CN101004423B - 流体样品分析用卡盒系统 - Google Patents

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Abstract

本发明属于流体样品检测，尤其涉及核酸分析卡盒技术领域，其特征在于，它含有：用微加工形成的卡盒及其控制部件，所述控制部件至少包含一个泵、一个阀和一个检测器；卡盒至少有一条微管道，该微管道至少有一个末端和所述泵或阀相连，在该微管道两个末端之间至少有一个允许封闭的流体样品流入孔；外部控制系统通过检测器对流体界面对通过流体样品加入孔下游的至少一个位置进行检测，产生反馈信号使外部控制系统选择性地开启或停断与上述微管道相连的泵或阀，以改变从流体样品加入孔流入的流体样品的运动状态；本发明具有可自动化、无污染、结构简单、易于加工、成本低度的特点。

Description

流体样品分析用卡盒系统
技术领域
本发明涉及生物检测方法及其专用设备，特别是涉及一种用于核酸分析的卡盒系统。
背景技术
随着生物技术的发展，对于核酸的检测和分析被越来越多的应用于各种检测目标，包括微生物识别、个人身份识别、疾病诊断、生物防恐、环境保护等各个方面。但是常规的核酸分析技术操作环节多，操作复杂，容易产生操作误差以及交叉污染。
系统集成化和自动化是避免核酸分析过程中人员操作带来的污染和低效的有效途径。一个集成的核酸分析系统可以从功能上分为样品承载和过程控制两部分。样品承载部分为核酸分析提供一个物理场所，一般它由多个功能单元组成，核酸样品和分析所用的试剂可在其上存储、流动，并发生特定的生物化学反应。过程控制部分用于操纵流体在不同功能单元的移动或停留、控制反应所需的温度条件、以及检测最终分析的结果。
一种系统集成方法是利用各种微加工工艺将一些过程控制部分的元件或模块，比如微泵、微阀、温度传感器、控制电路等直接加工到样品承载部分上。由于和样品或试剂直接接触的部分不宜重复使用，并且受限于目前微加工的水平，这种集成方法提高了系统的造价，使得集成化的核酸分析系统停留于实验室原型阶段，而难以形成产品进入市场。另外一个策略是将样品承载部分和过程控制部分尽可能的分开，这样前者作为和样品或试剂直接接触的部分主要只包含微管道、微腔体等微流体结构，而不包含任何运动部件，因此样品承载部分可以做得很便宜，并作为核酸分析的耗材一次性使用。过程控制部分则独立出来，它可以重复使用，并通过样品承载部分上的接口部位与后者连接，构成一套完整的集成化和自动化的核酸分析系统。
虽然从物理结构上可以将样品承载部分和过程控制部分分开，但它们之间存在着逻辑上的紧密联系。比如，流体以恒压气源，还是以可启停的泵，或是以电渗的方式驱动，相当程度上决定了微流体结构的具体形式；而特殊的微流体结构，比如具有被动阀效应的管道尺寸变化或局部壁面亲疏水性的处理，又影响着泵或阀的选择、设置，以及控制方案的确定。又如，生化反应是在壁面上还是在管道内部空间里完成，是否需要特殊的温度条件或者引入特定的标记物，决定了温控或检测的方式；而温控或检测元件的具体形式又反过来影响着微流体结构的尺寸和布置方式。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以克服以上所说缺陷的流体样品分析用卡盒系统，尤其是一种核酸分析用的卡盒系统。
本发明的特征在于：该系统含有：卡盒和独立于该卡盒外的控制部件，其中，
控制部件，含有：至少一个泵、至少一个阀以及至少一个检测器；
卡盒，至少有一条微管道，所述微管道中至少有一个末端和所述的泵相连，或者和所述的阀相连；在所述微管道两端之间至少有一个允许被封闭的流体样品加入孔；
所述与卡盒相连的泵和阀是被外部控制系统选择性地开启或停断的，使所述流体样品在微管道内按设定的方向流动；
所述检测器对流体样品加入孔下游的至少一处位置的流体样品界面进行检测，并产生反馈信号给外部控制系统，用于选择性地开启或停断与所述卡盒中的微管道相连接的泵和阀，使流体样品的运动状态发生改变。
所述的检测器是装在对应于所述检测器的卡盒外的无线收发元件，当流体界面经过所述无线收发元件所在的检测位置时所述无线收发元件发出电磁波强度或频率的反馈信号。
所述的检测器是电阻元件、或电抗元件或两者的组合，当流体界面经过所述电阻抗元件所在的检测位置时所述电阻抗元件因湿度变化而向外部控制系统发出电反馈信号。
所述的检测器是装在对应于所述检测位置的卡盒外的光电转换元件，当流体样品经过所述光电转换元件所在的检测位置时所述光电转换元件因光路的变化而发出电反馈信号。
所述控制元件包含一个设在所述卡盒中微管道上的设定位置的磁性元件，当含有磁性颗粒的流体经过该指定位置时外部控制系统对流体样品内的磁性颗粒的运动进行控制。
