NO317958B1

NO317958B1 - Et mikrostromningssystem for partikkelseparasjon og analyse

Info

Publication number: NO317958B1
Application number: NO19991051A
Authority: NO
Inventors: Gert Blankenstein
Original assignee: Scandinavian Micro Biodevices
Priority date: 1996-09-04
Filing date: 1999-03-03
Publication date: 2005-01-17
Also published as: EP0925494B1; NO991051D0; JP2002503334A; EP0925494A1; US6432630B1; DE69709377D1; US20030044832A1; AU4113297A; WO1998010267A1; US7138269B2; NO991051L; CA2264389A1; US20070207548A1; ATE211258T1; DK0925494T3; DE69709377T2

Abstract

Et mikrostrømningssystem er tilveiebrakt for å separere partikler, omfattende et mikrofabrikkert element som har en strømningskanal (5) definert deri for ålede en strøm av et fluid som inneholder partiklene gjennom strømningskanalen, første innløpsmidler (2) plassert i den ene enden av strømningskanalen for å lede fluidet inn i strømningskanalen, første utløpsmidler (7) plassert i den andre enden av strømningskanalen for å lede fluidet ut av strømningskanalen, strømningen av fluidet som inneholder partiklene kontrolleres på en slik måte at en partikkel av gangen passerer et tverrsnitt av strømningskanalen, idet elementet posisjoneres i et felt som er i det vesentlige vinkelrett på en lengdeakse til strømningskanalen slik at p artikler som oppholder seg i strømningskanalen og som er følsomme for feltet tvers over strømningskanalen avbøyes i retningen til feltet. Videre er det tilveiebrakt et mikrostrømningssystem for å analysere komponenter til et fluid som inneholder et mikrofabrikert element som har en strømningskanal definert deri for å lede en strøm av et fluid gjennom strømningskanalen, første innløpsmidler for a lede partikler inn i strømningskanalen, første utløpsmidler for å lede fluid ut fra strømningskanalen og en flerhet av analysesteder plassert i strømningskanalen og som omfatter immobiliserte reagenser hvorved fluidet kan analyseres for en flerhet av komponenter samtidig som det oppholder seg i strømningskanalen.

Description

Denne oppfinnelsen angår metoder og apparater for deteksjon, separasjon, sortering og analyse av partikler, slik som celler, celleorganeller, kuler, molekyler, slik som deoksyribonukleinsyre (DNA), proteiner, osv. i en væske. Særlig angår oppfinnelsen partikkelseparasjon ved å bruke forskjellige krefter slik som magnetiske, elektroforetiske, hydrodynamiske og/eller gravitasjons-krefter, f .eks. for be-nyttelse i strømningscytometri, lysmikroskopi, elektroforetisk separasjon, magnetoforese, osv.

Strømningscytometri er en velkjent teknikk som er benyttet for målinger med høye gjennomstrømninger av optiske og/eller elektriske karakteristikker til mikroskopiske biologiske prøver. Strømningscytometriinstrumentanalyse og isoler-te celler og organeller med spesielle fysikalske, biokjemiske og immunologiske egenskaper.

Tradisjonelt har cellesortering ved strømningscytometri (fluorescensaktivert cellesortering) vært den valgte metoden for isolering av spesifikke cellepopulasjoner ved overflatemarkører. Imidlertid lider cellesortering ved strømningscytometri av flere ulemper, spesielt høy fortynning av ønskede celleprøver, lav hastighet og sterilitetsproblemer. Videre er utstyret svært kostbart med høye operasjons- og vedlikeholdskostnader, som gjør teknikken tilgjengelig kun for et begrenset antall laboratorier.

Under de siste få årene har isolering av celler ved antistoff-koplete magnetiske kuler og bærere blitt utviklet til et pålitelig verktøy for isoleringen og karakteri-seringen av cellepopulasjoner. Immunomagnetisk celleseparasjon, f.eks. som kommersielt introdusert av Dynal A/S Miltenyi Biotec, har blitt en etablert metode for celleanalyse i klinisk diagnostikk. På grunn av den relativt lave prisen er denne metoden attraktiv i strømningscytometri, spesielt ved sortering av sjeldne cellulære hendelser. F.eks. skaffer sortering av fosterceller inneholdt i maternale blod-prøver et ikke-invasivt alternativ til diagnostiske prosedyrer før fødselen, slik som fostervannsprøve av morkakeprøve. Et annet sjeldent hendelsesscenario er de-teksjonen av lave konsentrasjoner av kreftceller som har en viktig rolle i diagnosti-sering av minimale residuale sykdommer og evaluering av passende terapier. En annen medisinsk anvendelse av cellesorteringssystemer er diagnose av bakteriel-og virussykdommer,

Selv om denne metoden tilbyr en relativt billig tilnærmelse for å sortere sjeldne cellulære hendelser, adderer den betraktelig tid til den samlede deteksjo-nen av den sjeldne hendelsen og tilbyr ikke multiparameteranalysen som er lett tilgjengelig med strømningscytometriteknikker. Eksisterende teknikker for magnetisk separasjon lider under den lave renheten til den sorterte cellefraksjonen og den lave gjenvinningsraten til de sorterte cellene. I de fleste systemer må flere vasketrinn implementeres i separasjonsprosedyren, som så medfører celletap. I tillegg kan ikke små underpopulasjoner av merkede celler direkte isoleres ved eksisterende magnetiske separasjonsteknikker.

En god oversikt over fluorescensaktiverte cellesorteringsprosedyrer og magnetisk aktivert cellesortering er gitt i Melamed et al., «Flow Cytometry and Sorting, (Ed. Melamed et al., Wiley & Sons Inc., 1990).

US 3 827 555 angir en anordning for å sortere og kvantifisere enkelte partikler i en væske, idet en ledevæske som inneholder partikler føres inn i en første væske og strømningsretningen kan endres mellom to forskjellige kanaler ved å endre trykket i den første kanalen. US 5 465 849 angir en anordning og en fremgangsmåte for å separere partikler i en væske i et magnetisk felt, idet feltet er plassert vinkelrett på en lengdeakse til strømningskanalen slik at partiklene kan separeres i forhold til følsomheten til feltet.

Fremskritt i mikrofabrikasjon og mikrofluidtekniske teknologier fortsetter å gi drivstoff til videre utforskning av miniatyriseringen av bioanalytiske instrumenter og biokjemiske analyser generelt. Den foreliggende oppfinnelsen angår utviklingen av en lavkostnads, ikke-invasiv diagnostisk testemetode og anordninger for å utføre slike tester som inkluderer måling, overvåkning, sortering og analysering av prøver som inneholder partikler, slike som organiske celler, mikrokuler, celleorganeller og makromolekyler slik som DNA. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en billig, rask og pålitelig metode og anordninger for å håndtere, sortere og analysere slike partikler.

Separasjon kan utføres i henhold til forskjellige fysiske egenskaper, slik som fluorescensegenskaper eller andre optiske egenskaper, magnetiske egenskaper, tetthet, elektriske egenskaper, osv. I henhold til et viktig aspekt av oppfinnelsen, utføres partikkelseparasjon ved å rette inn partiklene i én rad av partikler i en mikrostrømningskanal slik at partiklene kan behandles individuelt.

Derfor er det et formål med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe et mikrostrømningssystem og en fremgangsmåte for partikkelseparasjon som har en forbedret partikkelseparasjons effektivitet sammenlignet med den kjente teknikk.

Det er et annet formål med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe et mikrostrømningssystem og en fremgangsmåte for partikkelseparasjon der celle-oppløsning minimaliseres.

Det er enda et annet formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for preparering av fluider som inneholder partikler for separasjon og analyse av partiklene.

Det er enda et videre formål med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe et mikrostrømningssystem og en fremgangsmåte for samtidig separasjon av partiklene i en flerhet av partikkelgrupper.

Det er enda et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et mikrostrømningssystem som inkluderer fasiliteter for forbehandling og/eller etterbehandling av en prøve.

Det er enda et ytterligere formål med oppfinnelsen å utvikle et system for separasjon og analyse av fosterceller i hele matemale blodprøver ved å benytte et integrert automatisk mikrostrømningssystem. Systemet er utformet ved nedskalering og kombinering av forskjellige metoder for å håndtere, manipulere og analysere biokjemiske prøver. Derfor er diagnostikk før fødselen ved analyse av fosterceller separert fra en hel matemal blodprøve, et område som kan dra nytte av fremskritt i miniatyrisering.

Det er et annet formål med oppfinnelsen å utvikle et system for separasjon og analyse av kreftceller fra en prøve, som inneholder kreftceller og friske celler,

ved å benytte et integrert automatisert mikrostrømningssystem. Systemet er også utformet ved nedskalering og kombinasjon av forskjellige metoder for å håndtere, manipulere og analysere biokjemiske prøver. Derfor er kreftdiagnostikk ved analyse av kreftceller separert fra friske celler også et område som kan dra nytte av fremskritt i miniatyrisering.

I henhold til et første aspekt av oppfinnelsen oppfylles de ovenfor og andre formål ved et mikrostrømningssystem for separasjon av partikler, som omfatter et element som har

en strømningskanal definert deri for å lede en strøm av et fluid som inneholder partiklene gjennom strømningskanalen,

første innløpsmidler plassert i én ende av strømningskanalen for å føre fluidet inn i strømningskanalen,

første utløpsmidler plassert i den andre enden av strømningskanalen for å lede fluidet ut av strømningskanalen,

strømmen av fluidet som inneholder partiklene kontrolleres på en slik måte at en partikkel av gangen passerer et tverrsnitt av strømningskanalen,

idet elementet er plassert i et felt som er i det vesentlige vinkelrett på en lengdeakse til strømningskanalen slik at partikler som oppholder seg i strømnings-kanalen og som er følsomme for feltet tvers over strømningskanalen, avbøyes i retningen til feltet.

I henhold til et andre aspekt av oppfinnelsen oppfylles de ovenfor og andre formål ved en fremgangsmåte for separasjon av partikler, som omfatter trinnene

å lede en strøm av et fluid som inneholder partiklene gjennom en strøm-ningskanal på en slik måte at en partikkel av gangen passerer et tverrsnitt av strømningskanalen,

å plassere strømningskanalen i et felt som er i det vesentlige vinkelrett på en lengdeakse til strømningskanalen slik at partiklene som oppholder seg i strøm-ningskanalen og er følsomme for feltet tvers over strømningskanalen avbøyes i retningen til feltet og derved separeres fra fluidet.

I henhold til et tredje aspekt av oppfinnelsen oppfylles de ovenfor og andre formålene ved et mikrostrømningssystem for separasjon av partikler, som omfatter et element som har

første og andre utløpsmidler plassert i den andre enden av strømnings-kanalen for å lede fluid ut fra strømningskanalen,

overvåkningsmidler plassert i strømningskanalen for overvåkning av parametre til en partikkel som oppholder seg inne i et målevolum inne i strømnings-kanalen og tilveiebringelse av et utsignal som svarer til en overvåket parameter, kontrollmidler for å kontrollere passasje av fluid henholdsvis gjennom de første og andre utløpsmidler, som svar på utsignalet til overvåkningsmiddelet hvorved partikler kan separeres i henhold til verdier av en parameter overvåket av overvåkningsmidlene.

I henhold til et fjerde aspekt av oppfinnelsen oppfylles de ovenfor og andre formål ved en fremgangsmåte for separasjon av partikler, som omfatter trinnene

å lede en strøm av et fluid som inneholder partiklene gjennom en strøm-ningskanal på en slik måte at én partikkel av gangen passerer et tverrsnitt av strømningskanalen, idet strømningskanalen har første og andre utløpsmidler for å lede fluid ut fra strømningskanalen,

å overvåke parametre til en partikkel som oppholder seg inne i et målevolum inne i strømningskanalen og

å kontrollere passasje av fluid gjennom de første og andre utløpsmidler, henholdsvis, som svar på en overvåket parameterverdi, hvorved partikler kan separeres i henhold til verdiene av en overvåket parameter.

I henhold til en foretrukket utførelse av oppfinnelsen, en fremgangsmåte for å separere fosterceller fra matemale celler, omfatter trinnene å selektivt magnetisk farge fosterceller i et fluid som inneholder fosterceller og maternale celler, å lede en strøm av fluidet som inneholder fostercellene gjennom en strømningskanal på en slik måte at en fostercelle av gangen passerer et tverrsnitt av strømninigskana-len, å plassere strømningskanalen i et magnetfelt som i det vesentlige er vinkelrett på en lengdeakse til strømningskanalen slik at magnetisk fargede fosterceller som oppholder seg i strømningskanalen avbøyes i retningen til magnetfeltet.

