CN101548004A - 用于诊断学和细胞分析的微流体方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供分子识别检测和细胞分析的方法。本发明提供光学和非光学方法二者。所述方法利用在半透性结构中俘获颗粒。本发明阐述实施生物分子和细胞分析的特异性微流体系统构造。

Description

用于诊断学和细胞分析的微流体方法

相关申请案交叉参考

本申请案主张优先于均于2005年8月19日提出申请的美国临时申请案第60/709,574号和第60/709,593号二者，其揭示内容以引用方式并入本文中。

技术领域

本发明是关于分析和生物分析方法领域且更具体来说，是关于微流体分析系统、芯片实验室系统和微全分析系统。

背景技术

分子结合和细胞特性的分析对于疾病诊断、生物医学研究和药物发现甚为重要。因此，已研究出许多分析方法。然而，人们需要便于快速检测的改良方法。

发明内容

本发明提供比流式细胞术和激光扫描细胞术(LSC)具有显著优点的实施大规模单细胞和分析物分析的方法。微流体形式的捕获阵列允许高密度分析并易于图像处理。而且，利用本发明的芯片上样品的制备节省时间和试剂。此外，大量单细胞在不同时标内的时间相关现象能够利用此装置予以定性。本发明方法极为适于可观察到单细胞动态以提供快速医学筛选的高通量定量生物学。

本发明提供可用作生物捕获系统或微亲和力管柱的微流体装置。所述装置包含一个室，其具有入口；出口；和至少一个衬底，其中所述衬底布置于所述入口与所述出口之间并与所述入口和所述出口流体连通；盖子，其中所述盖子和所述至少一个衬底界定内部流动空间，所述流动空间具有高度；和多个堰式捕获器，其中所述多个堰式捕获器布置于所述衬底上并延伸到所述内部流动空间中，所述多个堰式捕获器的高度小于所述流动空间的高度。所述流体装置可进一步包含额外元件，其包括(但不限于)流体上与所述室连接的缓冲液槽；测量通过所述室的流体流动的构件；一或多个用于电测量位于所述室内的分析物或生物试剂的电极；位于所述室内多个堰式捕获器中至少两个堰式捕获器之间的多个珠粒(例如，亲和型珠粒)，所述珠粒可经官能化。所述装置也可包括一或多个泵和/或阀。

本发明也提供检测流体样品中目标分析物或生物试剂的方法。所述方法包括使样品与本发明微流体装置接触并检测所述装置中电或流动特性或光学的变化。

本揭示内容的一或多个实施例的细节陈述于附图和下文阐述中。自所述阐述和附图以及权利要求可清楚地了解本发明的其他特征、目的和优点。

附图说明

图1显示典型的夹心分析(Sandwich Assay)。需要荧光标记来确定结合事件是否成功。

图2显示常规凝集分析的浓度相关特性。所展示的相图示意性地显示了在抗原/所关注分子对微粒/细胞浓度的多个比率下的聚集类型。较小区域会形成大聚集体，而大量区域即使所关注分子的浓度非常高也不会形成大聚集体。

图3展示实施浓度相关凝集分析的大规模方法。必须大规模实施多步骤方法，包括离心分离和再悬浮。由于此类型方法为可使所形成聚集体剪切分离的高剪切应力方法，因此其通常不能成功。

图4A-C展示本发明的微流体单细胞分离分析。图中显示所述微流体装置实施例的示意图。分支递送通道确保含有细胞和试剂的流基本上均等地分布到每个捕获阵列中。仅展示一个入口和出口，然而可使用额外端口。插图显示一对捕获阵列的显微照片中所述装置的更多细节。

图5A-C展示本发明的高密度单细胞分离装置和方法。(a-b)显示的示意图展示利用流过所排列悬挂障碍的细胞捕获机制。两层(40μm和2μm)杯状PDMS捕获位点允许一部分流体流线进入捕获器。在捕获细胞并部分堵塞2μm开口区域后，通过受阻捕获器的流线份数减少，此达成捕获器的自封闭特性并且大量单细胞分离。所述图未按比例绘制。(c)显示单个捕获细胞阵列的相对比图像。比例尺为30μm。

图6A-E显示单细胞分离的统计。(a-d)显示不同几何形状的细胞分离捕获器的细胞捕获相对比显微照片。从a到d捕获器深度按10μm、15μm、30μm和60μm变化。所捕获细胞的数量随捕获器大小成比例变化，可观察到捕获器大小越小，所捕获单细胞就越多。(e)将针对(a)中所显示几何形状的捕获细胞分布与针对相同平均值的泊松分布(Poisson distribution)一起绘于图上。如果捕获概率不依赖于先前所捕获细胞的量，则可预期泊松分布。在此情形下，与随机过程相比，观察到含有单细胞的捕获器增加和含有零个和大于两个细胞的捕获器减少。此处的数据来自四次单独的装载，每次装载均是在采集数据之前使100μL含有约3 x 10⁶个细胞/ml的细胞溶液流过所述装置。

图7显示与浓度无关的凝集分析的程序。聚集体经由许多步骤在类似于那些用于细胞捕获的半透性结构上聚积而成。可使用阀在拟检测的微粒/细胞相与分子间转换。与离心分离和再悬浮相比，在此情形下聚集体不会破碎。在完全阻塞通道后，珠粒堆积并且可由肉眼观察到，此为确定分子存在的信号。另外，可直接实施电测量来观察通道的阻塞。

图8A-G显示本发明装置、分析方法和测量概念的示意图。(A)所述装置的轮廓。(B)将存于溶液中的官能化珠粒装入通道中，并将珠粒挤进两个“堤坝”间的指定区域。(C)将缓冲液推过珠粒堆，并用两个电极实施电阻测量。(D)使样品通过珠粒堆。(E)用缓冲液洗掉样品，并记录电阻测量值。如果存在对所述官能化珠粒具有特异性的分子，则其将覆盖所述珠粒，此使得通过珠粒堆的电阻增大。(F)显示于C部分中的珠粒堆区域的横截面。(G)显示于E部分中的珠粒堆的横截面。

图9A-C显示利用本发明方法和装置的捕获和检测的计算。(A)显示用于纳米腔计算的单位细胞。堆积微粒导致z相关面积和周长(其随单位细胞重复)。周长可用于计算由于生物分子结合而阻塞的区域。(B)绘制通过由3μm半径微粒堆所建立的纳米腔系统的面积和周长的z相关性曲线。图中面积最小化且周长最大化的区域在结合时导致最高的电阻增加。(C)绘制多种大小的生物分子在生物分子结合时电阻比随珠粒堆半径的变化曲线。

图10A-C展示本发明的流动和分析方法。(A)免疫色谱夹心分析的草图。(B)样品可通过在堆积珠粒中间的空隙空间。(C)如果金纳米颗粒结合到珠粒的表面，则光线会散射到肉眼可见的程度。

图11展示本发明大规模单细胞捕获装置。图中显示了具有25,000个捕获器/平方厘米的高捕获密度的大规模捕获阵列的俯视图。分支入口和出口允许更均匀地流向捕获阵列的每一区域。

图12A-B展示用于细胞过滤的单细胞分离阵列。(a)显示细胞捕获机制的3D图。(b)自玻璃衬底悬挂下来的两层(40μm和10μm)杯状PDMS捕获位点允许一部分流体流线进入捕获器。在捕获细胞并部分堵塞10μm开口区域后，通过受阻捕获器的流线份数减少，此导致大量单细胞分离。所述图未按比例绘制。与直径大于20微米的循环肿瘤细胞(CTC)相比，具有较小直径(6-12μm)的白细胞、RBC和血小板可通过所述捕获结构。以此方式分离并集中CTC。

