CN108474025A - 采用依次荧光淬灭和重新染色的生物样品的多表型分型 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用多轮荧光染色来表征生物样品中生物标记物的简单且准确的方法。所述方法涉及对细胞、组织或任何生物样品进行淬灭、去衍生化、胺剥离和重新染色(QUAS‑R)的步骤。

Description

采用依次荧光淬灭和重新染色的生物样品的多表型分型
本申请要求2016年8月12日提交的临时申请62/374,456，2016年8月11日提交的临时申请62/373,867，2016年3月3日提交的临时申请62/303,243和2016年1月7日提交的临时申请62/275,949的权益。
发明领域
福尔马林固定的石蜡包埋组织、循环血细胞或任何安装的生物样品可用荧光标记物进行染色以进行特定的鉴定和分类。然而，在本发明之前，染色限于1-5种荧光标记物。例如，循环肿瘤细胞(CTC)是从原发性/转移性实体瘤中脱落并在循环系统中发现的癌细胞。多年来，整个外周血液已被用于从癌症患者中分离CTC以作为晚期疾病的预后指标。目前，唯一临床验证的预后测定法是基于抗体介导的捕获来分离CTC，并基于三种细胞荧光标记物来鉴定CTC。这种FDA认证的检测方法(CTC Test)使用缀合有针对上皮细胞粘附分子(EpCAM)的抗体的铁磁流体纳米颗粒，从血液中捕获CTC。然后使用荧光标记物DAPI(将核染色并将物体识别为细胞)、细胞角蛋白(CK)(将细胞鉴定为上皮细胞)和CD45(排除白细胞)来识别捕获的细胞。
已经引入了大量的替代血细胞分离方法。这些测定将分析范围扩大到捕获CTCs之外，囊括了循环癌症相关的巨噬细胞样细胞(CAMLs)、循环内皮细胞(CECs)、上皮间质转化(EMT)细胞、循环成纤维细胞(CFs)等。对于许多应用来说，通过对细胞进行鉴定和分型来对CTCs进行简单的分析物计数是不够的。无论分离平台如何，荧光检测是细胞鉴定的常用手段，且之前限于每个细胞总共4-5种荧光。这将基于荧光的细胞表征限制在三种上述鉴定生物标记物和1-2种其他的亚型生物标记物。在临床和生物学方面，这将研究人员限制在对细胞的粗浅的蛋白质组鉴定，而真正探究相关细胞表型需要多个亚型标记物。研究人员试图通过从同一患者收集多个生物样品来克服这个限制，例如，收集许多管血液并分析来自每个管的细胞的不同标记物。然而，细胞具有巨大的表型异质性，这使得来自不同采血管的各个细胞的染色无法进行比较。类似地，需要不止一个的组织活检切片才能分析五个以上的标记物。如果有快速且简单的方法使用多种标记物分析相同样品以增强诊断和治疗，将提供巨大的临床益处。
对疾病中的细胞进行鉴定和分类是复杂的，因为根据疾病的进展、疾病的传播和对疾病治疗的应答，不同的细胞亚群会上调和/或下调表型。例如，癌细胞能够向不同状态转变，比如，上皮至间质转变，或改变炎症免疫检查点的表达，这些都是肿瘤活动状态随癌症进展或对治疗响应而实时动态变化的实例。这些变化发生在许多疾病中，因此，循环细胞(例如CTC、CAML、CEC、EMT等)是唯一适合作为实时追踪疾病进展的可能的代表性替代生物标记物。
对超过4-5个标记物进行荧光染色的一个例子是经历EMT的CTC。这种现象在癌症患者血液中很常见，并且已经被认为是在转移扩散中的主要细胞成分。不幸的是，EMT没有普遍接受的生物标记物的阳性集合，并通常由上皮蛋白(例如EpCAM和CK)的下调以及间充质干细胞蛋白(如波形蛋白和CD34)的上调来描述。然而，EMT目前是一个值得关注的话题，因为蛋白质组学分析受限于有限的自由荧光通道，因此EMT分型通常使用非蛋白质组学方法进行筛选，例如，mRNA表达或DNA分析。
在生物样品的基于荧光的染色中，硼氢化物衍生物(例如，氰基硼氢化物和硼氢化锂)是用于减少背景自发荧光并且不损害蛋白质组/基因组标记物的常用试剂。有趣的是，虽然硼氢化物衍生物以前用于使活检显微切片中的荧光变暗，但并未用于完全去除特定的荧光染料信号。硼氢化物(BH4)是一种温和的选择性羰基还原剂，通常用于有机化学中将酮和醛还原成醇，和/或将亚胺还原成仲胺，而不会还原酰胺或羧酸官能团。在显微镜检查中，BH4衍生物通常用于淬灭固定生物样品中的甲醛和戊二醛的自发荧光。甲醛、戊二醛和许多其他固定剂在与生物样品(如组织，细胞，蛋白质等)发生反应时变成自发荧光。自发荧光是由于羰基化和席夫碱化合物在样品上的积累引起的。将BH4衍生物加入到固定的生物样品中的第二个益处是能够减少游离醛基(例如，醛封闭)，其进一步最小化组织化学试剂的非特异性结合。