Videre er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å separere kreftceller fra andre celler, som omfatter trinnene å selektivt magnetisk farge kreftcellene i et fluid som inneholder kreftceller og andre celler, å lede en strøm av fluidet som inneholder kreftcellene gjennom en strømningskanal på en slik måte at én kreftcelle av gangen passerer et tverrsnitt av strømningskanalen, å plassere strømningska-nalen i et magnetfelt som i det vesentlige er vinkelrett på en lengdeakse til strøm-ningskanalen slik at magnetisk fargede kreftceller som oppholder seg i strøm-ningskanalen avbøyes i retningen til magnetfeltet.

Partiklene som skal separeres fra andre partikler i et fluid og/eller som skal separeres fra fluidet som inneholder partiklene, kan omfatte levende celler, kromosomer, organeller, kuler, biomolekyler, slik som deoksyribonukleinsyre (DNA), proteiner, osv.

Foretrukket er strømningen gjennom strømningskanalen en laminar strøm-ning slik at strømmen av partikler er forutsigbar og lett å kontrollere, f.eks. med en strøm av ledebuffere.

Når strømningen er laminar, kan partikkelstrømmen plasseres som ønsket inne i strømningskanalen, f.eks. ved å kontrollere strømningshastighetertil fluidet som inneholder partikler ved partikkeiinnløpet til elementet og strømnings-hastigheter til ledebufferne ved tilsvarende innløp.

Foretrukket er strømningskanalen liten slik at strømningen gjennom kanalen har et lavt Reynolds tall, f.eks. i området 0,01 -500, slik som 0,05-50, fortrukket 0,1-25. Derved er inertialeffekter, som forårsaker turbulens og sekundærstrøm-ninger neglisjerbare, viskøse effekter dominerer dynamikken, og miksing forårsa-kes kun ved diffusjon. Strømning av prøven, som er fluidet som inneholder partiklene og ledebufferne, kan lamineres i ledede lag gjennom kanalen og forflytning av partiklene i kanalen skyldes kun de eksterne kreftene som anvendes. Rey-noldstallet det er referert til er basert på den hydrauliske diameteren til strøm-ningskanalen, strømningshastigheten i lengderetningen og fluidtettheten og viskositeten, Re=pDh/u der den hydrauliske diameteren Dh er definert som fire ganger tverrsnittsarealet dividert på den fuktede perimeteren.

De illustrerte strømningskanalene til mikrostrømningssystemet har en bred-de i området fra 0,1 til 0,55 mm, foretrukket i området fra 0,1 til 0,4 mm, spesielt i området fra 0,1 til 0,2 mm, og en dybde i området fra 0,04 til 0,2 mm, foretrukket i området fra 0,04 til 0,1. Med hensyn til det minste tverrsnittsarealet til strømnings-kanalen er det foretrukket at dette arealet er i området fra 0,004 til 0,11 mm<2>, spesielt i området fra 0,004 til 0,02 mm<2>.

Det er antatt at enhver lengde av strømningskanalen innenfor området fra 0,1 til 20 mm, foretrukket 1,0 til 3,5 mm, vil føre til tilfredsstillende resultater.

Foretrukket opererer systemet med totale volumetriske strømningsrater

fra 0,1 opptil 200 u.l/min, som gir en strømningshastighet på 15 mm/min. opptil 180 mm/min. Den gjennomsnittlige tiden en partikkel oppholder seg inne i strøm-ningskanalen, som svarer til en separasjonstid i området fra 0,1 til 6 sek. Tiden en prøve oppholder seg i kanalen er definert av den totale volumetriske strømnings-raten til systemet.

Mikrostrømningssystemet kan omfatte midler for justering av strømningsra-ten for justering av tiden partiklene befinner seg i strømningskanalen.

Foretrukket har strømningskanalen en slik størrelse at for effektiv separasjon forskyves partiklene 10-30 um i strømningskanalen. Derved kan partiklene kun utsettes for et felt i en svært kort tidsperiode og derfor kan kontinuerlig separasjon av partiklene gjøres lettere.

For å innsamle partiklene, som er avbøyd i strømningskanalen, kan mikro-strømningssystemet videre omfatte andre utløpsmidler for å lede partikler ut som har blitt avbøyd i strømningskanalen.

Mikrostrømningssystemet kan omfatte andre innløpsmidler for å lede en første ledebuffer inn i strømningskanalen sammen med fluidet som inneholder partikler. Når strømningen er laminær, strømmer de to fluidene gjennom strøm-ningskanalen i parallell, tilstøtende hverandre langs et lite område som strekker seg langs en lengdeakse til strømningskanalen hvorved tverrsnittet og banen gjennom strømningskanalen til strømningen av fluidet som inneholder partiklene kan kontrolleres av den første ledebufferstrømmen. Videre kan partikler i fluidet som inneholder partiklene bli avbøyd inn i ledebufferfluidet når de to fluidene passerer feltet i det vesentlige normalt på lengdeaksen til strømningskanalen.

Videre kan to (eller enda flere) utløp tilveiebringes i nedstrømsenden til strøm-ningskanalen for henholdsvis å lede ut ledebufferen som nå inneholder separerte partikler og fluid i det vesentlige uten partikler følsomme for feltet i det vesentlige vinkelrett på strømningskanalen.

Mikrostrømningssystemet kan videre omfatte tredje innløpsmidler for å føre inn et andre ledebuffer for forbedret kontroll med banen til partikkelstrømmen gjennom strømningskanalen. Ved justering av strømningshastighetene til ledebufferne og fluidet som inneholder partiklene, kan strømningen inne i strømningska-nalen med fluid som inneholder partikler kontrolleres til å strømme innenfor et i det vesentlige sylindrisk formet område med en lengdeakse som strekker seg i det vesentlige parallelt med lengdeaksen til strømningskanalen og videre kan posisjonen inne i strømningskanalen og diameteren til strømningssylinderen kontrolleres ved tilsvarende justeringer av de volumetriske forhold mellom strømningsraten til fluidet som inneholder partikler og strømningsraten til ledebufferne.

Det er mulig å kontrollere tverrsnittsarealet til området som inneholder prø-ven til å være litt større enn tverrsnittsarealet til partiklene ved å justere de volumetriske strømningsratene til prøven og av de én eller to ledebufferne på en slik måte at partiklene inneholdt i prøven rettes inn til en enkelt rad av partikler. Dette er et svært viktig trekk siden det gjør det mulig å behandle hver partikkel individuelt og det fører til en følsom fremgangsmåte for sortering av partikler i henhold til deres følsomhet for et felt. En lagtykkelse til prøvestrømmen mindre enn 1 u.m kan oppnås.

Foretrukket er dybden av kanalen liten nok, f.eks. under 50 (im, for å tillate observasjon av partiklene som strømmer gjennom kanalen med et mikroskop. I en viktig utførelse av den foreliggende oppfinnelsen omfatter mikrostrømningssyste-met et deksel, f.eks. et transparent eller gjennomskinnelig deksel, for å dekke strømningskanalen. Når dekslet er transparent eller gjennomskinnelig, vil det være mulig å observere hendelser i strømningskanalen, f.eks. passasje av en "stained" eller farget partikkel eller celle.

Elementet med strømningskanalen kan produseres fra ethvert passende materiale, slik som silisium, polymerer, slike som pleksiglass, teflon, osv., glass, keramikk, metaller, slik som kopper, alumna, rustfritt stål, osv., osv.

Kanalen kan anbringes i elementet ved en hvilken som helst passende pro-duksjonsprosess, slik som fresing, etsing, osv.

I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen er elementet en silisiumbrikke produsert ved å benytte fotolitografi og kanalen er etset inn i silisiumbrikken.

Feltet kan være et magnetisk felt, et elektrisk felt, et gravitasjonsfelt, osv., og enhver kombinasjon av slike felt.

Et magnetfelt kan genereres av permanente magneter, slik som sjeldne jordmagneter, slik som samarium-germaniummagneter, en blanding av ferromagnetisk pulver og epoksy, osv., osv., elektromagneter, f.eks. i silisiumintegrerte elektromagneter, osv. Magnetene er foretrukket anbrakt tilstøtende strømningska-nalen slik at magnetfeltet er i det vesentlige vinkelrett på en lengdeakse til strøm-ningskanalen.

I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen er magnetene anbrakt i og limt til rektangulære spor som er etset inn i en silikonbrikke. Sporene er anbrakt tilstø-tende separasjonsstrømningskanalen. I eksemplet vist i fig. 1 kan en permanent-magnet eller en elektromagnet mottas av sporene i mikrostrømningssystemet. Sporene er f.eks. 0,5 mm brede, 0,5 mm lange og 0,2 mm dype. For generering av et magnetfelt kan en fast magnetisk blokk, f.eks. en sjelden jordmagnet, limes fast i sporet. Alternativt kan en blanding av ferromagnetisk pulver og epoksy injise-res inn i sporene for å danne en høy magnetfeltgradient.

Styrken til magnetfeltet inne i mikrostrømningssystemet kan være juster-bart. Hvis en elektromagnet benyttes for genereringen av magnetfeltet, kan stør-relsen til feltet varieres ved å variere amplituden til spenningen som sendes inn til elektromagneten. Hvis en permanent magnet genererer magnetfeltet, kan størrel-sen til feltet varieres ved å variere avstanden mellom magneten og strømnings-kanalen til mikrostrømningssystemet.

Som allerede nevnt avhenger nettoforskyvningen til en partikkel i mikro-strømningssystemet av kraften påført den av feltet. Dette kan bli benyttet for separasjon av en første gruppe av partikler av forskjellige typer i et fluid inn i en flerhet av partikkelsett; idet hvert sett omfatter en spesifikk type av partikler. Et mikro-strømningssystem med f.eks. fem separasjonsutløp kan benyttes til å separere et fluid, som inneholder partikler, i fem partikkelsett, der hvert sett omfatter partikler som er påvirket av feltet med en kraft av en spesiell størrelse, i det følgende be-tegnet som partikler med en spesifikk F-verdi. Partiklene med en lav F-verdi avbøyes kun litt av feltet og ledes ut fra strømningskanalen gjennom en tilsvarende utløpsport. Partikkelavbøying øker med økende F-verdi hvorved slike partikler ledes ut fra strømningskanalen gjennom de tilsvarende andre utløpene.

Partiklene som skal separeres fra andre partikler i et fluid og/eller som skal separeres fra fluidet som inneholder partiklene, kan være magnetisk farget for å lette separasjon i et magnetfelt.

I den foreliggende konteksten skal betegnelsen farging forstås på en bred måte. Betegnelsen er tenkt å dekke en hvilken som helst måte for markering av en partikkel for derved å forenkle deteksjon av partikkelen. F.eks. kan en celle bli farget med en fluoriserende substans, slik som akridin orange, metylenblått, osv., for å lette deteksjon av de fargede partiklene ved en fluorescensdetektor, eller en partikkel er sagt å være magnetisk farget når den er koplet til en magnetisk mikroku-le. Mikrokulen kan f.eks. bære et monoklonalt eller polyklonalt antistoff på dens overflate for kopling med et antigen til en celle som skal separeres ved å benytte et magnetfelt.

I tilfellet hvor partiklene må detekteres i en strømningskanal ved optiske midler, er slike partikler foretrukket farget med en kromofor reagent, eller en fluo-rescent probe.

Et elektrisk felt kan genereres av elektroder, slik som metallelektroder, slik som gullelektroder, osv. Elektroden kan anbringes på innsiden av strømningska-nalen, f.eks. for å introdusere elektroforetiske krefter, f.eks. for separasjon av ladede molekyler i fluidet, eller på utsiden av strømningskanalen f.eks. for å introdusere dielektroforetiske krefter, f.eks. for separasjon av partikler inneholdt i strømningen i henhold til følsomheten partiklene har for feltet. Foretrukket er elektrodene anbrakt på en slik måte at det elektriske feltet i det vesentlige er vinkelrett på en lengdeakse til strømningskanalen.

Det elektriske feltet kan være et høyfrekvent felt, f.eks. et felt på 5 MHz generert av elektroder anbrakt på innsiden av strømningskanalen. Levende celler anbrakt i et elektrisk felt vil polariseres og påvirkes av feltet og derfor kan et veks-lende felt benyttes for å separere levende celler fra andre partikler.

Feltet generert tvers over strømningskanalen kan benyttes til immobilisering av partikler hvorved partiklene kan holdes i det vesentlige faste posisjoner inne i strømningskanalen for en spesifikk periode, f.eks. som skissert i fig. 6, som tillater kjemiske reaksjoner mellom partiklene å skje og/eller at kinematiske målinger ut-føres på partiklene og/eller for å bringe partiklene i kontakt med forskjellige kjemiske substanser eller for å separere partiklene fra prøven. Partiklene kan gjennomgå et vasketrinn før fjerning eller reduksjon av feltet redispergerer dem.

