KR101764597B1 - 생물학적 샘플에서 희귀 사건 분석을 위한 고감도 다중매개변수 방법 - Google Patents

생물학적 샘플에서 희귀 사건 분석을 위한 고감도 다중매개변수 방법 Download PDF

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Abstract

CTC 또는 관심 있는 다른 세포를 함유하는 혈액 샘플이 영상 분석을 위한 형광 마커(fluorescent marker)에 의해 염색되고, 스캐닝(scanning)되어, 표적 세포 또는 세포 내 성분(subcellular element)의 카트리지 내의 존재 및 이들의 위치를 확인한다. 다음에, 원하는 표적 세포 또는 세포 내 성분을 함유하는 샘플이, 당해 샘플을 부분적으로 광퇴색(photobleaching)함으로써 추가로 처리되고, 이에 따라, 이들 동일한 표적이 초기 분석에 사용했던 것과 동일한 영상화 기준(imaging criteria)을 사용하여, 동일하거나 상이한 형광색소에 접합된 추가의 생체마커(biomarker)에 의해 재-분석될 수 있다. 본 발명은 순환(circulating) 상피 세포, 순환 종양 세포, 순환 내피 세포, 백혈구, 림프구 아형(lymphocyte subset), 세포 소기관 또는 관심 있는 수용체를 함유하는 세포, 세포 파편(cellular debris), 파열 세포 및 이들의 파편, 또는 포획 및 영상화될 수 있게 형성된 임의의 기타 성분과 같은 표적에 적용된다. 본 발명은, 특히 FISH와 같은 유전 분석과 결합될 경우, 관심 있는 개개의 표적에서 추가로 정보를 얻을 수 있는 수단을 제공한다.
고감도 다중변수 방법, 형광마커, 광퇴색, 생체마커

Description

생물학적 샘플에서 희귀 사건 분석을 위한 고감도 다중매개변수 방법{A high sensitivity multiparameter method for rare event analysis in a biological sample}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2005년 9월 20일에 제출된 미국 가출원 제60/718,676호, 2005년 10월 24일에 제출된 미국 가출원 제60/729,536호, 2006년 3월에 제출된 미국 가출원 제60/786,117호에 대한 우선권을 주장한, 2008년 3월 20일에 제출된 미국 출원 시리즈 번호 제12/067,532호의 부분 연속 출원이다. 상기 언급된 각각의 출원은 본원에 참조로 전문이 혼입되어 있다.
본 발명은 종양학 및 진단 테스트 분야에 관한 것이다. 본 발명은 암 또는 심혈관 장애와 같은 질환에서, 선별(screening), 병기 결정(staging), 치료 반응 또는 재발 등에 유용하다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 생물학적 샘플로부터 분리된 순환 희귀 세포의 분석 및 산출을 용이하게 하는 방법을 제공한다.
생물학적 샘플로부터, 종양 세포뿐만 아니라, 희귀 세포, 또는 기타 생물학적 실체(biological entity)를 특성화하는 방법은 이미 기재되어 왔다(미국 특허 제6,365,362호). 이 2 단계 방법은, 영상 기법에 의한 세포 검사를 고려하여, 분석에 앞서 실질적인 양의 파편 및 기타 방해 물질을 제거함과 동시에, 표적 세포의 획득을 확실하게 하기 위해 효율적인 강화(enrichment)를 요구한다. 당해 방법은 특수하게 자동화된 방법으로, 면역자기 강화(immunomagnetic enrichment)의 요소를, 다중매개변수 흐름 세포측정법(multi-parameter flow cytometry), 현미경법 및 면역세포화학(immunocytochemical) 분석법과 조합한다. 당해 조합 방법은 혈액 샘플에서 상피 세포를 강화하고 계수하는 데 사용되며, 이에 의해, 암 측정을 위한 도구를 제공한다.