图13A-C显示本发明单细胞捕获阵列的实施例。(A)显示细胞捕获装置的照片，其展示分支构造和具有捕获器阵列的捕获室。比例尺为500μm。细胞和培养基流自左边进入并进入个体捕获室中且在其中分布于个体捕获器中。(B)呈现捕获装置和机制的图。捕获器模制于PDMS中并结合到玻璃衬底上。捕获器大小偏向于主要捕获一个或两个细胞。所述图为清楚起见自实际运行装置倒转；运行中的装置是玻璃衬底面向下朝向地面操作。插图显示个体捕获器的几何形状。所述装置未按比例绘制。(C)显示具有捕获细胞的捕获阵列的高分辨率明视野显微照片。在大多数情形下，细胞位于捕获器的同位势最低点，而在一些情形下，两个细胞以相同方式捕获在捕获器中。放大图显示了所捕获细胞的细节。捕获是一个温和的过程并且在常规施加的压力下没有观察到细胞变形。

图14A-B显示模拟剪切应力。对捕获有球形细胞的捕获结构的3D模型绘制速度幅值与剪切应力幅值的图形。绘制距衬底z距离为20μm的速度幅值，同时绘制微通道和所捕获细胞的边界表面的剪切应力幅值。(A)绘制速度幅值，其显示捕获结构内速度减小的区域。比例从最大值50μm s^-1变成最小值0μm s^-1。(B)在装置的下边界绘制剪切应力幅值。此处，主图中的比例从0扩大到0.12dyn cm^-2。插图显示捕获区域的特写镜头，新比例从0扩大到0.025dyn cm^-2。注意到在捕获结构内剪切应力减小。比例尺为25μm。

图15A-C显示排列的单细胞培养物。图中显示在微流体阵列内培养的细胞的显微照片图像。在以平均速度(25μm s^-1)连续灌注培养基+10％FBS超过24小时下培养细胞。图中显示在(A)0小时，(B)12小时和(C)24小时时间的图片。箭头指出在此时间段内经历细胞分裂的细胞。比例尺为50μm。

图16显示阵列中的一致细胞特性。图中显示单个捕获细胞的生长特征。图中显示阵列中细胞生长电影的画面，其展示细胞分裂(前三排)和细胞粘附的形态指示(4排直到6排)二者。注意到在粘附细胞之间和分裂细胞之间观察到的形态具有一致性。接种后的小时数显示在每个图像的下面。在分裂后，子细胞仍留在捕获区域内。

图17A-B显示捕获结构和对照衬底中的细胞特性。(A)每小时报告在单细胞阵列中个体细胞的细胞粘附、分裂和死亡。(B)绘制在对照玻璃载玻片上且没有灌注的培养物的相同特征曲线。

图18A-B显示捕获结构和对照衬底中的形态。图中显示在于玻璃衬底上生长24小时后且没有灌注的HeLa细胞形态(A)和在捕获阵列中灌注24小时后的HeLa细胞形态(B)。注意到类似的粘附形态。(B)中由于细胞附着到PDMS衬底上而观察到一些不同。比例尺为25μm。

具体实施方式

除非另有说明，否则本文所用所有技术和科学术语皆具有与本发明所属技术领域的技术人员所通常了解的含义相同的含义。本文所述所有公开案和专利皆以引用方式并入本文中。

除非上下文另外明确指出，否则本说明书和随附权利要求中所用单数形式“一(a或and)”和“所述”包括多个所指事物。因此，例如，提及“一分析物”包括多种所述分析物且提及“所述阀”包括提及一或多个所属技术领域的技术人员所熟知的阀，等等。

对于生物分子识别，最普遍的方法使用荧光或化学发光检测。在此方案中，将带有标记元素的识别元件结合到所关注分子上并通过洗涤方法移除未结合的识别元件(Marquette等人，Biosensors & Bioelectronics 2006，21，1424-1433)。因此，仅在发生结合时产生选择性信号。在大多数情形下，将所述识别元件固定在表面上。这些技术在测定结合信号之前通常需要带有光源、滤波器和检测器的复杂光学系统。在大多数情形下，大型显微镜或微板阅读器会用于此目的。此技术的常见市售仪器是ELISA(Engvall等人，Journal of Immunology 1972，109，129)。对于便携式且廉价的诊断系统，期望纯粹电检测而没有光学变送。也利用生物分子识别的光学或电化学变送研制出多种基于芯片的微流体装置作为诊断系统(Yager等人，Nature 2006，442，412-418；Warsinke等人，Journal of Analytical Chemistry 2000，366，622-634)。此处，光学组件的系统整合或电化学测量的可重复性可能具有限制性。

微粒在宏观分析(Yingyongnarongkul等人，Combinatorial Chemistry & HighThroughput Screening 2003，6，577-587)和微流体分析(Verpoorte，E.，Lab on a Chip 2003，3，60n-68n)中通常用作识别元件固定的固定位点。这是因为颗粒与不同元件可容易地互换以实施不同分析并且固定的表面积较大，此导致随颗粒大小减小而增加的大光学信号。然而，基于微粒或珠粒的生物分析一直局限于结合的荧光或比色检测。

最典型的基于珠粒分析之一使用“夹心分析”(参见图1)，其中抗体附着到珠粒表面。如果抗原对抗体具有特异性，则其将随后结合到珠粒上。随后，将用荧光分子标记的第二抗体附着到抗原上形成“夹心”。此方法非常有效，但需要第二标记步骤，并且荧光必须用光学系统、光源和光检测器监测。

用于检测生物分子和其相互作用的另一个方法是珠粒凝集分析(Coombs等人，British Journal of Experimental Pathology 1945，26，255-266；Reis等人，Transfusion 1993，33，639-643)。在此分析中，由一些生物分子识别事件调介的多个珠粒或细胞聚集成簇通常是以含有悬浮珠粒/纳米颗粒的溶液的光学特性的变化来检测。在此类型系统中，聚集极大地取决于微粒/纳米颗粒与所关注分子的比(图2)并且因此如果浓度在最佳范围内，则仅会达成阳性检测。大规模方法可用以增大所述范围，但需要对聚集体实施离心分离和再悬浮(图3)。这些手动操作不易在便携式系统中实施，并且昂贵且耗时。

流式细胞术(FC)和激光扫描细胞术(LSC)是某些用于单细胞分析的最广泛使用的技术。利用流式细胞术通常观察到充分定性的细胞特性分布。简单来说，此技术涉及个体细胞的水力分离，所述个体细胞先前已使用可揭示所述细胞内所关注生物分子数量信息的荧光染料进行标记。存在光源、滤波机构和检测器以观察所述个体细胞的信号。所述技术是极高通量连续方法，其中在大多数情形下于分析后丢弃细胞。

因为流式细胞术通量很大，所以其是用于单细胞分析的使用最成功的技术；然而，在大多数情形下流式细胞术限于定性荧光信号(GFP-融合蛋白、免疫荧光和细胞内酶的荧光底物)(Fay等人，Biochemistry 1991，30，5066-5075；Nolan等人，NatureBiotechnology 1998，16，633-638；和Krutzik等人，Nature Methods 2006，3，361-368)。另外，流式细胞术没有解决重要的相同个体细胞的时间相关测量，或细胞内的荧光空间定位问题。利用此方法分析的细胞通常在分析前于烧瓶或平皿中生长，并且因此环境一致性限于烧瓶或平皿的一致性。值得注意的是，不能控制细胞-细胞接触，并且可扩散的分泌物保持在培养环境中。

激光扫描细胞术(LSC)是已使用的替代技术，其中表面固定细胞上的染料通过扫描激光激活，并且可及时重复询问(Griffin等人，Febs Letters 2003，546，233-236；Bedner等人，Cytometry 1998，33，1-9)。此处，比起FC来的优点是可在个体细胞中获得与时间相关的信息，并且粘附细胞可在分析期间保持在培养物的最初位点上。然而，LSC损失了通量，因为其仅可扫描板的有限区域。另外，对时间和通量进行一定折衷，因为扫描更多细胞会导致个体细胞测量之间的时间延长。对于LSC，试剂的引入是由移液管完成并且在溶液交换后仅缓慢的时间相关变化是有意义的。此尤其是由于在整个载玻片或板上溶液的不均匀引入和激光扫描的连续过程。如在FC中，将细胞保持在载玻片或平皿上，并且环境控制不佳。