I henhold til et femte aspekt av oppfinnelsen oppfylles de ovenfor og andre formål ved et mikrostrømningssystem for separasjon av partikler, som omfatter et element som har

innløpsmidler anordnet i én ende av strømningskanalen for å lede fluidet inn i strømningskanalen,

feltgenereringsmidler anordnet nær den andre enden av strømningskanalen for å generere et felt i det vesentlige langs en lengdeakse til strømningskanalen hvorved partiklene dras av feltet langs kanalen og distribueres i henhold til deres følsomhet til feltet og deres mobilitet.

F.eks. kan midler for generering av et magnetfelt plasseres i den lukkede enden av en mikrostrømningskanal, som i den andre enden har i det minste ett innløp for å lede inn en prøve som inneholder magnetisk merkede makromolekyler, f.eks. ribonukleinsyre eller proteiner. Prøven føres inn i kanalen hvor partiklene dras av magnetfeltet langs kanalen og, som ved elektroforese, vil partiklene distribueres i henhold tii deres følsomhet for magnetfeltet og deres mobilitet. Det gene-rerte magnetfeltet fjernes etter et forhåndsbestemt tidsintervall og fordelingen av partikler kan så observeres.

I henhold til en annen utførelse av oppfinnelsen er strømningen gjennom sorteringsutløpet ikke kontinuerlig, men kun tillatt ved en styringsanordning, f.eks. en ventil, når en partikkel med ønskede egenskaper detekteres av en deteksjonsanordning. Partiklene sorteres ved å benytte hydrodynamiske krefter i form av at strømningen divergeres fra det vanlige utløpet til sorteringsutløpet kun når den inneholder en partikkel som oppfyller visse kriterier. Konsentrasjonen av sorterte partikler i strømningen ut av sorteringsutløpet vil som en konsekvens være høy. Dette er spesielt en fordel for prøvestrømning med sjeldne tilfeller av partikler som det er lett etter. Deteksjonsanordningene kan f.eks. være optiske deteksjonsanordninger eller magnetiske deteksjonsanordninger f.eks. en Hall-sensor, eller midler for detektering av f.eks. elektriske eller andre egenskaper til partiklene. Deteksjonsmidlene kan i en alternativ utførelse benyttes til telling av partikler med de ønskede egenskapene som en separat funksjon eller i forbindelse med en hvilken som helst av de andre utførelsene som er beskrevet her.

I enda en annen utførelse er feltstyrken justerbar, f.eks. ved å justere spenningen tilført en elektromagnet eller til et sett av elektroder eller ved å justere avstanden fra en permanentmagnet til strømningskanalen. Partiklene er i en første operasjonsmodus fanget på innsiden av strømningskanalen av feltet med høy intensitet, mens på samme tid er sorteringsutløpet lukket. I en andre operasjonsmodus reduseres feltet og sorteringsutløpet åpnes på en slik måte at de fangede partiklene spres igjen og beveges ut sorteringsutløpet. Partiklene som er sjeldne i prøven kan ved å skifte mellom disse to operasjonsmodene sorteres ut i en sterkt konsentrert form. Et eksempel på denne utførelsen er skissert i fig. 6.

I en videre interessant utførelse involverer mikrostrømningssystemet i henhold til oppfinnelsen innretninger for utførelse av forbehandling og/eller etterbehandling av fluidet som inneholder partiklene. Disse mulighetene er skissert i fig. 5(f), 7 og 10. Som et eksempel kan partiklene behandles med en reagent før de blir ført inn i strømningskanalen, f.eks. ved å gjennomgå magnetisk farging eller farging med en kromofor. Etterbehandling kan omfatte midler for å innsamle eller konsentrere de avbøyde partiklene eller midler for å kontakte de avbøyde partiklene med én eller flere reagenser.

I en mulig kombinasjon av forbehandlings- og etterbehandlingsmidlene, kan cellene gjennomgå magnetisk farging før de føres inn i strømningskanalen, og etter separasjon kan fargingen fjernes ved å behandle de fargede cellene med en passende reagens.

Det er en viktig fordel med den foreliggende oppfinnelsen at det er tilveiebrakt et mikrostrømningssystem som opererer kontinuerlig med ingen krav om innblanding av en operatør.

Det er en annen fordel med den foreliggende oppfinnelsen at separasjon kan utføres i ett trinn.

Det er enda en annen fordel med den foreliggende oppfinnelsen at partiklene kan separeres i en kontinuerlig strømning uten å forstyrre vesentlig selve strømningen og at separerte partikler kan innsamles ved tilsvarende atskilte utløp av stømningskanalen uten å måtte avbryte strømningen i strømningskanalen.

Det er en annen viktig fordel med oppfinnelsen at partiklene inneholdt i prø-ven kan bli stilt på linje ved å justere strømningsraten til én eller flere ledebuffere, slik at partiklene kan analyseres og sorteres individuelt. Dette resulterer i et sorteringssystem med den høyeste sensiviteten for følsomheten til den enkelte partikkel for feltet påført sorteringskanalen og et sorteringssystem med den høyeste oppløsningen til deteksjonsmidlene for egenskapene oppvist av partiklene.

Det er enda en annen fordel med den foreliggende oppfinnelsen at mikro-strømningssystemet enkelt integreres i andre kontinuerlige strømningssystemer, slik som flow-cytometere, strømningsinjeksjonsanalysesystemer, osv.

Det er en ytterligere fordel med den foreliggende oppfinnelsen at partiklene kan separeres i en flerhet partikkelgrupper, f.eks. forskjellige underpopulasjoner av celler, basert på forskjellig susceptibilitet for feltet, som er generert tvers over strømningskanalen, for de forskjellige partikkelgruppene. Dette kan oppnås ved å benytte et mikrostrømningssystem med flere utløp som skissert i fig. 5{c).

Det er enda en ytterligere fordel med den foreliggende oppfinnelsen at mik-rostrømningssystemet tillater observasjon av partiklene i strømningskanalen ved å benytte et mikroskop.

Det er enda en ytterligere fordel med oppfinnelsen at det er tilveiebrakt et lukket system som tillater farlige biologiske prøver, slik som prøver som inneholder patogener, å føres inn i systemet uten å forurense laboratorieomgivelsen og uten å fremkalle fare for operatører som arbeider med patogene biomaterialer.

Det er enda en ytterligere fordel med oppfinnelsen at det er tilveiebrakt et system med en lav skjærspenning i strømningen som tillater en forsiktig behandling av biologiske prøver; f.eks. skjøre levende celler, og spesielt når to ledebuffere introduseres i kanalen.

Det er enda en ytterligere fordel med oppfinnelsen at en høy konsentrasjon av de sorterte partiklene kan oppnås selv fra prøver med sjeldne forekomster av partikler som det er lett og sortert etter.

I henhold til et viktig aspekt av oppfinnelsen, tilveiebringes et nytt system for immunomagnetisk celleseparasjon og manipulering som benytter en silisiumba-sert mikrofremstilt strømningsbrikke. Systemet kombinerer fordelen med flow-cytometri og immunomagnetiske separasjonsteknikker. Strømningsbrikken vil være en viktig komponent i et flyttbart mikrosystem for cellesortering og analyse. Strømningsbrikken er utformet for rask immunomagnetisk celleseparasjon nesten uten noe trykkfall. Dens enkle og billige fremstilling og allsidige sorterings- og de-teksjonsegenskaper tilbyr et alternativ til konvensjonelle celleseparasjons-systemer.

Det er en fordel med oppfinnelsen at det er tilveiebrakt et mikrostrømnings-system som er billig, lett å håndtere, allsidig, enkelt og flyttbart og som tilbyr muligheten for automasjon.

Det er tilveiebrakt et miniatyrisert strømningskanalsystem som benytter den fordelaktige oppførselen til fluid i mikrosystemer. Det oppfunnede systemet er i kontinuerlig drift. Istedenfor å holde tilbake de magnetiserbare partiklene i separa-sjonsenheten, avbøyes partiklene i retningen til magnetfeltet mens de passerer det kontinuerlig. Ved å splitte fluidstrømningen i to eller flere utløp, kan avbøying-en av partiklene benyttes for separasjon av partiklene i forskjellige partikkelsett, som hver forlater strømningskanalen gjennom et spesifikt utløp.

Det kontinuerlige separasjonssystemet (KSS) tillater effektiv an riking så vel som reduksjon av merket prøveinnhold av interesse. KSS er utformet til å passe inn under et mikroskop som tillater parallell deteksjon av de optiske egenskapene til prøven og styring av separasjonen av partikler.

En fordel med geometrien til den oppfunnede separasjonsstrømnings-kanalen er at en magnetisert eller elektrisk ladet partikkel kun må beveges over en avstand på 10-30 um for å separeres fra fluidet som inneholder partiklene.

Dessuten muliggjør oppfinnelsen isolasjon av multiple celler eller partikkel-subpopulasjoner fra en enkelt prøve på samme tid. Størrelsen og retningen til kraften F på en magnetiserbar partikkel, f.eks. en magnetisk merket celle, er av-hengig av størrelsen på magnetfeltet og antallet magnetiske momenter som er induserbare på en merket celle.

hvor S er antallet Bohr-magnetoner (uB) pr. partikkel og N er antallet partikler pr. celle.

Kuler med liten S beveger seg en kortere distanse i sideretning i forhold til strømningen gjennom strømningskanalen enn kuler med en høyere S-verdi. Dette kan benyttes til å separere underpopulasjoner av celler merket med forskjellige magnetiserbare kuler: ved å splitte strømningskanalen i flere utløpskanaler kan celler skilles fra hverandre og separeres på grunn av deres individuelle F-verdier.

Drag-kraften på en sfærisk partikkel kan finnes fra partikkelens Reynolds-tall, basert på partikkeldiameter, partikkelhastighet i forhold til fluidet og fluidets viskositet og tetthet. I en strømning med et Reynholds-tall mindre enn 100, kan drag-kraften D på partikkelen finnes fra en modifisert versjon av Stokes lov

der u. betegner viskositeten til væsken, U er den relative hastigheten til partikkelen og D er diameteren. Den numeriske verdien til parentesene på den høyre siden av formelen over er nær én for Reynolds-tall mindre enn én derfor kan den i det tilfelle utelates. Størrelsen til drag-kraften på partiklene, kraften påført partikkelen av feltet, avstanden partiklene behøver å bevege seg og tiden tilgjengelig for separasjonen er alle viktige aspekter som må betraktes når en separasjonsprosess og anordningen for å utføre den utformes. Et eksempel gis for separasjon ved gravitasjonsmidler. Den effektive gravitasjonskraften G defineres som gravitasjonskraften minus oppdriftskraften og finnes som hvor g er gravitasjonskonstanten. For enkelhet, er det antatt et Reynolds-tall for partikkelen mindre enn én og derfor er drag-kraften D gitt i en enkel form. Disse to kreftene, D og G, er like når maksimalhastigheten og synkningshastigheten IL har blitt oppnådd. Denne hastigheten finnes som

Hastigheten ved en gitt tid t kan finnes som

For en partikkel nedsenket i vann med en diameter på 30 u.m og en tetthet på 1,2 ganger tettheten til vann er synkningshastigheten 9 x 10"<5> m/s. Partikkelen vil nå 90% av denne hastigheten etter 2,1 x 10<*5> sekunder og derfor kan transientfasen neglisjeres. Det vil ta partikkelen 0,33 sekunder å tilbakelegge en distanse på

30 (im, noe som gjør metoden fornuftig å anvende til separasjonsformål.

Mens instrumentering i kjemi og biokjemi har blitt mer automatisert de siste årene, er fremdeles prepareringen av prøver en i høy grad laboratorieintensiv oppgave. Kravet er økende for høy gjennomstrømning, lettere benyttet, kostnads-effektive analytiske anordninger og prøver. Det som skaper denne muligheten er f.eks. det verdensomspennende forsøket på å sekvensiere det menneskelige genom, noe som resulterer i utviklingen av nye DNA-diagnose- og terapeututstyr. En annen viktig trend er minimeringen av helsekostnader og hospitalinnleggelser ved å teste pasienter og overvåke terapeutisk bruk i mindre og billigere omgivelser, den såkalte behandlingspunktanalysen ("point-of-care analysis").

Mikrostrømningsanordninger som inneholder oppstillinger av nukleinsyre-hybridiseringssteder, kjent som genosensorer, blir utviklet for en mangfoldighet av anvendelser i genomanalyse. En stor del av den generelle anstrengelsen for utvik-ling av genosensorer involverer optimalisering av eksperimentelle betingelser i den aktuelle bruken av genosensorene.

