KR100846491B1 - 미세유동 장치 내에서 표적 생체분자의 분리 및 정제를 위한 자성 비드 추출 장치 - Google Patents

미세유동 장치 내에서 표적 생체분자의 분리 및 정제를 위한 자성 비드 추출 장치 Download PDF

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Abstract

미세유동 장치 내에서 생체분자의 분리 및 정제를 위한 자성 비드 추출 장치 및 이를 포함하는 미세유동 장치가 개시된다. 본 발명에 따른 자성 비드 추출 장치는 버퍼액 챔버; 입구와 출구 및 상기 입구와 출구 사이에 샘플 용액이 흐르는 유로를 가지고, 상기 유로 중 일부에 상기 버퍼액 챔버와 접하는 연결부를 가지는 샘플 용액 채널; 및 상기 버퍼액 챔버에 인접하게 배치되고, 상기 샘플 용액 중에 혼합된 자성 비드가 상기 연결부를 통해 버퍼액 챔버로 유인되도록 자기력을 인가하는 자성체를 포함한다. 샘플 용액 채널의 유로를 따라 흐르는 샘플 용액 중에서 자성 비드만을 선택적으로 유인하여 상기 버퍼액 챔버에 포집하고, 나머지는 샘플 용액 출구를 통해 배출함으로써 별도의 세정 과정 없이 정제된 자성 비드를 얻을 수 있다.
미세유동 장치, 자성 비드, 분리, 정제

Description

미세유동 장치 내에서 표적 생체분자의 분리 및 정제를 위한 자성 비드 추출 장치{Magnetic bead extraction device for target biomolecule separation and purification in microfluidic apparatus}
도 1은 본 발명에 따른 자성 비드 추출 장치의 일 실시예를 도시한 평면도이다.
도 2는 상기 도 1의 Ⅱ-Ⅱ 단면을 도시한 단면도이다.
도 3a는 상기 도 1의 실시예에 따른 장치를 이용하여 자성 비드를 추출하는 과정의 초기상태를 보이는 사진이다.
도 3b는 상기 도 1의 실시예에 따른 장치에 의해 추출된 자성 비드를 보이는 사진이다.
도 4는 비교예 대한 실시간 PCR 결과를 보이는 그래프이다.
도 5는 상기 도 1의 실시예에 따른 장치를 이용하여 분리 및 정제된 샘플에 대한 실시간 PCR 결과를 보이는 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 미세유동 장치의 실시예를 도시한 평면도이다.
< 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 >
10: 샘플 용액 채널 11, 111: 샘플 용액 채널 입구
12, 112, 212: 샘플 용액 채널 출구 15: 연결부
20: 버퍼액 챔버 21, 121, 221: 버퍼액 챔버 입구
22, 122, 222: 버퍼액 챔버 출구 30, 130, 230: 자성체
51, 52: 자성 비드 100, 200: 자성 비드 분리 유닛
본 발명은 미세유동 장치내에서 생체분자의 분리 및 정제를 위해 샘플로부터 표적 생체분자를 포획한 자성 비드를 추출하는 장치에 관한 것이다.
혈장과 같은 생물학적 샘플로부터 특정의 표적 생체분자를 분리하는 방법으로서, 실리카, 유리섬유, 음이온교환수지 또는 자성 비드를 이용하는 방법이 알려져 있다. 이들 중에서 자성 비드를 이용하는 방법에 따르면, 표면에 표적 생체분자와 결합될 수 있는 프로브를 갖는 자성 비드를 샘플 용액에 투입하여 표적 생체분자를 포획하게 하고, 샘플 용액으로부터 다시 자성 비드를 분리함으로써 표적 생체분자를 추출한다. 이렇게 자성 비드를 이용하여 표적 생체분자를 분리하는 방법(bead based separation) 방법은 이미 상용화 되어서, 세포, 단백질, 핵산 또는 기타의 생체분자 등을 분리하는데 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 미국특허 US6,893,881에서는 항체가 코팅된 상자성(paramagnetic) 비드를 사용하여 특정 표적 세포를 분리하는 방법을 제시하고 있다.