令人惊讶的是，本发明发现生物样品可用至少25种不同的荧光标记物进行连续染色，并进行可视化用于精确的细胞学评估，这非常像经典的癌症组织病理分型。本发明提供了平台，其中生物细胞样品被原位固定，并依次用荧光标记物进行重新染色。在用4-5个荧光染料组进行第一轮染色后，对细胞进行成像、定位、标记和存档。标记细胞允许使用者在淬灭过程中的每一步之后重新定位相同的细胞。本发明包括一种将超过4-5个标记物染色的方法和试剂，涉及对细胞的淬灭、去衍生化、胺剥离和重新染色(QUAS-R)的步骤。在一个实施方式中，细胞在过滤器上分离，比如，CellSieveTM微过滤器(Creatv MicroTech)。重要的是，尽管用硼氢化物完全淬灭，但该技术仍保留了表位的完整性。在初始染色了DAPI和CTC标记物(CK和EpCAM)和CD45白血细胞标记物的胰腺癌患者样品上测试QUAS-R技术。目标是对细胞重新评估间充质干细胞标记物(CD34和波形蛋白)、运动标记物(CXCR4和波形蛋白)和炎症标记物(PD-L1和PD1)。本发明可以在相同的细胞样品上对这九种不同的表型癌症标记物依次进行分析、分型和追踪。
细胞样品可用4-5个荧光标记物一次染色并成像。已证明高达5次以上的重新染色。因此，可以在同一个细胞上评估>25个不同的标记物。
样品可被重新染色的次数限制取决于对样品的需求和安装以防止细胞损失。
本发明可应用于任何安装的生物样品(例如，从血液收集的细胞、组织活检、被病毒或细菌感染的细胞、从尿液收集的细胞、从脊髓液收集的细胞、从其他体液收集的细胞，术后切除的组织)并固定在任何可安装的基底上(例如玻璃、聚合物、金属)。
附图简介
图1.在硼氢化物溶液之前(图1a)和1.5小时以后(图1b)，荧光标记物在MDA-MB-231细胞上的荧光淬灭。比例尺的长度为10μm。
图2.每个荧光标记物在细胞上的信号强度比背景。图2a示出了标记物信号的平均强度。图2b示出了背景信号。图像尺寸是45μm x 45μm。
图3.示出了加入硼氢化物之后0、30分钟、60分钟和90分钟时细胞角蛋白阳性细胞的荧光淬灭。图像尺寸是45μm x 45μm。
图4.使用两轮QUAS-R的MDA-MB-231细胞。图4a示出了细胞角蛋白、EpCAM和CD45的初始染色。图4b示出了第一次QUAS-R之后对CD14、CXCR4和波形蛋白标记物重新染色的细胞。图4c示出了第二次QUAS-R之后对PD-L1、CD34和PD1标记物重新染色的细胞。图像尺寸是45μm x 45μm。
图5.第一轮、第二轮或第三轮染色中使用标记物染色时，信号强度的百分比变化的实验设计和代表性实例。图5a示出了使用三轮QUAS-R来染色细胞的代表性方法。图5b示出了无论染色次序如何，代表性信号强度都不表现出降解。
图6.在经历了2轮QUAS-R的5种不同细胞系(HUVEC、MDA-MB-231、A2058、LNCaP、MCF-7)上9种细胞标记物的总细胞信号强度和变化图表。在3轮QUAS-R之后，表面受体和细胞内标记物都没有降解。
图7.使用DAPI、抗CD14和抗CD34染色的HUVEC内皮细胞。
图8.图8a示出了MDA-MB-231上的EpCAM。白色箭头指向高表达EpCAM的细胞，而灰色箭头指向低表达的细胞。图8b是来自实施例2的EpCAM染色的放大图。
图9.患者衍生的EMT在QUAS-R之后证明了细胞分型和药物筛选的目标。图9a示出了对CK、EpCAM和CD45的初始染色。图9b示出了第一轮QUAS-R之后对CD14、CXCR4和波形蛋白的重新染色。图9c示出了第二轮QUAS-R之后对PD-L1、CD34和PD1的重新染色。图9d是以深灰色(100％)和白色(0％)表示的标记物百分比的不同标记物的热图。灰色阴影是从100％到0％阳性表达的百分比。VM＝波形蛋白，CK＝细胞角蛋白。图像尺寸是75μm x 75μm。
图10.描述了两轮QUAS-R以及不同的染色次序后的A2058细胞。图10a示出了使用CD14、CXCR4和波形蛋白的初始染色。图10b示出了被QUAS-R淬灭并使用细胞角蛋白、EpCAM和CD45染色的相同A2058细胞。图10c示出了又被QUAS-R淬灭并使用PD-L1、CD34和PD1染色的相同A2058细胞。
图11.示出了使用两轮QUAS-R的对LNCaP细胞的染色。图11a示出了对细胞角蛋白、EpCAM和CD45的初始染色。图11b示出了第一轮QUAS-R之后对CD14、CXCR4和波形蛋白的重新染色。图11c示出了第二轮QUAS-R之后对PD-L1、CD34和PD1的重新染色。
图12.示出了使用两轮QUAS-R对HUVEC细胞的染色。图12a示出了对CD14、CXCR4和波形蛋白的初始染色。图12b示出了第一轮QUAS-R之后对细胞角蛋白、EpCAM和CD45的重新染色。图12c示出了第二轮QUAS-R之后对PD-L1、CD34和PD1的重新染色。
图13.示出了使用两轮QUAS-R对MCF-7细胞的染色。图13a示出了对PD-L1、CD34和PD1的初始染色。图13b示出了第一轮QUAS-R之后对细胞角蛋白、EpCAM和CD45的重新染色。图13c示出了第二轮QUAS-R之后对CD14、CXCR4和波形蛋白的重新染色。
图14.在五种模式细胞系中的荧光标记物百分比热图。百分比表示为深灰色(100％)和白色(0％)。灰色阴影是从100％到0％阳性表达的百分比。
图15.图9d的热图示出了原始百分比。对总共764个EMTs，每个样品平均10个细胞，测定了九个标记物的存在。
发明概述
本文描述的具体实施方式仅代表本发明的原理，并不旨在限于所公开的实施方式。