为解决环境控制、快速时标测量、图像处理和分泌的生物分子分离等方面的问题，已提出数种单细胞分离方法。据报道，许多微流体技术允许个体细胞的光学询问与试剂的快速交换相结合。

一般来说，微流体技术利用微制造来小型化流体通道和导管。以允许通过流体灌注和压力梯度动力学控制试剂和细胞的方式建立通道和结构系统。大多数技术需要复杂的操作或制造来分离个体细胞。

本发明阐述使用半透性障碍物(本文称为“堰式捕获器”)在微流体平台内被动建立个体捕获细胞或分析物的一致阵列。在一些方面中，本发明提供不需要光学反馈的平台。在此平台中，个体细胞和分析物的微环境得以较佳控制，包括分别由分离和灌注引起的接触和可扩散刺激。本发明堰式捕获器结构的特征是允许在小于30秒内被动捕获阵列中的单细胞和分析物。改变捕获器的几何排列也允许通过捕获各组邻近细胞或分析物而改变细胞-细胞(或结合伙伴，例如抗原-抗体)接触的数量。虽然与FC的通量相比通量减小，但微流体整合允许数十至数百个单细胞并行实施快速时标测量。

如本文进一步阐述，本发明提供一种方法，由此小分子间的结合事件可通过简单且廉价的压力型或阻抗型测量以及低成本光电二极管光源和检测器的杂交整合检测。因此，排除了一般与基于珠粒分析有关的昂贵光学器件的需要。所述装置可用作便携式定点照护诊断装置。

本发明提供实施简化的浓度相关聚集以用于生物分析的微流体工具。因此，排除了离心分离和再悬浮的需要并增大了检测聚集的灵敏度范围。本发明装置、系统和方法可用于免疫分析、定点照护诊断学、DNA杂交检测、血型测定、单细胞分析以及癌症检测、微小残留疾病检测、多种临床病状中血小板活化的高通量筛选-用于心血管疾病治疗、改变细胞特性的药物的高通量筛选、血液中稀有细胞检测和活体外毒物学筛选，此处仅列举少数用途。

本发明实例性流体装置10在图4B中予以阐释。装置10流体系统布置于衬底25上。衬底25可为可用于形成流体通道的任何材料。所述衬底和/或堰式捕获器的表面可经改良以使其适于附着结合配体(例如生物分子)。可用于所述装置的衬底包括(但不限于)可直接使用或可用涂层(例如金属或聚合物)改良的金属、玻璃和塑胶。所述衬底可为金属、玻璃或硅表面。在一实施例中，所述衬底可由多种材料制成，其包括(但不限于)硅(例如硅晶圆、二氧化硅、氮化硅、玻璃和熔融硅石)、砷化镓、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、塑胶、树脂和聚合物(包括聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸树脂、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯和其他苯乙烯共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯)、高温合金、锆合金、钢、金、银、铜、钨、钼、钽、KOVAR、KEVLAR、KAPTON、MYLAR、黄铜、蓝宝石和其类似物。当任何样品处理步骤需要基于光的技术时，高质量玻璃(例如高熔点硼硅酸盐或熔融硅石)由于其UV传输特性而被使用。此外，所述装置的部分可视需要涂覆各种涂层来减少非特异性结合，以允许附着结合配体而有利于生物相容性、流阻和其类似物。

流体装置10包含至少一个入口端口20，其与至少一个流动室30(图示为流动室30a和30b)流体连接。流动室30包含多个捕获器式堰式捕获器35。堰式捕获器35可位于整个流动室30中，或可位于与入口端口20最接近的区域或入口端口20的远侧区域。多个堰式捕获器35可称为阵列。流动室30与一般在所述室远端(虽然其他出口端口可能安排在室30内的任何地方)的至少一个出口端口40流体连接。

微流体入口端口20、室30、出口端口40和任何其他流体通道可通过任何适宜微机械加工技术形成于适宜材料(例如硅晶圆)上。理想地，所选材料应能够被灭菌并且不应对可用于所述流体装置的生物试剂(例如细胞、多肽和其类似物)造成生物威胁。装置10的流体流动区域一般设计在衬底25中，衬底25随后通过盖子45封闭(参见，例如，图4C)。盖子45或衬底25可由透明材料形成。透明材料允许对所述装置中的细胞或其他生物材料方便地进行可视化监控。所述盖子可通过数种业内所熟知的手段连接(固定不变地或可移动地)。例如，可使用诸如环氧树脂或其他胶粘物等结合剂。在一方面中，将盖子45可滑动地安装于室30内以使盖子45可在所述室内向上或向下移动，从而增大了室30的容积。封闭所述实施例中所述盖子的方法已为业内所熟知。

参照图4C，进一步详细显示包含堰式捕获器35和盖子45的流动室30(也参见图13B)，同样例示的是生物试剂65(例如，细胞或分析物)。如此处进一步阐述，堰式捕获器35位于室30内以基本上(而非完全地)减少室30内的流体流动。堰式捕获器35经设计以具有足够大小来俘获/捕获流过室30的流体内的细胞或分析物。例如，流体接触的衬底表面与流体接触的盖子表面间的距离是42微米的地方(参见，例如，图13B)，所述堰式捕获器延伸到流体室30的流体流动空间中一段距离以防止生物试剂65流出堰式捕获器35。在图4C和图13B所图示的实例中，其中衬底表面与盖子表面间的距离是42微米，堰式捕获器35包含延伸约40微米到流体室30的流体流动空间中的堰式捕获器高度60。因此，大约2微米仍作为减小的流体流动空间55。在操作中，堰式捕获器35具有进入到室30的流动空间中的足够深度以抑制生物试剂65(例如，细胞或分析物)通过(“捕获”生物试剂65)，同时允许流体通过减小的流体流动空间55。

在一实施例中，堰式捕获器35能够被收缩进流体流动空间中以允许在分析后流动室30的清洗物通过。所述方法包括selanoid驱动或其他技术。在一实施例中，将与堰式捕获器相对的表面移动到距所述堰式捕获器较远处，由此增大减小的流体流动空间55。例如，在测量或分析后，将堰式捕获器收缩进衬底中或增大堰式捕获器与相对表面(例如盖子)间的距离以允许流体流动和流动室外的生物试剂通过。

堰式捕获器35可为阻止生物试剂65通过(“捕获”生物试剂65)同时允许流体在与堰式捕获器35关联的减小流体流动空间55中流动的任何形状。例如，如附图中所示，堰式捕获器35具有凹形。

如图4C中所示，捕获阵列的几何排列一般以交错方式设计以最优化生物试剂捕获。以所述几何排列和流动方式可捕获位于捕获阵列中的多种生物试剂。

在一方面中，堰式捕获器35可包含可用于结合试剂并提供聚集的结合剂。在此方面中，结合配体可固定不变地或可移动地固定在堰式捕获器表面上。如果目标分析物存在于样品中，则结合配体会俘获所述目标分析物。流体样品一般会包含目标分析物和官能化的包含结合剂的珠粒。

在另一方面中，包含官能化珠粒(所述官能化珠粒包含结合剂)的第一流体以流体方式通过微流体装置10，继之包含目标试剂的流体样品(参见，例如，图7)。

所述过程包含(一方面)自溶液中捕获目标分析物(例如，免疫特异性俘获)，继之其他目标试剂和结合剂的聚集体。聚集体的捕获会发生在所述捕获阵列内。所述结合剂(若需要)可通过各种化学和物理特性直接固定到堰式捕获器上，例如生物素直接衍生化，和与结合到金衬垫的抗生蛋白链菌素或官能化的烷烃硫醇连接。

