CN103459034A - 从生物流体中分离目标细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可操作的用于从生物流体中分离目标细胞的微流体装置（10）和一种从生物流体中分离目标细胞的方法。所述微流体装置（10）包括：入口（50），可操作的用于接收生物流体，所述生物流体包括目标细胞和其它组分；废液出口（60），可操作的用于接收至少生物流体中的其它组分；连接入口（50）与废液出口（60）的多个平行的细胞分离井阵列（190），每个平行的细胞分离井阵列（190）响应于跨越其的压力差，支持生物流体从入口（50）到废液出口（60）的流动，每个细胞分离井阵列（190）包括多个分离井，每个分离井尺寸化为机械地捕获其中的目标细胞，同时允许生物流体的其它组分流过；和至少一个压力维持结构，可操作的用于协助维持跨越多个平行的细胞分离井阵列（190）的每个的预定压力差。使用数量增多的陷阱可以处理量增加的流体，以提高被保留的目标细胞的数量。通过提供平行的阵列，可以增大每单位时间内可以处理的样品量。这可以减少样品处理时间，同时提高目标细胞的分离效率。此外，通过使用压力维持结构（40），每个平行的细胞分离结构阵列可被有效操作以确保正确地处理样品。这有助于改善增加微流体装置（10）的规模，这是很难的问题，因为很难在具有宽变化特性的样品的存在下可靠地实现可预测的流动。

Description

从生物流体中分离目标细胞

技术领域

本发明涉及一种可操作的用于从生物流体中分离目标细胞的微流体装置和一种从生物流体中分离目标细胞的方法。

背景技术

癌症是全球死亡的主要原因，早期检测是对抗该疾病的最有效方法之一。最新的临床研究表明，癌症患者血液中的癌细胞数量可以预测疾病的发展和治疗的效果。研究这些细胞还能引发对于疾病更好地理解。此外，获取血液样品比肿瘤活检要相对容易并且创伤小、痛苦少。

外周血液中循环肿瘤细胞（CTC）的分离和计算在对抗癌具有临床意义（J·M·鲁宾（J.M.Reuben），S·克里希纳默西（S.Krishnamurthy），W·伍德沃德（W.Woodward），M·克利斯托法尼利（M.Cristofanilli），医疗诊断的专家意见2，339（2008）；S·阿帝斯哈克（S.Urtishak），R·K·阿尔波（R.K.Alpaugh），L·M·韦纳，R·F·斯沃柏（R.F.Swaby），医药生物标记物2，137（2008））。癌症造成的死亡主要是由于该疾病的迟诊断，此时已出现转移（G·P·古普塔（G.P.Gupta），J·马萨格（J.Massague），细胞127，679-695（2006）；P·S·斯蒂克（P.S.Steeg），自然医学12，895（2006））。为了确保患者得到及时地治疗，计算血液中的CTC可补充现有的检测方法。此外，作为在任何健康测试中常规提取的体液，血液样品可以很容易地获得，以检测CTC。CTC在转移癌患者中被发现（W·J·阿拉德（W.J.Allard），J·马泰拉（J.Matera），M·C·米勒（M.C.Miller），M·瑞鲍利特（M.Repollet），M·C·康奈利（M.C.Connelly），C·饶（C.Rao），A·G·泰比（A.G.Tibbe），J·W·厄尔（J.W.Uhr），L·W·特斯他滨（L.W.Terstappen），临床癌症调查10，6897（2004）；S·斯蒂恩（S.Steen），J·奈穆那提斯（J.Nemunaitis），T·费舍尔（T.fisher），J·昆（J.Kuhn），进展（Proc）21，127（2008），贝勒大学医学中心），并与疾病的进展相关（M·克利斯托法尼利（M.Cristofanilli），G·T·巴德（G.T.Budd），M·J·埃利斯（Ellis），A·托佩克（A.Stopeck），J·马泰拉（J.Matera），M·C·米勒，J·M·鲁宾，G·V·多伊尔（G.V.Doyle），W·J·阿拉德，L·W·特斯他滨（L.W.Terstappen），D·F·海耶斯（D.F.Hayes），新英格兰医学期刊351，781（2004）；S·莫斯尔林（S.Mocellin），D·勋（D.Hoon），A·安布罗西（A.Ambrosi），D·尼蒂（D.Nitti），C·R·罗西（C.R.Rossi），临床癌症研究12，4605（2006）；G·韦德斯王（G.Wiedswang），B·拿米（B.Naume），自然肿瘤学临床应用4，154（2007））。治疗的有效性也可通过血液中的CTC数量来衡量（F·诺勒（F.Nole），E·穆宗（E.Munzone），L·佐尔兹诺（L.Zorzino），I·米歇尔拉（I.Minchella），M·萨尔瓦提斯（M.Salvatici），E·波特瑞（E.Botteri），M·米迪斯（M.Medici），E·瓦瑞，L·阿达莫利（L.Adamoli），N·罗特曼斯兹（N.Rotmensz），A·歌德赫希（A.Goldhirsch），M·T·山德里（M.T.Sandri），肿瘤学年报19，891（2008）；A·罗尔（A.Rolle），R·古恩在尔（R.Gunzel），U·帕克曼（U.Pachmann），B·威伦（B.Willen），K·赫夫肯（K.Hoffken），K·帕克曼，世界外科肿瘤学期刊3，18（2005））。因此，分离、量化和研究这些从外周血液中获得的细胞是很有益处。CTC在血液中的浓度很低，这造成了检测这些稀有细胞的技术难度（J·E·罗萨纳夫（J.E.Losanoff），W·朱，W·秦，F·曼奈尔罗（F.Mannello），E·R·索泰（E.R.Sauter），乳腺癌17，540（2008）；V·兹格希米德（V.Zieglschmid），C·赫尔曼（C.Hollmann），O·波克（O.Bocher），临床实验室科学评论42，155（2005））。

癌症患者血液中的CTC的绝对数量各不相同，取决于患者的状况。计算CTC的领先技术包括跟随免疫细胞化学检测的免疫磁性分离，如美国新泽西州的力登Veridex有限责任公司（强生公司）销售的细胞搜寻

系统（M·克利斯托法尼利（M.Cristofanilli），G·T·巴德，M·J·埃利斯，A·托佩克，J·马泰拉，M·C·米勒，J·M·鲁宾，G·V·多伊尔，W·J·阿拉德，L·W·特斯他滨，D·F·海耶斯，新英格兰医学期刊351，781（2004）；H·矢形（H.Yagata），S·中村（S.Nakamura），M·东井（M.Toli），H·坂东（H.Bando），S·大野（S.Ohno），A·片冈（A.Kataoka），临床肿瘤学国际期刊13，252（2008））。另一项领先技术是RT-PCR，指示外周血液中存在的CTC（L·A·马塔诺（L.A.Mattano），T·J·莫斯（T.J.Moss），S·G·艾默生（S.G.Emerson），癌症研究52，4701（1992）；C·P·施罗德（C.P.Schroder），M·H·瑞特斯（M.H.Ruiters），S·德容（S.deJong），A·T·泰伯斯克（A.T.Tiebosch），J·韦塞林（J.Wesseling），R·凡斯塔（R.Veenstra），J·德瓦利斯（J.de Varies），H·J·胡克斯特拉（H.J.Hoekstra），L·F·德雷杰（L.F.de Leij），E·G·德瓦瑞斯（E.G.de Vries），国际癌症杂志106，611（2003））。这些方法已被成功地展示在不同的癌症类型中（S·大钨（S.Dawood），K·Broglio，V·瓦莱罗（V.Valero），J·鲁宾，B·汉迪（B.Handy,），R·伊斯兰（R.Islam），S·杰克逊（S.Jackson），G·N·霍尔托巴吉（G.N.Hortobagyi），H·弗里切（H.Fritsche），M·克利斯托法尼利（M.Cristofanilli），癌症113，2422（2008）；R·萨塔尼克（R.Szatanek），G·Drabik，J·巴兰，P·科沃杰伊奇克（P.Kolodziejczyk），J·库里格（J.Kulig），J·斯塔储尔（J.Stachura），M·在穆巴拉（M.Zembala），肿瘤学报告19，1055（2008）；C·S·王（C.S.Wong），M·T·张（M.T.Cheung），B·B·马（B.B.Ma），E·潘辉（E.Pun Hui），A·C·陈（A.C.Chan），C·K·陈（C.K.Chan），K·C·李（K.C.Lee），W·卓（W.Cheuk），M·Y·林（M.Y.Lam），M·C·王（M.C.Wong），C·M·陈（CM.Chan），J·K·陈（J.K.Chan），A·T·陈（A.T.Chan），外科病理学国际期刊，16，（2008））。替代方法，如直接可视化检测（H·J·卡恩（H.J.Kahn），A·伯普里斯坦（A.Presta），L·Y·杨（L.Y.Yang），J·Blondal（J.Blondal），M·特鲁多（M.Trudeau），L·狄利克雷（L.Lickley），C·霍洛威（C.Holloway），D·R·麦克里迪（D.R.McCready），D·麦克林（D.Maclean），A·马克思（A.Marks），乳腺癌研究与治疗86，237（2004）），荧光激活细胞分选（FACS）（J·G·莫雷诺（J.G.Moreno），S·M·奥哈拉（S.M.O'Hara），S·格罗斯（S.Gross），G·多伊尔（G.Doyle），H·弗里切（H.Fritsche），L·G·葛美拉（L.G.Gomella），L·W·特斯他滨（L.W.Terstappen），泌尿学58，386（2001）），光纤阵列扫描技术（快速）血细胞计数器（R·T·Krivacic，A·拉丹尼（A.Ladanyi），D·N·库瑞（D.N.Curry），H·B·海斯河（H.B.Hsieh），P·库恩（P.Kuhn），D·E·博格斯如德（D.E.Bergsrud），J·F·凯珀若斯（J.F.Kepros），T·巴芭拉（T.Barbera），M·Y·何（M.Y.Ho），L·B·陈（L.B.Chen），R·A·勒纳（R.A.Lerner），R·H·布鲁斯（R.H.Bruce），美国科学院院报101，10501（2004））和涂覆微结构的抗上皮细胞粘附分子（S·纳格拉斯（S.Nagrath），L·V·斯奎斯特（L.V.Sequist），S·马赫斯瓦兰（S.Maheswaran），D·W·贝尔（D.W.Bell），D·伊里米亚（D.Irimia），L·犹库斯（L.Ulkus），M·R·史密斯（M.R.Smith），E·L·克沃克（E.L.Kwak），S·迪谷玛斯（S.Digumarthy），A·穆兹坎斯盖（A.Muzikansky），P·瑞恩（P.Ryan），U·J·巴利斯（U.J.Balis），R·G·汤普金斯（R.G.Tompkins），D·A·哈勃（D.A.Haber），M·汤纳（Toner），自然450，1235（2007））也被用于计算血液样品中的CTCs。复杂的程序、繁琐的检查和较长的处理时间是与大多数现有技术相关的限制性因素。此外，作为固定的样品，大多数现有技术需要分离的细胞失去生存力。