发现QUAS-R技术可用于快速并依次染色细胞系，可使用至少25种不同的荧光标记物以及DAPI。在一个实施方式中，将MDA-MB-231细胞固定在滤器上并使用CTC标记物组合进行染色：DAPI(蓝色)、CK(绿色)、EpCAM(红色)和CD45(蓝紫色)。图1a。使用硼氢化物溶液将细胞淬灭1.5小时。在MDA-MB-231细胞上的100％的CK的绿色、EpCAM的红色、CD45的蓝紫色以及大部分的DAPI的蓝色，荧光信号都被去掉了。图1b。在显微镜上进行图像采集的曝光时间在淬灭之前和之后是相同的。
将细胞的信号强度与背景进行比较。图2。图2a显示了每个荧光通道中MDA-MB-231细胞的图像。使用Zen2011 Blue软件测量信号的平均强度。将每个荧光通道的信号与没有细胞的过滤器上的区域进行比较以确定背景。图2b。通过从细胞信号中减去背景信号来计算每个细胞的整体染色强度。
在第二个实施方式中，对用FITC标记的细胞角蛋白抗体染色的患者样品使用淬灭技术。对细胞进行成像并且在加入硼氢化物溶液之前的时间0时测量信号。加入硼氢化物溶液，并在30分钟、60分钟和90分钟后对细胞成像。90分钟后，99％的初始荧光被淬灭。
在其他实施方式中，采用基于血液的活检(BBB)或其他生物样品来分析具有许多不同标记物的多种细胞类型(例如CTC、CAML、内皮细胞、成纤维细胞等)。当在乳腺、内皮、前列腺和黑素瘤来源的五种细胞系(MDA-MB-231、MCF-7、LNCaP、A2058和HUVEC)上进行QUAS-R时，表位完整性得以维持。图4、5和6。
由于免疫组织化学(IHC)基于细胞内和细胞外的表位进行癌症分型，因此本发明以在细胞内(细胞角蛋白和波形蛋白)和细胞外(EpCAM、CD45、CD31、CD34、PD-L1、CXCR4和CD14)具有广泛细胞定位的九种标记物为例。在一个实施方式中，将MDA-MB-231细胞固定在过滤器上并使用CTC染料细胞角蛋白、EpCAM和CD45进行染色：图4a。通过QUAS-R方法淬灭细胞并使用CD14、CXCR4和波形蛋白染色。图4b。再次通过QUAS-R方法淬灭细胞并使用PD-L1、CD34和PD1染色。图4c。
在一个实施方式中，将五种细胞系(A2058、LNCaP、MDA-MB-231、MCF-7和HUVEC)固定在过滤器上并以不同次序对九种不同标记物进行染色。图5。用一套过滤器，每个都带有五种细胞系中的一种，使用CTC标记物(与FITC缀合的针对CK的抗体(CK-FITC)，与PE缀合的针对EpCAM的抗体(EpCAM-PE)和与Cy5缀合的针对CD45的抗体(CD45-Cy5))进行染色。在第二套过滤器上，将五种细胞系用由PD-L1-FITC、CD34-PE和PD1-Dylight 650组成的组进行染色。在第三套过滤器上，将五种细胞系用由CD14-FITC、CXCR4-PE和波形蛋白-efluor660组成的组进行染色。图5a。确定背景信号并将每个标记物(每个标记物平均10个细胞)的强度进行归一化。然后，在所有过滤器上进行QUAS-R，并用第二个标记组对每套重新染色。图5a。对所有细胞类型测量每个标记物的强度并用背景进行归一化。图6。进行第二次QUAS-R，每套过滤器用第三个标记组重新染色。图5a。无论进行染色的次序如何，信号强度都不会降解。重复测量的ANOVA显示在三种次序染色[波形蛋白MDA-MB-231(p＝0.201)，细胞角蛋白LNCaP(p＝0.291)，CD14 HUVEC(p＝0.499)和CXCR4 MDA-MB-231(p＝0.857)]之间的信号强度无明显差异。
图6中显示了经历了QUAS-R的五种细胞系上的九种细胞标记物的总细胞信号强度和变化。在任何一轮QUAS-R中，表面受体和细胞内标记物都没有降解。使用具有Zen Blue成像软件的荧光显微镜对细胞进行成像。每个细胞的信号平均像素强度由软件给出，范围为0-4096。每个图像的本地背景的信号平均像素强度由软件给出，范围为0-4096。如果细胞像素的强度至少是本地背景像素强度的两倍，则认为信号为阳性的。高阳性信号通常被认为是背景的四倍细胞强度。根据荧光染料、立方过滤器、显微镜和曝光时间的不同，比例可能会稍有变化。图6a显示所有细胞系中PD-1为阴性。图6b显示CD34在HUVEC细胞系中呈弱阳性，并且因此表现为总体信号低。图6c显示所有细胞系中CD45为阴性。图6d显示PD-L1是有差异的，因为标准偏差(SD)大，但主要在A2058和MDA-MB-231细胞中表达。图6e显示CD14仅在HUVEC中为阳性并且差异很大，因为其仅在细胞上的突起中表达。此外，CD14信号定位于HUVEC子集的周边突起(图7)，导致细胞内部低/无信号。图6f显示EpCAM在LNCaP、MCF-7和MDA-MB-231上作为差异表达的表面标记物存在。总信号较低是由标记物的定位导致的。EpCAM看起来表达量低且SD高，因为信号在细胞之间高度不均一，且受体聚集在细胞表面，导致细胞具有高信号和低信号区域。图8。图6g显示细胞角蛋白在LNCaP、MCF-7和MDA-MB-231细胞中以细胞内丝的形式存在。图6h显示CXCR4是一种高度可变的表面标记物，主要存在于MDA-MB-231和HUVEC细胞中。CXCR4已被正确定位于MDA-MB-231细胞，尽管在高度变化的细胞群中SD很大。图6i显示波形蛋白在HUVEC、MDA-MB-231和A2058细胞中以细胞内丝的形式存在。