在本发明另一方面中，提供微亲和力流体管柱。参照图8A-C，微亲和力流体管柱100包含紧密堆积微球体或珠粒150的区域。所述珠粒可由任何材料制成并且表面可进行官能化。一般来说，所述珠粒会脱离芯片进行官能化，并随后装入微亲和力流体管柱100中。流体管柱100中的两个堰式捕获器(例如，堤坝)200a和200b将抓获所述珠粒以建立微亲和力流体管柱100。一旦装入珠粒，即可干燥所述装置并随后载运和/或存储。图8C-G展示如何使用微亲和力流体管柱100的基本想法。将样品推过珠粒堆150(参见，例如，图8D)。如果存在目标分析物或生物试剂，则其将特异性结合到官能化珠粒150上。比起其他技术来，所述管柱的优点是抗体与抗原间的扩散距离极其小。这意味着可使分析时间最小化，并且使灵敏度最大化。用力使全部样品通过微亲和力流体管柱100，这允许最大抗体-抗原相互作用。图8E展示在将样品洗掉后如何用抗体涂覆珠粒。图8F和8G分别代表(C)和(E)中管柱区域的横截面。所述微亲和力流体管柱技术在玻璃和PDMS二者中均有效。另外，能够通过依序装入不同的珠粒溶液将不同类型的珠粒装入相同的管柱中。此技术的一个优点是可在相同通道中同时进行对照实验。也可通过简单引入越来越小的珠粒到微亲和力流体管柱100的流体通道中堆积不同尺寸的珠粒(包括纳米颗粒)。

所述方法是基于建立具有分子结合位点的纳米腔系统，其中所述纳米腔在结合所关注分子(而不是非特异性分子)时尺寸减小可察觉到的份数。先前，已显示涂覆有蛋白质的珠粒与未经涂覆的珠粒相比会导致其通过的纳米孔的电阻增大。在所述情形下，需要电阻的时间相关动力学测量，并且在分析前对珠粒进行预处理。然而，在本发明中，测量是在用分析物直接处理的静止纳米腔系统中进行(图8)。结合分析物随后使横截面面积减小并使所测量的跨越所述纳米腔系统的流阻和电阻增大。所述纳米腔系统可通过堆积微粒(珠粒)形成或呈静止聚合物相形式。因为官能化珠粒可预堆积在简单装置中，所以具有极大潜力用作一次性定点照护诊断装置。

所捕获生物试剂(例如，细胞或多肽)的检测可以数种方法(例如，流速、流阻、电检测或光学检测)进行。电检测可通过基于电导、电容或电荷的检测达成。或者，检测可通过局部光学刺激和随后的检测(例如通过荧光)光学达成。

分析仪表可以操作方式与每个个体堰式捕获器关联或与作为整体的捕获阵列关联。所述分析仪表可包含电极、光检测器、显微镜焦点或其他类似感测装置。在一实施例中，所述入口端口和/或出口端口包含可测量电阻、流体流过所述室的阻抗的感测仪器，其中流体流动的减少是生物试剂捕获的指示。

电极可放置在珠粒堆内部或外部来实施所述测量。将电极放置在珠粒堆内部增加了制造的复杂性，但具有降低背景电阻的附加优点。另外，将电极放置在珠粒堆内部有助于防止由于堵塞导致的误确认，因为珠粒会将颗粒滤除在珠粒堆外。

对微粒的紧密堆积阵列的通过纳米腔系统的电阻变化进行模拟(图9)。已知周长，并假定饱和结合，可计算结合各种大小分子的纳米腔的阻塞面积。对于各种大小的微粒和生物分子，在图9C中绘制在结合时电阻增加的曲线。此分析表明，对于平均直径为50

的蛋白质分子，若要达到约10％的电阻变化需1μm直径或更小的珠粒大小。然而，如果实施夹心分析，其中在初始结合后较大颗粒与所关注分子相结合，则可期待甚至更大的变化。

如果在大型大规模色谱管柱的两端引入电极、或在含有电极的离心管中的另一具体构造中(其中分析物通过离心力推动通过微粒堆)，则通过微粒堆或纳米腔网状结构的电测量也可应用到通过所述管柱的电测量。

对于阻抗测量，避免双层电容影响并测量溶液电阻影响方面甚为重要。此可通过增加双层电容并将频率区域集中到(例如)介于10²至10⁶Hz之间达成。

除电阻变化外，预期流阻变化会大得多，这是由于流阻与横截面积的平方倒数成正比，反之则相反。纳入压力变送器(与微流体装置串联或整合到装置中)可用以检测分子结合。此概念的初始测试显示，当随后用抗生蛋白链菌素涂覆7μm生物素化珠粒时流阻加倍。

对于定点照护诊断装置，无仪器检测将是理想的，并且达成此的一个方法是使用免疫色谱测试。此测试利用胶态金颗粒可非常有效地散射光的事实。当许多金纳米颗粒聚集到一起时，光会被散射，并且看到的颜色取决于纳米颗粒的大小。验孕利用免疫色谱测试，并且具有胶态金纳米颗粒。一般地，所述纳米颗粒的大小可产生一条蓝色线。所述分析可在本发明微流体装置中实施。图10A显示所述分析的夹心样排列。可用对人体响应疾病而产生的抗体具有特异性的抗原对珠粒实施官能化。当将样品推过微亲和力流体管柱时，所述样品会通过珠粒间的空隙空间(图10B)。随后抗体(如果存在)将结合到珠粒的表面。一旦推过样品，则将附着到抗人类抗体的金纳米颗粒溶液推过所述管柱。所述抗人类抗体将结合到珠粒表面上的抗体(如果其存在)上。如果抗体不存在，则抗人类抗体不会结合到珠粒上，并且纳米颗粒将通过管柱。当在管柱中俘获到足够纳米颗粒时，则所述纳米颗粒会将光散射到肉眼可见的程度(图10C)。通过将高灵敏度且快速的微亲和力管柱与不需要额外仪器的检测方法组合，所述装置对于诊断筛选是非常成功的。

此概念已通过将连接抗生蛋白链菌素的40nm金颗粒结合到塞进微流体装置内管柱中的生物素化珠粒上实施。所述珠粒堆变成引人注目的粉红色，并且可容易地与对照实验区分开来。对照装置由塞进管柱中的普通珠粒组成。对照通道的颜色在引入胶态金溶液后仍未改变，因为在金与珠粒间无特异性结合。

本发明系统和方法可使用微流体流动调节器(例如一或多个本文所述微泵)来控制流速。例如，所述泵可为微机电(MEMS)微流体泵。所述微泵可以基本上不变或根据系统需要调整的预定频率运行。

本发明微流体装置可包含其他处理室，所述处理包括(例如)细胞裂解、细胞移除、细胞分离和其类似物、自其他样品组份的期望目标分析物的分离、目标分析物上的化学或酶促反应、目标分析物的检测和其类似物。本发明装置可包括一或多个用于样品处理和存储、废物或试剂存储的槽；通向所述槽和介于所述槽之间的流体通道，包括微流体通道。如本文更全面阐述，所述通道可包含电泳分离系统(例如，微电极)；控制流体移动的阀；泵，例如电渗、电水力或电动泵；以及检测器。本发明装置可经设计以同时或依序处理一个或多个样品或分析物。

如图4中所示，所述组件包括(但不限于)样品入口端口20、出口端口和其类似物。其他组件可包括流体泵；流体阀；用于加热和冷却的热模块；用于分析试剂的存储模块；相互作用室；以及检测模块。