关于循环中CTCs的情况有了更多的了解（K·潘特尔（K.Pantel），R·H·布若肯赫夫（R.H.Brakenhoff），B·勃兰特（B.Brandt），自然癌症综述8，329（2008））并且在分离之后，活细胞将被允许在CTC亚群体中进行研究。这可能对疾病的生物学特性提供有价值的见解，如癌症干细胞和转移之间的联系。虽然近期工作是分离CTCs（S·纳格拉斯，L·V·斯奎斯特，S·马赫斯瓦兰，D·W·贝尔，D·伊里米亚，L·犹库斯，M·R·史密斯，E·L·克沃克，S·迪谷玛斯，A·穆兹坎斯盖，P·瑞恩，U·J·巴利斯，R·G·汤普金斯，D·A·哈伯，M·汤纳，自然450，1235（2007）），但是由于与肿瘤相关的抗原结合到所述装置上，可能很难重获分离的细胞。重获这些细胞可能需要强机械力或生化制剂，结果是这些细胞的完整性可能会受到影响（S·F·常（S.F.Chang），C·A·常（C.A.Chang），D·Y·李（D.Y.Lee），P·L·李（P.L.Lee），Y·M·叶（Y.M.Yeh），C·R·叶（C.R.Yeh），C·K·郑（C.K.Cheng），S·Chien（S.Chien），J·J·赵（J.J.Chiu），美国科学院院报105，3927（2008））。此外，大多数方法将需要一些功能性修改，这是不令人满意的（O·拉若（O.Lara），X·童（X.Tong），M·兹博罗夫斯基（M.Zborowski），J·J·查尔莫斯（J.J.Chalmers），实验血液学32，891（2004））。

现有技术方便了从样品中识别细胞，但每种技术都有着它们自己的缺点。

因此，期望提供一种改进的技术用于识别样品中的细胞。

发明内容

根据第一方面，提供了一种微流体装置，可操作的用于从生物流体中分离目标细胞，所述微流体装置包括：入口，可操作的用于接收生物流体，所述生物流体包括目标细胞和其它组分；废液出口，可操作的用于接收至少生物流体的其它组分；多个平行的连接入口和废液出口的细胞分离井阵列，每个平行的细胞分离井阵列响应于跨越其的压力差，支持生物流体从入口到废液出口的流动，每个阵列包括多个分离井，每个分离井尺寸为机械地捕获其中的目标细胞，同时允许生物流体的其它组分流动；和至少一个压力维持结构，可操作的用于协助维持跨越多个平行的细胞分离井阵列的每个的预定压力差。

该第一方面认识到，试图从测试样品中分离目标细胞是有实际困难的。例如，与正在被处理的测试样品的物理性质相关的困难，以及在试图最大化正被分离的目标细胞的数量时遇到的困难。例如，由于分离的目标细胞的浓度通常是非常低的，可能有必要增加正被处理的样品的量，或例如使用细胞分离的结构、井或陷阱来提高目标细胞的分离效率。处理量增加的样品，需要更多的时间。尽管通过串联放置更多的细胞分离结构以增加目标细胞被保留的可能性可以提高目标细胞的分离率，但由于流动阻力的增加，这通常在操作时需要增大压力。同样地，在可能平行放置更多数量的细胞分离结构以减少流动阻力的同时，维持跨越数量增加的、用以保留其中被分离细胞的细胞分离结构的统一的压力差是有困难的。

因此，提供了微流体装置，该微流体装置可操作的用于分离或捕获目标材料，如来自流体的细胞，该流体例如生物流体。样品入口可以接收可能含有目标细胞和其他组分的生物流体。可以提供废液出口，接收至少生物流体的其它组分中的一些。连接入口与废液出口的可以是多个平行的分离井阵列。每个平行阵列能使得：跨越分离井阵列应用压力差之后，流体从样品入口流向废液出口。每个阵列可包括多个分离井，每个分离井可尺寸化为物理地捕获目标细胞。分离井的这种配置可以减少捕获流体其他组分的可能性。提供一个或多个压力维持结构，有利于实现在被操作的装置内的压力差。

通过这种方式，可以看出提供了一种装置，该装置可以提供数量增加的平行的分离井阵列、以能够处理量增加的流体，从而增加被保留的目标细胞的数量。通过提供平行阵列，可以增加每单位时间可以处理的样品的量。这可以减少样品的处理时间，同时增加目标细胞的分离效率。另外，通过使用压力维持结构，每个平行的细胞分离结构阵列可以被有效地操作，以确保正确地处理样品。特别是，可以增加以可控的方式维持通过每个平行陷阱阵列的样品流的可能性。这有助于改善增加微流体装置规模的问题，这是很难的问题，因为很难在具有宽变化特性的样品的存在下可靠地实现可预测的流动。这样的方法可以在减少的时间量中加强捕获力度。此外，这还有利于扩大装置规模，并可以在微流体环境中改善所述系统的操作的问题。

在一个实施例中，所述至少一个压力维持结构包括：在入口和多个平行的细胞分离井阵列之间放置的初级预滤器阵列，所述初级预滤器阵列包括多行初级结构，所述初级结构尺寸化为机械地捕获生物流体内大于目标细胞的部分。一些测试样品（例如血液）的问题是，样品的质量可能是较差的，也可能遭受凝血。因此，样品可能会造成局部的堵塞或扰乱细胞分离井阵列内的流动。这种对流动的扰乱可能会阻止压力差被维持在跨越细胞分离井。因此，预滤器阵列可放置在样品入口和细胞分离井阵列之间。预滤器阵列可包括构造成捕获具有预定尺寸样品流体中的组分的结构。提供这样的预滤器阵列可以使松散物料得到保持。通过在细胞分离井之前提供预滤器阵列，可以使材料限制在主要的微流体结构以外，这使随后的微流体结构的规模能够相当的缩小，从而有利于缩小微流体装置的尺寸。将理解的是，预滤器阵列呈现的区域可确定有多少材料可以被保留。同样地，还将理解的是，每个初级结构之间的距离可能会影响能够通过预滤器阵列的材料的数量。此外，这样的预滤器阵列可用于捕获也可能包含CTC的栓子。这些可被染色并经由碎片移除出口重获，而不通过细胞分离井。

在一个实施例中，相邻的行具有相对于彼此偏移的初级结构。初级结构的行的偏移提供了机械坚固阵列，该机械坚固阵列是有效的过滤器，因为大的材料很可能会被这种偏移结构阻碍其路径。

在一个实施例中，每个初级结构呈现所述生物流体的流动宽度，且在行内的相邻初级结构之间的距离近似为该宽度。

在一个实施例中，每行中相邻的初级结构之间的距离减小。

在一个实施例中，相邻的初级结构之间的距离从大约100μm减小到30μm。

在一个实施例中，每行中初级结构呈现的宽度减小。

在一个实施例中，相邻行之间的距离大于所述宽度。

在一个实施例中，每个初级结构具有大致弯曲的横截面，提供大致弯曲的横截面有助于减少通过预滤器阵列的任何流动阻抗。此外，弯曲的或圆形的横截面减少通过预过滤器阵列的流体内的任何目标细胞上的额外应力。

在一个实施例中，每个初级结构包括圆柱形的柱。在一个实施例中，每个初级结构具有约20μm的半径，行中相邻的初级结构之间的距离是约20μm，相邻行之间的距离是约40μm。当然，将理解的是，预滤器阵列组件的尺寸通常将根据目标细胞的大小来确定，并且需要被捕获的大的材料的可能尺寸由被分析的流体的属性来确定。

在一个实施例中，将初级预滤器阵列以预定距离远离多个平行的细胞分离井阵列放置。远离细胞分离井阵列放置预滤器阵列有助于恢复均匀的流速以及均衡跨越细胞分离井阵列的压力。换句话说，通过在预滤器阵列和细胞分离井阵列之间提供缓冲区域以平衡任何局部的压力变化，可以减少预滤器阵列内任何局部的障碍对通过每个细胞分离井阵列的材料流的影响。

在一个实施例中，初级预滤器阵列包括放置在入口和多行初级结构之间的入口流动分配器，所述入口流动分配器包括流体通道形成的树。因此，流动分配器结构可以设置在入口和初级结构之间。这样的流动分配器将生物流体分布到多行初级结构中，以跨越初级结构的行提供均匀的压力分布，从而消除由堵塞引起的局部流动干扰的影响。树内的级别的数量越多，过渡越平缓。将理解的是，提供这样的入口流动分配器可能必要的，因为由于所述装置扩大到包括了许多的平行的初级预滤器阵列而成为必要，因此，可以有助于提供不受约束的可扩展性。