당해 2 단계 방법은 전이암 환자에 대한 암 예후 및 생존에 적용된다(국제 공개공보 제WO 04076643호). 형태학적으로 온전한 순환 암 세포의 혈액 내 존재를 기반으로 하여, 이 방법은 전이 유방암 환자의 순환 암 세포의 존재를 질환 진행 및 생존까지의 시간과 상관시킬 수 있다. 보다 구체적으로는, 7.5밀리리터당 5개 이상의 순환 종양 세포의 존재는 최초의 추적 조사에서 예측치를 제공하며, 이에 의해, 환자 생존의 조기 예후 지표(prognostic indicator)를 제공한다.
상기 기재된 검정(assay)의 특이성은 검출된 세포수에 따라 증가하며, 아주 소수(일반적으로 5개 미만의 순환 종양 세포)만이 검출되는 경우에는 충분하지 않다. 이 문제에 대한 하나의 해결책은 의심되는 암 세포에 대한 상세한 유전 정보를 제공하는 것이다. 따라서, 개개의 의심되는 암 세포에 대한 다중매개변수 영상 세포측정법 및 다중매개변수 유전 분석과 함께 혈액 샘플의 강화를 도입하는 방법은 환자 선별, 질환의 재발 평가 또는 전체 생존(overall survival)에 대한 현재의 방법을 유의하게 향상시키는 데 완벽한 프로파일 및 확증 기전을 제공할 것이다. 개별적으로 분리된 표적 세포의 표현형 및 유전형 다중매개변수 분석에 의한, 희귀 순환 세포의 분석에서의 확증 검정이 기재되었다(참조: 계류중인 미국 특허출원 제12/067,532호). 확증은 임상적으로 유의한 수준의 감도를 제공하며, 따라서, 획득되는 임의의 정량적 정보를 임상의에게 확보시켜 준다. 관련 질환 상태는 극히 소수(1, 2, 3 또는 4개)의 순환 종양 세포(circulating tumer cell, CTC)를 사용하여 평가되며, 조기 질환 검출에 대한 확증을 제공한다.
동일한 마커를 사용하여 동일한 샘플에 대한 다중 고감도 검정을 수행하고, 이것을 희귀한 사건에 대해 행할 수 있는 다른 이용 가능한 기술은 없다. 다중매개변수 흐름 세포측정법이 일반적으로 행해지지만, 이것은 정확한 정보를 얻기 위해 수백 또는 수천 개의 표적 세포 또는 사건을 요구한다. 그러나, 환자가 7.5mL의 혈액 중에 단지 6개의 CTC를 가질 경우, 다중매개변수 분석을 수행하는 것은 말할 것도 없이, 확실하게 검출하기에 너무 적은 사건이다.
본 발명은 다중 형광 생물마커를 사용하여 희귀 순환 세포에서 정보 획득을 가능하게 하는 수단을 제공함으로써, 미국 특허 제6,365,362호에 기재되어 있고, CellTracks® Autoprep® System 및 Celltracks® Analyzer II System(제조원: Immunicon Corporation, 미국 펜실베니아주 헌팅돈 밸리(Huntingdon Valley) 소재)에서 사용되는 강화 및 분석 프로토콜을 확장한다.
본 명세서에 기재된 발명은 최종 결과를 달성하기 위해 작용하는 5 부분으로 이루어진 방법으로 이루어진다. 본 발명은 본질적으로, (1) 카트리지를 스캐닝하여 카트리지 내의 관심 있는 표적 세포를 가진 것들 및 이들의 위치를 확인하는 단계; (2) 카트리지로부터 체액을 흡인하여, 커버 슬립(cover slip) 위의 이들의 위치에 이들 세포를 건조시키거나 적극적으로 고정시키는 단계; (3) 형광 신호를 광퇴색하여, 표적 세포를 확인하기 위해 원래 사용되었던 형광을 제거하는 단계; (4) 하나 이상의 형광 항체 접합체(들) 또는 염료(들)를 사용하여 카트리지 내의 세포를 재염색하여, 관심 있는 표적 위 또는 내의 관심 있는 마커, 수용체, 단백질 등을 표지하는 단계; (5) 카트리지를 재스캐닝하고, 앞서 확인된 관심 있는 표적으로 복귀하고, 세포가 원하는 마커 또는 단백질에 대하여 양성인지 또는 음성인지를 결정하는 단계로 이루어진다.
