CN111330311B - 一种相变诱导靶标富集的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种相变诱导靶标富集的方法，在进行生物或化学传感检测的过程中，通过传感体系的相变过程把低丰度靶标富集到传感界面表面形成具有局部较高浓度的靶标区域从而提高检测的灵敏度。该方法通过传感界面附近的靶标富集产生信号放大，从而实现对现有传感方法的检测灵敏度提升。
Description
技术领域
本发明涉及生物及化学检测或传感领域。作为一种通用靶标富集手段，本发明应能用于所有溶液相，基于界面分子相互作用的生化检测技术。
背景技术
大部分现存的生物及化学检测方法，如酶联免疫法（ELISA）和基于核酸的检测技术等，分子的相互作用往往导致固－液界面附近的电荷发生转移，使得传感器的某种光或者电信号发生改变。一般来说，生物或化学传感器主要由传感界面，信号源及信号放大组块和信号展示等组块构成。比较经典的检测/传感器例子有：病毒/抗原检测试纸/试剂、抗体检测试纸/试剂、血糖传感器、核酸检测试剂、基因芯片、水中有害物质检测装置等等。生化传感器的应用十分广泛，包括在疾病检测、食品安全、新药研发、新药研发、环境监测等领域都有广泛应用。
当待测靶标的数量很少，丰度很低，又不易扩增时，往往需要使用超敏生物及化学传感器。
为了检测到这些数量很少的靶标，往往需要设计更灵敏的传感界面。除此之外，另外一个关键问题是传质问题，也就是说，传感界面与待测物在检测过程中可能根本没有发生相互作用，因而也不可能有诸如抗体捕获这样的过程出现。
发明内容
针对目前大部分提升生化传感器灵敏度的相关技术主要聚焦在如何优化传感器本身的设计上，而对于传质的关注不足等问题，本发明提供一种相变诱导靶标富集的方法：基于界面动力学基本原理，利用相变过程中溶质的不均匀扩散的现象，使得两相交界面附近的待测物质的浓度大幅度提高，形成局部高丰度区域，并以此为原理，在基本不改变生化传感器原有设计的情况下，大幅度改进其灵敏度。
本发明把基于这一思路的生物及化学传感技术命名为：基于相变诱导的靶标富集技术 (Phase-Transition Induced Target Enrichment，或P-TITE)。
本发明所采用的技术方案：
一种相变诱导靶标富集的方法，在进行生物或化学传感检测的过程中，通过传感体系的相变过程把低丰度靶标富集到传感界面形成具有局部较高浓度的靶标区域从而提高检测的灵敏度。
所述的传感界面包括金属或非金属介质表面。
所述的传感界面包括金纳米颗粒的表界面。
所述的靶标包括核酸（DNA、RNA）、多糖、蛋白质。
所述的相变过程为将传感体系于-20℃以下低温冷冻，冷冻完全后在室温下解冻。
本发明的有益效果
通过传感界面附近的靶标富集产生信号放大，将大幅度提高现有传感方法的检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明所提出的靶标富集效果示意图；
图2为一个实例中相变诱导DNA在金纳米球表面富集的定量结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明包括以下步骤：在进行传感检测的过程中，通过传感体系的相变过程把低丰度靶标富集到传感界面附近，创造出具有局部高浓度的靶标区域来实现超敏检测。具体的，所述传感界面包括电化学传感界面以及各种纳米颗粒（如金纳米颗粒）的表界面等。所述靶标包括溶液中的生物及化学分子，例如（但不仅限于）核酸、多糖、蛋白质等或是在分析科学中具有特殊意义的物质（如抗体，抗原）等等。
以检测病人体液中病毒抗原或抗体的胶体金试纸为例，利用相变诱导靶标富集技术，可较有效地避免在微量待测靶标下，胶体金免疫层析过程中并没有形成纳米金标记的复合物而产生的漏检。所述的相变诱导富集过程，可以但不仅限于冷冻使溶液结冰，然后解冻这一过程来实现。
实施例1 相变诱导DNA在金纳米球表面富集
针对纳米金颗粒的表面，采用传统的柠檬酸钠还原法，合成直径在15nm的金纳米球并将其浓缩至10 nmol/L，分别向100μL 金纳米球溶液中加入1μL、2μL、4μL、6μL、8μL 100μmol/L的DNA溶液。在本例中所采用的的DNA序列为AAAAAAAAAAAAAAATTTTTATGATGTTCGTTGTG-FAM，其中，poly A片段会对金纳米颗粒表面产生一定的吸附，从而使得金纳米球能够富集DNA在其表面，FAM则是后续用于荧光定量的荧光基团。超声混合后，将混合液放入冰箱-20℃冷冻两小时。冷冻之前也可加入防止金颗粒团聚的溶液（如PEG水溶液）。待溶液冷冻完全后，在室温下解冻，用PBS溶液重新悬浮三次即得到表面捕获DNA的金纳米球（相变诱导方法，如图1所示）。
作为比较，用标准的pH3方法促进金纳米球与DNA的结合，向DNA和金纳米球的混合溶液中加入盐酸缓冲液调节混合溶液的pH为3，室温孵育半小时后，用PBS溶液重悬三次即得到表面捕获DNA的金纳米球（pH3方法）。pH3方法的原理在于利用酸性溶液环境中的电荷作用在金纳米球表面富集DNA，在与相变诱导方法相同的中性pH条件下，金纳米球表面DNA会更稀少。在PBS重悬液中加入巯基乙醇使巯基乙醇的终浓度达到20mM，在室温下孵育过夜后，巯基乙醇能够取代金纳米球表面的DNA，使得金纳米球发生团聚而溶液变为无色。通过14000rpm离心15min获取上清液并测定其荧光强度。金纳米球表面的DNA浓度可以通过对比上清液中DNA的荧光强度和浓度的标准工作曲线得到，所富集DNA的数目见图2。由于相变原理造成胶体金和核酸的相互作用频率大幅度增加，导致胶体金表面的DNA远超过常规结合DNA的方法，见图2。这表明：P-TITE方法相比pH3方法能够更有效地把这一实验中的靶标（DNA）富集到胶体金附近。
对于后续检测而言，pH视具体检测内容有不同的适宜pH，中性酸性均有，但富集之后的pH改变一般不会影响已经富集的效果。
上述实施例仅以DNA靶标为例，但是对于本领域技术人员来说，在熟悉P-TITE相变诱导的原理后，也同样适用于RNA、多糖、蛋白质等，可以做出多种变形和修改，从而实施本发明。
上述实施例仅以金纳米球的表界面为例，但是对于本领域技术人员来说，在熟悉P-TITE相变诱导的原理后，也同样适用于多种金属或非金属介质表面，可以做出多种变形和修改，从而实施本发明。
上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求书及其任何等同物给出。
Claims (1)
1.一种相变诱导靶标富集的方法，其特征在于：在进行生物或化学传感检测的过程中，通过传感体系的相变过程把低丰度靶标富集到传感界面形成具有局部较高浓度的靶标区域从而提高检测的灵敏度；
所述的传感界面为金纳米颗粒的表界面；
所述的靶标为核酸；
所述的相变过程为将传感体系于-20℃以下低温冷冻，冷冻完全后在室温下解冻。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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