在一个实施例中，树的根级别呈现若干通向入口的流体通道，树的叶级别呈现通向多行的初级结构的'n'流体通道。将理解的是，所呈现的通向多行初级结构的流体通道的数目不需要与多行初级结构的第一行中的初级结构的数目完全匹配。

在一个实施例中，远离根级别、并朝向多行的初级结构的每个叶级别呈现至少一个额外的流体通道。

在一个实施例中，初级预滤器阵列包括在多行的初级结构和多个细胞分离井阵列之间放置的流动合并器，所述流动合并器包括流体通道形成的树。

在一个实施例中，微流体装置包括收集出口，可操作的用于接收由预滤器阵列捕获的碎片。

在一个实施例中，所述至少一个压力维持结构包括：在初级预滤器阵列和多个平行的细胞分离井阵列之间放置的次级预滤器阵列，所述次级预滤器阵列包括至少一行次级结构，该次级结构尺寸化为机械地捕获生物流体内大于目标细胞的部分。因此，可以提供放置在细胞分离井阵列和初级预滤器阵列之间的次级预滤器阵列。这样的次级阵列可以提高预过滤流体的能力。

在一个实施例中，每个次级结构呈现了生物流体的流动宽度，且在行中相邻的次级结构之间的距离小于该宽度。

在一个实施例中，次级预滤器阵列包括多行的次级结构。

在一个实施例中，每行中相邻的次级结构之间的距离减小。

在一个实施例中，每个次级结构具有通常直线形的横截面。

通过将呈现通常平坦区域的次级结构提供到细胞分离井阵列，可以对从细胞分离井到预滤器阵列的任何流动提供增加的阻力。这样布置可有助于在随后的处理中防止回流到入口，例如在冲洗或染色或重获目标细胞的处理中。

在一个实施例中，每个次级结构具有约35μm的宽度，行中相邻的次级结构之间的距离是约20μm。将再次理解的是，次级结构的确切尺寸需要使目标细胞能够通过，同时防止任何较大的部分通入到随后的结构中。

在一个实施例中，通过支撑结构来划分所述次级结构的行，所述支撑结构放置为与多个平行的细胞分离井阵列的每个边界对齐。提供的支撑结构可以提高次级预滤器阵列的机械完整性。通过将次级结构与细胞分离井阵列的边界对齐，来自预滤器阵列的材料的流动可以与细胞分离井阵列对齐，从而改善流动。

在一个实施例中，将次级预滤器阵列以预定距离远离多个平行的细胞分离井阵列放置。再次，通过将次级结构远离细胞分离井阵列放置，提供了缓冲区域，在所述缓冲区域内，尽管存在局部的障碍，但还可使出现压力平衡。

在一个实施例中，所述预定距离大约是500μm。当然，将理解的是，预滤器阵列和细胞分离井阵列之间的距离将取决于被处理的流体的特性和所述装置的尺寸。

在一个实施例中，所述至少一个压力维持结构包括：在多个平行的细胞分离井阵列和废液出口之间放置的流动合并器，所述流动合并器包括流体通道形成的树，可操作的用于维持通向多个平行的细胞分离井阵列的每个的所述出口呈现统一的压力。因此，流体合并结构可以设置在细胞分离井阵列和废液出口之间。如果没有这样的合并器，每个细胞分离井阵列所受到的压力可能会发生很大变化，这取决于所述废液出口与细胞分离井阵列的相对位置。例如，如果每个细胞分离井阵列直接连接到废液出口，那么那些物理位置上与废液出口最接近的将比那些相对较远的所受到的压力要小。这可能会导致细胞分离井阵列内流动的打乱，并可能会导致一个细胞分离井阵列中的流动会干扰到另一个中的流动。通过提供流动合并器，可以使跨越流体通道形成的树的每个级别的压力的分布更加均匀。树内的级别的数目越多，向废液出口的过渡越平缓。还将理解的是，提供这样的流动合并器可能由于所述装置扩大到包括了许多的平行分离井阵列而成为必要，因此，有助于提供不受约束的可扩展性。

在一个实施例中，树的根级别呈现一个通向废液出口的流体通道，树的叶级别呈现通向多个平行的细胞分离井阵列的'n'流体通道。将理解的是，所呈现的通向分离井阵列的流体通道的数目不需要与细胞分离井阵列的数目完全匹配。

在一个实施例中，均远离根级别、并朝向多个平行的细胞分离井阵列的每个叶级别呈现额外的流体通道。

在一个实施例中，流体通道具有约150μm的宽度。将理解的是，流动合并器的确切尺寸将取决于样品的特征和所述装置的尺寸。

在一个实施例中，微流体装置包括：目标细胞回收出口，并且其中所述至少一个压力维持结构包括：连接多个平行的细胞分离井阵列和目标细胞回收出口的导管，所述导管成形为限制流经所述导管的流动。因此，可以提供出口，通过该出口可以回收目标细胞。将理解的是，目标细胞可以从细胞分离井阵列中回收，并且目标细胞回收出口通常需要与那些细胞分离井阵列相结合。为了防止目标细胞回收出口的存在扰乱经过细胞分离井阵列的流动，可以提供导管，所述导管限制从细胞分离井阵列到目标细胞回收出口的流动。再次将理解的是，这有利于扩大所述装置以包括更多的细胞分离井阵列。

在一个实施例中，导管成形为通过引起流动方向的至少一个改变来限制流体的流动。虽然流动方向的改变可被用来限制流体的流动，将理解的是，可以等同地使用其他机制来限制流动。

在一个实施例中，导管成形为引起流动方向的至少两个正交的改变。

在一个实施例中，导管成形为引起流动方向的至少四个正交的改变。

在一个实施例中，导管的每个部分具有固定的宽度。

在一个实施例中，导管具有约50μm的宽度。当然，将理解的是，导管的确切尺寸将通常取决于需要回收的目标细胞的大小。

在一个实施例中，每个细胞分离井阵列包括沿流动方向间隔开的多个细胞分离井的子阵列；提供多个导管，每个导管连接子阵列和目标细胞回收出口。因此，不是提供仅仅一个用于从细胞分离井阵列回收目标细胞的导管，而是可以将细胞分离井阵列分裂成子阵列，并为这些子阵列的每个提供导管。将理解的是，这大大方便了从细胞分离井阵列中回收目标细胞。

在一个实施例中，每个导管由共同的连接有目标细胞回收出口的导管接收。

在一个实施例中，废液出口和目标细胞回收出口可操作的用于维持压力差，以引起平行的细胞分离井阵列内流动方向的改变，从而释放捕获的细胞并运送到目标细胞回收出口进行释放。

在一个实施例中，所述至少一个压力维持结构包括：连接多个平行的细胞分离井阵列和入口的流动分配器，所述分配器包括流体通道形成的树。再次将理解的是，这有利于扩大所述装置以包括更多的细胞分离井阵列。流动分配器可以设置在入口或任何过滤器和细胞分离井阵列之间。这样的流动分配器将生物流体分布到细胞分离井阵列中，以提供跨越细胞分离井阵列的均匀的压力分布，并避免堵塞造成的局部流动扰乱造成的影响。树内的级别的数目越多，过渡越平缓。将理解的是，提供这样的入口流动分配器可能由于所述装置扩大到包括许多平行的初级预滤器阵列而成为必要，因此，有助于提供不受约束的可扩展性。

在一个实施例中，树的根级别呈现若干通向入口的流体通道，树的叶级别呈现通向细胞分离井阵列的'n'流体通道。将理解的是，所呈现的通向细胞分离井阵列的流体通道的数目不需要与细胞分离井阵列的数目完全匹配。

在一个实施例中，都远离根级别、并朝向多个细胞分离井阵列的每个叶级别呈现至少一个额外的流体通道。

在一个实施例中，微流体装置包括：目标细胞回收出口，并且所述流动分配器连接多个平行的细胞分离井阵列与目标细胞回收出口。因此，可以提供出口，通过该出口可以回收目标细胞。将理解的是，目标细胞可以从细胞分离井阵列中回收，并且目标细胞回收出口通常需要与那些细胞分离井阵列相结合。为了便于目标细胞的回收，流动分配器有效收集细胞提供均匀的流动区域。再次将理解的是，这有利于扩大装置，以包括更多的细胞分离井阵列。当流动反向并提供给目标细胞回收出口时，这样的配置有助于浓缩从细胞分离井阵列中回收目标细胞。

在一个实施例中，目标细胞回收出口位于多个平行的细胞分离井阵列的入口侧。

在一个实施例中，微流体装置包括：试剂入口，可操作的用于接收试剂，所述试剂入口包括导管，所述导管可操作的用于在入口和多个平行的细胞分离井阵列之间运送试剂。因此，可以添加试剂与微流体装置中的物质发生反应。

在一个实施例中，所述导管可操作的用于在初级预滤器阵列和次级预滤器阵列之间运送试剂。因此，可以在预滤器阵列和细胞分离井阵列之间加入试剂，以避免在预滤器阵列内的任何堵塞，使试剂能够更迅速地到达目标细胞。