CTC 또는 관심 있는 다른 세포를 함유하는 혈액의 샘플이 영상 분석을 위한 형광 마커에 의해 염색되고, 스캐닝되어, 표적 세포 또는 세포 내 성분(subcellular element)의 카트리지 내의 존재 및 이들의 위치를 확인한다. 다음에, 원하는 표적 세포 또는 세포 내 성분을 함유하는 샘플이 당해 샘플을 부분적으 로 광퇴색함으로써 추가로 처리되고, 이에 따라, 이들 동일한 표적이 초기 분석에 사용했던 것과 동일한 영상화 기준을 사용하여, 동일하거나 상이한 형광색소에 접합된 추가의 생체마커(biomarker)에 의해 재-분석될 수 있다.
본 발명은 순환 상피 세포, 순환 종양 세포, 순환 내피 세포, 백혈구, 림프구 아형, 세포 소기관 또는 관심 있는 수용체를 함유하는 세포, 세포 파편, 파열 세포 및 이들의 파편, 또는 포획 및 영상화될 수도 있게 형성된 임의의 기타 성분과 같은 표적에 적용된다.
혈액으로부터 포획된 순환 종양 세포(CTC)가 CellTracks® Autoprep® System 및 CellTracks® Analyzer II System(제조원: Immunicon Corporation, 미국 펜실베니아주 헌팅돈 밸리 소재)을 사용하여 검출되고 분석되었다. 이 방법에서는, 형광 생체마커와 염료의 조합이 상피 기원 세포를 확인하고, 오염시키는 백혈구로부터 이들을 구별하는 데 사용된다. CellTracks® 분석 플랫폼은 이들 형광 마커를 검출하는 데 4개의 채널 또는 색으로 제한된다. UV 채널은 핵 염료인 4',6'-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 검출하여, 핵 사건 또는 세포 사건을 확인하고; 알로피코시아닌(APC) 채널은 백혈구를 확인하는 데 사용되는 CD45-APC를 검출하는 데 사용되고; 2개의 마커 채널, 피코에리트린(PE)과 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)는 PE 또는 FITC 중 어느 하나에 접합된 생체마커를 검출하는 데 사용된다. 표준 CellSearch® 키트(제조원: Veridex LLC, 미국 뉴욕주 라리탄(Raritan) 소재)를 사용하여, PE는 상피 세포를 확인하는 데 사용되는 사이토케라틴에 접합되며, FITC 채널은 관심 있는 추가의 마커에 이용 가능하다. 상피 세포 키트(Epithelial Cell Kit)(제조원: Immunicon Corporation, 미국 펜실베니아주 헌팅돈 밸리 소재)는 동일한 색 조합을 사용하며, 단지 사이토케라틴이 PE 채널을 벗어나서 FITC에 즉시 접합된다. 보다 강한 신호전달 PE 채널이 PE에 접합된 보다 어두운(dimmer) 생체마커의 검출을 가능하게 한다.
단지 4개의 채널 또는 색이 현재 CellTracks® Analyzer II System에 존재하고, 이들 색 중 3개가 상피 세포 및 백혈구를 검출하는 데 사용되고, 단지 하나의 채널만이 추가의 생체마커 분석에 이용 가능하다. 그러나, 특히 제약 산업에서는, 포획된 표적 위의 다중 생체마커를 검출할 필요성이 존재하며, 검출이 동일한 표적에서 일어나는 것이 선호될 것이다. 본 발명은 포획된 표적에 부착된 생체마커 및 염료로부터의 형광 신호의 제거, 및 추가의 관심 있는 마커를 갖는 동일한 표적의 재-염색을 가능하게 한다. 카트리지의 초기 스캐닝 후 건조 단계는 관심 있는 표적을 카트리지 내의 이들의 원래의 위치에 고정시키고, 이에 따라, 당해 카트리지가 재-염색될 경우, 이들 동일한 표적이 추가의 관심 있는 생체마커의 존재에 대하여 용이하게 발견되고 분석된다.
