CN103589629A

CN103589629A - 循环肿瘤细胞分离系统

Info

Publication number: CN103589629A
Application number: CN201310571949.2A
Authority: CN
Inventors: 李小卫
Original assignee: SHANGHAI KANGWEI HEALTH TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI KANGWEI HEALTH TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明属于生物及医学检测领域，涉及一种将血液样品中的循环肿瘤细胞从混合细胞群体中高纯度分离出来的系统。所述循环肿瘤细胞分离系统，包括样品准备模块、进样模块、第一微流控芯片、释放模块和收集模块，所述样品准备模块用于将血液处理为检测样品，所述进样模块用于将检测样品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取检测样品中的循环肿瘤细胞，所述释放模块用于使循环肿瘤细胞脱离第一微流控芯片获得采集样品，所述收集模块用于收集采集样品。本发明提供的技术方案与现有技术相比，具有系统简单，易于实现；成本更低；操作简单，自动化程度高。

Description

循环肿瘤细胞分离系统

技术领域

本发明属于生物及医学检测领域，涉及一种将血样中循环肿瘤细胞从混合细胞群体中高纯度分离出来的系统。

背景技术

稀有细胞是指生物样本中存在的数量稀少却具有重要生物学功能或临床检测意义的细胞，如人外周血中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、被病毒感染的细胞，孕妇外周血中的胎儿细胞，以及实体肿瘤中的肿瘤干细胞等。由于稀有细胞数量极其稀少，在大量背景细胞的干扰下通常无法直接进行检测，因此必须发展高效、快速的将稀有细胞从复杂生物样本中分离出来的方法与设备。

人外周血中的循环肿瘤细胞（CTC）是一类具有代表性的稀有细胞，它是指自发或因诊疗操作由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶（Racila E,Euhus D,Weiss AJ,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,4589-4594;Pantel K,Brakenhoff RH,Nat.Rev.Cancer2004,4,448-456;Zhe XN,Cher ML,Bonfil RD,Am.J.Cancer Res.2011,1,740-751;Butler TP,Gullino PM,Cancer Res.1975,35,512-516）。由于超过90%的癌症死亡是由转移造成的（Mehlen P,Puisieux A,Nat.Rev.Cancer2006,6,449–458），而循环肿瘤细胞是肿瘤转移灶的直接来源（Dawood S,Cristofanilli M,Curr.TreatOptions Oncol.2007,8,89-95;Fidler IJ,Nat.Rev.Cancer2003,3,453–458），因此循环肿瘤细胞是一种具有重大生物学意义和临床价值的稀有细胞，从血液中检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。但是，循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每10mL血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有高达约1亿个白细胞和500亿个红细胞（Zhe XN,Cher ML,Bonfil RD,Am.J.Cancer Res.2011,1,740-751），在数量巨大的背景细胞的干扰下无法对循环肿瘤细胞直接检测，这种检测包括基因突变、表面标志物、细胞活性、分泌蛋白谱以及力学性质等，所以将循环肿瘤细胞从外周血中分离出来成为循环肿瘤细胞检测前的必须的步骤。

国际上已有多家公司致力于开发循环肿瘤细胞分离与分析系统，其中唯一被美国食品药品管理局（FDA）批准的产品是强生公司的CellSearch^TM系统被批准用于转移性乳腺癌、结直肠癌与前列腺癌的预后评估、无进展生存期和总生存期的预测。我国国家食品药品管理局在2012年8月批准CellSearch^TM系统用于乳腺癌的预后评估。CellSearch^TM系统通过免疫磁珠从血液中捕获CTC，并通过对细胞核以及细胞表面标志物的多重染色进行确认并计数，然后根据7.5毫升外周血中检测到的循环肿瘤细胞的数目进行预后评估。其他开发循环肿瘤细胞分离与分析系统的公司包括Rarecell（德国）、ScreenCell（法国）、Abnova（中国台湾）、Clearbridge（新加坡）、Cytotrack（美国）、Cynvenio Biosystems（美国）、ApoCell（美国）、FLUXION（美国）、Epic Science（美国）、Silicon Biosystems（意大利）、AndaGen（德国）等。

目前从人外周血中分离循环肿瘤细胞的方法主要可分为两类，这两类方法同时也代表了从复杂生物学样品中分离稀有细胞的主要策略。一类方法是基于循环肿瘤细胞与血液中其他细胞物理性质的差异，如密度、大小、软硬程度等的不同实现循环肿瘤细胞与其他细胞的分离；另一类方法主要基于循环肿瘤细胞与血液中其他细胞表面标志物的差异，基于循环肿瘤细胞表面的特异性抗原，通过固定在基底表面或磁性颗粒上的针对循环肿瘤细胞表面特异性抗原的抗体或核算适配体实现循环肿瘤细胞的特异性捕获并与血液中其他细胞实现分离。CellSearch系统对循环肿瘤细胞的分离就是基于这种方法。