En annen utførelse av oppfinnelsen angår en lavteknologiform av genosen-sor- og immunosensorteknologi, som involverer oppstillinger av oligonukleotider på en mikrobrikke, som kan benyttes for å definere optimale driftsbetingelser og for å utvikle anvendelser av hybridiseringsoppstillinger i kartlegging og sekvensie-ring av genom. Genosensoroppstillingen plasseres i et mikrostrømningskanal-system som tillater drift i en gjennomstrømningsmodus. På denne måten kan flere trinn ved håndtering av mikrovæsker, f.eks. vaske- og fargetrinn, reagenstilsetting, integreres som en automatisert rutineprosedyre. I tillegg kan mikrostrømning-saordninger som inneholder oppstillinger av antistoff/antigen-steder, kjent som immunosensorer, utformes på samme måte. Systemet kan benyttes til kombinato-risk screening (screening med høy gjennomstrømming) og farmakokinetiske stu-dier.

I henhold til et sjette aspekt av oppfinnelsen oppnås ovenfor og andre formål ved et mikrostrømningssystem for analyse av komponenter av et fluid, som omfatter et element som har en strømningskanal definert deri for å lede en strøm av et fluid gjennom strømningskanalen, første innløpsmidler for å føre partiklene inn i strømningskanalen, første utløpsmidler for å lede fluid ut fra strømningskana-len og en flerhet av prøvesteder plassert i strømningskanalen og som omfatter immobiliserte reagenser, hvorved fluidet kan analyseres for en mangfoldighet av komponenter samtidig som det befinner seg i strømningskanalen.

Systemet kan videre omfatte feltgenereringsmidler plassert nær til i det minste noen av prøvestedene for å generere et felt nær til de tilsvarende prøve-stedene hvorved reagenser som oppholder seg i strømningskanalen og som er følsomme for feltet når det genereres på et utvalgt prøvested, tiltrekkes og immobiliseres på det utvalgte prøvestedet, eller frastøtes fra det utvalgte prøvestedet.

I en utførelse av oppfinnelsen omfatter elementet en flerhet av strømnings-kanaler anordnet i parallell eller i serie og hver av hvilke har prøvesteder hvorved fluidet som inneholder partiklene bringes i kontakt med et stort antall prøvesteder.

I henhold til et syvende aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for å analysere komponenter til et fluid som omfatter trinnene med å føre inn et fluid som inneholder partiklene i en strømningskanal og å tillate fluidet å strømme i kanalen, idet kanalen har en mangfoldighet av analysesteder, som hver omfatter immobiliserte reagenser hvorved fluidet kan analyseres for en mangfoldighet av komponenter samtidig som det oppholder seg i kanalen.

I henhold til et åttende aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for å danne analysesteder som omfatter immobiliserte reagenser i en strømningskanal, idet fremgangsmåten omfatter trinnene

å preparere utvalgte overflater på analysestedene for å immobilisere utvalgte reagenser,

å tildele en utvalgt reagens nær til et tilsvarende utvalgt analysested, og

å generere et felt nært til det utvalgte stedet hvorved reagensen tiltrekkes mot og bringes i kontakt med overflaten til det utvalgte analysestedet av feltet som er generert og immobiliseres ved kontakt med overflaten.

Derfor kan mikrostrømningssystemet i det tidligere avsnittet med en strøm-ningskanal med analysesteder videre omfatte feltgenererende midler plassert nær til i det minste noen av områdene som er tilpasset til å inneholde immobiliserte reagenser, idet hvert feltgenererende middel genererer et felt nært til det tilsvarende arealet hvorved reagenser som føres inn i strømningskanalen og som er følsomme for feltet som er generert i området, tiltrekkes og immobiliseres i området eller frastøtes fra området. Alternativt kan bredden av kanalen til mikrostrøm-ningssystemet utvides til å romme et todimensjonalt gitter av områder for å inneholde immobiliserte reagenser med feltgenereirngsmidler plassert nær til i det minste noen av disse områdene. I en annen utførelse kan mikrostrømningssyste-met for analyse av en prøve med et stort antall av reagenser samtidig, bestå av en oppstilling som omfatter et antall av parallelle kanaler som hver har en mangfoldighet av områder tilpasset til å inneholde immobiliserte reagenser plassert i strømningskanalene og videre omfattende feltgenereringsmidler for å generere felt nært til områdene hvorved reagenser som er følsomme for feltet immobiliseres i området. Feltgenereringsmidlene kan f.eks. være permanentmagneter, elektroder eller elektromagneter.

Anordningene med analysesteder muliggjør hurtig manipulasjon, deteksjon og analyse av makromolekyler, partikler og celler i biologiske eller kjemiske prøver ved at en mangfoldighet av tester kan utføres på den samme mikrobrikken. I henhold til oppfinnelsen er mikrostrømningssystemer og molekylærbiologi kombinert.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Utførelseseksempler av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet under henvisning til de medfølgende tegningene der

Fig. 1 illustrerer partikkelseparasjonsoperasjonen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, Fig. 2 viser et tverrsnittsbilde av en separasjons-strømningskanal i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, (a) viser hovedutførelsen og (b) viser et tverrsnittsbilde av en separasjons-strømningskanal for gravitasjonsseparasjon, Fig. 3 viser et mikrostrømningssystem med elektroder som feltgenererende midler, Fig. 4 viser et flytskjema til et magnetisk partikkelseparasjonsapparat i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, Fig. 5 viser flytskjemaer over forskjellige utførelser av den foreliggende oppfinnelsen. (a)-(d) viser utførelser med forskjellige antall av innløp og utløp, og (e) viser en utførelse med et forstørret separasjonskammer, og (f) viser en utførelse med et forstørret kammer for å samle inn separerte partikler, Fig. 6 illustrerer innfangning av magnetiske partikler i en strømningskanal Fig. 7 viser et flytskjema for optisk detektering og hydrodynamisk separasjon ved å benytte en blokkeringsventil, Fig. 8 viser et flytskjema for optisk detektering og hydrodynamisk separasjon ved å benytte sprøytepumper, Fig. 9 viser et flytskjema over to strømningskanaler koplet i parallell (a) og i sekvens (b) og (c), Fig. 10 illustrerer prinsippet med å introdusere en førbehandlingsinnretning i elementet som omfatter mikrostrømningssystemet, her videre kombinert med en etterbehandlingsinnretning eller en hydrodynamisk separasjonsinnretning,

Fig. 11 viser en strømningskanal for magnetoforese,

Fig. 12 viser en strømningskanal som har en serieoppstilling av analysesteder utstyrt med elektroder for å immobilisere prober, Fig. 13 viser en strømningskanal som har en serieoppstilling av analysesteder utstyrt med magneter for å immobilisere prober, Fig. 14 viser en strømningskanal som har en todimensjonal oppstilling av analysesteder utstyrt med magneter for å immobilisere prober, Fig. 15(a) og (b) viser to anordninger som hver omfatter en parallell oppstilling av mikrostrømningskanaler som hver har et analysested,

Fig. 16 illustrerer prepareringen av et mikrostrømningssystem,

Fig. 17 viser diagrammer f ra den magnetiske separasjonen beskrevet i eksempel 3, og Fig. 18 er et flytskjema som illustrerer en prosess for å separere fosterceller fra en matemal blodprøve ved å kombinere forskjellige separasjonsmetoder som beskrevet i eksempel 4.

DETALJERT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

I henhold til en foretrukket utførelse av oppfinnelsen separeres magnetisk fargede partikler, f.eks. immunologisk merkede celler med magnetiske partikler, slik som antistoff-koplede magnetiske kuler, fra ikke-magnetiske partikler, f.eks. ikke-merkede celler, ved å eksponere partiklene for et magnetfelt generert med en permanent eller en elektromagnet. Positive elle negative utvelgelsesmetoder kan anvendes. Ved positiv celleseparasjon separeres og isoleres celler av en spesifikk celletype fra en hetrogen blanding av celler.

Fig. 1 illustrerer prinsippet til separasjonsmetoden i henhold til oppfinnelsen. Et mikrostrømningssystem 1 er vist som har tre innløps- og to utløpsporter. Prøven 9 som inneholder partikler føres inn i separasjonsstrømningskanalen 5 gjennom en sentral innløpsport 2 og ledes kontinuerlig gjennom separasjons-strømningskanalen 5 til mikrostrømningssystemet 1 av to ledebuffere ("guiding buffers") 10 og 11, som hver føres inn i separasjons-strømningskanalen gjennom innløpsporter3 og 4, henholdsvis. Et feltgenererende middel som omfatteren magnet 8 er plassert i umiddelbar nærhet av stømningskanalen 5 og genererer et magnetfelt tvers over strømningskanalen 5. Når prøven 9 som inneholder partikler passerer magnetfeltet, dras de magnetisk fargede partiklene 12 inn i ledebufferet 10 og forlater strømningskanalen 5 sammen med ledebufferet 10 gjennom sorte-ringsutløpet 6, mens ikke-merkede celler 13 som ikke er påvirket av den magnetiske kraften forblir i fluidet 9 og forlater strømningskanalen 5 gjennom avfallsutlø-pet 7.

På grunn av den lille kanaldimensjonen er strømningen laminar med negli-sjerbar influens av inertialkrefter. Blanding av prøvestrømningen og ledebufferne er ikke detekterbar siden kontaktarealet er lite og kontakttiden reduseres til et subsekund-område. Tykkelsen til prøvestrømningen kan justeres nøyaktig ved å variere strømningsraten til de to ledebufferne. Dette muliggjør justering og optimalisering av det magnetiske mikrostrømningssystemet for forskjellige celletyper og størrelser. Volumstrømningen til prøven og de to ledebufferne justeres slik at partiklene i prøven stilles på linje i en enkelt strøm av partikler.

Det magnetiske feltet i mikrostrømningskanalen virker som et ekstremt sen-sitivt filter for magnetiske partikler, f.eks. celler. Celler merket med superparamag-netiske kuler (f.eks. MACS, Dynal) magnetiseres og tiltrekkes av magnetfeltet hvorved strømmen av magnetiserte partikler avbøyes inn i sorteringsutløpet. Den korte tiden fluidene oppholder seg i strømningskanalen og det lave Reynolds-tallene til strømingen i strømningskanalen minimaliserer påvirkningen til gravita-sjonen sammenlignet med påvirkningen til de magnetiske kreftene.

Fig. 2 viser et tverrsnittsbilde av to varianter av mikrostrømningssystemet 1 fremstilt ved å benytte halvlederteknologi. Mikrostrømningssystemet kan fremstil-les fra ethvert passende materiale slik som polymerer, glass, halvledere, slik som silisium, germanium, galliumarsenat, osv., osv.

Det første viste mikrostrømningssystemet (a) er en 3-lags sandwich. Det sentrale laget 14 er en silisiumskive som har en strømningskanal 5 etset inn i den. Silisiumskiven 14 er dekket med en transparent plate 15, slik som en glassplate, som har en tykkelse av f.eks. 0,16 mm. Fluider på innsiden av strømningskanalen 5 kan observeres gjennom glassplaten 15, f.eks. ved å benytte et mikroskop 16 (deteksjonsmiddel). Fluidinnløpet 2 og utløpet 7 er forbundet til rør 17,18, f.eks. smeltet silisiumkapillær eller teflonrør, for å føre fluider inn i eller lede fluider ut fra strømningskanalen 5. Bufferinnløp 3 og 4 og utløpet 6 for de utskilte partiklene er også vist. Bunnplaten 19, f.eks. laget av plast, letter montering av rørene 17,18.

En modifisert versjon (b) av mikrokanalsystemet for separasjon ble utformet med gravitasjon som kraftfeltet, på denne måten sorteres partikler på grunn av deres tetthet og/eller diffusjonskonstant, den siste er i hovedsak kontrollert ved formen og størrelsen på partiklene. Under drift er systemet plassert med strøm-ningsplanet i det vesentlige normalt på retningen til gravitasjonskraften. Som illustrert i fig. 2(b), har denne utførelsen av et mikrostrømningssystem 1 en prøve-innløpsport 2 og en utløpsport 7 plassert over mikrokanalen 5 og en bufferinn-løpsport 3 og en utløpsport 6 plassert under mikrokanalen 5. Prøven som inneholder partiklene 9 føres inn i separasjonsstrømningskanalen gjennom innløpsport 2, og en ledebuffer 10 føres inn i separasjons-strømningskanalen 5 gjennom innløp-sport 3. På denne måten skapes to laminerte lag med fluid som strekker seg langs det horisontale planet og som kontinuerlig strømmer gjennom separasjonsstrøm-ningskanalen 5 til mikrostrømningssystemet 1. Partiklene beveger seg fra det par-tikkelinneholdende laget til ledebufferlaget ved sedimentering. Når prøven som inneholder partikler 9 passerer strømningskanalen 5, dras partikler med en viss tetthet og størrelsesegenskaper inn i ledebufferet 10 av gravitasjonskraften og forlater strømningskanalen 5 sammen med ledebufferet 10 gjennom utløpsporten 6, mens partikler som er mindre følsomme for gravitasjonsfeltet forblir i prøven 9 og forlater strømningskanalen 5 gjennom avfalls-utløpet 7. Den vertikale forskyv-ningen av en spesifikk partikkel i prøven er gitt ved dens tetthet og diffusjonskonstant og kontakttiden prøvelaget har med ledebufferlaget. Kontakttiden er definert av den totale strømningsraten til fluidene som passerer gjennom mikrosystemet 1 og lengden av mikrokanalen 5. Systemet kan justeres slik at et ønskelig eller passende prøveeksemplar kan trekkes ut og separeres fra prøvestrømningen på grunn av deres tetthets- og/eller diffusjonsegenskaper ved å justere den volumetriske strømningsraten til ledebufferet og prøven som inneholder partiklene.