이 방법의 첫 번째 단계에서는, CellTracks® 카트리지가 Celltracks® Autoprep® System 및 Celltracks® Analyzer II System에서 처리되며, 여기서, 포획된 표적이 스캐닝되고, 카트리지 내 위치에 대해 확인된 원하는 표적의 존재가 결정된다. 카트리지 내 액체는 흡인에 의해 제거되며, 당해 카트리지는 밤새 공기 건조된다. 흡인 및 공기 건조는 카트리지가 원래의 MagNest®에 머물러 있는 동안에 행해진다. 이 단계는 표적, 통상적으로 CTC와 같은 세포를 카트리지 위의 제자리에 "고정"하며, 이에 따라, 이들은 본질적으로 움직일 수 없게 되고, 이들이 원래 검출되던 위치에서 영상 표면에 찍히게 된다. 세포를 고정하는 바람직한 방법은 카트리지를 공기 건조시키는 것이지만, 다른 고정 방법이 사용될 수 있고, 실제로, 몇 가지 유형의 항원을 노출하도록 요구될 수 있으며, 이들 항원과 특정 항체의 최적의 반응성을 달성할 수 있다. 이 건조 단계 또는 적극적 고정은 MagNest®로부터 카트리지가 제거될 수 있게 하며, 당해 카트리지가 세포 운동 또는 손실이 거의 없거나 전혀 없이 처리될 수 있게 한다. 이로써, 영상화 장치, 예를 들면, 이로 제한되지 않지만, Celltracks® Analyzer II System이, 후속되는 분석 동안에, 표적을 재-획득 가능하게 하는 것이다. 이 방법에서 두 번째 단계는 카트리지를, 표적의 초기 처리 동안에 이들 표적에 부착된 염료 및 마커의 형광을 퇴색하기 위해, 이로 제한되지는 않지만, LED에 의해 발생된 강한 광에 노출시킨다. 광퇴색은 형광색소가 고속으로 여기(excitation)될 때 효과적이다. 염료가 고효율로 여기되는 파장 대역(wavelength band)은 통상적으로 협소하다(10 내지 50nm). LED는 협소한 파장 대역에서 고효율로 광을 효율적으로 발생시키고, 근자외선부터 적외선까지의 방출시에 이용 가능하다. LED 효율은 히트 싱크(heat sink)에 의해 더욱 향상된다. 반사 또는 굴절 표면으로 이루어진 선택적인 호모게나이저는 샘플 위의 광 분포의 균일성을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 현재의 프로토타입 LED 블리처(bleacher)를 사용하여, 밝은 염료의 광퇴색은 최대 20분까지 걸릴 수 있다. 그러나 보다 어두운 신호에 대해서는 10 내지 15분이면 충분하다. 최종 단계 동안에는, 카트리지 내 샘플이 형광색소에 접합된 추가의 관심 있는 생체마커에 의해 재-염색된다. 염색 용액이 제거되고, 핵산 염료 용액, 예를 들면 DAPI를 함유하는 CellFix로 대체되고, 당해 카트리지가 영상화 장치에서 재-분석된다.
도 1a는 건조 후의 샘플의 완전성을 확증한다. 샘플이 건조된 후에, 표적의 페로플루이드(ferrofluid) 분포 및 위치는, CellTracks® Analyzer II System에서 초기에 스캐닝되었을 때와 동일하게 유지된다. 도 1b는 세포가 건조 전과 후에 있어서 온전하게 동일한 위치에 유지됨을 나타낸다.
도 2는 건조 후에 카트리지에서 재-염색하는 능력을 보여준다. 여기서는, 표적 세포가 혈액 내로 첨가되고, CellSave 보존제(제조원: Immunicon Corporation)을 사용하여 제조되고, 밤새 저장되었다. 다음에, 세포를 C11-PE를 사용하여 표지하는 CTC 키트를 사용하여, CellTracks® Autoprep® System 및 CellTracks® Analyzer II System에서 샘플이 처리되었다. 초기 스캐닝에서, FITC 채널은 FITC에 접합된 마커가 없었기 때문에 빈 채로 유지된다. 카트리지가 건조되고, 형광 신호가 퇴색된 후에, 카트리지 내에서 C11-FITC를 사용하여 샘플이 재-염색되고, 다음에, CellTracks® Analyzer II 시스템에서 재-스캐닝되었다. 샘플은 지금 PE 및 FITC 채널 둘다에서 양성이다. 샘플이 초기에 C11-PE로 염색되었을지라도, 후속되는 C11-FITC 결합에 충분한 결합 부위가 남아 있게 된다.