PD-L1和波形蛋白均在正确的细胞系(MDA-MB-231：高波形蛋白/高PD-L1，A2058：高波形蛋白/高PD-L1和HUVEC：高波形蛋白)显示强染色，在正确的细胞系(HUVEC：无PD-L1，LNCaP：无波形蛋白/低PD-L1和MCF-7：无波形蛋白/低PD-L1)中显示低/无染色，而细胞角蛋白染色的MCF-7 MDA-MB-231和LNCapP显示强染色。重要的是，没有一种生物标记物在两次重新染色之间强度下降，并且在每种适当的细胞系中呈现具有适当的染色强度。图6。可能的例外是PD-L1，其在第三次染色期间没有呈现倾斜下降，但是是在SD内。综上所述，这些实验证明QUAS-R提供荧光标记细胞的完全淬灭，并能够重新染色生物标本，而不会不利地影响其表位的质量。
另一个实施方式为EpCAM表达的可变性，表现在MDA-MB-231细胞中。图8。在图8a中，白色箭头指向高表达EpCAM细胞，而灰色箭头指向低表达细胞。图8b示出了来自第二组的EpCAM信号的放大图像。EpCAM在整个细胞中是弥漫性和点状的，导致总细胞信号强度在数值上看起来较低。
患者样品
已经显示，标准CTC荧光染色组可以像FDA批准的系统那样鉴定、量化和评分同样的临床预后CTC。然而，本发明还能够鉴定许多其他亚型的EMT，包括具有下调的细胞角蛋白信号和无EpCAM信号的细胞。尽管上皮标记物的下调是癌症中EMT的标志，但通过上调的间充质标记物进行额外的确认对于恰当地反映它们的干细胞和运动特征是至关重要的。
在一个实施方式中，将来自胰腺癌患者的血液样品过滤，将过滤器上收集的细胞用EMT标记物组(CK和波形蛋白)和CD45染色，并进行成像。在78％的胰腺样品中(无论哪个阶段)均发现EMTs，而对照样品均未检测到EMTs、CAMLs或CTC阳性信号。癌症患者样品总共有764个EMT，平均每个样品10个细胞。对所有癌症样品进行QUAS-R以检测9个标记物的存在。图9a示出了来自IV期胰腺样品的CK、EpCAM和CD45的表达谱。用抗CD14、抗CXCR4和抗波形蛋白对细胞重新染色并重新成像。图9b。对所有细胞成像后，进行第二次QUAS-R，并用抗PDL-1、抗CD34和抗PD-1对样品重新染色。图9c。每个标记物的存在表示为每种染色阳性的EMTs百分比的热图。图9d。热图显示以深灰色(100％)和白色(0％)显示的百分比。灰色阴影是从100％到0％阳性表达的百分比。
不出所料，所有EMTs都是CK阳性、CD45阴性的，CD14和PD-1在所有EMTs中也都是阴性的，因为这些分别是巨噬细胞和激活的T细胞的标记物。EpCAM在这种细胞类型中非常罕见，只发生在2％的细胞群中。图9d。EMT中没有EpCAM是EMT过程中公认的部分。波形蛋白是第二最普遍的标记物，并且在除三个细胞之外的所有细胞中发现，或在全部细胞的99％中发现。这并不奇怪，因为据报道EMT过程会下调细胞角蛋白并上调波形蛋白。该过程已被证明可增加细胞的间充质表型，并使细胞获得更好的运动。一些患者中CXCR4的普遍存在表明这些间充质细胞是迁移性的。PD-L1和CXCR4的表达在患者之间高度异质性，PD-L1的阳性率为100％至0％，CXCR4的阳性率为90％至0％。此外很少发现CD34，三名患者中只有五个细胞呈弱阳性。
使用标准的CTC荧光染料，根据细胞角蛋白、EpCAM和CD45的存在来鉴定、定量和评分EMT。从患者样品的循环细胞对EMT的鉴定，显示出QUAS-R技术用于诊断和治疗目的的能力。
这些实验表明生物样品中的细胞可进行重新成像并用多个免疫靶标进行分型，且可对这些标记物进行定量和评分。不同于经典的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)中的多组IHC测试，即：用生物样品的多个不同切片进行的组织活检，QUAS-R方法允许对同一生物样品用多种生物标记物重新染色。
发明详述
获得生物样品可能是困难的，并且当仅使用2-3个阳性荧光标记物和1个阴性荧光标记物时，临床上重要的生物标记物充其量只是表面上确定的,，这限制了其他的分类标记物。当前实践中使用经典的组织活检来测试关于潜在生物学的临床信息，这需要测试来自相同生物样品的不同切片(例如FFPE切片)。例如，在癌症病理学中，IHC是使用从大型FFPE活检组织切片切下的薄片(～5-10μm)完成的标准生物测定。但是，FFPE切片不完全相同，因此每种染色剂都施用于不同的细胞。在各自具有不同细胞群的多个切片上使用多种分型标记物染色，并不能提供诊断和治疗所必需的一致结果。另一方面，血液活组织检查(BBB)通常仅分离少数相关细胞类型，因此大多数样品(74％)中经含有少于两种的关键诊断细胞类型(例如CTC、CEC等)(0-81个CTC/7.5ml样品)。在这两种情况下，既需要鉴定细胞的类型，又需要对它们进行蛋白质组学分型以获得临床相关的标记物。