자성 비드를 이용하여 표적 생체분자를 분리하는 데 있어서 필수적인 것이 자성 비드의 세정(washing) 과정이다. 예를 들어, 항원을 포획하기 위해 자성 비드 표면에 항체등을 결합시키는 과정에서, 자성 비드 표면에 결합되지 않고 남은 여분의 항체 등을 자성 비드 세정을 통해 제거해 주어야 한다. 또한, 혈액, 세럼 등과 같은 샘플용액에과 자성 비드를 섞고, 배양 등의 과정을 거친 후, 여분의 혈장 또는 세럼 등과 같이 후속 과정에 영향을 줄 수 있는 물질을 제거해야 하는데, 이 경우에도 세정 과정이 필수적이다.
종래에 알려진 세정 과정을 살펴보면 다음과 같다. 자성 비드와 샘플의 혼합액이 담겨 있는 용기를 자석 근처에 위치하여 자석과 가까운 용기벽에 자성 비드들이 붙으면, 남은 용액을 피펫으로 제거하는 방법이다. 이러한 방법을 사용하여 세정하는 경우에는, 자석에 용기를 가까이 하고, 씻어 내고자 하는 잉여 용액을 제거한 후, 다시 자석에서 용기를 멀리한 상태로 세정 버퍼액을 주입하여 혼합하고, 다시 자석에 가까이 위치시켜서 용액을 분리하는 과정을 반복한다.
이 경우 한 번의 과정으로 제거하고자 하는 용액의 완벽한 제거가 어렵기 때문에, 전술한 과정을 여러 차례 반복해야 하고, 따라서 많은 시간과 노력이 소요되는 문제점이 있다. 또한, 많은 양의 버퍼액을 공급해야 하기 때문에 현실적으로 이러한 세정 과정을 마이크로칩 내에서 수행하기 어렵다. 또한, 수 ㎕ 정도로 적은 양의 샘플을 다루어야 하는 경우에는 피펫으로 용액을 제거할 때, 완벽하게 제거하기가 어렵기 때문에 용액의 정량 제어가 어려운 문제점이 있다.
본 발명은 전술한 문제점들을 해결하기 위해 제안된 것으로, 미세유동 장치 내에서 샘플 용액과 자성 비드의 혼합액으로부터 자성 비드만을 효과적으로 분리하여, 적은 양의 버퍼액만으로 표적 생체분자를 포획한 자성 비드를 신속하게 분리 및 정제할 수 있는 장치를 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 자성 비드 추출 장치는, 버퍼액 챔버; 입구와 출구 및 상기 입구와 출구 사이에 샘플 용액이 흐르는 유로를 가지고, 상기 유로 중 일부에 상기 버퍼액 챔버와 접하는 연결부를 가지는 샘플 용액 채널; 및 상기 버퍼액 챔버에 인접하게 배치되고, 상기 샘플 용액 중에 혼합된 자성 비드가 상기 연결부를 통해 버퍼액 챔버로 유인되도록 자기력을 인가하는 자성체를 포함한다.
상기 샘플 용액 채널은 V자형으로 굴절된 유로를 가지고, 상기 연결부는 상기 V자형 유로의 굴절된 부분에 배치된 것일 수 있다. 이 때, 상기 연결부에서 샘플 용액의 진입 및 진출 방향과 버퍼액 계면이 이루는 각도가 0°보다 크고 90°보다 작은 것이 바람직하다. 또한, 상기 자성체는 상기 버퍼액 챔버 외부의 아래 또는 위에 배치될 수 있다.
상기 버퍼액 챔버는 작동시에 버퍼액을 가두어 둘 수 있다. 이 때, 상기 샘플 용액 채널은 작동시에 샘플 용액이 상기 유로를 따라 층류를 이루며 상기 연결부를 통과할 정도의 폭과 높이 및 굴절각을 가지는 것이 바람직하다. 이는 상기 샘플 용액 중에서 자성 비드를 제외한 다른 구성 성분은 버퍼액에 섞이지 않고 층류를 따라 출구로 빠져나가도록 하기 위함이다.