所述的控制部件包含一个设在所述卡盒内微管道上指定位置的电场发生元件，当含有带电离子或颗粒的流体经过该指定位置时，外部控制系统对流体样品内的带电离子或颗粒的运动进行控制。
在所述卡盒内的微管道上有一个加热和/或测温元件，当流体经过该加热和/或测温元件所在的微管道上的指定位置时所述外部控制系统对所述流体样品的温度进行控制。
所述流体样品中被分析的对象是核酸，所述卡盒系统是核酸分析用卡盒系统。
在所述卡盒内的部分微管道内部填充或设置有有效结构，该结构使核酸分子在设定条件下发生预期的特异性吸附，而在另外一些设定条条下发生预期的脱附，所述有效结构至少含有颗粒、或微球、或纤维、或薄膜/或具有大表面体积比的微柱陈列、网格或它们的任意组合。
在所述卡盒内的部分微管道的内表面上涂覆或粘贴一层有效表面，所述有效表面至少含有有机物、或无机物、或改性物料，或它们的组合。
在所述卡盒的微管道内部有至少一个空间，其中固定了设定的化合物分子，用于和特定的核酸分子或者其衍生物发生反应。
在所述卡盒的微管道的表面，固定了设定的化合物分子，用于和特定的核酸分子或者其衍生物发生反应。
在所述卡盒的微管道内部，至少有一个空间，其中固定了设定的以规则形式排列的化合物分子以通过所述排列形式识别不同位置的化合物分子。
在所述卡盒的微管道内表面固定着设定的以规则形式排列的化合物分子以通过所述排列形式识别不同位置的化合物分子。
实验证明：本发明是有自动化、无污染、结构简单、易于加工、成本低度的特点。
附图说明
图1，本发明所述的核酸分析用卡盒系统示意图。
图2，结核菌在所述卡盒系统内进行核酸分析的结果照片。
具体实施方式
本发明遵循将样品承载部分和过程控制部分尽可能分开的原则，将前者做成卡盒的形式，其上集成了用于进行核酸分析中的核酸提取单元、酸扩增单元和核酸检测单元，各个单元之间通过微加工出来流体管道连接，并通过一个独立于卡盒的外部控制系统完成对于整个分析过程的控制。该控制系统至少包含一个可以启停的泵，一个可以通断的阀，和一个用于检测流体位置的检测器。它们构成一个反馈系统可以对流体样品在卡盒上的运动进行操纵。其中，选择可以启停的泵，而不是恒压气源，作为流体运动的驱动力，可以方便地获得和撤除推动流体所需的压力差，避免了复杂的流路设计。
使用这种反馈控制的前提是流体在卡盒上流动过程中不能产生气泡和由此引起的分段。由于用于核酸分析的生物样品或试剂常常含有表面活性剂成分，流体的表面张力和与固壁的接触角会因此而减小，其结果就是流体不易保持稳定的气液分界面，在流动中极易导致产生气泡，从而使检测器产生错误信号。因此，已有的核酸集成分析系统采用的都不是针对流体位置进行检测的反馈控制方式。但为了不产生气泡或使系统具有排除气泡的能力，卡盒必须集成部分过程控制系统的功能，通常的办法包括有设置疏水性透气膜或可溶涨阻塞管道的吸水性胶体颗粒，采用一层或多层软弹性体既作为微管道的一个壁面又作为微阀或微泵的运动部件，甚至采用少见的疏水性材料制造卡盒等，这些措施都增加了卡盒的复杂度和生产成本。
实际上，结合一系列微流体结构和微流动方式是可以保证不产生气泡的流动，从而实现针对流体位置进行检测的反馈控制的。首先，在微管道上可以加工出阻止流体沿管道边角自发向前流动的结构，用以稳定流体与空气的分界面。这些结构可以是沟槽或扩口形式，用以打断管道边角的连续性延伸；其次，分别流动的样品和试剂可以利用一些特定的微结构产生的被动阀效应，并结合上述的反馈控制系统，完成无气泡的融合。这些结构可以是对微管道特定位置上的尺寸作出的突然变化，也可以是对流路拓扑结构作出的特殊布置；最后，利用时间交替或时间脉动的流体推动方式，或者在管道壁面上加工出能够扰动流场的微细结构，可以实现两股流体的充分混合而不引入气泡。其他抑制气泡产生的措施还包括：尽量采用微管道替代扁平的微腔体，以利于流体在管壁的作用下形成稳定的气液界面；允许流体两端延伸出加热控温区域，以避免因冷凝而形成气泡和流体分段。
上述卡盒设计都只是针对在单一基质材料上加工出来微管道所做的几何尺寸或拓扑结构上的变化，没有引入第二种材料或做局部表面改性，也不用集成微泵、微阀等运动部件，因此具有微加工容易实现，可靠性高、成本低廉等优点。本发明的新颖之处就在于利用上述简单而又巧妙的微流体结构和微流动方式，并结合针对流体位置进行检测的外部反馈系统，来完成微型集成化核酸分析中对生物样品或试剂的一系列复杂操作。
下面以一个实例来进一步说明本发明的特征。如图所示，可以在一块有机玻璃板材上用精密机床加工出微管道、腔体，进样口等一系列微结构，其中主要的流动管道截面积为0.5mm×0.5mm，某些部位长度较短的更细微的缩管截面积为0.25mm×0.25mm，其它结构的平面尺寸在图中按相同比例画出，这里不再详述，而它们的深度可以不一致，比如在这个例子中杂交腔体的深度为0.1mm，废液池的深度为2.5mm。接着将它清洗干净，并和另外一块有机玻璃板材用热压的方式键合为一个卡盒整体。