所述至少一个入口端口20和所述至少一个出口端口40可包含控制递送和从室30移除流体的阀。

因此，本发明装置包括至少一个允许样品自入口端口20或槽流向系统其他组件或模块的流动通道。如所属技术领域的技术人员所了解，所述流动通道可根据通道的用途以多种方式设置。例如，开始于样品入口端口的单流动通道可分成多个较小的通道，以使原始样品分成分立的子样品来并行处理或分析。或者，来自不同模块(例如，样品入口端口和试剂存储模块)的数个流动通道可一起进入室30中。如所属技术领域的技术人员所了解，存在大量可能的设置；重要的是流动通道允许样品和试剂从所述装置的一部分移动到另一部分。例如，流动通道的路径长度可视需要改变；例如，当需要混合及时控反应时，可使用较长的流动通道。

在一实施例中，本发明装置包括至少一个用于将样品引入到装置中的入口端口20。此可为流动室30的一部分或与流动室30分离或为混合室；换句话说，样品可自样品入口端口直接进入包含多个堰式捕获器的室中。

在本发明另一方面中，本发明装置可包括细胞处理室。当样品包含含有目标分析物的细胞或包含需要分成亚群来检测目标分析物或期望细胞的细胞时，细胞处理室是有用的。例如，血液中目标分析物的检测可能需要移除血细胞以有效分析，或在检测之前必须将细胞(和/或细胞核)裂解。在本上下文中，“细胞”包括真核和原核细胞、以及在分析前可能需要处理(例如在目标核酸检测之前自病毒颗粒释放核酸)的病毒颗粒。随后将样品提供到包含堰式捕获器35的室30中。

在本发明另一方面中，所述系统包含至少一个泵。所述泵可为任何类型泵装置，包括基于电极的泵。机电泵可用于本发明系统，例如基于电容驱动、热驱动和压电驱动的机电泵。适宜的芯片上的泵包括(但不限于)电渗(EO)泵和电水力(EHD)泵；业内有时将所述基于电极的泵称为“电动(EK)泵”。所有所述泵均依赖于沿流动通道放置的电极的设置。如业内所阐述，每个所述基于电极的泵的设置略有不同；例如，EHD泵的效率取决于两个电极间的间距，两个电极越靠近，用以实现流体流动所需要的电压越小。或者，对于EO泵，由于电极仅与施加力有关，因此电极间的间距应较大，可高达移动流体的通道长度的一半；且如同在EHD中一般与产生电荷(力将作用于其上)无关。

在一实施例中，使用电渗泵。电渗(EO)是基于如下事实：在离子材料存在下，许多固体(包括石英、玻璃和其他)的表面变得以不同方式带电荷，带正电荷或带负电荷。带电荷表面会吸引水性溶液中带相反电荷的抗衡离子。施加电压导致抗衡离子迁移到带相反电荷的电极，并且也移动大量流体。体积流速与电流成正比，并且在流体中产生的体积流动也与所施加的电压成正比。电渗流动可用于具有一定电导性的液体并且通常不适于非极性溶剂。

在另一实施例中，使用电水力(EHD)泵。在EHD中，当施加电压时，与流体接触的电极转移电荷。此电荷转移通过向流体转移电子或自流体移出电子发生，以使液体沿着自带电荷电极至带相反电荷的电极的方向流动。EHD泵可用来泵送诸如非极性溶剂等电阻性流体。

在另一方面中，所述泵在所述微流体装置或室30的外面。在所述方面中，所述泵可为蠕动泵、注射泵或其他业内常用泵。

在本发明另一方面中，本发明装置包括至少一个流体阀，其可控制流体流入或流出所述装置的模块或室或将其分流于一或多个通道中。多种阀为业内所熟知。例如，在一实施例中，所述阀可包含毛细屏障，如在PCTUS97/07880(其以引用方式并入本文中)中所概述。在所述实施例中，所述通道通向经设计以有利于形成使液体表面(例如开口处的弯月面)最小化的能量的较大空间。一般来说，毛细屏障包括恰在通入较大空间(例如室)的开口之前提高通道垂直高度的堤坝。此外，如美国专利第5,858,195号(其以引用方式并入本文中)中所述，可使用“虚拟阀”类型。

在又一实施例中，本发明装置包括允许引入流体(包括样品)至本发明任何模块中并随后关闭端口以避免样品损失的封闭端口。

本发明装置可包括至少一个存储模块以分析试剂(例如，缓冲液、样品、结合剂)。所述存储模块与系统的其他模块利用流动通道连接并且可包含坑或室，或延长的流动通道。其可含有任何数量的试剂、缓冲液、酶、电子介体、盐和其类似物(包括冷冻干燥试剂)。

在另一实施例中，本发明装置包括混合模块；与存储模块一样，所述混合模块再次为延长的流动通道(尤其用于混合)、坑或室。尤其在延长的流动通道的情形下，在通道侧面上可能有突起以达成混合。

本发明装置可包括检测模块。例如，所述检测模块可纳入电感测和光学照明二者以使方案得以实现，其中标记探针或细胞包括多个经光化学离解的检测部分，以将来自单个探针的检测到的信号放大到超出背景阈值之外。

在一方面中，本发明检测模块包含电极。此处所谓“电极”指的是一种组合物，当将其连接到电子装置时，其能够感测到电流或电荷并将电流或电荷转变成信号。或者，可将电极定义为一种可向溶液施加电位和/或在溶液中的物质之间来回传递电子的组合物。电极已为业内所熟知且包括(但不限于)某些金属和其氧化物，包括金；铂；钯；硅；铝；金属氧化物电极，包括铂氧化物、钛氧化物、锡氧化物、铟锡氧化物、钯氧化物、硅氧化物、铝氧化物、钼氧化物(Mo₂O₆)、钨氧化物(WO₃)和钌氧化物；和碳(包括玻璃碳电极、石墨和碳糊)。

在另一方面中，所述检测器可为能够检测光学变化的光学检测器。光学变化可能为与聚集体或细胞有关的发光或荧光标记存在的结果。

在一实施例中，利用电子检测，包括电流分析法、伏安法、电容法和阻抗法。适宜技术包括(但不限于)电重量测定法；库仑法(coulometry)(包括控制电位库仑法和恒电流库仑法)；伏安法(循环伏安法、脉冲伏安法(常规脉冲伏安法、方波伏安法、差分脉冲伏安法、Osteryoung方波伏安法和恒电量脉冲技术)；溶出分析(阳极溶出分析、阴极溶出分析、方波溶出伏安法)；电导测量(电解电导、直接分析)；时间相关电化学分析(计时电流分析法、计时电位分析法、循环计时电位分析法和电流分析法、交流极谱法、计时电流测定法(chronogalvametry)和计时库仑法)；交流阻抗测量；电容测量；交流伏安法；和光电化学。

因此，本发明提供用于检测目标分析物或生物试剂(包括细胞)的包含具有多个堰式捕获器的衬底的装置。所述衬底可由多种材料制成且可采用多种设计来构造。在一些情形下，所述衬底的一部分可以移动；例如，界定室30的所述衬底/盖子可为可在使用后自装置移开的可拆卸盒子。

如所属技术领域的技术人员所了解，本发明装置可以多种方式制成。适宜制造技术再次由所选择的衬底而定。实例性方法包括(但不限于)多种微机械加工和微制造技术，包括薄膜沉积工艺(例如旋涂)、化学汽相沉积、激光制造、光刻和其他利用湿化学工艺或等离子体工艺的蚀刻技术、压纹、喷射模塑和粘结技术。此外，还有用于产生期望流体导向路径的印刷技术，即印刷材料的图案可容许定向的流体传送。

此外，应了解，虽然此处的大部分讨论针对具有堰式捕获器的平面衬底的使用，但也可使用其他几何形状。例如，两个或多个平面衬底可经堆叠以产生在一个平面内或平面间含有连续堰式捕获器的三维装置。