도 3a 및 3b는 발광 다이오드(LED)를 사용하여 형광 신호를 퇴색하는 능력을 보여준다. 세포는 혈액 내로 스파이킹(spiking)되고, CellSave 보존제를 사용하여 유지되고, 밤새 저장되었다. 다음에, 세포를 C11-PE를 사용하여 표지하는 CTC 키트를 사용하여, CellTracks® Autoprep® System에서 샘플이 처리되었다. 다음에, Celltracks® Analyzer II System에서 카트리지를 스캐닝하였다. 액체를 흡인하고, 카트리지를 건조시킨 후에, CellFix가 카트리지에 다시 첨가되었으며; 카트리지가 MagNest®로부터 제거되고, 다음에, LED로부터의 광에 최대 20분 동안 노출되었다. 카트리지가 MagNest® 내로 다시 위치되고, CellFix가 흡인되었으며, 세포가 C11-FITC로 재-염색되고, 다음에, DAPI로 재-염색되었다. 이러한 재-염색은 스파이킹된 세포가 재-획득되고 Celltracks® Analyzer II System에서 분석될 수 있게 하는 데 있어서 필수적이다. 퇴색은 초기 C11-PE 염색에서만 관찰되었다. 샘플이 Celltracks® Analyzer II System에서 스캐닝된 후에, 이들은, 평균 형광 강도(MFI) 를 결정하는 소프트웨어를 사용하여, 염색 강도 휘도(staining intensity brightness)에 대하여 평가되었다.
도 3a는 C11-PE로 밝게 염색된 SKBR 세포의 퇴색을 나타낸다. 퇴색하고 20분 후에, PE MFI는 약 4000 내지 0에 가깝게 떨어진다. 도 3b는 C11-PE, 통상적으로는 CTC에 대하여 보다 어둡게 염색되는 PC3-9 세포의 퇴색을 나타낸다. PE MFI는 10 내지 15분 동안의 퇴색 후에 500 내지 2000의 범위로부터 0까지 떨어진다.
최종의 목적은 샘플의 초기 처리 동안에 CellTracks® Autoprep® System에서 전에 사용되지 않은 마커로 재-염색하는 것이다. 도 4에서의 영상은 DAPI, CD45 APC 및 C11-PE의 염료 조합을 사용하여 CellTracks® Autoprep® System에서 처리된 CTC를 포획하고, 이들 신호를 퇴색하고, 다음에, DAPI, C11-FITC 및 p-AKT PE로 세포를 재-염색하는 능력을 보여준다. AKT는 PI3K 경로를 거쳐 세포 신호전달을 하는 데 있어서 중요한 키나아제이다. 이 효소는 인산화에 의해 활성화되고, 몇몇 종양에서는 연속적으로 활성화되는 것으로 알려져 있다.
도 4a는 혈액으로부터 포획되고, C11-PE에 의해 CellTracks® Autoprep® System에서 염색된 SKBR 세포의 초기의 스캐닝을 나타낸다. 음성 FITC 채널을 주목하라. 도 4b는 퇴색하고, C11-FITC로 재-염색한 후의 샘플을 나타낸다. 음성 PE 채널 신호를 주목하라. 도 4c는 퇴색하고, C11-FITC 및 pAKT-PE로 재-염색한 후의 샘플을 나타낸다.
본 발명은 관심 있는 다중 형광 생체마커를 사용하여 CTC에서 정보를 얻을 수 있게 하는데, 이것은 CellTracks® Autoprep® System 및 CellTracks® Analyzer II System에서 단일 처리 프로토콜을 사용해서는 통상적으로 가능하지 않을 것이다. 이것은 초기 처리 동안에 사용되는 염료의 형광 신호를 퇴색하고, 추가의 형광 생체마커를 사용하여 카트리지에서 재-염색(이는 동일한 형광 채널을 사용하여 즉시 재-스캐닝될 수 있다)함으로써 이를 달성한다.