Alternativt kan mikrostrømningssystemet omfatte to ytterligere innløpsporter for å føre en andre og en tredje ledebuffer inn i mikrokanalen 5, hvor de to ytterligere innløpsportene er plassert over mikrokanalen, en på hver side av prø-veinnløpsporten 2. Strømningsratene til prøven og den andre og den tredje ledebufferen kan justeres slik at partiklene som er inneholdt i prøven stilles på linje i en enkelt linje.

Kjennetegnende trekk for et utførelseseksempel av et mikrostrømnings-system i henhold til oppfinnelsen, f.eks. som vist i fig. 1 og 2, er vist i tabell 1.

Magnet

Permanentmagnet

Sjelden jordart Samarium-Germanium 0,5 x. 0,5 x 0,2 mm Elektromagnet

Fig. 3 viser et mikrostrømningssystem 1 som benytter elektroder 20, 21 for å generere et elektrisk felt tvers over strømningskanalen 5. Elektrodene 20,21 kan introdusere dielektroforetiske eller elektroforetiske krefter benyttet for partikkelseparasjon. For at elektroforetisk separasjon skal finne sted kan gullelektroder plasseres på innsiden av veggene til strømningskanalen 5. Ved å påføre en spenning tvers over elektrodene genereres et elektrisk felt i det vesentlige vinkelrett på en lengdeakse til strømningskanalen. Det elektriske feltet forårsaker av-bøyning av ladde partikler eller molekyler i strømningskanalen 5 hvorved elektrisk ladde partikler kan avbøyes vekk fra prøven som inneholder partikler og som strømmer i mikrostrømningskanalen og inn i et ledebuffer som også strømmer i strømningskanalen og tilstøtende prøven som inneholder partikler i mikrostrøm-ningskanalen. Fig. 4 viser et mikrostrømningsapparat 22 som inkluderer et mikrostrøm-ningssystem 1 som vist i fig. 1 og 2. Mikrostrømningssystemet 1 har to innløp 2, 3 og to utløp 6, 7, to sprøytepumper 23, 24, to 3-veis styreventiler 25, 26 og kapillære rør 27, 28. De kapillære rørene 27, 28 benyttes for å sammenkople de to sprøytepumpene 23, 24 med innløpene 3, 2, henholdsvis, til mikrostrømningssys-temet 1.

Konvensjonelle sprøytepumper med midler, f.eks. skritt-motorer (ikke vist), for å bevege stemplene i en forhåndsbestemt hastighet har blitt benyttet for å generere en kontinuerlig strømning av ledebufferet gjennom innløpsrøret 27 og en kontinuerlig strømning av prøven gjennom innløpsrøret 28. Systemet kan drives i en første lastemodus hvor de to 3-veis styringsventilene 25, 26 åpnes for strøm-ning mellom sprøytepumpene 23, 24 og bufferreservoaret 29 og prøvereservoaret 30, henholdvis, og sprøytepumpene 23, 24 lastes med buffer og prøve fra reser-voarene 29, 30, henholdsvis. I en etterfølgende andre operasjonsmodus åpnes de to 3-veis ventilene 25, 26 for strømning mellom sprøytepumpene 23, 24 og det kapillære røret 27 til bufferinnløpet 3 og det kapillære røret 28 til prøveinnløpet 2 til mikrostrømningssystemet 1, henholdsvis. Sprøytepumpene er i denne andre ope-rasjonsmodusen styrt for å generere en forhåndsdefinert volumetrisk strømnings-rate gjennom mikrostrømningssystemet 1.

Fig. 5 illustrerer forskjellige mikrostrømningssystemer31, 32, 33, 34, 35 og 36 som har strømningskanaler med forskjellige geometrier, og som illustrerer forskjellige utførelser av oppfinnelsen. Mikrostrømningssystemer med to eller tre inn-løpsporter og to, tre eller fem utløpsporter, henholdsvis, er vist i fig. 5(a)-(d). Systemet vist i 5(a) med innløpsporter for prøve og to ledebuffere, henholdsvis, og

sorteringsutløpsport og avfalisutløpsport er lik systemet vist i fig. 1. Fig. 5{b) og (c) viser systemet med flere utløpsporter, tre og fem, henholdsvis, hvortil partikler kan sorteres og forlate strømningskanalen i henhold til deres følsomhet for det påførte feltet. Et enkelt system med to innløp og to utløpsporter er vist i fig. 5(d), likt det i fig. 2{b) som er benyttet til gravitasjonssortering. Et mikrostrømningssystem med en separasjonskanal utstyrt med en magnet der bredden til separasjonskanalen er forstørret før todelingen i et sorteringsutløp og et avfallsutløp, er vist i fig. 5{e). I henhold til oppførselen til væskene i én strømningskanal er størrelsen til tverrsnittsarealet okkupert av prøvestrømningen proporsjonal med bredden til separasjonskanalen. I henhold til dette øker den transversale avstanden mellom to partikler A og B proporsjonalt med økningen i bredden til separasjonskanalen. En større avstand mellom partikler som skal separeres gir en høyere selektivitet til den mekaniske separasjonen. Fig. 5(f) viser et mikrostrømningssystem hvor bredden til utløpskanalen 5 er økt for å danne et kammer hvor de sorterte partiklene samles for videre prosessering eller analyse, f.eks. detektering, farging, avfarging eller kultivering.

Fig. 6 illustrerer et system der partiklene er fanget på innsiden av mikro-strømningskanalen 5 for en ønsket periode ved å benytte det elektromagnetisk utstyrte apparatet. I dette tilfelle er magnetfeltet justert slik at magnetiske partikler 12 dras mot den indre veggen til mikrostrømningskanalen 5 nær elektromagneten

8. Ved fjerning av strømmen til elektromagneten 8 spres partiklene 12 igjen og beveges raskt til sorteringutløpsporten 6. Denne 2-trinns sorteringsprosedyren er et alternativ til den kontinuerlige sorteringsprosedyren som er spesielt nyttig ved sortering av ekstremt sjeldne hendelser der fortynning av den sorterte cellefraksjonen kan være et problem. Sorteringsutløpsporten 6 kan være lukket når strømmen tii elektromagneten 8 slås på og er åpen når strømmen til elektromag-

neten 8 slås av. Figuren viser magnetiske partikler 12 i ferd med å bli trukket ut fra en kontinuerlig prøvestrømning 9. De magnetiske partiklene 12 tiltrekkes av magnetfeltet og trekkes ut fra prøvestrømningen 9 ved bunnfelling ved den indre veggen til mikrostrømningskanalen 5 nær elektromagneten 8. Når strømmen tilført elektromagneten 8 slås av, frigis de magnetiske partiklene 12 tilbake til strøm-ningen igjen. Strømningsseparasjonskanalen trenger ikke å ha et sorteringsutløp, isteden kan en buffer fø res inn i mikrostrømningskanalen 5 etter prøven og de fangede partiklene kan frigis ved å fjerne strømmen tilført elektromagneten 8. Fig. 7 illustrerer en annen utførelse av den foreliggende oppfinnelsen for separasjon av partikler som oppfyller visse kriterier, fra prøven 9 ved hydrodynamisk kraft. Apparatet omfatter en 2-veis ventil 40 og et mikrostrømningssystem som har en separasjonsstrømningskanal 5 med tre innløp 2, 3, 4, to utløp 6, 7 og ett innsamlingskammer 37. Prøven 9 som inneholder partikler føres inn i separa-sjonsstrømningskanalen 5 gjennom en sentral innløpsport 2 og ledes kontinuerlig gjennom separasjonsstrømningskanalen 5 til mikrostrømningssystemet ved to ledebuffere 10 og 11, som hver innføres i separasjonsstrømningskanalen 5 gjennom innløpsporter 3 og 4, henholdsvis. Prøven 9 overvåkes ved å benytte et mikroskopobjektiv 16. Apparatet har styremidler 38 for å styre to-veis ventilen 40. Styremidlene omfatter overvåkningsmidler som har en optisk deteksjonsanordning, f.eks. et fotomultiplikatorsystem (PMT), et CCD kamera/brikke eller en fotodiode, optisk forbundet til mikroskopobjektivet 16. Objektivet 16 fokuseres på målevolumet, som er lokalisert på innsiden av strømningskanalen 5. Størrelsen av målevolumet er definert ved et lite hull eller spalte 39 plassert foran den optiske detekto-ren og ved forstørrelsen av objektivet 16. Den 2-veis ventilen 40, f.eks. en piezoe-lektrisk dropp-på-kommando biekkstråle-printerventil, forbinder innsamlingskammeret 37 med sorteringsutløpet 6. Strømningsrestriksjonen til avfallsutløpskanalen 7 er mye større enn strømningsrestriksjonen til sorteringsutiøpskanalen. Dette kan oppnås ved å tilknytte en strømningsbegrenser (ikke vist) til avfallsutløpskanalen 7. Derfor, hvis 2-veis ventilen 40 er åpen, så avbøyes prøven 9 som inneholder partiklene mot sorteringsutløpet 6. Innsamlingskammeret 37 benyttes for å samle inn og fange de sorterte partiklene for etteranalyse. Andre partikler fortsetter å strømme ut gjennom avfallsutløpet 7.

Partiklene separeres fysisk ved å benytte hydrodynamiske krefter i henhold til optiske målinger på hver partikkel. Fotomultiplikatorsignalet (PMT) som genereres når en partikkel oppholder seg i målevolumet, sendes til en pulshøydeanalysa-tor som også er omfattet inne i styremidlene 38. En utvelgelseskrets tilveiebringer et aktiveringssignal når en spesifikk partikkel oppviser fotometriske egenskaper av en forhåndsbestemt type. Hvis PMT-signalet for en spesifikk partikkel indikerer at partikkelen er av en spesifikk type, så produseres en aktiveringspuls. Ventilen 40 åpnes ved aktiveringspulsen, som medfører at væske som inneholder den spesifikke partikkelen strømmer gjennom sorteringsutløpet 6 og fanges på innsiden av innsamlingskammeret 37. Varigheten av aktiveringspulsen er gjort tilstrekkelig lang slik at den ønskede partikkelen transporteres til innsamlingskammeret 37. For lyseksitasjon kan flere kilder benyttes, f.eks. laser, wolframlampe, fotodiode. For samling av lyset kan en fiberoptisk kabel, en fotolinse, et objektiv eller et lysmikroskop benyttes. Forskjellige optiske deteksjonsmetoder f.eks. fluorescens, absorpsjon, kan benyttes.

Mikrostrømningssystemet kan plasseres på et flyttbart bord slik at mikro-strømningssystemet kan flyttes til utvalgte posisjoner i forhold til mikroskopet hvorved et passende volum av mikrostrømningskanalen kan flyttes inn i målevolumet til apparatet.

Under eller etter sortering kan den fangede prøven igjen analyseres, f.eks. ved å benytte et mikroskop. Når ventilen 40 er lukket, er partiklene fanget på innsiden av innsamlingskammeret 37 og kan observeres for en ønsket periode. En ønsket væske eller reagens for å vaske, kultivere eller farge partiklene eller cellene kan føres inn i innsamlingskammeret 37. Etter separasjonsprosessen kan partiklene trekkes tilbake ved å spyle innsamlingskammeret 37 med en passende buffer som føres inn i mikrostrømningssystemet gjennom en av innløpene 2, 3, 4.

Sorte ringsapparatet ble utformet for å oppnå en minimal fortynning av den utskilte prøvefraksjonen. Hydrodynamisk separasjon av partikler kan utføres på grunn av optiske, elektriske, magnetiske og/eller andre egenskaper til den partik-kelinneholdende prøven.