EMTs(具有低的细胞角蛋白和低/无EpCAM的细胞)通常从乳腺癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌中分离。然而，通常需要关于患者的癌症的其他信息，这就需要染色其他的标记物。由于多个生物标记物的探究对于恰当地鉴定EMT是必需的，且对于EMT没有单个的生物标记物组，所以需要用一组EMT指示性生物标记物来测试这些细胞才能准确诊断。过去，需要多管血液才能获得用于染色超过4-5个标记物的EMT。
生物样品分析技术难度不可低估。例如，组织活检用于检测癌细胞的存在并执行药物靶标的伴侣诊断。对于免疫治疗，需要使用适当的标记物进行其他的检测以表征任意肿瘤，并分析肿瘤微环境中T细胞和巨噬细胞的存在。为了准确鉴定肿瘤细胞，对药物靶标进行染色，并评估肿瘤微环境，需要使用多片FFPE样品进行多种生物标记物染色。可用于测试的活检组织样品的数量通常是有限的，并且不允许使用超过4-5个生物标记物染色。使用9-25种临床适用的生物标记物对FFPE组织或任何生物样品进行依次的多组重新染色，提供了关于存在的细胞亚型的更大量的信息。
另一个实施方式涉及分析患者血液中的癌症相关细胞。在分析血液样品中的CTC时的一个技术难题是它们的稀少性。由于来自癌症患者的血液样品通常是每109个血细胞含有～1个CTC，因此过去这限制了对细胞的详细分析。必须用DAPI荧光鉴定CTC，用细胞角蛋白鉴定CTC并且用CD45以排除白细胞；仅留下1-2个可用于蛋白质组分型的通道。已经报道了超出标准标记物(DAPI、EpCAM、CK和CD45)的CTC的其他染色，但是这种染色主要限于1-2个其他的标记物。检查从同一患者的重复或多个样品中分离的CTC可提供一定程度的复合，然而，由于血液中的肿瘤细胞很少、非常异质化且分布不均匀，因此这种方法不能产生一致且可靠的结果。血样中CTC的集群导致仅有39％的CTC被计数，这与在高度异源的胰腺癌组织活检中观察到的CTC集群相当。如图9所示，胰腺癌细胞之间的强度差异可以在细胞角蛋白、EpCAM、CXCR4、波形蛋白、PD-L1和CD34中观察到。QUAS-R技术使得通过使用9-25种不相关的荧光抗体，以简单廉价的淬灭和重新染色方法，扩大了对血液样品的蛋白质组学细胞分型。
除了CTC以外，许多重要的细胞类型存在于癌症患者的血液中。例如，CAML是循环肿瘤来源的细胞，具有许多潜在的临床应用，包括早期癌症检测。一贯出现在CAML上的标记物包括CD14、CD34、CD146、CD11c等。循环EMTs可通过荧光染色的波形蛋白一致地鉴定。因此，使用QUAS-R用一大组各种标记物进行染色，对于改善患者血液中存在的所有感兴趣的细胞的鉴定至关重要。
最近，表明在可光活化荧光团上的部分BH4淬灭不会改变被淬灭的蛋白质，并且与高分辨率显微镜兼容。硼氢化物的这些属性使用任意和所有硼氢化物的衍生物(例如硼氢化钠、硼氢化锂、氰基硼氢化物等)都可以说明，并且也说明其非常适合暂时减少来自生物样品的荧光信号而不用担心破坏表位。然而，现有技术仅使荧光稍微暂时变暗，并未完全去除荧光。QUAS-R技术涉及使用硼氢化物对特定的荧光素进行永久性淬灭，这也没有表位损伤。可从结合的抗体中去除总IHC特异性荧光，而不破坏IHC表位的可视化或定量。硼氢化物溶液也可去除残留的背景荧光，并能疏通任何被封闭的表位。使用这种方法以及任何有机染料(例如，氟、纳米晶体等)已使至少六种单独的共轭荧光剂(alexafluor488、FITC、efluor 615、efluor 660、PE、APC和青色素5)完全变暗。实施例描述了在BBB上使用QUAS-R，然而，该方法适用于涉及固定或未固定样品的任何生物测定。
实施例表明EMT全部都表达CK，而且大多数表达波形蛋白。当然，EMT是一个由多个分子和蛋白质组通路定义的瞬时过程，并非所有这些都已被完全鉴定。能够使用多种细胞标记物进行染色，使得能够阐明已经开始EMT过程的CTC的潜在生物学(例如，低/阴性CK和EpCAM)，同时证实所述细胞最初不是造血细胞(CD45)或骨髓样细胞(CD14)谱系。生物标记物组现在可扩展到包括所有已知的生物细胞类型和标记物类型。对于EMTs，这些组可包括其他标记物，如N-钙粘蛋白、TWIST、SNAIL、ZEB1。QUAS-R方法使用手动鉴定和AxioVision’Mark和查找模块的组合。然而，其可适应全自动系统来简化流程。不管是自动化或手动，能够使用多种鉴定和分类的生物标记物来筛选超出基本识别能力的生物样品，而无需过量采样或使用不匹配的样品切片，这大大提高了诊断准确性和临床效用。
实施例
实施例1
健康人和患者血液样品
从2012年至2013年，在威斯康星医学院从正在积极接受I-IV期胰腺癌治疗的患者中抽取12个外周全血样品。根据威斯康星医学院当地机构评审委员会(IRB)的要求收集样品，患者签署知情同意书。将所有血液样品吸入CellSave防腐管TM(约9mL，JanssenDiagnostics)并运送至临床核心实验室进行处理。在研究完成前，来自机构的结果和患者身份不被共享或传播。所有患者样品首先用标准抗体混合物标记以用于染色上皮细胞，所述上皮细胞由FITC标记的抗细胞角蛋白8、18、19，r-藻红蛋白(PE)标记的抗EpCAM和青色素5标记的抗CD45组成。