在一个实施例中，所述试剂包含至少一种荧光原位杂交试剂。

在一个实施例中，所述试剂包括第一荧光探针和第二荧光探针中的至少一个。

在一个实施例中，在试剂入口和多个平行的细胞分离井阵列之间提供初级预滤器阵列。

在一个实施例中，每个细胞分离井阵列在入口和出口之间平行连接。

在一个实施例中，细胞分离结构包括月牙状结构，该月牙状结构可操作的用于保留目标细胞，例如，肿瘤细胞、胎儿细胞或干细胞。

在一个实施例中，每个细胞分离结构在月牙状结构中限定至少有一个间隙。

在一个实施例中，每个间隙大约6μm到9μm。

在一个实施例中，月牙状结构沿倾斜轴倾斜，所述倾斜轴相对于经过细胞分离井阵列的流动方向非正交。

在一个实施例中，每行的细胞分离井内的每个细胞分离井沿相同的倾斜轴倾斜。

在一个实施例中，相邻行的细胞分离井内的每个细胞分离井沿相对的倾斜轴倾斜。

在一个实施例中，每行内的细胞分离井通过间隙被隔开，相邻行内的细胞分离井被放置为与间隙对齐。

在一个实施例中，相邻行的细胞分离井之间的距离沿从入口到出口的流动方向增加。

依据第二方面，提供了一种从生物流体中分离目标细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在入口处接收生物流体，所述生物流体包括目标细胞和其他组分；跨越连接入口与废液出口的多个平行的细胞分离井阵列施加压力差，所述废液出口可操作的用于接收至少生物流体的其它组分，每个平行的细胞分离井阵列响应于跨越其的压力差支持生物流体从入口到废液出口流动，每个细胞分离井阵列包括多个分离井，每个分离井尺寸化为机械地捕获其中的目标细胞，同时允许生物流体的其他组分流动；和维持跨越所述多个平行的细胞分离井阵列中的每个的预定压力差。

在一个实施例中，维持预定的压力差包括以下步骤：在入口和多个平行的细胞分离井阵列之间放置初级预滤器阵列，所述初级预滤器阵列包括多行初级结构，所述初级结构尺寸化为机械地捕获生物流体内大于目标细胞的部分。

在一个实施例中，相邻行具有相对于彼此偏移的初级结构。

在一个实施例中，每个初级结构呈现生物流体的流动宽度，且行内的相邻初级结构之间的距离相近为该宽度。

在一个实施例中，每行中相邻的初级结构之间的距离减小。

在一个实施例中，相邻的初级结构之间的距离从大约100μm减小到30μm。

在一个实施例中，每行中初级结构呈现的宽度减小。

在一个实施例中，每个初级结构具有深度，并且相邻行之间的距离大于所述宽度。

在一个实施例中，每个初级结构具有大致弯曲的横截面。

在一个实施例中，每个初级结构包括圆柱形的柱。

在一个实施例中，每个初级结构具有约20μm的半径，在行中相邻的初级结构之间的距离是约20μm，相邻行之间的距离是约40μm。

在一个实施例中，放置步骤包括：将初级预滤器阵列以预定距离远离多个平行的细胞分离井阵列放置。

在一个实施例中，初级预滤器阵列包括放置在入口和多行的初级结构之间的入口流动分配器，所述入口流动分配器包括流体通道形成的树。

在一个实施例中，树的根级别呈现若干通向入口的流体通道，树的叶级别呈现通向多行的初级结构的'n'流体通道。

在一个实施例中，每远离根级别、并朝向多行初级结构的每个叶级别呈现至少一个额外的流体通道。

在一个实施例中，初级预滤器阵列包括在多行初级结构和多个细胞分离井阵列之间放置的流动合并器，所述流动合并器包括流体通道形成的树。

在一个实施例中，所述方法包括施加压力差的步骤，以接收由预滤器阵列在收集出口处捕获地碎片。

在一个实施例中，所述维持预定的压力差的步骤包括以下步骤：在初级预滤器阵列和多个平行的细胞分离井阵列之间放置次级预滤器阵列，所述次级预滤器阵列包括至少一行次级结构，所述次级结构尺寸化为机械地捕获生物流体内大于目标细胞的部分。

在一个实施例中，每个次级结构呈现生物流体的流动宽度，并且行中相邻的次级结构之间的距离小于该宽度。

在一个实施例中，次级预滤器阵列包括多行的次级结构。

在一个实施例中，每行中相邻的次级结构之间的距离减小。

在一个实施例中，每个次级结构具有通常直线形的横截面。

在一个实施例中，每个次级结构具有约35μm的宽度，行中相邻的次级结构之间的距离是约20μm。

在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：通过支撑结构来划分次级结构的行，所述支撑结构放置为与多个平行的细胞分离井阵列的每个边界对齐。

在一个实施例中，所述放置的步骤包括：将次级预滤器阵列以预定距离远离多个平行的细胞分离井阵列放置。

在一个实施例中，所述预定距离大约是500μm。

在一个实施例中，所述维持预定的压力差的步骤包括以下步骤：在多个平行的细胞分离井阵列和废液出口之间放置流动合并器，所述流动合并器包括流体通道形成的树，可操作的用于维持通向多个平行的细胞分离井阵列的每个的所述出口呈现统一的压力。

在一个实施例中，树的根级别呈现一个通向废液出口的流体通道，树的叶级别呈现通向多个平行的细胞分离井阵列的'n'流体通道。

在一个实施例中，远离根级别、并朝向多个平行的细胞分离井阵列的每个叶级别呈现额外的流体通道。

在一个实施例中，流体通道具有约150μm的宽度。

在一个实施例中，所述维持预定的压力差的步骤包括以下步骤：提供连接多个平行的细胞分离井阵列与目标细胞回收出口的导管，导管成形为限制流所述导管的流动。

在一个实施例中，所述方法包括从目标细胞回收出口回收目标细胞的步骤。

在一个实施例中，所述从目标细胞回收出口回收目标细胞的步骤包括通过在废液出口和目标细胞回收出口之间施加压力差来反转通过细胞分离井的流动。

在一个实施例中，导管成形为通过引起流动方向的至少一个改变来限制流体的流动。

在一个实施例中，导管成形为引起流动方向的至少两个正交的改变。

在一个实施例中，导管成形为引起流动方向的至少四个正交的改变。

在一个实施例中，导管的每个部分具有固定的宽度。

在一个实施例中，导管具有约50μm的宽度。

在一个实施例中，每个细胞分离井阵列包括沿流动方向间隔开的多个细胞分离井的子阵列；所提供多个导管，每个导管连接子阵列与目标细胞回收出口。

在一个实施例中，每个导管由共同的连接有目标细胞回收出口的导管接收。

在一个实施例中，所述从目标细胞回收出口回收目标细胞的步骤包括通过在废液出口和目标细胞回收出口之间维持压力差来反转经过分离井的流动，以引起在平行的细胞分离井阵列内流动方向的改变，从而释放将被运送到目标细胞回收出口的已被捕获的细胞。

在一个实施例中，所述维持预定的压力差的步骤包括以下步骤：提供连接多个平行的细胞分离井阵列与入口的流动分配器，所述流动分配器包括流体通道形成的树。

在一个实施例中，树的根级别呈现若干通向入口的流体通道，树的叶级别呈现通向细胞分离井阵列的'n'流体通道。

在一个实施例中，远离根级别、并朝向多个细胞分离井阵列的每个叶级别呈现至少一个额外的流体通道。

在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：提供目标细胞回收出口，所述流动分配器连接多个平行的细胞分离井阵列与目标细胞回收出口的。

在一个实施例中，所述方法包括从目标细胞回收出口回收目标细胞的步骤。

在一个实施例中，所述从目标细胞回收出口回收目标细胞的步骤包括通过在至少一个缓冲端口（buffer port）和废液出口和目标细胞回收出口之间施加压力差来反转通过细胞分离井的流动。

在一个实施例中，所述方法包括在多个平行的细胞分离井阵列的入口侧放置目标细胞回收出口。

在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：在试剂入口处接收试剂，试剂入口包括导管，导管可操作的用于在入口和多个平行的细胞分离井阵列之间运送试剂。

在一个实施例中，导管用于在初级预滤器阵列和次级预滤器阵列之间运送试剂。

在一个实施例中，所述试剂包含至少一种荧光原位杂交试剂。

在一个实施例中，所述试剂包括第一荧光探针和第二荧光探针中的至少一个。

在一个实施例中，在试剂入口和多个平行的细胞分离井阵列之间提供初级预滤器阵列。

在一个实施例中，每个细胞分离井阵列在入口和出口之间平行连接。在一个实施例中，细胞分离结构包括月牙状结构，该月牙状结构可操作的用于保留目标细胞，例如肿瘤细胞、胎儿细胞或干细胞。在一个实施例中，细胞分离结构包括“U”或“V”型结构。

在一个实施例中，每个细胞分离结构在月牙状结构中限定至少有一个间隙。

在一个实施例中，每个间隙大约6μm到9μm。

在一个实施例中，月牙状结构沿倾斜轴倾斜，所述倾斜轴相对于经过细胞分离井阵列的流动方向非正交。

在一个实施例中，行内的细胞分离井内的每个细胞分离井沿相同的倾斜轴倾斜。

在一个实施例中，相邻行的细胞分离井内的每个细胞分离井沿相对的倾斜轴倾斜。

在一个实施例中，每行内的细胞分离井通过间隙被隔开，相邻行内的细胞分离井被放置为与间隙对齐。

在一个实施例中，相邻行的细胞分离井之间的距离沿从入口到出口的流动方向增加。

在一个实施例中，所述方法包括进行荧光原位杂交（FISH）的步骤。将理解的是，这可以在分离井内的细胞上进行，或者细胞可以转移到装置内或装置外的另一种结构中以进行FISH。

在一个实施例中，所述方法包括进行二次荧光原位杂交（FISH）的步骤。通过这种方式，由于细胞是固定的，可以研究细胞的亚群体，并且可以确定是何种细胞表达了何种蛋白质。