Et eksempel på en optisk og mekanisk oppstilling av apparatet basert på fluorescensdeteksjon er illustrert skjematisk i fig. 7. Prøven 9, f.eks. partikkelsus-pensjon, ledes gjennom separasjonskanalen 5 ved to ledebuffere 10,11 slik at partiklene som er inneholdt i prøvene 9 stilles på en linje i en enkelt strømning som strømmer i et plan vinkelrett på den optiske aksen til objektivet 16. Strøm-ningen belyses med en kvikksølvlampe som passerer eksitasjonsfiltre for f.eks. fluoresceinmålinger. Et dobbeltbrytende speil reflekterer eksitasjonslyset til sorte-ringsbrikken via f.eks. et 20x mikroskopobjektiv 16. Det emitterte fluorescenslyset innsamles av det samme objektivet 16, passerende et dobbeltbrytende speil. Bak speilet fungerer en spalte 39 som en feltstopp som begrenser deteksjonsområdet til en smal stripe. Hver partikkel som passerer objektivet 16 genererer et kort sig-nal fra fotomultiplikatoren som er optisk forbundet til objektivet 16. Fotomultipltka-torsignalet forsterkes og sendes til en maksimalverdidetektor.

Utløserf rekvensen til ventilen 40 benyttet i denne anordningen er 1500 Hz som tilsvarer en minimal utløsertid på 0,6 ms.

Fig. 8 illustrerer en alternativ utførelse av separasjonsapparatet vist i fig. 7 med en separasjonsstrømningskanal 5 som har tre innløp 2, 3, 4 og to utløp 6, 7. Prøven som inneholder partiklene føres inn i separasjonsstrømningskanalen 5 gjennom den sentrale innløpsporten 2 og to ledebuffere føres inn i kanalen 5 gjennom de to andre innløpsportene 3, 4, henholdsvis. Midler for justering av strømningshastighet som omfatter en skrittmotor som driver sprøytepumpene 41, 42 er forbundet til de to utløpsportene 6, 7, henholdsvis. Sprøytepumpene 41, 42 suger prøven og bufferen via innløp 2, 3 og 4, henholdsvis, gjennom separasjons-strømningskanalen 5. Cellene overvåkes ved den optiske aksen til mikroskopobjektivet 16 og strømmer til separasjonsforbindelsen. Ledebufferne og prøven som inneholder uvalgte celler strømmer ut og inn i sprøytepumpen 42 i avfallsutløpet. Hvis en spesifikk celle har optiske egenskaper som forårsaker en aktiveringspuls, aktiveres skrittmotoren til pumpen 41 ved sorteringsutløpet og skrittmotoren til pumpen 42 ved avfallsutløpet stoppes, som bevirker at væsken strømmer til sorte-ringsutløpet 6. Perioden pumpen 41 ved sorteringsutløpet slås på, henholdsvis pumpen 42 ved avfallsutløpet slås av, gjøres tilstrekkelig lang for å sikre at den ønskede cellen har blitt ført inn i innsamlingskammeret 37. Når én eller begge av sprøytepumpene 41, 42 etter en eller annen operasjonstid trenger å bli tømt, svit-sjes de 3-veis ventilene 43, 44 fra deres normale driftsposisjon hvor de åpner for strømning fra separasjonsstrømningskanalen 5 til sprøytepumpene 41, 42, henholdsvis, til i en posisjon hvor de 3-veis ventilene 43, 44 åpner for strømning mellom sprøytepumpene 41,42 og en avfalls-container (ikke vist) og hvor skrittmotoren som driver sprøytepumpene 41, 42 drives i reversretning av den normale driftsretningen for å tømme sprøytepumpene 41,42.

Fig. 9(a) viser to strømningskanaler45, 46 som drives i parallell. Prøven som inneholder partiklene føres inn i strømningskanalene 45, 46 gjennom inn-løpsporter 47, 48, henholdsvis. Ledebuffere føres inn i strømningskanalene gjennom innløpsporter 49, 50, henholdsvis. I strømningskanalene 45, 46 avbøyes partikler som er følsomme for det magnetiske feltet generert henholdsvis av magnetene 51, 52, fra prøven som inneholder partikler inn i de tilsvarende ledebuffere og strømmer deretter gjennom sorteringsutløpet 53. Den gjenstående delen av prø-ven forlater strømningskanalene 45, 46 gjennom avfallsutløpene 54, 55, henholdsvis. Separasjon økes ved å benytte flere strømningskanaler koplet i parallell. Fig. 9(b) og (c) viser eksempler på kombinasjoner av mikrostrømnings-systemer for magnetisk, hydrodynamisk eller gravitasjonsseparasjon. I fig. 9(b) separeres partikler først fra en prøve i en magnetisk separasjonskanal, hvoretter de sorterte partiklene utsettes for en hydrodynamisk separasjon på grunn av de optiske egenskapene til partiklene. På denne måten er det mulig å analysere og separere partikler fra en prøve basert på både optiske og magnetiske egenskaper til partiklene eller til andre kombinasjoner av egenskaper eller karakteristikker. I fig. 9(c) er to magnetiske separasjonskanaler koplet i serie for å oppnå et svært rent produkt. Fig. 10 illustrerer eksempler på mikrostrømningsystemer som har midler for automatisk merking av partikler med fluorescensprober eller magnetiske prober. Systemet kan kombineres med etterbehandlingsmidler for fjerning av probene eller for annen behandling av de sorterte partiklene. Systemet omfatter et mikro-strømningssystem som inneholder kanaler 56, 57 for addering av væsker til prø-ven, f.eks. reagenser for celleoppløsning eller farging, en kanal 58 for inkubering og kultivering eller lagring av prøven for videre bearbeiding, og en separasjonskanal 5. En prøve introduseres inn i mikrostrømningssystemet via et innløp 2 og én eller flere reagenser kan adderes kontinuerlig til prøven, som transporteres inn i inkubasjonskanalen 58. En enkel mikrostrømningsstruktur ble konstruert for forbehandling av prøven. Foretrukket administreres strømningsratene av datama-skink^trollérte^prøytepumper. Inkubasjonsperioden mellom blanding og analyse av prøven er gitt av den volumetriske strømningsraten til sprøytepumpene og tverrsnittsarealet og lengden til inkubasjonskanalen. Fig. 11 viser et mikrostrømningssystem for magnetisk separasjon av makromolekyler, f.eks. ribonukleinsyre eller proteiner fra en prøve. Magnetiske kuler merket med et fluorescensfargestoff og en probe spesifikk for f.eks. DNA adderes til prøven som så inkuberes. Denne prøven føres inn via innløpsport 2 til separa-sjonskammeret 5 og partiklene dras av feltet generert av magneten 8 langs separasjonskanalen 5 på grunnlag av deres mobilitet. Etter en definert periode fjernes det magnetiske feltet og fluorescensbåndene kan observeres under et mikroskop. Ved å kjøre standarder av kjent størrelse er det mulig å kalibrere systemet og separere partikler av f.eks. DNA på grunn av deres størrelse og form, lik elektroforese. Fig. 12(a) med detaljer i fig. 12(b) viser en oppstilling av sensorer ordnet i rekkefølge. En mikrostrømningskanal 5 haren flerhet av analysesteder, hvert utstyrt med feltgenererende midler 59 som individuelt kan slås på og av. Strøm-ningskanalen 5 som er vist har rektangulære elektroder 59 plassert i små fordypninger på bunnveggen til strømningskanalen 5. En spenning kan påføres selektivt på hver elektrode 59. Forskjellige prober, reseptorer, indikatorer, osv. kan tiltrekkes og immobiliseres ved de utvalgte elektrodene 59 ved å påføre en spenning på de utvalgte elektrodene 59 samtidig som en væske som inneholder de tilsvarende probene, reseptorene, indikatorene, osv. oppholder seg i strømningskanalen 5. Preparering av de multiple analysestedene kan oppnås ved sekvensielt å laste

hvert analysested med en spesifikk probe. Spenning påføres til én eller flere spesifikke elektroder i mikrostrømningskanalen 5, og et fluid som inneholder en spesifikk probe, reagens eller indikator osv. føres inn i mikrostrømningskanalen 5 hvor probene osv. vil tiltrekkes til elektrodene 59 til hvilke spenning er påført. Deretter slås spenningen av. Så påføres en spenning til den neste elektroden 59 og det neste fluidet som inneholder en spesifikk probe osv. føres inn i mikrostrømnings-kanalen 5. På denne måten kan forskjellige analysesteder som hver inneholder en spesifikk probe, reagens, eller indikator skapes. Antistoffer, fluorescensmolekyler, DNA, RNA og proteinfargestoffer er eksempler på prober.

Som et alternativ til elektrodene 59 kan en magnetisk kraft selektivt påføres analyséstedéne med en oppstilling av eléktromaghéter plassert på eller nær overflaten tii mikrostrømningskanalen 5 for å immobilisere prober osv. som har magnetiske egenskaper på ønskede analysesteder. Alternativt kan en fotoaktiverings-prosess benyttes for kovalent kopling av molekyler eller partikler til overflaten av kanalen 5 ved analysestedene.

Et eksempel på en probe er DNA, som har en total negativ ladning, dras til elektrodeoverflaten 59 ved en positiv forspenning, et annet eksempel er DNA-dekkede magnetiske partikler som dras mot overflaten til mikrostrømningskanalen 5 ved magnetiske midler.

Ved modifisering eller dekking av overflaten til mikrostrømningskanalen 5 og/eller elektrodene 59 eller magnetene, kan spesifikke kjemiske og mekaniske egenskaper skapes. For å øke bindingskreftene til proben kan overflaten dekkes med et spesifikt lag eller matriks, f.eks. en polymer slik som uretan eller en reaktiv kjemisk gruppe. Når strømmen til den valgte elektroden eller elektromagneten slås av, forblir proben på overflaten f.eks. ved absorpsjon. På denne måten kan en innkapsling eller immobilisering av molekylet oppnås.

Derfor kan et felt generert av utvalgte analysesteder tvers over strømnings-kanalen 5 benyttes til immobilisering av partikler, slik som biomolekyler, hvorved disse kan holdes i det vesentlige faste posisjoner inne i strømningskanalen permanent eller for en spesifikk tidsperiode som tillater at kjemiske reaksjoner mellom partiklene og en innført reagens finner sted og/eller kinetiske målinger på partiklene å utføres og/eller partiklene å bringes i kontakt med forskjellige kjemiske substanser. For analyse av reaksjonene i mikrostrømningssystemet kan det benyttes optiske deteksjonsmidler, f.eks. et mikroskop.

Det er en viktig fordel med anordningen at et antall analyser kan utføres i en enkelt anordning. Under driften av anordningen kan forskjellige bearbeidings-trinn, slik som f.eks. vasketrinn og reagensaddisjon utføres.

Fig. 13 viser en mikrostrømningsanordning med en strømningskanal 5 og med en oppstilling ordnet i rekkefølge av analysesteder og permanentmagneter 8 plassert på en separat innsats 60. En andre innsats 61 har en strømningskanal 5, et innløp 2 og et utløp 7. Innsatsen 60 som bærer magnetene 8 kan plasseres eksakt under den andre innsatsen 61 slik at magnetene 8 er nøyaktig plassert under analysestedene i strømningskanalen 5 som vist i figuren under innsats 61.

Prober som skal immobiliseres ved et spesifikt analysested ved å benytte et magnetfelt, som beskrevet i fig. 12 eller fig. 13, kan plasseres på det ønskede analysestedet ved en fremgangsmåte som omfatter trinnene med å plassere et

definert volum av væsken som inneholder den magnetiske proben eller reagensen ved å benytte f.eks. blekkstrålebasert dispensetreknologi inne i et spesifikt volum av strømningskanalen 5 rett over en av permanentmagnetene 8 for å immobilisere den magnetiske proben eller reagensen på et analysested på overflaten til strøm-ningskanalen 5. Fremgangsmåten kan gjentas for forskjellige prober som skal immobiliseres på forskjellige analysesteder, henholdsvis. Etter immobilisering dekkes innsatsen 61 som inneholder strømningskanalen 5 av en transparent innsats 15, f.eks. en glassplate, som tillater oppstillingen av analysesteder med probene på innsiden av mikrostrømningskanalen 5, å bli observert. En analyse av

oppstillingen av analysesteder utføres ved å introdusere en prøve gjennom innløp 2 inn i mikrostrømningskanalen 5 hvor den passerer oppstillingen av analysesteder og forlater mikrostrømningskanalen 5 gjennom utløp 7. Et objektiv 16 optisk

forbundet til en optisk detektor, f.eks. et fluorescensmikroskop, kan fokuseres på oppstillingen i mikrostrømningskanalen 5 for å overvåke de kjemiske reaksjonene på analysestedene.