在本发明方法和系统中，微粒的微流体处理有助于聚集体的形成和聚集事件的检测二者。所述技术允许用于诊断应用(免疫感测和DNA杂交检测)的便宜、无标记、容易操作的生物分子检测方法。检测可利用基于微流体室中聚集体积聚的简单的电方法、压力方法和肉眼光学方法。为有助于聚集，利用微流体方法交替地涂覆结合识别元件的微粒层和检测到的生物分子层，以克服聚集分析中的非线性浓度相关困难(图7)。

所述方法使用如本文所述的装置，其包含：(1)容纳微粒/纳米颗粒的半透性结构(例如，堰式捕获器)；(2)在与所述颗粒结合的分子和与涂覆颗粒结合的其他颗粒间的转换暴露物件；和(3)在一个以上位置处结合的分子和识别元件(例如多克隆抗体)。其他方法和特征可包含：(1)放大持续聚集事件的方法，例如通道对其他颗粒的完全不透性-此导致微通道中颗粒聚积和指示分子存在的肉眼可见聚集体；(2)也可电测量占据微通道的大量珠粒，使用芯片上的电极和在10²到10⁶Hz范围内的高频率阻抗测量来测量与双层电容支配区域相对的溶液电阻支配区域。电化学直流和交流测量可用于横跨电极发生电荷转移的情况。

可用于本发明方法和系统的结合配体(例如生物分子)的实例包括一般在活有机体中发现的分子(例如聚合物)。实例包括(但不限于)蛋白质、核酸、脂质和碳水化合物。

本文所用术语“目标分析物”和“生物试剂”是指欲检测样品中的分子或有机体。目标分析物的实例包括(但不限于)多核苷酸、寡核苷酸、病毒、多肽、抗体、天然存在的药物、合成药物、污染物、变应原、影响因子(affector)分子、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子。

生物试剂包括有机和无机分子，其包括生物分子。例如，所述分析物可为环境污染物(包括农药、杀虫剂、毒素和其类似物)；化学品(包括溶剂、聚合物、有机材料和其类似物)；治疗分子(包括治疗和滥用药物、抗生素和其类似物)；生物分子(包括，例如，激素、细胞因子、蛋白质、脂质、碳水化合物、细胞膜抗原和受体(神经受体、激素受体、营养受体和细胞表面受体)或其配体)；全细胞(包括原核和真核细胞)；病毒(包括，例如，反转录病毒、庖疹病毒、腺病毒、慢病毒)；孢子；和其类似物。目标分析物和生物试剂的其他实例包括(但不限于)免疫球蛋白，尤其是IgE、IgG和IgM，且尤其为与治疗学或诊断学相关抗体，包括但不限于，人白蛋白、载脂蛋白(包括载脂蛋白E)、人绒毛膜促性腺素、皮质醇、α-甲胎蛋白、甲状腺素、促甲状腺激素(TSH)、抗凝血酶等各物的抗体；药物的抗体(包括抗癫痫药物(苯妥英(phenytoin)、扑米酮(primidone)、卡马西平(carbamazepine)、乙琥胺、丙戊酸和苯巴比妥(phenobarbitol))、作用于心脏的药物(地高辛(digoxin)、利多卡因(lidocaine)、普鲁卡因胺(procainamide)和丙吡胺)、支气管扩张药(茶碱)、抗生素(氯霉素、氨苯磺胺)、抗抑郁药、免疫抑制剂、滥用药物(苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻素、可卡因(cocaine)和鸦片剂)和数种病毒的抗体(包括正粘病毒(例如，流感病毒)、副粘病毒(例如，呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒)、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼肠病毒、囊膜病毒(例如，风疹病毒)、细小病毒、痘病毒(例如，天花病毒、痘苗病毒)、肠道病毒(例如，脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus))、肝炎病毒(包括A、B和C)、庖疹病毒(例如，单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus))、轮状病毒、诺沃克病毒(Norwalk viruses)、汉他病毒(hantavirus)、沙粒病毒、棒状病毒(例如，狂犬病病毒)、反转录病毒(包括HIV、HTLV-I和-II)、乳多泡病毒(例如，乳头瘤病毒)、多瘤病毒和微小核醣核酸病毒和其类似物)和细菌的抗体(包括多种病原性和非病原性相关原核生物，包括芽孢杆菌(Bacillus)；弧菌(Vibrio)，例如，霍乱弧菌(V.cholerae)；埃希氏菌(Escherichia)，例如，肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli)；志贺氏菌(Shigella)，例如，痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)；沙门菌(Salmonella)，例如，伤寒沙门菌(S.typhi)；分枝杆菌(Mycobacterium)，例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprea)；梭菌(Clostridium)，例如，肉毒梭菌(C.botulinum)、破伤风梭菌(C.teteni)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)；棒状杆菌(Cornyebacterium)，例如，白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)；链球菌(Streptococcus)，化脓性链球菌(S.pyogenes)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)；葡萄球菌(Staphylococcus)，例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)；嗜血菌(Haemophilus)，例如，流感嗜血杆菌(H.influenzae)；奈瑟球菌(Neisseria)，例如，脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)；耶尔森菌(Yersinia)，例如，兰伯氏贾第虫(G.lamblia)、鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)；假单胞菌(Pseudomonas)，例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)；衣原体(Chlamydia)，例如，沙眼衣原体(C.trachomatis)；博德特菌(Bordetella)，例如，百日咳博德特菌(B.pertussis)；密螺旋体(Treponema)，例如，苍白密螺旋体(T.palladium)；和其类似物)；酶(和其他蛋白质)，包括但不限于用作心脏病指示剂或用于心脏病治疗的酶，包括肌酸激酶、乳酸脱氢酶、天门冬氨酸氨基转移酶、肌钙蛋白T、肌红蛋白、纤维蛋白原、胆固醇、甘油三酯类、凝血酶、组织型纤溶酶原激活物(tPA)；胰腺疾病指示剂，包括淀粉酶、脂肪酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶；肝功能酶和蛋白质，包括胆碱酯酶、胆红素和碱性磷酸酶；醛缩酶、前列腺酸性磷酸酶、末端脱氧核苷酰转移酶和细菌和病毒酶(例如HIV蛋白酶)；激素和细胞因子(其中许多起细胞受体的配体作用)，例如红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素(包括IL-1直至IL-17)、胰岛素、胰岛素样生长因子(包括IGF-1和IGF-2)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(包括TGF-α和TGF-β)、人生长激素、转铁蛋白、表皮生长因子(EGF)、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、瘦素、VEGF、PDGF、睫状神经营养因子、促乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、降钙素、人绒毛膜促性腺素、皮质醇、雌二醇、滤泡刺激激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、孕酮和睾酮；和其他蛋白质(包括α-甲胎蛋白、癌胚抗原CEA、癌症标志物和其类似物)。此外，也可直接检测任何通过使用抗体间接检测的生物分子；换句话说，病毒或细菌细胞、治疗和滥用药物和其类似物的检测可直接实施。

适宜目标分析物包括碳水化合物，其包括(但不限于)如下癌症的标志物：乳癌(CA15-3、CA549、CA27.29)、与抗原有关的粘蛋白样肉瘤(MCA)、卵巢癌(CA125)、胰腺癌(DE-PAN-2)、前列腺癌(PSA)、CEA和结肠直肠癌和胰腺癌(CA19、CA50、CA242)。适宜目标分析物也包括金属离子，尤其重金属和/或有毒金属，包括但不限于铝、砷、镉、硒、钴、铜、铬、铅、银和镍。

目标分析物和生物试剂可以数种不同样品类型的形式存在，其包括但不限于体液(包括血液、淋巴液、唾液、阴道和肛门分泌物、尿、粪便、汗液和眼泪)和实体组织(包括肝、脾、骨髓、肺、肌肉、脑和其类似物)。例如，广义来说，样品包括(但不限于)环境样品、工业样品和生物样品。环境样品包括来自环境的材料，例如土壤和水。工业样品包括在制造过程中产生的产物或废物。生物样品可为动物(包括人类)、流体(例如，血液、血浆和血清)、固体(例如，大便)、组织、液体食物(例如，牛奶)和固体食物(例如，蔬菜)。