随附的独立和从属权利要求陈述了本发明的进一步的具体和优选的方面。从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征进行适当的组合，并且为那些权利要求中明确陈述以外的组合。

除另有说明外，本发明的实践将使用在生物化学、细胞和分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术中，这些技术在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术在文献中得到解释。见，例如，J·萨姆布鲁克（J.Sambrook），E·F·弗里奇（E.F.Fritsch），T·曼尼阿蒂斯（T.Maniatis），1989，分子克隆：实验室手册，第二版，图书1-3，冷泉港实验室出版社；奥苏贝尔·F.·M.（Ausubel,F.M.）等（1995和定期补充卷；最新分子生物学技术，9、13和16章，约翰威利父子（John Wiley&Sons），纽约州，纽约）；B·罗伊（B.Roe），J·瑰珀翠（J.Crabtree），A·卡恩（A.Kahn），1996，DNA分离和序列分析：基本技术，约翰威利父子；J·M·波拉克（J.M.Polak）和詹姆斯O'D·麦吉（James O'D.McGee），1990，原位杂交：原理与实践；牛津大学出版社：M·J·盖特（M.J.Gait）（主编），1984，寡核苷酸合成：一种实用的方法，爱尔兰出版社；D·M·J·李立（D.M.J.Lilley）和J·E·达尔贝里（J.E.Dahlberg），1992，酶学方法：DNA结构部分A：酶学中DNA方法的合成和物理分析，科学出版社；使用抗体：实验室手册：便携式协议NO.I，由爱德华·哈洛里（Edward Harlow），大卫·莱茵（David Lane），爱德·哈洛（Ed Harlow）著（1999，冷泉港实验室出版社，出版号0-87969-544-7）；抗体：实验室手册，由爱德·哈洛（主编），大卫·莱茵（主编）（1988，冷泉港实验室出版社，出版号0-87969-314-2），1855。药物筛选手册，由若玛克里桑娜·司萨拉（Ramakrishna Seethala），颇若伯哈瓦斯·B·费尔南德斯（Prabhavathi B.Fernandes）著（2001，纽约州，纽约，马塞尔·德克尔（Marcel Dekker），ISBN0-8247-0562-9）；和实验室参考：食谱、试剂和其他在工作台使用的参考工具的手册，由简·罗斯凯姆斯（JaneRoskams）和琳达·罗杰斯（Linda Rodgers）编著，2002，冷泉港实验室，出版号0-87969-630-3。这些中的每个大体的文本通过引用合并于此。

附图说明

现将进一步地描述本发明的实施例，参照附图，其中：

图1示出了根据一个实施例的并入诊断系统的微流体装置；

图2示出了制造的微流体装置10的实验室原型；

图3更详细地示出了根据一个实施例微流体装置的配置；

图4A更详细地示出了第一预滤器阵列的结构；

图4B更详细地示出了次级预滤器的结构；

图4C更详细地示出了多个细胞分离井阵列的结构;

图4D更详细地示出了梯度发生器的结构；

图4E更详细地示出了限流器的结构；

图5更详细地示出了的细胞分离井；

图6更详细地示出了根据另一个实施例的微流体装置的配置；

图7A、图7B和图7C更详细地示出了流动合并器；

图8更详细地示出了预滤器阵列；

图9更详细地示出了细胞分离井。

详细描述

本发明的示例性实施例的描述如下。癌症转移是癌症相关死亡的主要原因。此外，临床报告显示疾病的发展与癌症患者外周血液中循环肿瘤细胞的数目之间有着较强的相关性。根据实施例，提供了一种无标记的微流体装置，能够通过目标细胞的独特的、不同的物理性能（如变形性和尺寸）从全血中分离目标细胞，如肿瘤细胞或其它细胞。在乳房癌、结肠癌和其他类型的肿瘤细胞株上进行了测试，分离的效率是平均至少80％。还获得了有生存力的细胞，得到了进一步地观察，以提高对转移过程的理解。

对比常规的生化技术，根据实施例的微流体装置提供了一种在血液中分离有生存力的癌细胞的机械的和有效的方法。微流体装置有潜力在临床设置中用于癌症发展和癌症治疗的常规监测。根据实施例，提供了一种装置，所述装置提供了一种具有高流通量和高效率的从外周血中计算并分离有生存力的CTC或其他目标细胞的方法。CTC的分离和量化提供了一种替代的疾病标记物，有助于监测癌症的发展以及确定总的生存期。根据实施例，重获有生存力的CTC有助于进一步研究对于疾病的关键生物决定因素，这可能会对疾病的杀伤力提供见解。与大多数现有的方法相比，根据实施例，以较少的步骤从血液中分离CTC或其他目标细胞的能力降低了得到重要疾病信息的复杂性。大多数现有的方法需要繁琐、费时的多次富集和鉴定程序。根据实施例的装置能够对全血样品进行直接处理。此外，在大多数现有方法中细胞的生存力受到了损害。即使现有技术使用抗上皮细胞粘附分子（EpCAM）涂覆的微观结构能够分离有生存力的CTC，但重获是一个挑战，因为需要高剪切流来打破生化结合的亲和力。此外，将错过上皮细胞粘附分子的负性的（negative）CTC。

微流体装置相对于常规的生化分离，提供了一种替代技术。所述装置利用介电电泳力对分离和控制细胞是有利的，因为它们不要求样品或微流体装置的功能化（P·Y·邱（P.Y.Chiou），A·T·太田（A.T.Ohta），M·C·吴（M.C.Wu）,自然436,370-372(2005)；D·S戈瑞（D.S.Gray），J·L·谭（J.L.Tan），J·沃尔德曼（J.Voldman），C·S·陈（C.S.Chen），生物传感器与生物电子学19，771-780（2004）；D·S·戈瑞，J·L·谭，J·沃尔德曼，C·S·陈，生物传感器与生物电子学19,771-780(2004)；A·罗森塔尔（A.Rosenthal），J·沃尔德曼，生物物理学期刊88，2193-2205(2005)；J·沃尔德曼，生物技术新见17,（2006））。然而，高效的肿瘤细胞分离可能是困难的，因为在血液中CTC或其他目标细胞的浓度较低，并且白细胞与癌细胞的大小相对类似。

根据实施例，通过利用CTC或其他目标细胞不同于血液成分的特有流变学差异的生物力学分离方法，通过控制输入/输出条件，重获CTC或其它目标细胞比较容易实现。另外，没有必要对装置或CTC或其它目标细胞进行功能性的生物化学修饰，来保持CTC或其它目标细胞的完整性。实施例的微系统具有高流通量，能够在几分钟之内处理血液样品。进一步地，实施例允许分离过程的实时可视化。此外，系统可以提供使用均一阵列计算目标细胞（如CTC）的简单的方法。另外，所述装置可允许实时计算分离的细胞。

例如，实施例中启用荧光原位杂交（FISH）。这样的技术可用于检测和定位目标细胞的染色体上的存在或不存在特定DNA序列。荧光探针通过试剂入口150进入，所述荧光探针仅结合到与染色体表现出高度的序列相似性的那些部分。荧光显微镜可用来找出荧光探针与染色体结合的位置。FISH也可用于检测和定位样品内特定的mRNA，并可以帮助明确细胞和组织内的基因表达的空间-时间模式。在实施例中，FISH涉及固定细胞（即，杀死细胞和化学交联蛋白质、核酸），将所固定的细胞暴露给染色剂使其可见。染色剂通常是结合到DNA的部分的核酸探针，并具有荧光标记，以使染色体可见。在第一轮中，微流体装置10能够使目标细胞得到筛选，在分离井190中得到固定，然后使其可见或染色以确定目标细胞。例如，识别肿瘤细胞的染色剂可以用来（例如，在细胞表面上表达的、结合到肿瘤特异性抗原的抗体）识别已被筛选出的哪些细胞是肿瘤细胞。使用FISH染色的第二轮可用来观察那些特定细胞的染色体（例如，看是否存在可能与肿瘤显型有关的染色体的断裂）。因此，双重染色是可能的。由于目标细胞固定在分离井190中，在分离井中目标细胞在筛选的过程中被捕获，可能增加这样的确定性：使用第一染色剂识别的任何细胞均是使用第二染色剂之后正被检查的细胞。在阵列中，积极地来自第一信号的那些位置的FISH信号可以简单地进行检查。没有固定，是不可能做到这一点的。FISH可以在分离井190中的目标细胞上进行，或是可以在微流体装置10上的FISH结构（未示出）内部或微流体装置10外部进行。例如，一个单独的通道（未示出）可以设置在微流体装置10的一侧（具有适当的接头用于试剂的引入），FISH可以在通道内执行，或替代的或额外的，可以设置另外的结构（未示出）使少量的试剂能够定位在靠近分离井的地方，并用管通向分离井，以便使用最少量的试剂。根据所使用的染色剂，可能需要额外的入口端口和导管。

根据实施例的装置在帮助临床医生在肿瘤疾病的监测和重获有生存力的CTC或其他目标细胞以用于进一步的分析中具有潜在的应用。装置的易用性和可携带性相对现有的方法呈现了有吸引力的替代方法。高流通量确保了诊断结果的快速恢复时间，它可以帮助及时用药，有助于更好地获得生存的机会。