Fig. 14 viser en annen utførelse av oppfinnelsen som omfatter en innsats 62 med en mikrostrømningskanal som inneholder analysesteder 63 oppstilt i en

to-dimensjonal oppstilling, en innsats 64 med permanentmagneter 8 og en transparent innsats (ikke vist) for å dekke innsatsen 62 med mikrostrømningskanalen. Analysestedene 63 er formet som små fordypninger på overflaten til bunnveggen til mikrostrømningskanalen. Dimensjonene til innsatsene 62, 64 og posisjonen til analysestedene 63 og magnetene 8 er de samme, så hvis innsats 62 plasseres over innsats 64 som vist i fig. 14(b), da er magnetene 8 lokalisert under analysestedene 63.

Utførelsene vist i fig. 12, 13 og 14 kan benyttes for hybridisering av DNA som beskrevet under. En magnetisk bærer inkludert en DNA-probe kan immobiliseres på et spesifikt analysested som beskrevet tidligere. På denne måten skapes en oppstilling av analysesteder i en mikrostrømningskanal hvor hvert analysested inneholder en forskjellig DNA-probe. Deretter føres en prøve som inneholder

^ålmolékyleTinnllTiikr^ foretrukket helt til prøven har fylt

mikrostrømningskanalen. Etter at målmolekylet har blitt hybridisert til et DNA i et spesifikt analysested, er en løsning av reporterprober, f.eks. fluorescensprober, ført inn i strømningskanalen hvor den binder seg på analysestedet som bærer det hybridiserte DNA. Ved å benytte en fluorescensdektektor, f.eks. en fotomultiplika-tor, fokusert på de forskjellige analysestedene kan reaksjonen på hvert analysested overvåkes. Ved å fjerne magnetfeltet på et spesifikt analysested kan det magnetiske materialet inkludert DNA-proben fjernes, slik at prosessen kan rever-seres. På denne måten kan en fornybar oppstilling av analysesteder skapes og vaskeprosesser kan implementeres i driften av oppstillingen av analysesteder.

Fig. 15(a) viser en anordning i henhold til oppfinnelsen for å utforme en fler-forsøksanalyse i et mikrostrømningssystem ved å benytte en parallelloppstilling av analysesteder. Systemet omfatter en oppstilling av parallelle mikrostrømningska-naler 65 som hver inneholder et analysested med en spesifikk probe immobilisert ved å benytte f.eks. et elektrisk eller magnetisk felt eller ved fotoaktivering som beskrevet tidligere. F.eks. kan innsatsen som inneholder en permanent-magnet (ikke vist) plasseres under de parallelle mikrostrømningskanalene 65 hvorved magnetiske prober kan immobiliseres i mikrostrømningssystemet ved å benytte dispenserteknologi. På denne måten kan en flerhet av analysesteder skapes i oppstillingen av parallelle strømningskanaler 65 ved å tillate en samtidig analyse av en prøve med en flerhet av prober eller reagenser definert ved antallet av parallelle mikrostrømningskanaler 65.

Mikrostrømningssystemet består av to parallelle strømningskanaler 66, 67 som er forbundet via et antall av parallelle mikrostrømningskanaler 65 som hver inneholder et analysested. En injeksjonsstrømningskanal 66 har et innløp 2 og er forbundet til et utløp 68 via en blokkeringsventil 69, og avfallsstrømningskanalen 67 er forbundet til et avfallsutløp 70 via en blokkeringsventil 71. Ved å blokkere en av de to utløpene 68, 70 med blokkeringsventilene 69, 71, henholdsvis, er det mulig å lede den injiserte strømmen gjennom oppstillingen av kanaler 65 som inneholder analysesteder eller gjennom injeksjonskanalsutløpet 68, henholdsvis. Strømmen gjennom alle kanalene 65 som inneholder analysesteder flyter sammen inn i avfallskanalen 67 og forlater systemet via avfallsutløp 70. Under passe-ring av kanalene 65 som inneholder analysestedene, kommer prøven i kontakt med sanseprober, som er immobilisert på analysestedene. Kjemiske reaksjoner kan detekteres som beskrevet for fig. 12.

I fig. 15(b) er det vist en alternativ utførelse av en oppstilling av parallelle kanaler 65 som inneholder analysesteder. Mikrostrømningssystemet har tre inn-løpsporter 2, 3, 4 for å lede forskjellige væsker inn i mikrostrømningssystemet. Ved å forbinde utløpsport 68 til en strømningsbegrenser, er kun én blokkeringsventil 71 nødvendig for å drive systemet. Hvis blokkeringsventilen 71 mellom kanaloppstillingen 65 og avfallsutløpet 70 er lukket, er kanaloppstillingen 65 blok-kert og strømmen fra innløp 2, 3,4 vil passere injeksjonskanalen 66 og forlate mi-krostrømningssystemet via utløp 68. Når blokkeringsventilen 71 er åpen vil væsken introdusert i injeksjonskanalen 66 flyte inn i sensorkanaloppstillingen 65 på grunn av den høyere strømningsbegrensningen ved utløp 68 sammenlignet med avfallsutløp 70. Fig. 16 viser et mikrostrømningssystem fremstilt som en 3-lags sandwich. Det sentrale laget er en silisiumskive som har en strømningskanal estet inn i den. Silisiumskiven er dekt med en transparent plate, slik som en glassplate, som har en tykkelse på f.eks. 0,16 mm. Fluider på innsiden av strømningskanalen kan overvåkes gjennom glassplaten, f.eks. ved å benytte et mikroskop eller andre optiske deteksjonsmidler. Fluidinnløpet og utløpet er forbundet til rør, f.eks. smeltet silisiumkapillær eller teflonrør, for å lede fluider inn i eller lede fluider ut fra strøm-ningskanalen. Bufferinnløp og -utløp for de sorterte partiklene er ikke vist. Bunnplaten, f.eks. laget av plast, letter monteringen av rørene. Fig. 16(1) til (5) illustrerer den følgende beskrivelsen og fremstillingen og prepareringen av et mikrostrømningssystem. En separasjonsstrømningskanal ble utformet for å passe inn i et system som omfatter en silisium/glass-sandwich dannet ved bonding. Mikrokanalene ble etset inn i silikonskiven dekket med en plate av borglass som har en tykkelse på 0,2 mm som tillater overvåkning av mikrokanalene ved å benytte f.eks. et mikroskop. Separasjonsstrømningskanalen ble fab-rikkert på et 4", 350 nm, <100> silisiumskive. Et 1,5 um lag av Si02 ble påført overflaten av silisiumskiven og det ble dannet et mønster med en maske som inneholdt kanalutf orm ingen. Et 2,6 um lag av fotoresist ble spunnet på toppen av Si02 og formet med en maske som definerer mellomliggende hull. 2-trinnsmasken som består av en Si02-maske og en fotoresistmaske ble benyttet for å etse en

2-nivåstruktur med vertikale vegger ved reaktiv ionetsing (RIE) på et SFe:C>2 plas-ma. Hullene var initielt etset til en dybde av 22 um og så etset dypere sammen med kanalene, som var etset til dybder i området fra 40 um til 100 um. Et lag av 1,8 um Si02 ble formet med en maske for innløp og utløp på baksiden av silisiumskiven. Etsingen ble utført i KOH ved 80°C og ble stoppet når alle de mellomliggende hullene var klart tydelige fra baksiden. Til sist ble en glasskive anodisk bondet til silisiumskiven. Mikrokanalene var utformet for volumetriske strømnings-raterfra 0,1 til 200 ul/min med en gjennomsnittlig strømningshastighet på maksi-malt 100 (mm/min).

Separasjonsstrømningskanalen kan forsynes med én eller to permanentmagneter eller elektromagneter på tre forskjellige måter: (a) Sjeldne jordarter Samarium-Cobalt blokkmagneter på 1,0 x 1,0 x 0,5 mm (Goudsmit, Nederland) kan limes med silisiumgummi i åpningsspalten til se-parasjonsstrømningskanalen. (b) Sjelden jordart (Sr) magnetisk pulver (Tropag, Hamburg, Tyskland) kan blandes med epoksy 1:1 (v/v) og denne magnetiske masse kan limes i åpningsspalten til separasjonsstrømningskanalen og gir et tykt magnetisk filmlag på 1,0 x 1,0x0,5 mm. (c) Ferittstålull kan limes med silisiumgummi inn i åpningsspalten til separa-sjonsstrømningskanalen. En høy magnetisk feltgradient kan så introduseres inn i åpningsspaltene ved å anvende et eksternt magnetfelt, f.eks. ved en elektromagnet (Goudsmit, Nederland) plassert nær til separasjonsstrømningskanalen.

EKSEMPEL 1

Et mikrostrømningssystem med en layout som skissert i fig. 5(d) med to innløp og to utløp har blitt testet ved å benytte den til separasjon av forskjellige magnetiserbare partikler. Testbetingelsene er listet nedenfor. Separasjonseffektiviteten (anrikingsrate) E og uttømmingsraie 1/E er definert ved For separasjon av forskjellige paramagnetiske standardkuler av forskjellige stør-relser og paramagnetiske feltstyrker, er resultatene vist i tabell 2.

EKSEMPEL 2

Videre har mikrostrømningssystemet benyttet i eksempel 1 også blitt testet ved å benytte det til separasjon av humane T-lymfocytter (JURKAT-celler). Magnetisk fargede og ikke-fargede JURKAT-celler ble benyttet for å danne en hetrogen celleprøve. Til magnetisk farging av cellene ble det benyttet en CD4-magnetisk overflatemarkør f ra Miltenyi Biotech. JURKAT-celler ble oppløst i 1% PBS/BSA til en konsentrasjon på 10<7>/ml. Biotin-konjugert CD4 magnetiske mikrokuler ble addert ved 2(il beholdning («stock»)/10<7> celler ved å følge fremstillerens instruksjon.

De magnetisk fargede cellene (10<7> celler/ml) som er strømmet gjennom mikrobrikken i 10 minutter og fluider ble innsamlet ved de to utløpene. Tre eksperimenter ved forskjellige strømningsrater (5, 25, 50 uJ/min) ble utført. De samme eksperimentene ble utført ved å benytte magnetisk ufargede celler.

En alikvot av de innsamlede prøvene ble analysert under et mikroskop og partiklene ble telt ved å benytte et Neubauer mikroskopikammer. For hvert ekspe-riment ble en prøve på 1uJ analysert:

EKSEMPEL 3

Systemet anvendt for separasjon av magnetiserbare partikler fra en prøve er vist i fig. 4. Det omfatter to sprøyteinfusjonspumper (Harvard Apparatus, Southnatik, Az) som tilveiebringer konstante strømningsrater på 0,1 til 100 uJ/min ved å benytte en 0,5 ml mikrosprøyte (Hamilton, Bonaduz, Sveits), en separa-sjonsstrømningskanal av silisium for separasjonen av de magnetiserbare partiklene, og en innsamlingsenhet for å samle inn de sorterte partiklene. To 3-veis mik-roventiler (Lee, Parameter AB, Sverige) var integrert i apparatet for steril løsnings-håndtering. Alle komponentene ble sammenkoplet med smeltede silisiumkapillarer (340 um id., Supelco, USA). SFCen var plassert under et invertert mikroskop (Ax-iovert 100, Zeiss, Tyskland) for visualisering av separasjonsprosedyren. Alle mikrokanalene og rørene var deaktivert ved silanisering som beskrevet i Blanken-stein, G. Scampavia L, Branebjerg J, Larsen UD, Ruzicka J (1996): Flow switch for analyte injection and cell/particle sorting in Analytical Methods and Instrumen-tation, uTAS'96 conference, 17-22 november 1996, Basel. Et FACScan med 488 nm argonlasereksitering og innsamling av foroverspredt og sidespredt og fluorescens av fluorescein ble benyttet (Becton Dickinson, Mountain View, CA) for alle eksperimenter. Resultatene ble innsamlet og analysert ved å benytte FACScan forsøkssoftware (Becton Dickinson).

Resultater på bruken av en separasjonsstrømningskanal utstyrt med en permanentmagnet optimalisert for Dynalkuler er vist i fig. 17.En kulesuspensjon av 1-5 x 10<8> partikler/ml som inneholder en blanding av ikke-merkede magnetiske Dynalpartikler (d: 4,5 um, M-450) og fluorescens-kalibreringskuler (d: 3,2 um, Dako A/S, Glostrup, Danmark) har blitt separert. Omkring 1 ml av den ikke-magnetiske, ikke-avbøyde fraksjonen ble innsamlet ved avfallsutløpet og analysert ved flow-cytometri (B). For å telle opp de positive og negative fraksjonene ble det innsatt to vinduer for den statistiske evalueringen. Før separasjon inneholdt prø-ven 38,3% fluorescenspartikler og 55,8% magnetiske partikler, henholdsvis (a). Etter sortering av det beskrevne systemet ble nesten alle magnetiske partikler funnet i den sorterte fraksjonen innsamlet fra sorteringsutløpet (B) og ikke-magnetiske partikler ble funnet i den negative fraksjonen (c) innsamlet fra avfalls-utløpet, henholdsvis. Under optimaliserte forhold var en anrikningsrate på 350 oppnåelig.