获得来自匿名健康志愿者(n＝12)的血样，有书面的和签署的知情同意书。知情同意书符合西方机构评审委员会的要求。供体血来自在血液采集中心使用标准的排除条件，例如，所有样品都是来自正常健康的个体。将血液样品吸入CellSave防腐管并运送至临床核心实验室进行处理。
实施例2
CTC染色程序在CellSieveTM过滤器上执行。
使用低压真空系统用CellSieveTM CTC计数试剂盒(Creatv MicroTech)过滤样品，所述低压真空系统基于尺寸排阻(～7微米)分离CTC。使用CTC计数染料对细胞进行染色和荧光鉴定(实施例4)。使用带有CellSieveTM过滤器的过滤器支架组件创建低压系统。将外周血(7.5ml)在预固定缓冲液中稀释并通过过滤器。洗涤过滤器，用CellSieveTM后固定缓冲液进行后固定，并使用CellSieveTM预透化缓冲液进行透化过滤。用由FITC-抗细胞角蛋白8、18、19，PE-抗EpCAM和Cy5-抗CD45组成的抗体混合物将捕获的细胞染色1小时，并用Fluoromount-G/DAPI(Southern Biotech)进行固定。使用带Carl Zeiss AxioCam的Olympus BX54WI荧光显微镜对样品成像。对于细胞之间的相同信号比较，曝光预设为2秒(青色素5)、2秒(PE)、100-750毫秒(FITC)和10-50毫秒(DAPI)。使用带有AxioVision Mark和查找模块的Zen2011Blue(Carl Zeiss)处理图像、标记细胞的x/y位置，并以半自动方式重新定位以前成像的细胞。将样品存档并在4℃下储存一周至两年。
实施例3
细胞系。
从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚)购得MCF-7(HTB-22)和MDA-MB-231(HTB-26)人乳腺癌细胞系、LNCaP(CRL-1740，克隆FGC)前列腺癌、A2058(CRL-11147)人皮肤黑色素瘤细胞系和HUVEC-C(CRL-1730)内皮细胞。如ATCC推荐的，所有细胞系在含有胎牛血清(FBS)的细胞系特异性培养基中生长。使用规定的细胞培养条件(5％CO2，37℃)在T-75烧瓶中维持细胞系，每3-4天更换培养基，除MDA-MB-231细胞系之外，其在37℃生长不添加CO2。使用胰蛋白酶-EDTA(ATCC马纳萨斯，弗吉尼亚)收集细胞，以125×g离心5分钟，于含有1％多聚甲醛的PBS中重悬细胞。孵育后，将细胞稀释于10倍体积的PBS中，离心并重悬于新鲜PBS中，然后掺入正常血液中并在5分钟内使用微过滤器分离。
实施例4
其他标记物组
标记物通过针对标记物的抗体来鉴定。通过与荧光标记的抗体在室温下孵育1小时使样品染色。初级CTC组：FITC标记的抗细胞角蛋白8、18、19，r-藻红蛋白(PE)标记的抗EpCAM和青色素5标记的抗CD45(Creatv MicroTech)，第二组：Alexafluor 488标记的抗PDL1(2.5ug/mL)和Dylight 650标记的PD-1(5ug/mL)，PD-L1和PD-1均由MD Anderson癌症中心的Steven Lin博士赠与，PE标记的CD34(2.5ug/mL，克隆4H11)，和第三组：FITC标记的抗CD14(5ug/ml，克隆61D3)、PE标记的抗CD184(5ug/ml，克隆2B11)、efluor660标记的抗波形蛋白(2.5ug/ml，克隆V9)。
使用带Carl Zeiss AxioCam的Olympus BX54WI荧光显微镜对样品成像。对于细胞之间的相同信号比较，曝光预设为2秒(青色素5和APC)、2秒(PE)、1000毫秒(FITC和Alexafluor 488)、500毫秒(efluor 660)和10-50毫秒(DAPI)。使用Zen2011Blue(CarlZeiss)处理图像、标记细胞的x/y位置，并重新定位以前成像的细胞。
实施例5
1.过滤器上细胞的荧光淬灭(QUAS-R)
在初始CTC染色后一周至两年时，将归档的样品从存储中去除。在淬灭过程之前，样品此前已被染色、成像并标记。将切片浸入100mL 1X PBS中15分钟并小心拆卸。将过滤器放入反应室(Corning)中并用1mL 1X PBS洗涤5次。
淬灭：将具有结合细胞的过滤器与1mg/ml硼氢化钠溶液(Fisher Scientific)一起在室温下在化学通风橱中孵育1小时。除去硼氢化物溶液，用1ml 1X PBS洗涤滤器六次。
去衍生化和胺剥离：在醛固定期间，固定剂中的聚合物反应并交联蛋白质。随着样品老化，聚合物降解并且各种聚合物衍生物形成。去衍生化是一个术语，用来描述去除各种聚合物衍生物。醛固定(如戊二醛或福尔马林)与胺和蛋白质反应引起自发荧光。胺剥离洗掉游离和反应的胺以及与它们相关的自发荧光。这些步骤包括(a)将过滤器置于干净的反应室(Corning)中，并在室温下用100mM Tris pH＝9.0孵育1小时以除去硼氢化物和(b)通过用1ml 1X PBS洗涤过滤器三次以除去Tris。