본 발명은 동일한 샘플의 다중 재-퇴색 후 재-염색을 고려한다. 본 발명은 동일한 세포(들)에 대한 다중 특이적 결합 파트너 검정(multiple specific binding partner assay)에서 퇴색 처리 및 이의 사용을 추가로 고려한다. 따라서, 세포의 다중매개변수 분석이, 형광 채널; 더욱 많은 필터, 더욱 많은 광원의 추가 없이, 그리고 데이터를 수집하고 분석하는 기계 및 소프트웨어의 복잡도의 증가 없이 수행될 수 있다. 결과적으로, 이것은 기존의 4색 형광 분석기의 성능을 확대시켜, 복잡하고 비용이 많이 드는 시스템 개조 없이 'N' 매개변수 분석을 수행한다. 이것은 또한 사용자가 관심 있는 카트리지를 확인하고, 이들을 건조 또는 고정하고, 다음에, 나중의 고가치(high value) 분석을 위해 이들을 저장할 수 있게 해준다.
본 발명은 동일한 세포에 대한 2개 이상의 분석 물질에 대하여 동일한 고감도 형광체(fluorophore)의 사용을 제공하며, 이는 당해 기술분야에서 임의의 다른 기술에 의해서는 가능하지 않다. 예를 들어, PE는 높은 흡수 및 형광 양자 수율을 갖는데, 이에 의해, PE는 IGF-1R 및 p-AKT와 같은 고감도 마커를 검출하는 데 매우 적합하게 된다. 이들 마커는, 항체 접합체가 PE 대신에 FITC에 접합되어 있을 경우, 이들 마커가 검출될 수 없을 정도로 표적 세포에서의 농도가 낮다. 양성 세포 위의 IGF-1R은, FITC를 사용하여 검출 가능한 신호를 제공하기에 전혀 충분하지 않은데, 이는 FITC의 감도 및 양자 수율이 보다 낮기 때문이다. p-AKT에 대해서도 마찬가지인데, 그러나 본 발명에서는, CTC가 CK-PE를 사용하여 확인될 수 있다. CK-PE 신호는 0으로 퇴색되고, 결정된 동일한 세포의 항(anti)-IGF-1R-PE 및 IGF-1R 상태로 재-염색된다. IGF-1R 신호는 0으로 추가로 퇴색되고, 항-p-AKT-PE를 사용하여 카트리지에서 다시 재-염색될 수 있다. 이 처리는 3개의 모든 분석 물질이, 이용 가능한 가장 고감도의 형광색소를 사용하여, 동일한 세포에서 평가될 수 있게 해준다.
본 발명은 또한 추가의 고가치(high value) 연구 또는 임상 정보를 샘플에서 수집 가능하게 하며, 환자를 다시 불러 추가의 샘플을 수집해야 할 필요가 없다. CTC 또는 기타 관심 있는 표적이 발견된 경우, 본 발명을 이용하여 샘플이 제조될 수 있고, 환자가 추가의 침습적 시술을 받게 하는 일 없이, 이들 CTC의 특성이 조사되고 탐색될 수 있다. 또한, 샘플이 관심 있는 표적을 함유하지 않는 것으로 발견될 경우에는, 추가의 고가치 시험, 시술 및 시약을 사용할 필요가 없게 된다. 이는 샘플이 실제로 관심 있는 표적을 함유하는지의 여부를 알기 전에 시험용 시약이 첨가되어야 하는 다른 방법과는 상이하다.
본 발명은, 관찰된 발현과 상관시킬 수 있거나 관찰된 발현을 설명할 수 있는, 유전자 증폭, 전위 또는 손상을 모색하기 위해 동일한 세포에 대한 후속의 FISH 분석을 추가로 고려한다. 후속의 FISH 분석을 위한 바람직한 수단은 리피트-프리 프로브(repeat-free probe)의 사용을 포함한다(미국 특허 제12/067,532호).
