CN107400623A - 循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片及其自动捕获方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片及其自动捕获方法。循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片包括样品进样模块、样品分选模块以及缓冲液进样模块。进样单元连接于样品分选模块，进样单元用于将待检测样品送入微流控芯片中。缓冲液进样模块包括振荡流单元及连续流单元，振荡流单元及连续流单元分别连接于微流控芯片。样品分选单元用于对待检测样品的细胞进行分选，靶细胞收集单元用于收集经分选得到的靶细胞；微流控芯片包括样品分选单元、靶细胞收集单元以及非靶细胞收集单元；非靶细胞收集单元用于收集经分选后得到的非靶细胞和产生的废液。该循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片能够实现细胞的自动分选、假阳性比率低。

Description

循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片及其自动捕获方法

技术领域

本发明涉及分子生物学及医学领域，特别是涉及一种循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片及其自动捕获方法。

背景技术

人外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)是一类数量稀少却具有重要临床意义的稀有细胞，它是指从肿瘤病灶脱离并播散进入人外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。通常地，循环肿瘤细胞提示了人体内肿瘤的存在以及可能的转移。由于临床上超过90％的癌症死亡都是由转移造成的，而循环肿瘤细胞提供了人体内除了肿瘤病灶以外的肿瘤转移性病灶的来源，因此，从血液中捕获并检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。然而，循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每10mL血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞，因此，从外周血中快速、高效的分离循环肿瘤细胞是后续对循环肿瘤细胞计数、以及分子、功能分析的前提。

目前，微流控芯片分选和富集CTCs的原理主要分为4类：a.利用抗原抗体亲和性进行分选；b.利用细胞物理特征的不同进行分选，比如细胞大小、变形性以及不同大小的细胞在流场中的力学特性；c.利用免疫磁珠具有磁性兼连接抗体的作用进行分选；d.利用不同细胞的电学性能差异进行分选等。然而，已有的循环肿瘤细胞检测设备通常都是基于磁球分离技术，不但循环肿瘤细胞的捕获效率低，而且设备操作繁琐、复杂，更重要的是，这些设备和技术尚没有实现循环肿瘤细胞检测过程的自动化控制，即没有实现血液检测样品和试剂的自动化进样，细胞的自动化捕获及鉴定分析，由此，循环肿瘤细胞的检测存在过多的人为干预，使得循环肿瘤细胞的检测准确性低，检测成本过高。

目前，唯一通过美国食品和药品监督管理(FDA)认证的CTCs分离和计数系统是Cellsearch，它是一个依赖于免疫磁珠原理的半自动化工作系统，该系统通过连接了抗上皮细胞黏附分子抗体EpCAM的磁珠和CTCs表面标志物EpCAM特异性结合，达到捕获CTCs的目的。CTCs的识别使用经典的免疫染色法。该系统分选的CTCs效率为80％。尽管Cellsearch已通过FDA批准，但该系统还存在一些缺陷，比如无法实现全自动分选、假阳性比率高、富集后的CTCs没有生物活性等，更为重要的是，Cellsearch捕获的CTCs仅仅是EpCAM阳性的类型，而许多恶性程度很高的CTCs并不表达EpCAM，从而无法被检测出来。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够实现细胞的全自动分选、假阳性比率低的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片。

一种循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，包括样品进样模块、样品分选模块以及缓冲液进样模块；所述样品进样模块包括进样单元及进样微通道；所述样品分选模块包括样品分选单元、靶细胞收集单元以及非靶细胞收集单元；所述缓冲液进样模块包括振荡流单元及连续流单元；

所述样品分选单元具有容置腔，所述容置腔内具有由多个微柱行组成的微柱阵列，每个所述微柱行由多个微柱组成，所述微柱行将所述容置腔分隔成多个收集区，每个所述微柱行上相邻所述微柱之间具有相等的间隔且该间隔形成样品通道，不同的所述微柱行上所述样品通道的宽度均不等；由所述微柱阵列的第一个微柱行至最后一个微柱行，所述样品通道的宽度逐渐减小；