重新染色：将1XPBS/20％FBS添加到室中以封闭细胞30分钟。孵育后，除去PBS/FBS溶液。将下一组抗体染色剂在室温下加入室中1小时。抗体孵育后，将过滤器在1X PBS/1％Tween中洗涤，并将切片用Fluoromount-G/DAPI(Southern Biotech)固定。
样品沿x/y轴取向，此前成像的细胞使用荧光显微镜和软件，如Zen2011 Blue(Carl Zeiss)软件，重新定位。如上所述预设图像和曝光，并使用Zen2011Blue(CarlZeiss)处理图像。在细胞上对荧光标记物成像后，用下一个抗体混合物重复QUAS-R程序并重新成像。对于涉及荧光淬灭可视化的时间门控实验，将过滤器置于通风橱中的荧光显微镜(比如Olympus)下，并将过滤器保留在硼氢化物溶液中进行成像。
2.固定在载玻片上的细胞荧光淬灭(QUAS-R)或活组织检查
在最初荧光染色后一周至两年时，将存档的活检样品从存储中去除。在淬灭过程之前，样品此前已被成像并标记。将切片浸入100mL 1X PBS中15分钟。用1mL 1X PBS将切片洗涤5次。然后在化学通风橱中室温下将切片涂布或浸入含有1mg/mL硼氢化钠溶液(FisherScientific)的科普林氏缸中1小时。除去硼氢化物溶液，用1ml 1X PBS洗涤切片六次。将切片置于干净的科普林氏缸中，并在室温下用100mM Tris pH＝9.0孵育1小时。除去Tris，将切片用1ml PBS洗涤三次并置于含有1XPBS/20％FBS的科普林氏缸中30分钟。孵育后，除去PBS/FBS溶液，并将下一组抗体染色剂在室温下加入活检样品中1小时。抗体孵育后，切片在1X PBS/1％Tween中洗涤，切片用Fluoromount-G/DAPI(Southern Biotech)固定。样品沿x/y轴取向，此前成像的细胞使用荧光显微镜和软件，如Zen2011 Blue(Carl Zeiss)软件，重新定位。如上所述预设图像和曝光，并使用Zen2011 Blue(Carl Zeiss)处理图像。在细胞上对荧光标记物成像后，可用另一个抗体混合物重复QUAS-R程序并重新成像。
实施例6
依次筛选细胞系中的生物标记物
每个细胞系被单独过滤到微过滤器上，并且每个细胞类型(n＝3)用抗体组1(CK，EpCAM和CD45)、抗体组2(PD-L1，CD34和PD-1)或抗体组3(CD14，CXCR4和波形蛋白)染色。图5a。成像和标记后，如上所述，通过QUAS-R方法淬灭每个单独的过滤器，然后用第二抗体组重新染色，即，第1套过滤器最初用CK、EpCAM和CD45染色，然后用抗体组2(PD-L1，CD34和PD-1)染色；第2套过滤器最初用PD-L1、CD34和PD-1染色，然后用抗体组3(CD14，CXCR4，波形蛋白)染色；以及第3套过滤器最初用CD14、CXCR4和波形蛋白染色，然后用抗体组2(CK，EpCAM和CD45)染色。所有最初标记的细胞都被找到并重新成像。
对所有细胞系成像后，在每套滤器和细胞系上进行第二次QUAS-R。这次第1套过滤器用抗体组3重新染色、第2套过滤器用抗体组1重新染色，并且第3套过滤器用抗体组1重新染色。再次，所有最初标记的细胞都被找到并重新成像。
虽然本发明是针对特定实施方式和实施例进行描述的，但是本发明的概念可以广泛应用。
其他疾病和病症具有可以使用QUAS-R技术分析的感兴趣的细胞和/或组分。含有活性或无活性病毒感染、病毒成分、细菌感染、细菌成分以及其他疾病和疾病成分的细胞也可在血液和组织中找到。每种疾病或病症的标记物会有所不同，因此需要对不同的生物标记物染色。
亲和组分不限于如实施例中所述的抗体。其他常见的亲和组分，比如适体、凝集素、蛋白质、酶等，也可用于QUAS-R技术。
细胞也存在于各种体液中，包括但不限于血液、尿液、骨髓、淋巴组织、脑脊液、羊水、胆汁、唾液、痰、腹水、胸腔积液、宫颈阴道液、卵巢囊液、子宫内膜液、子宫灌洗液、淋巴积液。本发明所述的QUAS-R技术也可用于筛选这些体液中的不同细胞和生物标记物。
可使用任何硼氢化物衍生物来淬灭样品(例如，硼氢化钠、硼氢化锂、氰基硼氢化物、四正丁基硼氢化铵，苄基三乙基硼氢化铵等)。上述淬灭实施例使用了衍生的硼氢化钠，但其他衍生物也可以很好地发挥淬灭作用。
QUAS-R技术可用于任何含有细胞的生物样品。生物样品的示例包括但不限于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织、漂浮细胞、血细胞、癌细胞、病变细胞、来自不同器官的组织、淋巴细胞、毛发、皮肤、骨髓等。CTC只是用于说明这一过程的细胞的一个例子，并不限制其应用。
QUAS-R技术也可用于固定在基底上的样品。基底的类型包括但不限于玻璃、金属、聚合物、塑料、纸张、纤维材料等。
a.上述淬灭步骤描述了固定在聚合物上的细胞的应用。该过程可用于在其上固定生物样品的所有材料。