结合配体、伙伴或同源物是指能够或怀疑能够物理上相互作用的两个分子(例如，蛋白质)。在上下文合适的情况下，由于互补性能够彼此杂交的两个核酸分子理解为结合伙伴。聚集体可通过结合配体与其关联结合伙伴的相互作用形成。

本文所用术语“互补的”或“互补性”是用以指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“5′-A-G-T-3′”与序列“3′-T-C-A-5′”互补。互补性可为“部分的”，其中仅一些核酸碱基按照碱基配对规则是匹配的。或者，核酸之间存在“完全的”或“全部的”互补性。核酸链间互补性的程度对核酸链间杂交的效率和强度具有重要影响。

提供以下实施例来阐释而非限制本发明。在下文中详细阐述所述实例中采用的科学方法的各项参数并大体上为实践本发明提供指导。

实例

在本发明一方面的使用中，将细胞通过微流体装置的分支入口端口引入到包含捕获阵列的个体室中(图4)。将单细胞分离进由两个通道高度水平组成的规则高密度阵列中。较大的40μm通道高度作为细胞溶液的主要流体导管，而2μm高度区域用以形成提高的捕获区域(图5)。具有2μm空隙使得小部分流体流线可以携带细胞进入捕获器。一旦细胞进入捕获器并部分堵塞所述2μm空隙，则进入堰式捕获器捕获区域的流体流线(和细胞)份数会减少。此导致大量单细胞分离(图5、图6a-e)。实际上，捕获概率取决于先前所捕获细胞的数量。此通过将泊松分布与实验测量的分布进行比较统计学显示于图6e中(N＝199捕获位点，4次单独装载)。如果捕获独立于先前捕获事件，则数据应符合泊松分布。此处，显示单细胞超过泊松分布，而0、3和4个捕获细胞有所降低。如果试图解释捕获纯粹取决于几何拟合，则预计捕获两个细胞更为普遍，因为通道高度大于典型哺乳动物细胞直径的两倍(40μm相比于15μm)。

如本文所述，可使用多种堰式捕获器大小和几何形状。保持相同的堰式捕获器宽度和通道高度，堰式捕获器的深度可在10到60μm间变化。表示凹处“深度”的捕获结构的深度不应与称为“高度”的通道深度相混淆。所述各种深度导致捕获细胞数量的差异(图6)。对于10μm深的堰式捕获器，大于50％的堰式捕获器含有单细胞，随堰式捕获器深度增加，单细胞分离的份数降低。对于10μm深的堰式捕获器捕获细胞数量的分布显示于图6e中。由于过多细胞经历较高剪切力并且自较为不稳定的位置移开，因此阵列密度也影响单细胞的捕获效率。

我们发现所述装置非常有效且容易使用，其能够在小于30秒内实施捕获。而且，在证实了所述方法的效用后，已成功制造并运行了所述装置。当与其他流体机械捕获方法比较时，所述方法的不同之处包括随电阻增大捕获器的“自封闭”、使用简单流过程序即可增强单细胞分离的几何形状调整、和高密度阵列能力。与流式细胞术(FC)相比，尽管FC能在数个时间点询问成百上千的细胞，但其不能在长时间段内分析相同细胞，也不能在个体细胞内进行位置相关荧光分析。用FC尤其难以探测的是在向细胞添加化合物时的快速时间相关变化。本文所提出的装置和技术具有弥补FC中所有所述空白的潜力，并具有中等通量。

人们已通过观察细胞生长和分裂以及在个体细胞阵列中的酶含量来展示动力学细胞分析。可将细胞长时间保持在含有适当培养基的培养物中，且尤其有用的是在固定位置的悬浮细胞的培养物，所述细胞不附着到表面且利用其他方法难以观察。

微流体芯片制造。捕获阵列培养装置的模具是如Di Carlo等人所述使用负性光阻剂(SU-8 50和SU-8 2002，Microchem公司，3000rpm旋转速度，40μm和2μm厚)制造。按照制造商说明书制备聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sylgard 184，Dow Corning)，将其在真空室中脱气1小时并随后浇注在模具上并在70℃烘箱中固化2小时。用手术刀从模具上切下PDMS并随后小心地剥离模具。用平刃针冲出流体入口和出口以便进行管连接。在结合前将玻璃载玻片和PDMS结构二者均用氧等离子体(0.5托，40W)处理20秒。

细胞培养和制备。实验中使用HeLa(人类子宫颈癌)细胞系(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Bethesda，MD)。通过使用补充有10％胎牛血清(FBS)的杜贝克氏改良鹰氏培养基(Dubelcco′s Modified Eagle Medium)(DMEM)每周传代两次保持所述细胞。为进行装载，使用5mL胰蛋白酶EDTA(0.25％，Gibco，Carlsbad，CA)自100mm直径的培养皿分离粘附细胞。随后添加等量的DMEM+FBS到减活的剩余胰蛋白酶中。随后将细胞离心得到沉淀并重新悬浮于经磷酸盐缓冲的盐水pH7.4(PBS，Gibco，Carlsbad，CA)中。关键实验细节是在15分钟胰蛋白酶消化之内捕获悬浮细胞以减少与表面的非特异性粘附。通过与三通阀连接的注射器将刚悬浮的细胞引入先前填充有PBS的装置中。对于对照实验，将经悬浮细胞引入PDMS孔所包含的玻璃载玻片上并在培养箱或(37℃)加热台中培养以用于延时实验。

芯片上的细胞培养。在装载前首先用70％乙醇将管道、阀和装置灭菌5分钟。随后用无菌PBS注入装置和管道。先前步骤全部在生物安全罩中实施以减少污染。随后，添加细胞溶液并将细胞捕获至期望密度。接下来，将阀转到无菌培养基+10％FBS并且启动流动以灌注细胞。使用注射泵(Cole-Parmer)以0.75μl min^-1流速在捕获区域产生约25μm s^-1的平均速度。在观测图像期间将细胞保持在培养箱中或在显微镜台上加热至37℃以用于延时实验。

显微镜方法和数据分析。对于延时实验，用加热台装备Olympus MIC-D显微镜。利用提供的MIC-D软件每3到6分钟采集延时图像。利用IrfanView分析图像以确定形态和细胞分裂。长轴为短轴1.3倍的细胞视为“粘附细胞”。如果细胞自粘附形态收缩，变成球形并随后分成两个子细胞则将其确定为分裂。如果细胞显示起泡、在6小时内无运动或形状变化或其他凋亡特征，则将其确定为凋亡。

装置模拟。对于细胞培养，了解并控制细胞表面上的剪切应力甚为重要，因为细胞路径可由高剪切应力激活而导致不期望的细胞特性。利用有限元方法(FEMLAB 3.0，Comsol公司)对经分离捕获结构周围的流动场进行3D模拟。利用Navier-Stokes方程来模拟仅具有粘性项(即在子域中ρ＝0)的流体流动。边界条件由25μms^-1的平均入口速度和设定为0的出口压力组成。计算域的侧壁设定为对称，以模拟一排捕获结构。模拟单个捕获器(粗筛孔)而不是阵列。采集贯穿所述域的速度和所述域边界处的剪切应力分量二者。