根据实施例的装置是根据细胞的生物流变学制造的，并依赖于细胞的可变形性和尺寸。研究各种不同类型的细胞的生物流变学可用来确定所述装置的尺寸。在这些研究中，可以使用新鲜的细胞样品确保一致的生物流变学性能。根据实施例，提供了一种微流体装置，仅利用癌细胞和血液成分的生物流变学性能差异从全血中分离目标细胞，诸如乳腺和结肠起源中的有生存力的癌细胞。不需要对微流体装置的进行任何功能性修饰，因为分离仅仅依赖于目标细胞的生物流变学性能差异，目标细胞例如癌细胞和血液成分。过去的研究已经表明病变细胞的剪切模量、刚度、尺寸和/或可变形性（L·魏斯（L.Weiss），癌症研究进展54，（1990）；L·魏斯，D·S·季米特洛夫（D.S.Dimitrov）,理论生物学期刊121,307（1986））是特有的、不同于血液成分的（H·穆罕默德（H.Mohamed），L·D·麦柯迪（L.D.McCurdy），D·H·斯扎若斯奇（D.H.Szarowski），S·杜瓦（S.Duva），J·N·特纳（J.N.Turner），M·卡格纳（M.Caggana），IEEE纳米生物科学汇刊3,251（2004)）；J·P·谢尔比（J.P.Shelby），J·怀特(J.White)，K·甘乃森（K.Ganesan），P·K·拉舍得（P.K.Rathod），和D·T·邱(D.T.Chiu)，美国科学院院报100，2003）。采用的方法利用这个差异以实现血液中癌细胞的高纯度分离。基于生物流变学差异分离样品的可行性研究也已成功地进行了（S·J·谭（S.J.Tan），L·犹巴斯（L.Yobas），G·Y·H·李（G.Y.H.Lee），C·N·王（C.N.Ong），C·T·林（C.T.Lim），生物计算学、生物信息学和生物医学技术的国际会议，2008，生物技术'08（2008））。分离过程在一个单个步骤中实现，保存了这些细胞的完整性和生存力。通过控制和操纵根据实施例装置中的流动条件来重获分离的细胞也是很简单的。

所述装置的设置包含两个主要部分来处理样品，如血液。压力控制组件通过计算机的软件控制维持所需的压力设定，进而驱动血液样品进入到装置中或通过装置抽出血液样品。所述装置对阻碍在细胞分离区域中的细胞的物理特性起作用，如血液细胞中的癌细胞。添加预滤器用以解释凝固，所述凝固可能存在于血液中，并且压力设定的变化将允许重获的目标细胞进入收集点。装置中的直接免疫荧光染色也可以用于计算和纯度鉴定。

微流体装置可用于捕捉和分离目标细胞以达到诊断和预防的目的，目标细胞如癌症患者的外周血液中的循环肿瘤细胞。微流体装置在肿瘤学研究中的应用是有吸引力的，特别是预知和预测药物的反应。实施例克服了由血液中较低的癌症细胞计数与大量的样品量相结合形成的技术挑战。通过利用血液中癌细胞的生物力学性能差异，实施例实现了癌细胞的有效分离。

概述

如下将更详细地进行说明，为了捕获足够数量的细胞，需要提供分离目标细胞的生物力学方法。生物力学分离的实际应用存在一个问题，由于为了捕获足够数量的目标细胞，因此需要处理大量的血液。为了能够处理大量的血液，可取的是增加微流体装置的规模，但是在控制通过装置各部分的流动时存在实际困难，特别是，维持用来机械地分离目标细胞的所需的跨越任何结构压力差。因此，提供了若干配置，该配置促进所需流动和微流体装置的部分的压力差，使所述装置能够处理大量的样品，如血液。

图1示出了诊断系统，通常为100，包含根据一个实施例的微流体装置10。应当理解的是，诊断系统100也可用于下面图6中示出的另一种微流体装置10'替换。所述诊断系统100包括控制系统20，所述控制系统20与包含微流体装置10的微流体装置组件30连接。微流体装置组件30包括与微流体装置10连接的含有待分析样品的样品注射器40。在控制系统20的控制下，样品注射器40供应其中所含的样品到微流体装置10的样品入口50。经由废液出口60，还与微流体装置10连接的是废液注射器70。所述废液注射器70也由控制系统20控制，并接收从微流体装置10流出的流体。还与微流体装置10连接的是细胞收集注射器80，用于接收由微流体装置10捕获、经由目标细胞出口90提供的目标细胞。还与微流体装置10连接的是一个或多个试剂注射器（未示出），提供试剂进入微流体装置10，以便与微流体装置内的流体和/或目标细胞进行相互作用，以辅助随后的分析。还与微流体装置10连接的是一个或多个堵塞注射器（未示出），用于在其内收集微流体装置10内被收集的大型废料。微流体装置组件30包括可安装在显微镜、密封管和微流体装置10上的定制固定器。

控制系统20通过经由计算机110的软件控制维持所需的压力设定，计算机110驱动可编程注射器泵120施加压力差给注射器以控制流体流过微流体装置10。特别是，可编程注射器泵120施加压力差给样品注射器40和废液注射器70以控制从入口50到废液出口60的流动。可编程注射器泵120也可控制试剂在微流体装置10中的应用，并控制注射器便于收集从微流体装置10进入细胞收集注射器80的目标细胞和便于收集从微流体装置10到堵塞注射器的大型废料。

为了便于控制注射器，压力传感器130与注射器相连，这些注射器经由作为接口装置的万用表140向计算机110提供压力值。这样的配置允许用于样品分析的半自动化处理。分离样品中目标细胞的效率很可能依赖于所使用的压力设定，该配置能够实现这样的压力设定。压力控制比连续注射更受到青睐，因为它防止流体进入装置，由于碎片大，所述装置中应设有一个障碍。这允许采取补救措施，使得不会被浪费潜在地珍贵的样品。压力设定可被定期监察，并可使用软件控制可编程注射泵120（以LabVIEW（虚拟仪器）编码）来做出调整，例如每100毫秒。通过压缩或扩展附属于注射器泵120的注射器，在连接到微流体装置10的连接管中产生差压。

概述来说，如下所述操作微流体系统100。首先，将待分析的样品放置在样品注射器40中，其随后将联接到样品入口50。可编程注射器泵施加压力差以迫使样品进入样品入口50。样品通过微流体装置10，微流体装置10捕获其中的目标细胞，如下将更详细地进行说明。从废液出口60出现的样品中任何未被捕获的目标细胞和其它组分被接收到废液注射器70中。

一旦样品注射器40提供了所需的样品量，样品注射器40可保持静止，同时一个或多个试剂注射器被激活以运送多种试剂中的一种进入微流体装置10。可继续在废液注射器70中收集剩余的液体，可扩展废液注射器70以协助维持所需的压力差和流动方向。一旦引入任何所需的试剂，那么微流体装置10内捕获的目标细胞可直接在原位被分析。额外地或可选地，捕获的目标细胞可以从微流体装置10中回收。通常，这是通过改变经过微流体装置10的流动的方向朝向目标细胞出口90以在细胞集合注射器80中进行存储来实现的。这可这样实现：将样品注射器40保持在静止的状态，同时扩展细胞收集注射器80，并且或者收缩废液注射器70、或者收缩连接到废液出口60处或者附近的一个点的、含有温和液体的注射器。如下将更详细地进行说明，由反向压力差引起地反向流动能够使捕获的目标细胞能够脱离微流体装置10内的结构，并向细胞收集注射器80行进。

微流体装置-第一实施例

图2示出了制造的微流体装置10的实验室原型。使用键合到载玻片上的生物相容聚合物（聚二甲基硅氧烷）通过软光刻技术实现该装置制造。

图3更详细地示出了微流体装置10的配置。可以看出，微流体装置10具有样品入口50，废液出口60和目标细胞出口90。此外，所述装置具有试剂入口150和碎片移除出口160。碎片移除出口160通常连接到碎片注射器（未示出），以使不能通过微流体装置10的大型的物品碎片被去除，如下将更详细地进行说明。此外，被捕获的栓子也可能包含CTC，该被捕获的栓子可被染色，并通过碎片移除出口160重获。

微流体装置包括：第一预滤器阵列170，执行样品的初级预过滤以捕获大型碎片，如血块或其它大的部分；次级预滤器180；多个细胞分离结构阵列190，捕获目标细胞；和压力梯度发生器200。此外，限流器210设置在细胞分离井阵列和目标细胞出口90之间。

预滤器阵列170、180的配置与梯度发生器200和限流器210的配置一起使得能够提供具有许多平行的细胞分离井阵列的大规模装置，这是因为能够实现那些细胞分离井阵列中的每个的统一的流量和压力差。

装置操作

概述来讲，微流体装置10的操作如下。首先，通过样品入口50引入样品，并在入口50和废液出口60之间产生压力差以引起一般沿A方向通过装置的流动。这会导致被测试的样品通过初级预滤器170和次级预滤器180。预滤器预过滤样品，从而在样品提供给微流体装置10之前，不再需要对样品进行前处理。样品内的任何大型碎片很可能被截留在预滤器阵列中。如有遇到一些特别大的碎片，则可产生一个压力差，以使得从碎片移除出口160流出，例如收缩连接到入口50、试剂口150或废液出口60的注射器，并扩展连接有碎片移除出口160的注射器，以驱逐任何可能会阻止流动的大的部分，从而将它们从微流体装置10移除。将理解的是，这样的堵塞将通过压力传感器130被检测到。

预过滤的样品随后进入到多个细胞分离井阵列190中。细胞分离井利用了目标细胞相对于样品中其它细胞可能具有不同力学性能的特点。例如，肿瘤细胞可以是硬的，一般大于大多数血细胞，当肿瘤细胞通过细胞分离结构时血细胞将阻碍其流动。这样目标细胞将保留在细胞分离结构中，同时允许其他成分流过。通过维持引起一般沿A方向流动的压力差，目标细胞仍可保留在细胞分离井中。