近年来通过将微流控技术与抗体捕获相结合发展出了一系列的循环肿瘤细胞芯片捕获技术，可以保持CTC的活性，为了提高其微通道的捕获效率，目前的研究重点均集中在微通道表面的形状上，如微柱阵列芯片（Nagrath S,SequistLV,Maheswaran S,et al.Nature2007,450,1235-1239;Maheswaran S,Sequist LV,Nagrath S,et al.N.Engl.J.Med.2008,359,366-377）、表面具有周期性凹凸结构“鱼骨型”芯片（Stott SL，Hsu C-H,Tsukrov DI,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,18392-18397）等。

但是，以上技术和系统目前仍存在以下缺陷：

1）捕获到循环肿瘤细胞的纯度较低，存在大量白细胞的非特异性吸附，需要通过特异性染色鉴别循环肿瘤细胞，耗时且容易出现假阳性；

2）捕获到的循环肿瘤细胞往往被固定在芯片表面，无法释放进行后续的检测。

发明内容

目前，我们研发出了一种能够解决以上问题的分离方法：主要是对捕获抗体进行修饰，具体是标记上标记多核苷酸形成抗体-单链标记多核苷酸复合物，微流控芯片内负载有与标记多核苷酸互补的单链固定多核苷酸。抗体与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原结合，标记多核苷酸与固定多核苷酸特异性结合形成稳定的双链核苷酸结构，从而从样品中捕获循环肿瘤细胞并固定到微流控芯片的微通道表面。所述标记多核苷酸或固定多核苷酸中包含光敏基团，在一定波长的紫外光照射下即可断裂，因此在原有分离方法的基础上，通过紫外光照射切断双链核苷酸来释放被固定在微通道表面的循环肿瘤细胞，并进行收集。增加的释放模块使循环肿瘤细胞的后续检测成为可能，另外通过捕获释放两个过程分别将不吸附的物质和非特异性吸附的白细胞与循环肿瘤细胞分离，大大提高了其纯度。该方法目前还没有相适应的系统来实现。

基于以上研究成果，本发明提供了一种循环肿瘤细胞分离系统，能够从血液样品中高效捕获循环肿瘤细胞，并解决分离系统存在严重的非特异性吸附、无法收集捕获的循环肿瘤细胞进行后续检测的问题。

本发明的技术方案是：所述循环肿瘤细胞分离系统，包括样品准备模块、进样模块、第一微流控芯片、释放模块和收集模块，所述样品准备模块用于将血液处理为检测样品，所述进样模块用于将检测样品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取检测样品中的循环肿瘤细胞，所述释放模块用于使循环肿瘤细胞脱离第一微流控芯片获得采集样品，所述收集模块用于收集采集样品。

优选地是，所述检测样品是全血首先经抗凝处理或红细胞裂解处理，然后与抗体-单链标记多核苷酸复合物混合孵育获得的样品。抗体-单链标记多核苷酸复合物可以在三维空间中与血样中的循环肿瘤细胞重复的接触和结合，与现有技术中通过微流控芯片负载的抗体去结合来比，结合效率大大提高。

优选地是，所述第一微流控芯片的微通道表面上负载有单链固定多核苷酸，所述固定多核苷酸与检测样品上的单链标记多核苷酸可特异性结合，所述单链标记多核苷酸或固定多核苷酸中包含可被特征波长紫外光切断的光敏基团。与现有技术中通过负载抗体的磁珠来捕获，并通过磁场固定在微通道内的方式相比，通过固定多核苷酸和标记多核苷酸的特异性结合来固定，洗脱分离时的损失大大降低。

优选地是，还包括第二微流控芯片，所述第二微流控芯片用于提取采集样品中的残余白细胞，并将剔除白细胞后的样品导入收集模块。进一步提高采集样品中循环肿瘤细胞的纯度。

优选地是，所述第一微流控芯片与第二微流控芯片的入口通过微管连接，所述微管上设置阀门。从第一微流控芯片中流出携带释放的循环肿瘤细胞的采集样品通过微管进入第二微流控芯片内，在第二微流控芯片中将其中残留的白细胞捕获。

优选地是，所述第二微流控芯片的微通道表面负载有针对白细胞表面特异性抗原的白细胞捕获抗体，所述采集样品流经第二微流控芯片时，其中残留的白细胞表面抗原与负载的白细胞捕获抗体结合，将白细胞固定在第二微流控芯片的微通道内。这样使得采集样品中循环肿瘤细胞的纯度进一步提高。