본 발명은 CTC 또는 일단 발견된 다른 관심 있는 표적의 상세한 분석을 가능하게 한다. 이는, 약물 개발 과정에서, 개개인의 CTC가 표적 약물 요법(targeted drug theraphy)에 민감할 것인지 여부를 확인하는 데 사용될 수 있다. 다음에, 이것은 세포내 마커 또는 다른 마커가, 시험관내 연구로부터 예측된 바와 같이, 치료법에 반응하여 상향 조절되는지, 하향 조절되는지 또는 인산화되는지의 여부를 결정함으로써, 약물 기전 연구를 추가로 조사하거나 확증하는 데 사용될 수 있으며, 이에 따라, 동반 진단(companion diagnostics)으로서 제공된다. 본 발명은 표적 개별적 약물(targeted personalized medicine)에 대한 환자의 적합성을 결정하기 위한 샘플을 획득하기 위해, 최소한의 침습적 방법을 제공함에 있어서 유용성을 갖는다. 다른 적용이 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면, 염증 손상에서 중요한 백혈구 아형의 활성화 상태의 검출, 또는 인터루킨 스톰(storm), 예를 들면, 패혈 쇼크의 검출이지만, 이로 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 연구용(research use only, RUO) 공급으로서 유용하며, 최종적으로는 병원 및 표준 실험실(reference laboratory)에서 사용될 수 있는 제품으로서 가능할 것이다.
본 발명의 바람직한 특정 양태가 기재되어 있고, 상기에 구체적으로 예시되어 있지만, 이는 본 발명이 이러한 양태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 기조로부터 벗어나는 일 없이 여기에 다양한 변형이 만들어질 수 있으며, 전체 개선 범위는 하기 청구항에 기재된다.
도 1a 및 1b: 패널 A: 건조 후 샘플의 완전성(integrity) 및 표적의 위치의 확증. 패널 B: 세포가 건조 전과 후에 동일한 위치에 나타나 있다.
도 2: 건조 후에 재-염색된 카트리지
도 3a 및 3b: LED를 사용한 형광 신호의 퇴색. 패널 A: C11-PE로 염색된 SKBR 세포의 퇴색 후 C11-FITC 재-염색. 패널 B: C11-PE로 염색된 PC3-9 세포의 퇴색 후 C11-FITC 재-염색
도 4: 패널 A는 C11-PE로 염색된 SKBR 세포의 초기 스캐닝을 나타낸다. 패널 B는 퇴색 및 C11-FITC 단독으로 재-염색한 후의 샘플을 나타낸다. 패널 C는 C11-FITC 및 pART-PE로 재-염색된 샘플을 나타낸다.

Claims (10)

  1. a. 형광 표지에 의해 샘플을 제조하는 단계;
    b. 샘플을 스캐닝(scanning)하여, 순환(circulating) 상피 세포, 순환 종양 세포, 순환 내피 세포, 백혈구, 림프구 아형(lymphocyte subset), 세포 소기관 또는 관심 있는 수용체를 함유하는 세포, 세포 파편(cellular debris), 파열 세포 및 이들의 파편, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표적 사건(target events)을 확인하는 단계;
    c. 샘플로부터 유체(fluid)를 흡인하여, 동일한 위치에 표적 사건을 남겨 두는 단계;
    d. 표적 사건을 광퇴색(photobleaching)하는 단계;
    e. 표적 사건을 형광 항체 접합체, 또는 형광 항체 접합체 및 염료의 조합인 제2 형광-표지된 마커로 재염색하는 단계;
    f. 표적 사건을 재스캐닝하는 단계; 및
    g. 각각의 추가의 형광-표지된 마커에 대하여 단계 c부터 단계 f까지 반복하는 단계를 포함하는, 희귀한 사건 분석에서 감도를 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 사건이 순환 종양 세포인, 희귀한 사건 분석에서 감도를 증가시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 추가의 단계가 상기 표적 사건의 다중매개변수 유전형(multiparametric genotype) 프로파일링인, 희귀한 사건 분석에서 감도를 증가시키는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유전형 프로파일링이 FISH인, 희귀한 사건 분석에서 감도를 증가시키는 방법.
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