b.QUAS-R技术可以施用于在溶液中的、没有固定在基底上的细胞。
c.该技术可施用于固定在载玻片上的FFPE样品。
QUAS-R技术可用于淬灭由老化引起的带自发荧光的旧样品。老化可能导致荧光剂降解。老化也会导致亲和组分(例如，抗体、适体、凝集素、蛋白质、酶等)的降解。
a.这包括固定或未固定的样品。
b.除了淬灭特定的荧光之外，老化的样品还有其他的非特异性荧光需要淬灭。
c.非特异性荧光在该过程中也被淬灭。
d.必须淬灭此前未染色的样品以除去背景荧光和自然发生的自发荧光。
e.固定的生物样品或老化的样品具有可能被化学修饰或三级结构改变而封闭的表位。除了淬灭之外，硼氢化物还有一个作用就是它具有疏通表位以重新染色的能力。
QUAS-R方案已被证实可重新染色多达5次。在样品上施用QUAS-R次数的限制取决于对样品的需求和安装以防止细胞损失。
试剂的类型和浓度、孵育时间以及执行QUAS-R步骤的方案会因样品类型而异。

Claims (20)

1.一种对生物样品的生物标记物重新染色的方法，所述方法包括：
a.使用还原剂来淬灭荧光；
b.去衍生化和胺剥离；以及
c.使用一个或多个其他荧光标记物来对所述样品重新染色。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品此前已被一种或多种荧光标记物染色。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品此前未被荧光标记物染色并且已储存至少一周。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其进一步包括：
a.将所述样品固定在表面上；以及
b.可视化所述生物标记物。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述还原剂是硼氢化物衍生物，其选自硼氢化钠、硼氢化锂、氰基硼氢化物、四正丁基硼氢化铵和苄基三乙基硼氢化铵。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述硼氢化物是硼氢化钠。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物标记物选自基本由细胞、病毒组分、细菌组分和疾病组分组成的组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞选自组织、血液中的癌症相关细胞、CTC、EMT、CAML、CEC、血细胞、淋巴细胞、毛细胞、皮肤细胞和骨髓细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述癌症细胞是人癌症细胞。
10.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述生物样品选自血液、尿液、骨髓、淋巴组织、脑脊液、羊水、胆汁、唾液、痰、腹水、胸腔积液、阴道液、卵巢囊液、子宫内膜液和淋巴积液。
11.一种筛选生物样品中的生物标记物的方法，所述方法包括：
a.使用还原剂来淬灭荧光；
b.去衍生化和胺剥离；以及
c.使用一个或多个其他荧光标记物来对所述样品重新染色。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物样品此前已被一种或多种荧光标记物染色。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物样品此前未被荧光标记物染色并且已储存至少一周。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述还原剂是硼氢化物衍生物，其选自硼氢化钠、硼氢化锂、氰基硼氢化物、四正丁基硼氢化铵和苄基三乙基硼氢化铵。
15.根据权利要求12或13所述的方法，其进一步包括：
a.将所述样品固定在表面上；以及
b.可视化所述生物标记物。
16.一种表征生物样品中的生物标记物的方法，所述方法包含括：
a.使用还原剂来淬灭荧光；
b.去衍生化和胺剥离，以及
c.使用一个或多个其他荧光标记物来对所述样品重新染色。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物样品此前已被一种或多种荧光标记物染色。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物样品此前未被荧光标记物染色并且已储存至少一周。
19.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括：
a.将所述样品固定在表面上；以及
b.可视化所述生物标记物。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述还原剂是硼氢化物衍生物，其选自硼氢化钠、硼氢化锂、氰基硼氢化物、四正丁基硼氢化铵和苄基三乙基硼氢化铵。
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