所述进样单元、所述进样微通道以及所述容置腔依次连通，且所述进样微通道连通于所述微柱阵列的第一个收集区，所述进样单元用于将待检测样品通过所述进样微通道送入所述容置腔中，进入所述容置腔内的所述待检测样品通过所述微柱阵列并按照所述待检测样品的细胞尺寸进行分选；所述靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道不小于靶细胞临界体积的微柱行所在的收集区以用于收集经分选得到的靶细胞；所述非靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道小于靶细胞临界体积的微柱行所在的收集区以用于收集经分选后得到的非靶细胞。

所述振荡流单元及所述连续流单元分别连通于所述容置腔，所述振荡流单元用于向所述容置腔内提供用于振荡的缓冲液流，所述振荡流单元能够交替地分别向所述容置腔内提供压力和提供吸力；所述连续流单元用于向所述容置腔内提供连续的缓冲液流，所述连续流单元能够连续地向所述容置腔内提供压力。

在其中一个实施例中，还包括中央控制模块；

所述中央控制模块连接于所述进样单元以用于控制所述进样单元将待检测样品通过所述进样微通道送入所述容置腔中；

所述中央控制模块连接于所述振荡流单元以用于控制所述振荡流单元为所述容置腔提供用于振荡的缓冲液流；所述振荡流单元向所述容置腔内提供的压力促使靶细胞和非靶细胞纵向通过各个微柱行的样品通道，所述振荡流单元向所述容置腔内提供的吸力促使卡在各个微柱行的样品通道内的靶细胞和非靶细胞吸回至所述收集区内；

所述中央控制模块连接于所述连续流单元以用于控制所述连续流单元为所述容置腔提供连续的缓冲液流，以使得所述收集区内的靶细胞和非靶细胞处于流动状态。

在其中一个实施例中，所述样品分选单元具有进液口、连续流入口以及振荡流入口，所述进液口、所述连续流入口以及所述振荡流入口均连通于所述容置腔；

所述进样微通道连通于所述进液口，所述振荡流单元连通于所述振荡流入口，所述连续流单元连通于所述连续流入口。

在其中一个实施例中，所述进样微通道呈“S”形。

在其中一个实施例中，所述振荡流单元能够交替地分别向所述容置腔内提供20-50KP的压力和提供20-50KP的吸力，所述连续流单元能够连续地向所述容置腔内提供20-50KP的压力。

在其中一个实施例中，所述振荡流单元能够交替地分别向所述容置腔内提供35KP的压力和35KP的吸力；所述连续流单元能够连续地向所述容置腔内提供35KP的压力。

在其中一个实施例中，所述微柱阵列的微柱行和微柱列的组合为N行×M列；所述N为20-45之间的整数，所述M为384-640之间的整数。

在其中一个实施例中，所述样品通道为2-20μm。

在其中一个实施例中，所述微柱阵列的相邻的所述相邻微柱行之间的间距为40-80um。

在其中一个实施例中，所述靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道不小于8um的所述微柱行所在的收集区以用于收集经分选得到的靶细胞；所述非靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道小于8um的所述微柱行所在的收集区以用于收集经分选后得到的非靶细胞。

在其中一个实施例中，所述中央控制模块控制所述进样单元将待检测样品通过所述进样微通道送入所述容置腔中的流速为4mL/h-10mL/h。

本发明的另一目的还在于提供一种循环肿瘤细胞自动捕获方法。

一种循环肿瘤细胞自动捕获方法，包括如下步骤：

通过样品进样模块的进样单元及进样微通道进样至样品分选单元的容置腔内；

所述容置腔内的样品通过所述容置腔内的微柱阵列上宽度逐渐减小的微柱行样品通道进行分选，细胞尺寸较大的靶细胞截留在所述微柱阵列中样品通道不小于靶细胞临界体积的所有微柱行所在的收集区内，细胞尺寸较小的非靶细胞进入所述微柱阵列中所述样品通道小于靶细胞临界体积的所有微柱行所在的收集区内；