这个卡盒不含任何运动部件。流体的运动完全靠外部的一个控制系统完成。卡盒上一些管道的末端和该控制系统上的泵(pump-0～4)连接，另一些管道的末端和控制系统上的电磁阀(valve-0～2)连接。该卡盒上有四个加样口，在图中用箭头标出，分别用于加入核酸扩增的试剂，核酸扩增的模板，杂交亲和液，和用于显示杂交结果的微球悬浮液。加完样后加样口随即可用胶带条封闭。管道上的一些关键位置需要对流体界面的通过进行检测，以实现对流动的反馈控制，这些位置在图中用黑点标出。具体的检测方式可以是在卡盒之外这些关键位置的上、下方分别设置一对红外传感器(IR-0～IR-7)，其中一个为发光管，另一个为接收管，信号的发射与接收均由控制系统完成。
核酸集成分析的完整过程如下：
(1)首先启动泵1，将含有模板的流体样品推至IR-1对准的检测点处。IR-1产生反馈信号使得泵1停止工作，模板样品在毛细作用下进入缩管100，并在被动阀的效应下停止在三通处。然后启动泵0，将扩增试剂推至IR-0对准的检测点处。IR-0检测到来流后，通过短暂延续泵0的工作使扩增试剂和模板样品接合，然后控制系统交替启停泵0和泵1，利用时间脉动的方式将上述两股流体混合均匀。当IR-1检测到模板样品液尾后，泵1随即停止工作，由泵0将扩增反应混合液推入扩增毛细管，并在前者到达IR-7对准的检测位置时停止泵0的工作，控制系统开始进入扩增温度循环。在本实例中，扩增毛细管是包裹了电阻加热元件的玻璃管，它通过胶粘的方式封装在卡盒上。
(2)完成扩增后，启动泵2，将杂交亲和液推至IR-5对准的检测位置，通过短暂延续泵2的工作，将流体推过并使其一部分进入IR-6附近的缩管101，同时将其前液面停止在紧接着的下游缩管102之前某处。然后启动泵0，将扩增产物推至IR-6对准的检测位置，通过短暂延续泵0的工作，使得上述两股流体接合，然后控制系统交替启停泵0和泵2，利用时间脉动的方式将两股流体混合均匀。当IR-0和IR-2分别检测到液尾后，泵0和泵2随即分别停止工作，此时杂交腔体完全被充满，控制系统开始进入杂交反应控制过程。杂交腔体的壁面上预先固定了特异性的分子探针，可以和扩增产物中的待检测核酸分子发生亲合反应。根据需要，该反应可能需要温度控制，可以利用外部的温控元件对杂交腔体局部进行加热。本实例进一步提供了实现往复流动杂交的手段，即杂交混合液的前液面应流出杂交腔体，经过并一部分进入其下游的一个缩管103，并越过IR-4对准的检测位置。之后，在泵2和阀0以及泵4和阀2的配合工作下，可以实现杂交混合液的两端液面在IR-4和IR-5之间来回流动。
(3)本实例还集成了杂交完成的微球检测环节。微球检测的原理是利用微球表面包敷的亲和素与杂交腔体内已结合好了的核酸分子上的生物素之间的亲和反应，使得微球集中在已经通过杂交固定在了特定位置上的待检测核酸分子上，这样通过肉眼或简单的光学显微镜就能观测到微球标记出来的阳性或阴性的杂交信号。首先，开通阀0，并启动泵4，将杂交混合液推出杂交腔体，使其流向废液池，当IR-5检测到液面时，停止泵4的工作，此时杂交腔体已经没有流体了。然后开通阀2，并启动泵3，将微球悬浮液推至缩管103处并与那里残留的微量杂交混合液接合。在此过程中，管道内空气通过连接到阀2的管道排出。从缩管103流出的微球悬浮液一部分流向杂交腔体，一部分流向IR-4对准的管道，当IR-4检测到微球悬浮液后，关闭阀2，这样剩余的微球悬浮液继续流进杂交腔体。当微球悬浮液的液尾到达缩管103时，由于被动阀效应，缩管内的微量微球悬浮液将保留在那儿，而空气沿连接到阀2的管道将IR-4对准的管道里的剩余微球悬浮液推向杂交腔体。此时IR-4会检测到微球悬浮液的液尾，并产生信号停止泵3的工作，并关闭阀2。让微球悬浮液在杂交腔体内停流一段时间，以使生物素和亲和素发生充分的结合。
(4)最后，当微球标记过程完成后，启动泵3或泵4，将微球悬浮液推出杂交腔体，并流向废液池。整个核酸分析过程完成。
图(2)是针对结核病菌在上述卡盒上所做的集成化核酸分析的结果。其中第1列和第6列为亲和反应质控点，第2列为阴性对照点，第3列为空白对照点，第5列为杂交-亲和反应质控点，第4列为特异性检测探针点。

Claims (14)

1.流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，该系统含有：卡盒和独立于该卡盒外的控制部件，其中，
控制部件，含有：至少一个泵、至少一个阀以及至少一个检测器；
