA153为例)的含量。
④5例血液系统疾病患者和5例健康对照者乳腺癌疾病血清肿瘤标志物CA153检测结果见图6。
⑤乳腺癌疾病血清肿瘤标志物检测方法对乳腺癌疾病的诊断价值分析
以5例血液系统疾病患者作为血液系统疾病组，5例健康对照者作为非血液系统疾病组，结果表明，采用本试剂盒双抗体夹心法进行肿瘤标志物CEA和AFP浓度检测的最低检测限为5pg/mL，检测范围为5-50000pg/mL。肿瘤标志物CA125、CA199和CA153浓度检测的最低检测限为0.1u/ml，检测范围为0.1-1000u/ml。通过将检测结果和现有的商业化检测方法(电化学方法)的检测结果进行对比，发现使用本发明芯片得出的检测结果和现有的商业化检测方法(电化学方法)的结果检测结果具有高度一致性，表明使用本发明芯片得出的检测结果具有准确性。同时，通过对同一血清样本进行多次(本实施例中采用10次)测定，获得的检测结果之间的变异系数均小于10％，表明本检测芯片具有良好的重复性，可以进一步作为乳腺癌肿瘤标志物医学诊断的参考。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种非诊断目的的用于乳腺癌肿瘤标志物检测的方法，采用一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括微流控芯片、纯化的重组蛋白CA153、CA125、CEA、AFP和CA199，生物素标记的CA153单克隆检测抗体、CA125单克隆检测抗体、CEA单克隆检测抗体、AFP单克隆检测抗体和CA199单克隆检测抗体；APC-霉链亲和素偶联物、封闭液、工作液和抗体稀释液；
所述微流控芯片包括反应层衬底和位于其上的微流道加样层，所述反应层衬底包括载玻片基板和组装于载玻片基板上的氧化石墨烯量子点纳米材料基底，所述氧化石墨烯量子点纳米材料基底上印刷有CA153单克隆捕获抗体条形码、CA125单克隆捕获抗体条形码、CEA单克隆捕获抗体条形码、AFP单克隆捕获抗体条形码和CA199单克隆捕获抗体条形码；
所述微流道加样层的底部设有多个微流道凹槽，多个所述微流道凹槽与多个所述单克隆捕获抗体条形码垂直布置形成多个反应点阵，所述微流道加样层上还设有上下贯通的流入孔和流出孔，所述微流道凹槽的两端分别与所述流入孔和流出孔连通；
检测方法包括如下步骤：
（1）将微流道加样层与印刷有CA153单克隆捕获抗体条形码、CA125单克隆捕获抗体条形码、CEA单克隆捕获抗体条形码、AFP单克隆捕获抗体条形码和CA199单克隆捕获抗体条形码的反应层衬底依靠自重贴合，形成封闭的反应腔室；
（2）从多个流入孔分别注入不同的待测样本，孵育10-40 min，使待测样本中的肿瘤标志物充分与反应层衬底上的单克隆捕获抗体结合，孵育完成之后，从流出孔将多余的待测样本抽干；
（3）在含BSA质量浓度为0.5-5%的DPBS中揭片，并且用质量浓度为0.5-5%的BSA将没有吸附在反应层衬底上的肿瘤标志物冲洗干净；
（4）取混合检测抗体溶液满铺在反应层衬底上，用封口膜贴合在反应层衬底上，孵育10-40 min；
（5）揭下封口膜，用质量浓度为0.5-5%的BSA冲洗，然后取APC-链霉亲和素偶联物满铺在反应层衬底上，此时，APC-链霉亲和素偶联物与带有生物素标记的肿瘤标志物检测抗体特异性结合固定在反应层衬底上，然后对肿瘤标志物进行荧光检测。
2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的用于乳腺癌肿瘤标志物检测的方法，其特征在于，所述封闭液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为1-6%的牛血清蛋白溶液。
3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的用于乳腺癌肿瘤标志物检测的方法，其特征在于，所述工作液是用DPBS溶液和用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为0.5-5%的牛血清蛋白溶液。
4.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的用于乳腺癌肿瘤标志物检测的方法，其特征在于，所述抗体稀释液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为0.5-5%的牛血清蛋白溶液。
5.根据权利要求4所述的一种非诊断目的的用于乳腺癌肿瘤标志物检测的方法，其特征在于，所述DPBS溶液，pH为7.2-7.4，浓度为0.01-0.1mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的用于乳腺癌肿瘤标志物检测的方法，其特征在于，所述单克隆检测抗体浓度大于100ug/ml，所述单克隆检测抗体的工作浓度稀释倍数为 1:100-1:500。
7.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的用于乳腺癌肿瘤标志物检测的方法，其特征在于，所述APC-霉链亲和素偶联物浓度大于100ug/ml，所述的APC-霉链亲和素偶联物的工作浓度稀释倍数为1:100-1:500。
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