成功制造捕获阵列并进行测试。所述装置由并行连接的分支捕获室构成(图13A)，而在所述室内的阵列由U形PDMS结构构成，所述U形PDMS结构高度为40μm且偏移所述衬底2μm(图13B-C)。每个室在其宽度上含有4至5个捕获器(图13C)。而且，每排捕获器不对称地偏移先前排(图13C)。定性观察到与对称偏移排相比，不对称的捕获器排可更好地填充整个室。测试数个长度的捕获器深度(10μm、15μm、30μm和60μm)以获得最佳的个体细胞分离。我们发现10微米深的捕获器最始终如一地捕获个体HeLa细胞(平均直径为约15μm)。对于其他具有不同平均直径的细胞类型，最佳捕获器大小应有所不同。另外，由于群体中存在细胞大小分布，可能偏向于捕获可更容易占据捕获位点的较小细胞。

对于含有球形捕获细胞的单个3D捕获器结构，如Materials in Methods中所述模拟流体速度和剪切应力。实施此来确定捕获细胞的剪切应力条件以与生理学上相关的剪切应力进行比较。对于实验中所用的0.75μL min^-1流速，最大速度达到约50μm s^-1并且在通道中间自衬底z＝20μm位置处单个被占据捕获器周围的速度幅值的分布显示于图14A中。在捕获器前面和后面的区域中，速度如预计的那样减小。还模拟球形捕获细胞上的剪切应力并且绘制在相同流动条件下通道底部表面上捕获细胞的分布曲线(图14B)。底部表面的剪切应力接近粘附细胞会感受到的剪切应力。此处，在捕获结构外部观察到的平均剪切应力为6 x 10^-2 dyn cm^-2并且在捕获器中的平均剪切应力为2.5 x 10^-3 dyn cm^-2。此导致主流与捕获器内之间的剪切应力比为约24。球形捕获细胞上的平均剪切应力也为3.5 x 10^-3 dyn cm^-2。所述数字比血管内皮细胞经历的约10dyn cm^-2的生理学剪切应力低很多，但与间隙渗流所引起的剪切应力相当。对于低雷诺数(Reynold′s number)，所述装置中观察到的剪切应力比仍独立于流速并且是表征自主流所捕获单细胞“隔离”程度的数值。

在培养基+10％FBS的恒定灌注下获得单个HeLa细胞的规则阵列培养物。对于25μL min^-1流速，每3分钟获取培养在显微镜台上的HeLa细胞捕获阵列的延时图像(图15)。12和24小时后的细胞显示于图15B-C中。最初，此序列的单细胞捕获率为70％(图15A)。在12小时后，观察到形态的小变化，其自球形形态转向粘附形态。而且，在少数情形下观察到细胞分裂(顶部红箭头-图15B)。在24小时后，大多数细胞显示粘附形态并且用箭头做出标志的两个细胞已分裂。在一些情形下，也观察到细胞脱离捕获结构。对于分裂和粘附细胞，捕获结构中数个细胞随时间的特性显示于图16中。应注意，在大多数情形下，在细胞分裂后两个子细胞仍分离在捕获结构中。另一个有趣的观察是所捕获HeLa细胞的粘附方向性。观察到大部分生长中HeLa细胞的长轴与捕获结构的长轴平行。而且在所述情形下，看来似乎细胞变得粘附到与玻璃衬底相对的PDMS结构上。此可能是由于血清中含有促粘附蛋白质，促粘附蛋白质可粘附到偏向附着的疏水PDMS表面。在一些情形下，由于捕获器界面处的衍射PDMS结构上的粘附可能限制显微镜分析。为限制粘附，将来的研究可以利用高浓度的会涂覆所述PDMS表面的牛血清白蛋白(BSA)处理。

细胞粘附、死亡、分裂和自捕获器脱离的动力学定量分析实施24小时时间段并在图17A中绘制曲线。此处，观察到在15小时后50％的细胞显示粘附形态。在24小时后，6％的细胞显示出凋亡特征，而15％的细胞已从最初捕获位点附近脱离。24小时后捕获结构内的高水平保持可能归因于捕获结构内的剪切遮蔽。另外，5％的细胞在24小时后经历细胞分裂。将所述结果与使用相同玻璃衬底没有捕获器或灌注的对照实验中的细胞特性进行比较(图17B)。在此实验中，50％的细胞在近似14小时后粘附，而5％的细胞在24小时后凋亡，并且仅1％的细胞经历细胞分裂。将细胞视为“粘附细胞”的要求是其长度为其宽度的1.3倍。

粘附形态通过将捕获结构中的细胞特性与对照实验中在类似条件下培养的细胞进行比较证实(图18)。在玻璃载玻片上(图18A)和所述装置中(图18B)看到的图像中观察到类似的粘附和拉长形态。

本发明提供基于微流体的水力捕获方法以建立可用灌注动力学控制的单个粘附细胞阵列。培养HeLa细胞并在24小时后观察到在原始捕获位置的高水平保持。另外，细胞分裂、粘附和凋亡特性与在相同衬底上的静置培养相当，表明细胞所受应力没有超过正常培养条件。在细胞分裂后，也观察到子细胞保持在原始捕获结构内。与先前单细胞阵列相比，通过接触和可扩散元素二者的细胞-细胞通信是所述装置中的可控制参数。所述技术可用于单细胞的代谢、药代动力学、药物毒性、剪切应力激活和化学信号路径激活和抑制研究。

Claims (20)

1、一种微流体装置，其包含：

入口；

出口；和

至少一个衬底，其中所述衬底布置于所述入口端口与所述出口端口之间并与所述入口端口和所述出口端口流体连通；

盖子，其中所述盖子和所述至少一个衬底界定内部流动室，所述流动室具有高度；

多个堰式捕获器，其中所述多个堰式捕获器布置于所述衬底上并延伸到所述内部流动室中，所述多个堰式捕获器的高度小于所述流动室的高度；和

至少一个检测装置，其中所述至少一个检测装置测量通过所述室的流动动力学或电特性。

2、如权利要求1所述的微流体装置，其进一步包含流体上与所述室连接的缓冲液槽。

3、如权利要求1所述的微流体装置，其进一步包含用于测量通过所述室的流体流动的构件。

4、如权利要求1所述的微流体装置，其进一步包含用于电测量位于所述室内的分析物或生物试剂的电极。

5、如权利要求1所述的微流体装置，其进一步包含多个珠粒，所述珠粒位于所述室内多个堰式捕获器中的至少两个堰式捕获器之间。

6、如权利要求5所述的微流体装置，其中所述多个珠粒经官能化以结合分析物或生物试剂。

7、如权利要求5所述的微流体装置，其中所述珠粒具有不同直径。

8、如权利要求5所述的微流体装置，其中所述珠粒包含结合的纳米颗粒。

9、如权利要求5所述的微流体装置，其中所述珠粒经核酸和/或多肽官能化。

10、如权利要求1所述的微流体装置，其包含引导通过所述室的流体流动的构件。

11、如权利要求8所述的微流体装置，其中所述引导流动的构件包含至少一个泵。

12、如权利要求1所述的微流体装置，其进一步包含多个可操作以开始、停止或减少通过所述系统的流体流动的阀。

13、如权利要求1所述的微流体装置，其中所述盖子在所述室内可移动。

14、如权利要求13所述的微流体装置，其进一步包含用于测量通过所述珠粒的电阻变化的构件。

15、如权利要求1所述的微流体装置，其进一步包含通过测量所述室内流阻或压力的变化而测量与堰式捕获器关联的分析物或生物试剂的构件。

16、如权利要求5所述的微流体装置，其进一步包含通过测量所述室内流阻或压力的变化而测量与珠粒关联的分析物或生物试剂的构件。

17、如权利要求1所述的微流体装置，其中所述多个堰式捕获器经设计以捕获分析物并促进凝集。

18、如权利要求1所述的微流体装置，其中所述多个堰式捕获器经设计以捕获生物试剂。

19、如权利要求18所述的微流体装置，其中所述生物试剂是细胞或病毒颗粒。

20、一种检测流体样品中目标分析物或生物试剂的方法，其包含：

使所述样品与如权利要求1所述的微流体装置接触和检测选自由电阻、流量、流体压力和光学组成的群组的变化。

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