본 발명의 다른 일 측면에 따른 자성 비드 추출 장치는, 입구와 출구 및 상기 입구와 출구 사이에 버퍼액이 흐르는 유로를 가지는 버퍼액 챔버; 입구와 출구 및 상기 입구와 출구 사이에 샘플 용액이 흐르는 유로를 가지고, 상기 유로 중 일부에 상기 버퍼액 챔버와 접하는 연결부를 가지는 샘플 용액 채널; 및 상기 버퍼액 챔버에 인접하게 배치되고, 상기 샘플 용액 중에 혼합된 자성 비드가 상기 연결부를 통해 버퍼액 채널로 유인되도록 자기력을 인가하는 자성체를 포함한다.
상기 버퍼액 챔버는 작동시 버퍼액이 상기 유로를 따라 층류를 이루며 흐를 정도의 폭과 높이를 가지고, 상기 샘플 용액 채널은 작동시에 샘플 용액이 상기 유로를 따라 층류를 이루며 상기 연결부를 통과할 정도의 폭과 높이 및 굴절각을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 연결부에서 샘플 용액 흐름의 방향과 버퍼액 흐름의 방향은 서로 동일할 수 있다.
또한, 상기 샘플 용액 채널은 V자형으로 굴절된 유로를 가지고, 상기 연결부는 상기 V자형 유로의 굴절된 부분에 배치된 것일 수 있다. 이 때, 상기 연결부에서 샘플 용액의 진입 및 진출 방향과 버퍼액 계면이 이루는 각도가 0°보다 크고 90°보다 작은 것이 바람직하다. 또한, 상기 자성체는 상기 버퍼액 챔버 외부의 아래 또는 위에 배치될 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따른 미세유동 장치는, 자성 비드를 이용하여 샘플 용액으로부터 표적 생체분자를 분리하는 미세유동 장치에 있어서, 자성 비드가 혼합된 샘플 용액으로부터 자성 비드를 분리 및 정제하는 적어도 하나의 자성 비드 추출 유닛을 포함하며, 상기 자성 비드 추출 유닛의 구성은 위에서 언급한 두 가지 유형의 자성 비드 추출 장치 중 어느 하나일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 미세유동 장치는 둘 이상의 자성 비드 추출 유닛을 포함하고, 상기 둘 이상의 자성 비드 추출 유닛은 선 순위 자성 비드 추출 유닛의 버퍼액 챔버 출구가 후 순위 자성 비드 추출 유닛의 샘플 용액 채널 입구로 연결되도록 연쇄적으로 배치될 수 있다.
여기서, 상기 자성 비드는 그 지름이 0.001㎛ 내지 200㎛인 것일 수 있다. 또한 상기 자성 비드는 그 표면이 금속 산화물, 스티렌(styrene), 아가로스(agarose) 또는 실리카(silica)와 같이 불특정 생체분자의 부착이 가능한 재료층으로 이루어진 것일 수도 있고, 표면에 항체, 항원, DNA, 비오틴(biotin), 단백질(protein), 스트렙트아비딘 또는 아민기(NH2-)나 카르복시기(COOH-) 등과 같이 특정 생체분자에 특이 결합되는 프로브를 가지는 것일 수도 있다.
본 명세서에서 생체분자는 아미노산, 단백질, 당, 지질, 핵산 등의 생체 합성 분자를 비롯하여 동물성 세포, 바이러스, 박테리아 등을 포함하여 일컫는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 실시예를 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 자성 비드 추출 장치의 일 실시예를 도시한 평면도이다. 본 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 자성 비드 추출 장치는 자성 비드(51)가 혼합된 샘플 용액이 흐르는 유로를 제공하는 샘플 용액 채널(10)과 버퍼액을 일시적으로 저장하거나 흐르도록 할 수 있는 버퍼액 챔버(20)를 구비한다. 상기 샘플 용액 채널(10)은 샘플 용액이 주입되는 입구(11)와 배출되는 출구(12) 및 상기 입구(11)로부터 상기 출구(12)까지 샘플 용액이 흐르는 유로를 가지고, 아울러 상기 유로 중간에 상기 버퍼액 챔버(20)와 연결된 연결부(15)를 갖는다. 상기 샘플 용액 채널(10)은 상기 연결부(15)를 중심으로 굴절될 수 있다. 상기 버퍼액 챔버(20)는 버퍼액이 주입되는 입구(21)와 배출되는 출구(22)를 갖는다. 자성체(30)는 버퍼액 챔버(20)의 아래 또는 위에 인접하게 배치되어 상기 연결부(15)를 통과하여 흐르는 샘플 용액 중에서 자성 비드(51)를 상기 버퍼액 챔버(20) 내로 유인할 수 있는 정도의 자기력을 인가한다.