缓冲液进样模块的连续流单元向所述容置腔内提供连续的缓冲液流，并且所述连续流单元连续地向所述容置腔内提供压力，以使得所述收集区内的靶细胞和非靶细胞处于流动状态，所述缓冲液进样模块的振荡流单元向所述容置腔内提供用于振荡的缓冲液流，并且所述振荡流单元交替地向所述容置腔内提供压力和提供吸力，所述振荡流单元向所述容置腔内提供的压力促使靶细胞和非靶细胞纵向通过各个微柱行的样品通道，所述振荡流单元向所述容置腔内提供的吸力促使卡在各个微柱行的样品通道内的靶细胞和非靶细胞吸回至所述收集区内；

所述靶细胞收集区内的靶细胞在所述连续流单元提供的压力作用下处于横向流动状态并朝向靶细胞收集单元流动，进入所述非靶细胞收集区内的非靶细胞在所述连续流单元提供的压力作用下处于横向流动状态并朝向非靶细胞收集单元流动。

本发明涉及的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，具有以下优点：

(1)以微流控芯片技术为核心，能够自动化完成稀有细胞的检测过程，从而减少稀有细胞检测中的过多人为干预。通过微流控芯片的不同间距的微柱阵列设计及压力的操作，实现细胞的连续捕获，解决现有微流控芯片实现高通量细胞采集工艺的复杂、通量不高等问题。

(2)本发明通过对微流控芯片样品分选单元中微柱的巧妙设计，使细胞容易从微柱中穿过，而难以从微柱中退回。即，在振荡流的正向压力作用下，细胞容易从微柱间通过，在振荡流的吸力作用下，细胞难以从微柱中穿过。然而部分卡在微柱间的细胞可以在振荡流的吸力作用下脱离微柱间的束缚，有效防止堵塞，实现连续有效的分选。

(3)本发明微流控芯片内的液体在振荡流和连续流的相互作用下具有一个向容置腔对角流动的总趋势，体积较大且形变能力较差的细胞则被微柱阻挡而停留在微柱间距较大的区域，最后流入靶细胞收集单元；而体积较小和细胞形变能力强的细胞则流向微柱间距较小的区域，最后流入非靶细胞收集单元。

(4)本发明设计的微流控芯片，完全根据细胞大小进行细胞分离，不涉及抗原-抗体结合等生物或电化学方法进行捕获，避免了由于抗原表达差异等因素造成的假阳性结果，提高了检测准确率和靶细胞纯度。

附图说明

图1为本发明实施例1中所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片示意图；

图2为图1中所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片分解示意图；

图3为图1中所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片的样品分选单元分解示意图。

附图标记说明

10、中央控制模块；20、样品进样模块；21、进样单元；22、进样微通道；30、缓冲液进样模块；31、振荡流单元；32、连续流单元；40、微流控芯片；41、进液口；42、振荡流入口；43、连续流入口；44、样品分选单元；441、容置腔；442、微柱行；443、微柱阵列；444、样品通道；445、收集区；45、靶细胞收集单元；46、非靶细胞收集单元。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

参见如1及图2所示，本实施例提供了一种循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片。一种循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片包括中央控制模块10、样品进样模块20、样品分选模块40以及缓冲液进样模块30。

参见图2所示，样品进样模块20包括进样单元21及进样微通道22。缓冲液进样模块30包括振荡流单元31及连续流单元32。样品分选模块40包括样品分选单元44、靶细胞收集单元以及非靶细胞收集单元46。

进样单元21、进样微通道22以及样品分选模块40依次连接，进样微通道22与样品分选单元44的容置腔441连通。中央控制模块10连接于进样单元21以用于控制进样单元21将待检测样品通过进样微通道22送入样品分选单元44的容置腔441中。中央控制模块10控制进样单元21将待检测样品通过进样微通道22送入样品分选单元44的容置腔441中的流速可以在4mL/h-10mL/h之间，本实施例中优选为6mL/h。