优选地是，所述进样模块为样品注射器件，所述释放模块为发射紫外光光源，所述样品注射器件出口与第一微流控芯片的进样口相接，所述发射紫外光光源设置在第一微流控芯片的微通道上。

样品注射器件可以为注射器、自动化注射器和恒流泵的一种或者一种以上的组合。

本领域技术人员都清楚微流控芯片一般包括进样口、微通道、洗脱液贮液池、废液收集器和各部分之间的阀门，还可以根据需要设置更多检测需要的原料贮液池等。

优选地是，所述第一微流控芯片和第二微流控芯片的微通道表面上设置微结构，所述微结构为周期性的微柱阵列结构、周期性表面凹凸的鱼骨型结构、沉积的纳米线或沉积的纳米带。

优选地是，还包括控制模块，所述控制模块用于控制进样模块、第一微流控芯片、第二微流控芯片、释放模块以及收集模块的工作。

优选地是，所述控制模块为计算机或单片机。

本发明提供的技术方案与现有技术相比，具有以下的优点和特点：

1）系统简单，易于实现。在现有技术的基础上增加释放模块即可克服严重的非特异性吸附问题，增加的第二微流控芯片更可以进一步提高收集的循环肿瘤细胞的纯度；

2）成本更低。商业化系统，如CellSearch的细胞捕获系统，系统复杂，成本高昂，与之相比本发明提供的技术方案成本低廉，更易于市场推广；

3）操作简单，自动化程度高。

附图说明

图1是本发明所述循环肿瘤细胞分离系统一具体实施方式的结构示意图；

图2是本发明所述第一微流控芯片、第二微流控芯片和微管的结构示意图。

图中所示：

1-注射器，2-微管，21-第一单向阀，3-第一微流控芯片，31-第一微通道，32-进样口，33-第一废液收集器，34-第一出液口，35-第一阀门，4-第二微流控芯片，41-第二微通道，42-第二废液收集器，43-第二阀门，44-进液口，45-第二出液口，5-紫外灯，6-循环肿瘤细胞收集器，61-第二单向阀，7-计算机。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作详细描述：

如图1所示，本发明所述循环肿瘤细胞分离系统包括样品准备模块、进样模块、第一微流控芯片3、第二微流控芯片4、释放模块、收集模块和控制模块。

所述样品准备模块用于将血液处理为检测样品，所述检测样品是将1000个结肠癌肿瘤细胞HCT116用细胞膜红色荧光探针DiI染成红色，然后与1毫升经抗凝处理的健康人的全血或者经过红细胞裂解的全血混合，同时加入1微升1mg/ml抗体-单链标记多核苷酸复合物，将混合物置于摇床上共同充分孵育半小时获得的样品。其中所述抗体-单链标记多核苷酸复合物是上皮细胞粘附分子（EpCAM，购自美国R&D Systems公司）与单链标记多核苷酸（SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3序列见表1，由生工生物合成）混合后置于摇床上共同充分孵育半小时获得。所述单链标记多核苷酸（SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3）序列终包括可被波长为365nm的紫外光切断的光敏基团-PC spacer。

所述进样模块包括注射器1。

如图1和2所示，所述第一微流控芯片3包括第一微通道31、设置在第一微通道31一端的进样口32、设置在第一微通道31另一端的第一出液口34、与第一出液口34相连的第一废液收集器33，第一废液收集器33与第一微通道31之间的第一阀门35。

所述第一微通道31的表面设有微结构，所述微结构为周期性表面凹凸的鱼骨型结构（制作方法见Wang,S.T.;Liu,K.;Liu,J.A.et al,.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,3084-3088），其中“鱼骨”宽度为35μm，水平夹角为45度，周期性间隔为100μm，一组共20条“鱼骨”。

所述第一微通道31的鱼骨结构表面上负载有固定多核苷酸SEQ ID NO.1（序列见表1）。

如图1和2所示，所述第二微流控芯片4包括第二微通道41、设置在第二微通道41一端的进液口44、设置在第二微通道41另一端的第二出液口45、与第二出液口45相连的第二废液收集器42以及第二微通道41与第二废液收集器42之间的第二阀门43。

所述第二微通道41的结构与第一微通道31相同的“鱼骨”结构。

所述第二微通道41的鱼骨结构表面上负载白细胞捕获抗体，所述白细胞捕获抗体是针对白细胞表面抗原CD45的抗体（购自美国R&D Systems公司）。

如图2所示，所述第一微流控芯片3与第二微流控芯片4之间设置微管2，所述微管2一端与第一微流控芯片3的第一出液口34相连，另一端与第二微流控芯片4的进液口44相连，所述微管2上设置第一单向阀21。