一旦样品通过了微流体装置10，样品注射器40通常是空的，随后试剂可以经由试剂入口150引入。于是，微流体装置10使目标细胞能够在原位进行免疫荧光染色，以量化并计算它们或引导它们到目标细胞出口90用于回收。芯片染色的好处在于通过避免任何中间的预备步骤简化了操作，最大限度地减少由于样品转移造成的细胞损失，以最大限度地提高收率。此外，试剂用量最小，因为微流体装置10的内部体积小。对于免疫荧光染色，样品入口50是关闭的，试剂入口150是打开的。按照标准的免疫荧光协议，芯片染色可通过依次流过每个试剂来完成。手动地或使用商业图像处理软件实现读出，从而使用普通荧光显微镜或任何兼容的阵列扫描仪来确定携带肿瘤标志物的细胞。

一旦完成所有芯片程序，目标可通过产生的压力差将耙细胞从装置移除用于外部的处理或分析，所述压力差引起细胞分离井阵列内通常沿A的反方向、朝向目标细胞出口90的流动。通过扩展连接到目标细胞出口90的注射器和收缩连接到废液出口60的注射器，这是可能实现的。这样可驱逐分离井中被捕获地任何目标细胞，并让它们流向目标细胞出口90。

第一预滤器阵列

图4A更详细地示出了第一预滤器170阵列的结构。由于癌症患者血液中具有相当多的堵塞，也由于微栓子的存在（已脱落的肿瘤碎片），因此预过滤是至关重要的。第一预滤器阵列170包括了结构220阵列。这些结构形成为按行和列的阵列。每一行从它的相邻列偏移。在本实施例中，第一预滤器阵列170包括多个20μm的圆形结构，并且在每行中的结构之间具有20μm的间隙。每个相邻行之间具有40μm的间隙。每个相邻行通过另一个20μm偏移，以确保大型物料团块保持在适当位置。所述间隙充分地大于细胞，以允许细胞轻易地通过预滤器阵列170。每行之间的距离设定为60μm，以允许样品顺畅地流动。在遭受长期储存的或不适当地储存的样品中会很可能地出现团块。在血液到达分离阵列190之前，第一预滤器阵列170应有效地移除这样的团块，以使他们不妨碍样品的处理。虽然本实施例具有均匀间距的结构220，但将理解的是，可以配置间距以减少流动的方向上的间距（即220可以是级联结构，其中具有越来越小的间隙）。同样地，可提供一系列具有不同直径和不同流动间隙的不同的结构220，这些结构220可以相对较小（如在水过滤系统中）以捕获微栓子。

次级预滤器

图4B更详细地示出了次级预滤器180的结构。提供了次级预滤器180以助于防止可能已通过第一预滤器170的任何大型碎片进入细胞分离井190阵列。次级预滤器180相距初级预滤器170一定距离，以使流量正常化并均衡在第一预滤器阵列170中由于任何堵塞所造成的任何局部的压力变化。同样地，次级预滤器阵列180相距细胞分离井190一定距离，以提供这样正常化的流量和压力。

所述次级预滤器阵列180包括一行的结构。在本实施例中，提供了一行具有35μm到20μm大小的矩形的障碍230，障碍之间间隔有20μm的间隙。障碍230通过支撑结构240分开，这有助于在制造过程中微流体装置10的机械完整性。从中可以看出，支撑结构的配置对齐于将分离区域划分为多个分离井阵列190的类似的支撑结构。这有助于对准从次级预滤器180到分离井190阵列的流动。虽然本实施例中仅有一行的障碍230，但将理解的是，可以提供具有统一的间隔的多行，和/或所述间隔配置为沿流动的方向的减少（即障碍230可以是级联结构，其中具有越来越小的间隙）。

细胞分离井阵列

图4C更详细地示出了多个细胞分离井阵列的配置或结构190。在本实施例中，提供了8行12列的细胞分离井阵列。每一个阵列由支撑结构250划分。每个阵列大约为560μm乘850μm。每个阵列包括了图5中更详细说明的数行和数列的分离结构260。所述分离井阵列的划分便于目标细胞的计算和回收，并提供统一的流动特性。区域化的阵列还通过提供大型支撑结构以防止装置的坍塌，来便于微流体装置的制造。此外，使用区域化的阵列有利于进一步地方便扩大装置的规模。

每个区域化的阵列约560μm宽和850μm长，并拥有200个细胞分离结构260。每个阵列内包括更多的分离结构260将影响回收过程，从而不被看好。每行中的细胞分离结构260是交错的，以增加流体动力的效率。为了制造方便和分离效率，对分离结构260的尺寸和位置进行最优化。目标细胞，如CTC，通常是很少变形的，并且大于大多数的血细胞，所以目标细胞将被动地保留在分离井260中，并且多行的分离井260增加了总的细胞保留率。结构的流体动力学属性还可以防止在任何特定的区域中积累细胞，以便顺利地处理样品。

分离井

在图5中可以看出，细胞分离井260的布置是错开的以提高分离收率，偏移有助于捕获错过细胞分离井260中先前排的细胞。每个分离结构内大约5μm、优选6μm到9μm的间隙在允许组分离开细胞分离井260的同时，将目标细胞保留在适当的位置。为了捕获胎儿（fetal）细胞，这些间隙可能会减小到2或3μm。每个细胞分离井260的半径约约10μm，以能够捕获约6到28μm的细胞。细胞分离井260面对流动方向A的部分是圆形的，以确保细胞顺利地过渡进入到细胞分离井260中。因此，可以看出，选择机制是基于目标细胞是硬的且通常大于大多数血细胞，在目标细胞通过细胞分离井260时，这会阻碍它们的流动。由于结构之间的间隙，当处理大量血液时，血液成分能够变形通过间隙，这将防止在设备中的堵塞。由于当细胞分离井260填满时引导细胞向下的设计，已占用的细胞分离井260往往仅留住一个或成对的细胞（duplet cell），这将便于计数。

梯度发电机

图4D更详细地示出了梯度发生器200的结构。在多个细胞分离井阵列190和废液出口60之间设置有梯度发生器200。梯度生成器200包括连接结构，该连接结构将导管的数量从在多个细胞分离井阵列190最近的位置处的最大数量减少到与废液出口60连接的单一导管。这个树状结构通过在每个级别中至少减少一个来减少导管的数量。这样的配置提供了串联的梯度发生器，它辅助维持细胞分离井阵列190中每一列的统一条件。特别的，梯度发生器200提供了细胞分离井阵列的每一列呈现出的大致恒定的压力，而不用考虑它相对于废液出口60的相对位置。可以看出，发生器是由多个数目减少的支撑结构限定的，支撑结构尺寸大致为190μm乘150μm，限定出通常为150μm宽的通道。

限流器

图4E更详细地示出了在多个细胞分离井阵列190和目标细胞出口90之间的限流器210的配置。为了便于从多个细胞分离井阵列190中回收目标细胞，限流器210与细胞分离井阵列的每一行相连接。每个限流器包括一个成圈的或扭曲的导管，所述导管改变了流动的方向，以增加流体的阻力，并在例如样品处理期间提供轻微的反压，并提供试剂的应用以最大程度地减少在重获目标细胞时此区域任何污染物的出现。提供与细胞分离区域连接的多个接头，以有助于促进目标细胞的回收。

微流体装置-第二实施例

所述装置类似于上面描述的装置，但具有重新配置的部分，在初级分离结构和分支网络中有改变。概述来讲，微流体装置10'的操作如下所示。首先，样品通过样品入口50'引入，并在样品入口50'和废液出口60'之间产生压力差，以引起通过微流体装置10'的大致沿A方向的流动。这使正在被测试的样品通过初级过滤器170'，从而不再需要在样品提供给微流体装置10'之前对样品进行前处理。

过滤后的样品随后进入多个细胞分离井阵列190'中。按照上面描述的方式，细胞分离井利用了目标细胞可能具有样品中其它细胞不同的力学性能的特点。然后目标细胞将被保留在细胞分离井内，同时样品内的其他成分流过。通过维持使得通常沿A方向流动的压力差，目标细胞仍被保留在细胞分离井中。

一旦样品通过了微流体装置10'，样品注射器通常是空的，然后试剂可以经由试剂入口150'引入。于是，微流体装置10'使目标能够在原位对目标细胞进行免疫荧光染色，从而在将染色的细胞引导到目标细胞出口90'以用于回收之前，按照与上面描述的类似的方式对它们进行量化和计算。

初级过滤器

图8示出了初级过滤器170'的配置。在本实施例中，从入口50'到一对平行的初级过滤器170'，提供了双重路径。每个初级过滤器170'具有分支树状结构172'，它用于分配初级过滤器170'中的样品。在本实施例中，，分支树状结构172'为单一导管，并在树内的每一级处分裂为双重导管。这有助于通过以统一的流速流过初级过滤器170'的整个宽度，而分配样品。

随后，所述样品经过一系列的圆柱形的柱175'和177'，它们保留碎片和细胞团块。柱175'和177'之间的间隙沿A方向从行到行逐渐地减少，从约100μm的起始间隙下降到约30μm的间隙。此外，圆柱形的柱175'和177'的直径可以沿A方向从行到行减小。

随后过滤的样品通过导管的分支网络174'被接收，所述导管与单一导管55'结合，单一导管55'随后与平行的细胞分离结构阵列190'相连接。将理解的是，分支网络还可减少至多个导管。

初级过滤器170'放置在远离平行的细胞分离结构阵列190'，以防止由过滤器170'捕获地碎片或细胞团块所造成的任何局部流动的扰动。

虽然可以提供单一的初级过滤器170'，但在本实施例中，提供了一套平行的初级过滤器170'，以便如果一个初级过滤器170'在操作过程中被堵塞，样品仍可通过另一初级过滤器170'继续流动。