参见图2所示，振荡流单元31及连续流单元32分别连接于样品分选模块40。且连续流单元32与靶细胞收集单元以及非靶细胞收集单元46处于样品分选单元44上相对的位置。振荡流单元31与样品进样单元处于同一个位置，并且振荡流单元31向容置腔441内提供的压力与样品通道444的朝向一致，也即与样品穿过样品通道444的方向一致。振荡流单元31向容置腔441内提供的吸力与样品通道444的朝向相反，也即与样品穿过样品通道444的方向相反。中央控制模块10连接于振荡流单元31以用于控制振荡流单元31向样品分选单元44的容置腔441内提供用于振荡(一个振荡单位)的缓冲液流。中央控制模块10控制进样单元21将待检测样品通过进样微通道22送入样品分选单元44的容置腔441的流速为6mL/h。振荡流单元31能够交替地分别向样品分选单元44的容置腔441内提供20-50KP的压力和提供20-50KP的吸力。在本实施例中，优选为振荡流单元31能够交替地分别向样品分选单元44的容置腔441内提供35KP的压力和35KP的吸力。

参见图2所示，中央控制模块10连接于连续流单元32以用于控制连续流单元32向样品分选单元44的容置腔441提供连续(一个连续单位)的缓冲液流。连续流单元32能够连续地向样品分选单元44的容置腔441内提供20-50KP的压力。在本实施例中，优选为连续流单元32能够连续地向样品分选单元44的容置腔441内提供35KP的压力。

参见图3所示，样品分选单元44具有容置腔441。样品分选单元44由底片、上盖相互键合形成。容置腔441内具有由多个微柱行442组成的微柱阵列443，每个微柱行442由多个微柱组成。参见图2所示，微柱的形状包括但不限于半圆型、圆角等腰梯形、圆角三角形。微柱阵列443可以是N行×M列；N为20-45之间的整数，M为384-640之间的整数。在本实施例中，微柱阵列443可以是20行×384列、26行×448列、32行×512列、38行×576列或者45行×640列，微柱阵列443优选为32行×512列。微柱阵列443的多个微柱行442将样品分选单元44分隔成多个收集区，每个微柱阵列443的微柱行442上，相邻的微柱之间具有相等的间隔且该间隔形成样品通道444，不同的微柱阵列443的微柱行442上相邻的微柱之间的样品通道444的宽度均不等；由微柱阵列443的第一个微柱行442至最后一个微柱行442，相邻的微柱之间的样品通道444的宽度逐渐减小。微柱阵列443的微柱行442上相邻微柱之间的间距构成的样品通道444的宽度为2-20μm。微柱阵列443的相邻微柱行442之间的间距为40-80um。在本实施例中，优选相邻微柱行442之间的间距为60um。

样品分选单元44具有进液口41、连续流入口43以及振荡流入口42。进液口41、连续流入口43以及振荡流入口42均连通于容置腔444。

参见图2所示，进样微通道22连通于进液口41。振荡流单元31连通于振荡流入口42。连续流单元32连通于连续流入口43。进样单元21具有样品进样通道，进样微通道22为S形通道。样品进样通道连通于样品分选模块40的进液口41。

进样微通道22连通于进液口41，进液口41设在微柱阵列的第一个收集区内，也即进液口41朝向微柱阵列的第一个收集区内，也即进样微通道22朝向微柱阵列的微柱样品通道的宽度较大的一侧，进入样品分选模块40内的待检测样品通过微柱阵列并按照待检测样品的细胞尺寸进行分选，靶细胞收集单元45连通于微柱阵列中样品通道不小于靶细胞临界体积的所有微柱行所在的收集区以用于收集经分选得到的靶细胞；非靶细胞收集单元46连通于微柱阵列中样品通道小于靶细胞临界体积的所有微柱行所在的收集区以用于收集经分选后得到的非靶细胞和产生的废液。进一步地，在本实施例中，靶细胞收集单元45连通于微柱阵列中样品通道不小于8um的微柱行所在的收集区以用于收集经分选得到的靶细胞；非靶细胞收集单元46连通于微柱阵列中样品通道小于8um的微柱行所在的收集区以用于收集经分选后得到的非靶细胞。

本发明涉及的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，具有以下优点：

(1)以样品分选模块40技术为核心，能够自动化完成稀有细胞的检测过程，从而减少稀有细胞检测中的过多人为干预。通过样品分选模块40的不同间距的微柱阵列设计及压力的操作，实现细胞的连续捕获，解决现有样品分选模块40实现高通量细胞采集工艺的复杂、通量不高等问题。