所述释放模块为紫外灯5（购自美国Cole-Parmer公司，功率为40W，功率密度为1.19mW/cm²），所述紫外灯5设置在第一微通道31上方。

所述收集模块为循环肿瘤细胞收集器6，所述循环肿瘤细胞收集器6与第二微通道41相通，所述第二微通道41与循环肿瘤细胞收集器6之间设置第二单向阀61。

所述控制模块为计算机7，所述计算机7分别与注射器1、紫外照明灯5、第一单向阀21、第二单向阀61、第一阀门35和第二阀门43相连。

表1

序列名称	序列
		SEQ ID NO.1	5’-NH₂-AAAAAAAAAAGTCGAGGATTCTGAACCTGT-3’
SEQ ID NO.2	5’-NH₂-AAAAA-PC spacer-AAAAAACAGGTTCAGAATCCTCGAC-3’
		SEQ ID NO.3	5’-NH₂-PC spacer-AAAAAAAAAAACAGGTTCAGAATCCTCGAC-3’

下面说明循环肿瘤细胞分离系统的工作过程：

1）捕获循环肿瘤细胞

通过计算机7控制将检测样品通过注射器1以1ml/h的流速从进样口32注入第一微通道31内，未吸附物质用第一废液收集器33收集；然后以2ml/h的流速用无细胞血浆或PBS清洗微通道，洗去部分非特异系吸附的细胞，用第一废液收集器33收集；此时，使用活细胞工作站对第一微流控芯片3中的循环肿瘤细胞、非特异性吸附的细胞以及流经芯片的血液中未被捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获率约为85%，纯度低于1%；

2）释放循环肿瘤细胞

通过计算机7控制紫外灯5（优选波长为365nm紫外光）向第一微通道41进行照射5-15分钟，照射结束，关闭第一阀门35，打开第一单向阀21，以2ml/h的流速用无细胞血浆或PBS清洗从第一微通道表面脱落的循环肿瘤细胞（当然也有一些白细胞会被洗脱），采集样品通过微管2进入第二微通道41；通过并对释放的细胞进行计数，其中循环肿瘤细胞的纯度提升至20-80%；

3）捕获白细胞并收集循环肿瘤细胞

采集样品通过第二微通道41时，其中的白细胞上的特异性抗原CD45与负载在第二微通道41表面的CD45抗体结合，将从第一微通道中洗脱的白细胞固定在第二微通道41内，分离出的循环肿瘤细胞被收集到循环肿瘤细胞收集器6内，收集到的循环肿瘤细胞的纯度提升至95%以上。

Claims

1.一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，包括样品准备模块、进样模块、第一微流控芯片、释放模块和收集模块，所述样品准备模块用于将血液处理为检测样品，所述进样模块用于将检测样品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取检测样品中的循环肿瘤细胞，所述释放模块用于使循环肿瘤细胞脱离第一微流控芯片获得采集样品，所述收集模块用于收集采集样品。

2.根据权利要求1所述一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，所述检测样品是全血首先经抗凝处理或红细胞裂解处理，然后与抗体-单链标记多核苷酸复合物混合孵育获得的样品。

3.根据权利要求2所述一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，所述第一微流控芯片的微通道表面上负载有单链固定多核苷酸，所述固定多核苷酸与检测样品上的单链标记多核苷酸可特异性结合，所述单链标记多核苷酸或固定多核苷酸中包含可被特征波长紫外光切断的光敏基团。

4.根据权利要求3任一所述一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，所述释放模块为发射紫外光光源，所述发射紫外光光源设置在第一微流控芯片的微通道上。

5.根据权利要求1-4任一所述一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，还包括第二微流控芯片，所述第二微流控芯片用于提取采集样品中的残余白细胞，并将剔除白细胞后的样品导入收集模块。

6.根据权利要求5所述一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，所述第一微流控芯片与第二微流控芯片的入口通过微管连接，所述微管上设置阀门。

7.根据权利要求5所述一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，所述第二微流控芯片的微通道表面负载有针对白细胞表面特异性抗原的白细胞捕获抗体，所述采集样品流经第二微流控芯片时，其中残留的白细胞表面抗原与负载的白细胞捕获抗体结合，将白细胞固定在第二微流控芯片的微通道内。

8.根据权利要求5所述一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，所述第一微流控芯片和第二微流控芯片的微通道表面上设置微结构，所述微结构为周期性的微柱阵列结构、周期性表面凹凸的鱼骨型结构、沉积的纳米线或沉积的纳米带。

9.根据权利要求5所述一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，还包括控制模块，所述控制模块用于控制进样模块、第一微流控芯片、第二微流控芯片、释放模块以及收集模块的工作。

10.根据权利要求9所述一种循环肿瘤细胞分离系统，其特征在于，所述控制模块为计算机或单片机。