상기 샘플 용액 채널(10) 내의 샘플 용액 흐름 방향과 상기 연결부(15)에서 버퍼액의 경계면이 이루는 각도, θ는 0°보다 크고 90°보다 작은 범위에서 결정되는 것이 바람직하다. θ값이 지나치게 작으면, 샘플 용액에 혼합된 자성 비드(51)도 상기 연결부(15)를 지나쳐서 출구(12)쪽으로 흘러가기 쉽고, θ값이 지나치게 크면 샘플 용액 자체가 상기 버퍼액 챔버(20) 내로 섞여 들어오기 쉽기 때문이다. 본 실시예에서는 버퍼액 계면에 대한 샘플 용액 유로의 진입 및 진출각을 45°로 설정하여 실험하였다. 상기 연결부(15)의 폭은 샘플 용액 채널(10) 내의 유속과 상기 자성체(30)의 자기력 및 상기 자성 비드(51)의 크기 등을 고려하여 자성 비드(51)가 상기 연결부(15)를 통과하여 상기 버퍼액 챔버(20)로 진입할 수 있을 정도로 정해지는 것이 바람직하다. 다만, 상기 연결부(15)는 샘플 용액과 버퍼액의 계면에서 물질의 확산이 일어날 시간을 줄이도록 설계되는 것이 바람직하다.
상기 버퍼액 챔버(20)는 작동시에 버퍼액을 일시적으로 저장할 수 있는 구조일 수도 있고, 상기 샘플 용액 채널(10)과 마찬가지로 입구(21)와 출구(22) 사이에 버퍼액이 흐르는 유로를 더 구비한 구조일 수도 있다.
전술한 구조의 자성 비드 추출 장치는 미세유동 장치의 일부로서 칩 내에 마련될 수 있다. 좀 더 구체적으로는, 서로 포개어지는 두 개의 판 중 어느 하나의 내측면에 상기 도 1에 도시된 샘플 용액 채널(10) 및 버퍼액 챔버(20) 형상의 음각 패턴을 형성하고, 각각의 입구(11)(21) 및 출구(12)(22) 위치에 구멍을 뚫음으로써 마련될 수 있다.
도 2는 상기 자성 비드 추출 장치가 칩 내에 구현된 예로서, 상기 도 1의 Ⅱ-Ⅱ 단면을 도시한 단면도이다. 상판(70) 저면에 소정 깊이의 음각 패턴에 의해 버퍼액 챔버(20)가 마련되고, 상기 버퍼액 챔버(20)의 양 단에 입구(21)와 출구(22)가 마련되어 있다. 하판(80)에는 상기 버퍼액 챔버(20)의 저면에 인접하게 자성체(30)가 배치되어 있다.
본 발명에 따른 자성 비드 추출 장치 및 이를 포함하는 미세유동 장치는 일 예로서, 표적 생체분자의 분리를 매개하는 자성 비드 등을 이용하여 전혈, 타액, 소변 등 복잡한 유체로부터 표적 세포 또는 바이러스 등을 분리하여 정제하고, 이로부터 핵산을 신속하게 분리하는 랩온어칩의 통합(integration)을 가능하게 한다.