(2)本发明通过对样品分选模块40样品分选单元44中微柱的巧妙设计，使细胞容易从微柱中穿过，而难以从微柱中退回。即，在振荡流的正向压力作用下，细胞容易从微柱间通过，在振荡流的吸力作用下，细胞难以从微柱中穿过。然而部分卡在微柱间的细胞可以在振荡流的吸力作用下脱离微柱间的束缚，有效防止堵塞，实现连续有效的分选。

微流控芯片是一个集样品制备、反应、分离、检测等功能于一体的小型分析实验平台，它通过微加工技术，在硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)等材料上，根据实际需求，制作出各种结构的、尺寸在微米量级的管道进行实验。将原来需要在一个综合实验室内完成的工作简化到一个微小的芯片上，不仅减少了耗材和试剂的消耗、大大降低了成本，而且提高了检测的灵敏度和分析速度，具有自动和高效的优点。随着微流控芯片技术在细胞生物学中的应用不断扩展，微流控芯片具有的可集成样品预处理和分析为一体的优势，在DNA测序、蛋白质检测、细胞操控和胞内成分分析等研究领域显示出巨大的应用潜力。由于微流控芯片管道尺寸在微米量级和细胞尺寸匹配，非常适合应用于细胞分选。

(3)本发明样品分选模块40内的液体在振荡流和连续流的相互作用下具有一个向对角流动的总趋势，体积较大且细胞形变能力较差的细胞则被微柱阻挡而停留在微柱间距较大的区域，最后流入靶细胞收集单元，而体积较小和细胞形变能力强的细胞则流向微柱间距较小的区域，最后流入非靶细胞收集单元46。

(4)本发明设计的样品分选模块40，完全根据细胞大小进行细胞分离，不涉及抗原-抗体结合等生物或电化学方法进行捕获，避免了由于抗原表达差异等因素造成的假阳性结果，提高了检测准确率和靶细胞纯度。

(5)本发明所涉及的制备材料主要包括硅片、玻璃、PDMS，主要涉及的制备方式是微加工技术中成熟的干法、湿法刻蚀，强紫外键合等工艺，材料较为廉价，制造成本低。

实施例2

本实施例采用实施例1中的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片对临床样品进行检测。

采用实施例1中的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，对20例肿瘤患者外周血样品(编号1-20)进行检测。

1、试剂配方：

(1)封闭液的配制：最低必需培养基(MEM)中含有15％聚蔗糖，0.2％的Pluronic和5％牛血清白蛋白(BSA)。

(2)Hank's平衡盐溶液：

2、具体检测步骤：

(1)封闭：样品分选模块40的样品分选单元44由PDMS的底片和上盖玻璃片构成，为了防止细胞与PDMS和玻璃表面进行非特异性吸附，在使用该样品分选模块40前，需要对其进行封闭处理。将上述配制的封闭液经缓冲液入口及样品入口注入，使整个微通道(包括样品分选单元44、样品入口微通道，提供压力的缓冲液微通道以及用于细胞收集的微通道)充满封闭液，并孵育15分钟。

(2)洗涤：使用Hank's平衡盐溶液对孵育完成的样品分选模块40进行洗涤。

(3)进样：在中央控制模块10的控制下，进样单元21将5mL待测样品从样品入口注入，同时在中央控制模块10的控制下，振荡流单元31提供振荡的缓冲液压力(向样品分选单元44的容置腔444内3秒35KP的压力，从样品分选单元44的容置腔444内向外的1.5秒35KP的吸力，压力与吸力交替切换)，连续流单元32提供连续的缓冲液压力(向样品分选单元44的容置腔444内连续35KP的压力)。当待测样品完全进入样品分选模块40后，振荡流单元31和连续流单元32在中央控制模块10的控制下继续工作5min。

(4)细胞收集与鉴定：收集靶细胞收集单元的细胞，采用益善生物技术股份有限公司的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法(CN2014102285119)对收集到的CTCs进行进一步的鉴定。具体检测结果如下表所示：