在图6中可以看出，包括额外的初级过滤器170'用来防止碎片或其它异物从试剂入口150'和从缓冲端口195'进入微流体装置10'。因此，初级过滤器170'存在于入口50'、试剂入口150'和缓冲端口195'处。它们避免碎片进入腔室。碎片可以包括使得细胞分离腔室中的流动不均匀的灰尘。

细胞分离井阵列

图7A更详细地示出了多个细胞分离井阵列190'的部分。图7B示出了当流体沿A方向流动时，分支网络210'内的压力。在本实施例中，提供了16个平行的细胞分离井阵列190'。然而，将理解的是，可以提供更多或更少的平行阵列。平行的细胞分离井阵列190'的这种配置实现了每小时约2到6mL的处理速度。

过滤的样本在导管55'处被接收，并通过分支网络210'进行分配，以实现经过细胞分离井的每个阵列的均匀流动。可以看出，分支网络210'形成树状结构，其中在树的每一级中，每个导管分裂为两个导管（尽管每个导管可以分裂为两个以上的导管）。因此，在本实施例中，将单一导管55'扩展为提供全部的16个平行的细胞分离井阵列，将需要四个级别的树。入口通道的这个分支网络影响吞吐量，并有助于均匀地分配流量。当流体进入装置时，流体属性通常是不统一的，但通过分支网络得到改善。分支网络从1->2->4->8->16在每一级增加导管的数量。使用16个或更多的导管是可能的，但一般至少需要8个导管以提供均匀的流动。16个导管每小时给出至少2.5ml样品。

在图6中可以更加详细地看到，提供了反向配置的分支网络220'，它合并从细胞分离井阵列190'接收的废料。该废料随后在导管65'处被接收，并在压力下流入废液出口60'。

细胞陷阱

在图9中可以更详细地看出，细胞分离井阵列190'包括月牙状的细胞陷阱262'和264'以分离和捕获细胞。细胞陷阱262'和264'限定了尺寸大小在约6μm到约9μm的两个或更多的月牙形状的缺口。细胞陷阱262'和264'各自向左和向右倾斜，以提高捕获效率。优化了单个细胞陷阱262'和264'之间的距离以提高通过微流体装置10'的流量。间隔每行的细胞陷阱262'和264'以增加细胞捕获的概率。增加连续行的细胞陷阱262'和264'之间的距离以提高处理的吞吐量。

细胞重获

为了重获捕获的细胞，微流体装置10'内的流动方向在细胞分离井阵列190'内反转。这通过防止流进或流出入口50'、试剂入口150'或废液出口60'的任何流动得以实现。流体通过缓冲端口195'引入，通过过滤器阵列170'过滤。

经缓冲端口195'接收的流体在导管65'中被接收，并由反向配置的分支网络220'分配进入平行的细胞分离结构阵列190'。这反转了流动方向（以产生沿与A方向相反的方向的流动）并驱逐细胞陷阱262'和264'内任何被捕获的细胞。图7C示出了当流体沿与A方向相反的方向流动时，分支网络210'内的压力。被驱逐的细胞随后行进到分支网络210'中，并接收在导管55'中。然后确定朝向目标出口90'的流动，并通过目标细胞出口90'重获细胞。

使用这样的配置有可能将目标细胞出口90'放置在细胞分离区域的顶部（在平行的细胞分离结构阵列190'的入口侧）而不是在细胞分离区域的侧面。通过将目标细胞出口90'放置在顶部而不是侧面，可以在平行的细胞分离结构阵列190'的内部建立均一流动的区域，以实现有效地细胞的移除。

在平行的细胞分离结构阵列190'的底部放置缓冲端口195'，有助于在细胞重获的过程中均匀地分配通过平行的细胞分离结构190'的流量。为了有助于细胞移除，压力差维持在195'的缓冲区和目标细胞出口90'之间。为了消除细胞损失，在平行的细胞分离结构阵列190'和目标细胞出口90'之间不包括过滤器。

因此，反而将目标细胞出口90'放置在装置的顶端（即，在入口的相同侧），而不是放置目标细胞出口90'在芯片的一侧，这可能导致不均匀的流动属性，其中仅在装置的目标细胞出口侧（右手边）有流动，而在装置的另一侧（左手边）没有流动，这导致目标细胞出口侧的分离井中仅有的细胞被冲出，而装置另一侧上的那些细胞仍被捕获。缓冲端口195'放置在装置的底部。在捕获后，缓冲溶液从底部的缓冲端口195'冲出以将细胞冲洗出去到达顶部的目标细胞出口90'。在本实施例中，穿过装置的流动是均匀分配的，使得还可存在变位（dislodgement）和冲出更多细胞，从而提高分离的效率。

将理解的是，图6中示出的实施例的特征可以与图2中示出的实施例的特征相结合。

本文件中提到的每个申请和专利以及上述每个申请和专利中引用或参考的每个文件，包括每个申请和专利的诉讼程序（“申请引用文件”）和每个申请和专利中及任何申请引用文件中引用或提到的任何制造商的说明或产品目录，通过引用合并于此。此外，本文引用的所有文件和本文引用文件中所有引用或参考的文件，以及本文引用或提及的任何产品的制造商说明和产品目录，通过引用合并于此。

本发明描述的方法和系统的各种修改和变形在不脱离本发明的范围和精神下，对本领域技术人员来说显而易见的。虽然本发明中结合了具体的优选实施例进行描述，但应当理解，所要求的本发明不应该不适当地受限于这种具体的实施例。实际上，用于实施本发明所描述模型的各种修改对于细胞和分子生物学或相关领域的技术人员来说是显而易见的，这些修改意图涵盖在在权利要求的范围内。

Claims (15)

1.一种微流体装置，可操作的用于从生物流体中分离目标细胞，所述微流体装置包括：

入口，用于接收所述生物流体，所述生物流体包括目标细胞和其它组分；

废液出口，用于接收至少所述生物流体中的所述其它组分；

连接所述入口与所述废液出口的多个平行的细胞分离井阵列，每个平行的细胞分离井阵列响应于跨越所述入口与所述废液出口的压力差，支持所述生物流体从所述入口到所述废液出口的流动，每个细胞分离井阵列包括多个分离井，每个分离井尺寸为机械地捕获其中的目标细胞，同时允许所述生物流体的其它组分的流动；和

至少一个压力维持结构，可操作的用于协助维持跨越所述多个平行的细胞分离井阵列的每个的预定压力差。

2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述至少一个压力维持结构包括：

放置在所述入口和所述多个平行的细胞分离井阵列之间的初级预滤器阵列，所述初级预滤器阵列包括多行初级结构，所述初级结构尺寸化为机械地捕获生物流体内大于目标细胞的部分。

3.根据权利要求2所述的微流体装置，其中每个初级结构具有通常弯曲的横截面。

4.根据权利要求2或3所述的微流体装置，其中所述至少一个压力维持结构包括：

放置在所述初级预滤器阵列和所述多个平行的细胞分离井阵列之间的次级预滤器阵列，所述次级预滤器阵列包括至少一行次级结构，所述次级结构尺寸为机械地捕获生物流体内大于目标细胞的部分。

5.根据权利要求4所述的微流体装置，其中每个次级结构具有通常直线形的横截面。

6.根据权利要求5所述的微流体装置，其中通过支撑结构来划分所述次级结构的行，所述支撑结构放置为与所述多个平行的细胞分离井阵列的每个边界对齐。

7.根据任一前述权利要求所述的微流体装置，其中所述至少一个压力维持结构包括：

在所述多个平行的细胞分离井阵列和所述废液出口之间放置流动合并器，所述流动合并器包括流体通道形成的树，所述流体通道形成的树可操作的用于维持通向所述多个平行的细胞分离井阵列的每个的所述出口呈现统一的压力。

8.根据权利要求7所述的微流体装置，其中所述树的根级别呈现一个通向所示废液出口的流体通道，所示树的叶级别呈现通向所示多个平行的细胞分离井阵列的'n'流体通道。

9.根据权利要求8所述的微流体装置，其中远离所述根级别、并朝向所述多个平行的细胞分离井阵列的每个叶级别提供额外的流体通道。

10.根据任一前述权利要求所述的微流体装置，包括：

目标细胞回收出口，并且其中所述至少一个压力维持结构包括：

导管，所述导管连接所述多个平行的细胞分离井阵列和所述目标细胞回收出口，所述导管成形为用以限制流经所述导管的流动。

11.根据权利要求10所述的微流体装置，其中所述导管成形为通过引起流动方向的至少一个改变来限制流体的流动。

12.根据任一前述权利要求所述的微流体装置，其中，每个细胞分离井阵列包括沿流动方向间隔开的多个细胞分离井的子阵列；提供多个导管，每个导管连接所述子阵列和所述目标细胞回收出口。

13.根据任一前述权利要求所述的微流体装置，包括：

试剂入口，可操作的用于接收试剂，所述试剂入口包括导管，所述导管可操作的用于在所述入口和所述多个平行的细胞分离井阵列之间运送试剂。

14.根据权利要求13所述的微流体装置，其中所述导管可操作的用于在所述初级预滤器阵列和所述次级预滤器阵列之间运送试剂。

15.一种从生物流体中分离目标细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

在入口处接收生物流体，所述生物流体包括目标细胞和其他组分；

跨越连接所述入口与废液出口的多个平行的细胞分离井阵列施加压力差，所述废液出口可操作的用于接收至少所述生物流体的其它组分，每个平行的细胞分离井阵列响应于跨越其的压力差支持所述生物流体从所述入口到所述废液出口的流动，每个细胞分离井阵列包括多个分离井，每个分离井尺寸化为机械地捕获其中的目标细胞，同时允许所述生物流体的其他组分的流动；和

维持跨越所述多个平行的细胞分离井阵列的每个的预定压力差。

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