EKSEMPEL 4

Dette eksempelet angår anriking av fosterceller i en prøve for magnetisk aktivert cellesortering. En kombinasjon av utførelsen av oppfinnelsen som vist i fig. 7 og 10 (øvre), optisk cytometri, og fig. 4 og 10 (nedre), magnetisk celleseparasjon, tilveiebringer et kraftfullt apparat for effektiv anriking av fosterceller i en prøve.

Prosessen for å øke konsentrasjonen av fosterceller i matemale blodprøver involverer de følgende trinn (se fig. 18): (i) et første seleksjonstrinn for å fjerne majoriteten av de matemale blodcellene basert på deres volum, størrelse og tetthet; (ii) et andre sorteringstrinn for å isolere fosterblodcellene fra de gjenværende matemale blodcellene basert på immuno-fluorescensseparasjon ved å benytte en anordning som beskrevet i fig. 7 og/eller basert på immuno-magnetisk separasjon ved å benytte en ordning som beskrevet i fig. 4.1 eksemplene vist i fig. 9(b) er den magnetiske blodprøven først separert i et magnetisk separasjonskammer, fulgt av en separasjon på grunnlag av optiske egenskaper til prøven, eller to magnetiske separasjoner er utført, den ene etter den andre, se fig. 9(c), for å oppnå et sterkt renset produkt.

Et eksempel på sortering av partikler med svært lav konsentrasjon fra en prøve av maternalt blod i en ikke-invasiv prenatal screening-test er presentert i det følgende avsnittet.

Nukleerte ("Nucleated") røde blodceller er funnet i maternalt blod i en konsentrasjon på 10 til 1000 pr. ml av alle nukleerte celler. Bianchi har vist (D.W. Bianchi, Journal of Pediatrics, 1995,127, 6, side 847-856) at det er mulig benytte slike celler for genetisk screening i prenatal diagnose. Celleoverflatemarkøren CD71+ er for eksempel, en passende markør for å velge slike celler fra maternalt blod. Testresultatene demonstrerer at magnetisk aktivert cellesortering er et kraftfullt anrikningssystem for å sortere og isolere nukleerte fosterblodceller fra maternalt blod. For dette er den magnetiske aktiverte cellemikroteknologien som

beskrevet i denne oppfinnelsen benyttet. Fosterceller skjelnes og separeres fra

maternalt blod ved å benytte en spesifikk overflatemarkør (CD71) som kun er til-stede på cellemembranen til de nukleerte fosterblodcellene. Ved selektivt å feste en magnetisk antistoffprobe på CD71 er en magnetisk probe festet i det vesentlige eksklusivt til fostercellene.

EKSEMPEL 5

Dette eksemplet angår uttømming av magnetisk merkede CD45 positive celler (matemale leukocytter) fra en maternal blodprøve spisset med navlestreng-blod. En strømningsbrikke beskrevet i fig. 1 ble benyttet i et system som beskrevet i fig. 4.1 dette eksperimentet ble en 1:3 spiss (foster/maternal, v/v) benyttet for å demonstrere ytelsen til den magnetiske separasjonen. Heparin ble benyttet som en antikoagulant. De nukleerte cellene var merket med CD45 dekket med magnetiske mikropartikler på 0,1ul (Immunicom, USA), ved å benytte et monoklonalt antistoff mot CD45 som det første laget. Celleoppløsningen ble innsamlet ved begge utløpene 6 og 7 (se fig. 1). For å teste sorteringseffektiviteten ble deler av begge de innsamlede fraksjonene analysert på objektglass. Resultatene viste at de fleste av cellene, mer enn 95%, innsamlet ved sorteringutløpet 6 var CD45-positive.

EKSEMPEL 6

Fluorescensaktivert cellesortering som benytter anordningen beskrevet i fig. 7. Første resultater har vist en anrikningsfaktor på mer enn 300, som indikerer at den anvendte anordningen er et kraftfullt verktøy for anrikningen av sjeldne cellulære hendelser.

EKSEMPEL 7

Det er gitt et eksempel på utførelsen av oppfinnelsen som beskrevet i fig. 12 for bruken av en multippel sensoroppstillingsteknologi for å sanse en gruppe av analytter i ett trinn. For dette formålet kan biosansingskomponentene slik som an-tigener eller antistoffer lastes inn i et spesifikt analysested til strømningskanalen og immobiliseres der.

Magnetiske partikler som bærer en antigenprobe immobiliseres på overflaten til mikrostrømningskanalen ved magnetiske midler. Immobiliseringen av hver probe er nøyaktig spesifisert til et sted ved å slå på en spesifikk elektromagnet.

Etter lading av overflaten med forskjellige grupper av antigenprober, ledes testløsningen gjennom strømningskanalen 5 til mikrobrikken. Hvis prøven inneholder et antistoff, som er komplementært til en av de forskjellige antistoffene, vil det binde til det spesifikke stedet hvor dette antistoffet er immobilisert. I et tredje trinn må prøveløsningen fjernes, og en væske som inneholder et sekundært antistoff mot FC-regionen til det første antistoffet ledes gjennom mikrostrømningskanalen. Det sekundære antistoffet koples til et fluorescensfargestoff som tillater identifika-sjonen av et spesifikt analysested hvortil antistoffene har blitt bundet. Anordningen kan benyttes for rask screening av blodprøver, f.eks. for identifikasjon av bakteri-er eller virus i blodprøver ved å ha en mikrostrømningskanal med virus/bakterie-spesifikke antigenprober.

Claims

1. Mikrostrømningssystem for separasjon av partikler, omfattende et element som har en strømningskanal definert deri for å lede en strøm av et fluid som inneholder partiklene gjennom strømningskanalen, første innløpsmidler plassert i den ene enden av strømningskanalen for å føre fluidet inn i strømingskanalen, første utløpsmidler plassert i den andre enden av strømningskanalen for å lede fluidet ut fra strømningskanalen, karakterisert ved at systemet omfatter andre innløpsmidler for å innføre et første ledebuffer for å kontrollere tverrsnittet og strømningsbanen gjennom strømningskanalen til strømmen av fluider som inneholder partikler, idet strømmen av fluid som inneholder partiklene kontrolleres på en slik måte at én partikkel av gangen passerer et tverrsnitt av strømningskanalen, elementet plasseres i et felt som er i det vesentlige vinkelrett på en lengdeakse til strømningskanalen slik at partiklene som oppholder seg i strømningskanalen og som er følsomme for feltet tvers over strømningskanalen avbøyes inne i det første ledebufferet i retningen til feltet.

2. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 1, karakterisert ved at det videre omfatter tredje innløpsmidler for å føre inn et andre ledebuffer, idet tverrsnittet og banen gjennom strømningskanalen til strømningen av fluidet som inneholder partikler kontrolleres av de første og andre ledebufferstrømmer som omgir strømmen til fluidet som inneholder partikler.

3. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 2, karakterisert ved at bredden og posisjonen til strømmen av fluid som inneholder partikler kontrolleres ved justering av det volumetriske forholdet mellom fluidstrømningsraten og strømningsraten til ledebufferne.

4. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at elementet videre omfatter feltgenereringsmidler plassert nær strømningskanalen for å generere et felt i det vesentlige normalt på en lengdeakse til strømningskanalen.

5. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det videre omfatter overvåkningsmidler plassert ved strømningskanalen for å overvåke parametre til en partikkel som oppholder seg inne i et målevolum inne i strømningskanalen og skaffer et utsignal svarende til en overvåket parameter.

6. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 5, karakterisert ved at overvåkningsmidlene omfatter optiske deteksjonsmidler for å overvåke optiske parametre til en partikkel som oppholder seg inne i et målevolum inne i strømningskanalen og skaffer et utsignal svarende til en optisk parameter.

7. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 5 eller 6, karakterisert ved at overvåkningsmidlene omfatter en Hall-sensor for måling av en magnetisk parameter til en magnetisk partikkel inne i et spesifikt volum av strømningskanalen.

8. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av kravene 5-7, karakterisert ved at det videre omfatter feltgenererende styremidler for å kontrollere styrken til feltet generert av feltgenererende midler som svar på utsignalet til overvåkningsmidlene hvorved partiklene separeres i henhold til verdier av en parameter overvåket av overvåkningsmidlene.

9. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at Reynolds-tallet til strømmen av fluidet som inneholder partiklene gjennom kanalen er i området 0,01-500, foretrukket i området 0,05-50, spesielt i området 0,1-25.

10. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at det videre omfatter det laveste tverrsnittsarealet til strømningskanalen er i området 0,004-0,11 mm<2>.

11. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det videre omfatter andre utløpsmidler for å lede ut partikler som har blitt avbøyd i strømningskanalen.

12. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det videre omfatter de feltgenererende midler omfatter en magnet.

13. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 12, karakterisert ved at de feltgenererende midler videre omfatter feritte-lementer plassert ved strømningskanalen for å fokusere magnetfeltet.

14. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det videre omfatter feltgenereringsmidlene omfatter en elektrode.

15. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at posisjonene i forhold til strømningskanalen til de feltgenererende midler er justerbare for justering av styrken til feltet tvers over strømningskanalen.

16. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som heist av de foregående krav, karakterisert ved at det videre omfatter justeringsmidler for strøm-ningshastighet for justering av tiden partiklene oppholder seg i strømningskanalen.

17. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det videre omfatter et deksel for å dekke strøm-ningskanalen.

18. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 17, karakterisert ved at dekslet er et transparent eller translucid deksel som tillater optisk overvåkning av strømningskanalen.

19. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at de avbøyde partiklene omfatter levende celler.

20. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved de avbøyde partiklene omfatter kuler, mikrosfærer, kromosomer, organeller, biomolekyler eller proteiner.

21. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at de avbøyde partiklene har blitt magnetisk, kromoforisk eller fiuorescensf arget.

22. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det videre omfatter en flerhet av utløp for å lede ut partikler separert i henhold til deres forskjellige følsomhet for feltet tvers over strømningskanalen.

23. Mikrostrømningssystem i henhold til et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at elementet videre omfatter førbehandlings- og/eller etterbehandlingsinn retninger.

24. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 23, karakterisert ved at fø rbehandlingsinn retningene omfatter inkuba-sjonsmidler for å forberede eller førreagere fluidet som omfatter partiklene.

25. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 23 eller 24, karakterisert ved at fø rbehandlingsinn retningen omfatter midler for magnetisk, fluorescens eller kromoforisk farging.

26. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 23, karakterisert ved at etterbehandlingsinnretningene omfatter midler for innsamling eller konsentrering av de avbøyde partiklene.

27. Mikrostrømningssystem i henhold til krav 23, karakterisert ved at etterbehandlingsinnretningene omfatter midler for å bringe de avbøyde partiklene i kontakt med én eller flere reagenser.

28. Fremgangsmåte for å separere partikler, karakterisert ved at den omfatter trinnene å lede en strøm av et fluid som inneholder partiklene gjennom en strøm-ningskanal med et ledebuffer på en slik måte at en partikkel av gangen passerer et tverrsnitt av strømningskanalen, å plassere strømningskanalen i et felt som er i det vesentlige vinkelrett på en lengdeakse til strømningskanalen slik at partiklene som oppholder seg i strøm-ningskanalen og som er følsomme for feltet tvers over strømningskanalen avbøy-es i retningen til feltet og derved separeres fra fluidet som inneholder partiklene og inn i ledebufferen.

29. Fremgangsmåte i henhold til krav 28, karakterisert ved at feltet i hvilket strømningskanalen er plassert er et magnetfelt og partiklene omfatter fosterceller og matemale celler, og fremgangsmåten omfatter trinnet å selektivt magnetisk farge fostercellene for å gjøre de fargede cellene føl-somme forteltet i hvilket strømningskanalen er plassert.

30. Fremgangsmåte i henhold til krav 28, karakterisert ved at feltet i hvilket strømningskanalen er plassert er et magnetfelt og partiklene omfatter kreftceller og andre celler, og fremgangsmåten omfatter trinnet å selektivt magnetisk farge kreftceller for å gjøre de fargede cellene føl-somme for feltet i hvilket strømningskanalen er plassert.