表1样品检测结果

由检测结果可知，本发明的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片能实现样品中各种类型CTCs(上皮型、上皮-间质型和间质型)的全自动化捕获，同时有效去除样品中的正常血细胞，残留的白细胞数量很少，几乎没有红细胞的残留。说明本发明循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片能够高效快速地将样品中的CTCs进行捕获分离，并且捕获到的CTCs具有很高的纯度，非常适用于下游分子和蛋白相关方面的研究。

实施例3

本实施例采用实施例1中的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片对细胞株进行检测。

1、样品制备

本实施例选用上皮型细胞株MCF-10A、间质型肿瘤细胞株U118、上皮-间质混合型肺癌细胞株PC-9和阴性对照CCRF-HSB-2淋巴母细胞进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。用细胞计数器取一定数量的上述细胞，加入5mL正常人外周血中，制备如下表所示细胞浓度梯度的样品：

表2样品细胞浓度

2、样品检测

利用实施例1中的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片和实施例2中的检测方法，对样品编号21-30进行检测，按鉴定试剂盒中阳性CTCs细胞判断标准，对富集得到的表达CTCs相关标志物的细胞进行分析和统计，具体结果如下表3所示。

表3样品检测结果

为了评估本发明循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片的分离纯化的纯度，同时对靶细胞收集单元45中残留的正常血细胞进行分析和统计，具体结果见表4。

表4样品检测结果

从上述检测结果可以看出，本发明提供的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，可以全自动的完成循环肿瘤细胞的收集，减少循环肿瘤细胞在检测中的过多人为干预，提高检测效率。本实施例循环肿瘤细胞的回收率高(96％-100％)，纯化效果好(残留的白细胞数量很少，红细胞几乎无残留)，说明本发明提供的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片具有全自动化、回收率高、纯化效果好和检测结果稳定等优点。

实施例4

本实施例涉及样品分选单元44对捕获效果的影响

1、样品分选单元44的设计

本发明循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片的样品分选模块40中的样品分选单元44由不同柱体直径及间距的微柱组成微柱阵列，微柱阵列可以有多种组成方式，其行和列可以任意组合；微柱阵列的微柱之间的间距，在同一行中是一致的，而在不同的行中均不一样。为了研究微柱阵列行和列的组合方式对检测结果的影响，本实施例设计了5个实验组的行和列组合方式，具体如表5所示：

表5样品分选单元44微柱阵列设计

实验组	微柱阵列行数	微柱阵列列数
			实验组1	20	384
实验组2	26	448
			实验组3	32	512
实验组4	38	576
			实验组5	45	640

2、样品检测

本实施例选用肝癌细胞株HepG2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取100个HepG2细胞，加入20例健康志愿者外周血中(即每5mL外周血液样品中含有100个HepG2细胞)，编号41-60。利用实施例1中的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片和实施例2中的检测方法，对样品进行检测，按鉴定试剂盒中阳性CTCs细胞和白细胞判断标准，对捕获到的表达CTCs相关标志物和白细胞相关标志物的细胞进行分析和统计，具体结果如表6。

表6样品分选单元44的微柱阵列设计对检测结果的影响

从上述检测结果可以看出，由不同行和列组成的样品分选单元44均能实现样品中循环肿瘤细胞的捕获，微柱阵列行和列越多，捕获到的靶细胞纯度越高，但过多的微柱阵列可能会造成部分靶细胞的丢失。由上表可知，其中，32行×512列微柱阵列组成的样品分选单元44对样品中靶细胞的捕获效率最好，能达到捕获效率和纯度的最优平衡。

实施例5

本实施例涉及缓冲液压力对捕获效果的影响

1、缓冲液压力的设计

本发明的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片中，缓冲液进样模块30包含振荡流单元31和连续流单元32：振荡流单元31在中央控制模块10控制下通过交替地提供压力和吸力为样品分选模块40提供一个振荡的缓冲液流，有效防止微柱间隙的堵塞，使样品分选单元44具有持续分选的能力；连续流单元32在中央控制模块10控制下通过连续地提供压力为样品分选模块40提供一个连续的缓冲液流。为了研究振荡流单元31和连续流单元32中压力对检测效果的影响，本实施例设计了以下3个实验组的压力，具体如表7所示：