卡盒，至少有一条微管道，所述微管道中至少有一个末端和所述的泵相连，或者和所述的阀相连；在微管道上加工成沟槽或扩口；对微管道特定位置的尺寸作出突然变化，在所述微管道两端之间至少有一个允许被封闭的流体样品加入孔；
所述与卡盒相连的泵和阀是被外部控制系统选择性地开启或停断的，使所述流体样品在微管道内按设定的方向流动；
所述检测器对流体样品加入孔下游的至少一处位置的流体样品界面进行检测，并产生反馈信号给外部控制系统，用于选择性地开启或停断与所述卡盒中的微管道相连接的泵和阀，使流体样品的运动状态发生改变。
2.根据权利要求1所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于：所述的检测器是装在对应于所述检测器的卡盒外的无线收发元件，当流体界面经过所述无线收发元件所在的检测位置时，所述无线收发元件发出电磁波强度或频率的反馈信号。
3.根据权利要求1所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于：所述的检测器是电阻元件、电抗元件或两者的组合，当流体界面经过所述电阻元件、电抗元件或两者的组合所在的检测位置时，所述电阻元件、电抗元件或两者的组合因湿度变化而向外部控制系统发出电反馈信号。
4.根据权利要求1所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于：所述的检测器是装在对应于所述检测位置的卡盒外的光电转换元件，当流体样品经过所述光电转换元件所在的检测位置时，所述光电转换元件因光路的变化而发出电反馈信号。
5.根据权利要求1所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于：所述控制部件包含一个设在所述卡盒中微管道上的设定位置的磁性元件，当含有磁性颗粒的流体经过该设定位置时，外部控制系统对流体样品内的磁性颗粒的运动进行控制。
6.根据权利要求1所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，所述的控制部件包含一个设在所述卡盒内微管道上指定位置的电场发生元件，当含有带电离子或颗粒的流体经过该指定位置时，外部控制系统对流体样品内的带电离子或颗粒的运动进行控制。
7.根据权利要求1所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，在所述卡盒内的微管道上有一个加热和/或测温元件，当流体界面经过该加热和/或测温元件所在的微管道上的指定位置时，所述外部控制系统对所述流体样品的温度进行控制。
8.根据权利要求1所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，所述流体样品中被分析的对象是核酸，所述卡盒系统是核酸分析用卡盒系统。
9.根据权利要求8所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，在所述卡盒内的部分微管道内部填充或设置有效结构，该结构使核酸分子在设定条件下发生预期的特异性吸附，而在另外一些设定条件下发生预期的脱附，所述有效结构至少含有颗粒或微球或纤维或薄膜或具有大表面体积比的微柱阵列、网格或它们的任意组合。
10.根据权利要求8所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，在所述卡盒内的部分微管道的内表面涂覆或粘贴一层有效表面。
11.根据权利要求8所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，在所述卡盒的微管道内部有至少一个空间，其中固定了设定的化合物分子，用于和特定的核酸分子或者其衍生物发生反应。
12.根据权利要求8所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，在所述卡盒的微管道的表面，固定了设定的化合物分子，用于和特定的核酸分子或者其衍生物发生反应。
13.根据权利要求1所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，在所述卡盒的微管道内部，至少有一个空间，其中固定了设定的以规则形式排列的化合物分子，通过所述排列形式识别不同位置的化合物分子。
14.根据权利要求13所述的流体样品分析用卡盒系统，其特征在于，在所述卡盒的微管道内表面固定着设定的以规则形式排列的化合物分子，通过所述排列形式识别不同位置的化合物分子。
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