表7缓冲液压力设计

2、样品检测

本实施例选用肝癌细胞株HepG2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取100个HepG2细胞，加入15例健康志愿者外周血中(即每5mL外周血液样品中含有100个HepG2细胞)，编号61-75。利用实施例1中的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片和实施例2中的检测方法，对样品进行检测，按鉴定试剂盒中阳性CTCs细胞和白细胞判断标准，对捕获到的表达CTCs相关标志物和白细胞相关标志物的细胞进行分析和统计，具体结果如表8：

表8缓冲液压力的对检测结果的影响

从上述检测结果可以看出，所设计的的不同缓冲液压力的循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片均能有效地从样本中分离出肿瘤细胞，压力越大，捕获到的靶细胞纯度越高，但过大的缓冲液压可能会造成部分靶细胞的丢失。其中，当缓冲液压力为35KP时样品分选单元44对样品中靶细胞的捕获效率最好，能达到捕获效率和纯度的最优平衡。

实施例6

本实施例涉及样品流速对分离纯化效果的影响

1、样品流速设计

为研究样品流速对设备分离纯化效果的影响，本实施例设计了5个实验组，具体见表9：

表9样品流速的设计

实验组	样品流速
		实验组9	4mL/h
实验组10	5mL/h
		实验组11	6mL/h
实验组12	7mL/h
		实验组13	10mL/h

2、样品检测

本实施例选用肝癌细胞株HepG2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取100个HepG2细胞，加入20例健康志愿者外周血中(即每5mL外周血液样品中含有100个HepG2细胞)，编号96-115。采用上述样品流速和实施例2检测方法，对样品进行检测，具体结果见表10。

表10样品检测结果

从上述5实验组的检测结果可以看出，本发明设备在样品流速为4mL/h-10mL/h时均能实现样品中循环肿瘤细胞的分离纯化，其中当样品流速在4mL/h、5mL/h和6mL/h时，样品中循环肿瘤细胞的富集率和分离纯化纯度都能达到最优效果，当样品流速大于6mL/h时，会造成较低的肿瘤细胞富集率，同时残留的血细胞数目显著增多，因此，本发明提供的装置在进行样品检测时最佳的流速为6mL/h。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一种循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，包括样品进样模块、样品分选模块以及缓冲液进样模块；所述样品进样模块包括进样单元及进样微通道；所述样品分选模块包括样品分选单元、靶细胞收集单元以及非靶细胞收集单元；所述缓冲液进样模块包括振荡流单元及连续流单元；

所述样品分选单元具有容置腔，所述容置腔内具有由多个微柱行组成的微柱阵列，每个所述微柱行由多个微柱组成，所述微柱行将所述容置腔分隔成多个收集区，每个所述微柱行上相邻所述微柱之间具有相等的间隔且该间隔形成样品通道，不同的所述微柱行上所述样品通道的宽度均不等；由所述微柱阵列的第一个微柱行至最后一个微柱行，所述样品通道的宽度逐渐减小；

所述进样单元、所述进样微通道以及所述容置腔依次连通，且所述进样微通道连通于所述微柱阵列的第一个收集区，所述进样单元用于将待检测样品通过所述进样微通道送入所述容置腔中，进入所述容置腔内的所述待检测样品通过所述微柱阵列并按照所述待检测样品的细胞尺寸进行分选；所述靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道不小于靶细胞临界体积的微柱行所在的收集区以用于收集经分选得到的靶细胞；所述非靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道小于靶细胞临界体积的微柱行所在的收集区以用于收集经分选后得到的非靶细胞；

所述振荡流单元及所述连续流单元分别连通于所述容置腔，所述振荡流单元用于向所述容置腔内提供用于振荡的缓冲液流，所述振荡流单元能够交替地分别向所述容置腔内提供压力和提供吸力；所述连续流单元用于向所述容置腔内提供连续的缓冲液流，所述连续流单元能够连续地向所述容置腔内提供压力。

2.根据权利要求1所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，还包括中央控制模块；

所述中央控制模块连接于所述进样单元以用于控制所述进样单元将待检测样品通过所述进样微通道送入所述容置腔中；

所述中央控制模块连接于所述振荡流单元以用于控制所述振荡流单元为所述容置腔提供用于振荡的缓冲液流；所述振荡流单元向所述容置腔内提供的压力促使靶细胞和非靶细胞纵向通过各个微柱行的样品通道，所述振荡流单元向所述容置腔内提供的吸力促使卡在各个微柱行的样品通道内的靶细胞和非靶细胞吸回至所述收集区内；

所述中央控制模块连接于所述连续流单元以用于控制所述连续流单元为所述容置腔提供连续的缓冲液流，以使得所述收集区内的靶细胞和非靶细胞处于流动状态。

3.根据权利要求1或2所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，所述样品分选单元具有进液口、连续流入口以及振荡流入口，所述进液口、所述连续流入口以及所述振荡流入口均连通于所述容置腔；

所述进样微通道连通于所述进液口，所述振荡流单元连通于所述振荡流入口，所述连续流单元连通于所述连续流入口。

4.根据权利要求1或2所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，所述进样微通道呈“S”形。

5.根据权利要求1或2所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，所述振荡流单元能够交替地分别向所述容置腔内提供20-50KP的压力和提供20-50KP的吸力，所述连续流单元能够连续地向所述容置腔内提供20-50KP的压力。

6.根据权利要求5所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，所述振荡流单元能够交替地分别向所述容置腔内提供35KP的压力和35KP的吸力；所述连续流单元能够连续地向所述容置腔内提供35KP的压力。

7.根据权利要求1或2所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，所述微柱阵列的微柱行和微柱列的组合为N行×M列；所述N为20-45之间的整数，所述M为384-640之间的整数。

8.根据权利要求1或2所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，所述样品通道为2-20μm。

9.根据权利要求1或2所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，所述微柱阵列的相邻的所述相邻微柱行之间的间距为40-80um。

10.根据权利要求1或2所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，所述靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道不小于8um的所述微柱行所在的收集区以用于收集经分选得到的靶细胞；所述非靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道小于8um的所述微柱行所在的收集区以用于收集经分选后得到的非靶细胞。

11.根据权利要求1或2所述循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，其特征在于，所述中央控制模块控制所述进样单元将待检测样品通过所述进样微通道送入所述容置腔中的流速为4mL/h-10mL/h。

12.一种循环肿瘤细胞自动捕获方法，其特征在于，包括如下步骤：

通过样品进样模块的进样单元及进样微通道进样至样品分选单元的容置腔内；

所述容置腔内的样品通过所述容置腔内的微柱阵列上宽度逐渐减小的微柱行样品通道进行分选，细胞尺寸较大的靶细胞截留在所述微柱阵列中样品通道不小于靶细胞临界体积的所有微柱行所在的收集区内，细胞尺寸较小的非靶细胞进入所述微柱阵列中所述样品通道小于靶细胞临界体积的所有微柱行所在的收集区内；

缓冲液进样模块的连续流单元向所述容置腔内提供连续的缓冲液流，并且所述连续流单元连续地向所述容置腔内提供压力，以使得所述收集区内的靶细胞和非靶细胞处于流动状态，所述缓冲液进样模块的振荡流单元向所述容置腔内提供用于振荡的缓冲液流，并且所述振荡流单元交替地向所述容置腔内提供压力和提供吸力，所述振荡流单元向所述容置腔内提供的压力促使靶细胞和非靶细胞纵向通过各个微柱行的样品通道，所述振荡流单元向所述容置腔内提供的吸力促使卡在各个微柱行的样品通道内的靶细胞和非靶细胞吸回至所述收集区内；

所述靶细胞收集区内的靶细胞在所述连续流单元提供的压力作用下处于横向流动状态并朝向靶细胞收集单元流动，进入所述非靶细胞收集区内的非靶细胞在所述连续流单元提供的压力作用下处于横向流动状态并朝向非靶细胞收集单元流动。