좀 더 구체적인 예를 들면 다음과 같다. 스트렙트아비딘이 부착된 자성 비드에 바이오틴이 결합된 세포 또는 바이러스에 특이적인 항체를 반응시키면, 스트렙트아비딘과 바이오틴의 특이적인 친화성 결합에 의해 자성 비드에 항체가 결합하게 된다. 여기에 세포 또는 바이러스를 포함한 시료를 접촉시키면, 특정 세포 또는 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 상기 세포 또는 바이러스에 결합함으로써 특정 세포 또는 바이러스는 농축되는 것이다. 따라서, 사용하는 항체의 종 류를 달리하면 원하는 세포 또는 바이러스를 농축할 수 있는 것이다. 이후에 다양한 세포 파괴 방법을 이용하여 농축된 세포 또는 바이러스를 파괴하면 원하는 DNA를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 미세유동 장치에서, 상기 자성 비드는 불특정한 생체분자를 부착시킬 수 있도록 그 표층이 금속 산화물, 스티렌(styrene), 아가로스(agarose) 및 실리카(silica) 중에서 선택된 재료로 이루어질 수도 있다. 또한, 상기 자성 비드는 그 표면에 특정한 표적 생체분자와 결합할 수 있는 프로브를 가질 수 있다. 이러한 프로브는 자성 비드를 특정한 표적 생체분자에 친화성을 갖는 항체, 항원, DNA, 비오틴 및 스트렙트아비딘 중에서 선택된 어느 하나 이거나, 아미노기(NH2-) 또는 카르복시기(COOH-)와 같은 작용기를 갖는 물질로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 자성 비드가 항체로 표면처리된 경우, 항체는 원하는 특정 세포 또는 바이러스만 선택적으로 포획할 수 있기 때문에, 매우 낮은 농도의 세포 또는 바이러스를 검출하고자 하는 경우에 유용하다. 세포 또는 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 결합된 자성 비드는 Invitrogen, Qiagen 사 등에서 시판하고 있으며, 이의 예는 Dynabeads
Figure 112007077349203-pat00001
Genomic DNA Blood (Invitrogen), Dynabeads
Figure 112007077349203-pat00002
anti-E.coli O157(Invitrogen), CELLectionTM Biotin Binder Kit (Invitrogen), MagAttract Virus Min M48 Kit(Qiagen) 등이 있다. 상기 특정 항체가 결합된 자성 비드를 이용하여 디프테리아 독소(Diphtheria toxin), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), HBV, HCV, HIV, 인플루엔자(Influenza) A, Influenza B, 리스테리아(Listeria), 마이코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 루벨라 바이러스(Rubella virus), 로타바이러스(Rotavirus) 등을 분리할 수 있다.
본 발명의 미세유동 장치에서 상기 자성 비드의 크기는 그 지름이 0.001㎛ 내지 200㎛인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 0.1㎛ 내지 100㎛일 수 있다. 자성 비드의 크기는 상기 미세유동 장치를 통해 분리 및 정제하고자 하는 표적 생체분자의 크기에 따라서 적정하게 선택할 수 있다. 또한, 상기 자성 비드는 자성을 띠는 것이면 어떤 재료로도 만들어질 수 있다. 특히, 강자성체를 띠는 Fe, Ni, Cr 의 금속 및 이의 산화물로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 재료로 만들어질 수 있다.
이하에서는 상기 도 1 및 도 2에 도시된 자성 비드 추출 장치의 동작을 살펴봄으로써 본 발명의 특징이 더 명확하게 드러날 수 있도록 설명한다.
버퍼액 챔버(20)에 내에 버퍼액이 정체되어 있는 경우, 샘플 용액 채널(10)의 입구(11)를 통해 자성 비드(51)가 혼합된 샘플 용액을 주입하면, 상기 샘플 용액이 유로를 따라 흐르며 상기 연결부(15)를 지나게 된다. 이 때, 상기 자성 비드(51)는 상기 자성체(30)의 자기력에 의해 유인되어 상기 버퍼액 챔버(20) 내에 포집된다. 한편, 자성 비드를 제외한 샘플 용액의 다른 성분들은 유로를 따라서 상기 연결부(15)를 그대로 통과하여 출구(12)를 향한다. 이렇게 해서 매우 적은 양의 버퍼액을 이용하여 별도의 세정 과정이 필요 없을 정도로 정제된 자성 비드(52)를 얻을 수 있다. 이 때, 상기 샘플 용액 채널(10) 내의 샘플 용액 흐름은 층류를 유 지하는 것이 바람직하다. 이 경우 샘플 용액의 층류로부터 정체되어 있는 버퍼액 내로 확산되어 들어오는 물질의 양은 무시할 수 있을 정도로 적기 때문이다.
버퍼액 챔버(20)가 입구(21)와 출구(22) 및 상기 입구(21)로부터 출구(22)까지 버퍼액이 흐르는 유로를 가지는 경우, 즉 상기 연결부(15)를 중심으로 상기 버퍼액 챔버(20) 내에 버퍼액의 흐름이 형성되는 경우에도, 전술한 바와 같은 과정으로 상기 샘플 용액 챔버(10)를 따라 흐르는 샘플 용액으로부터 자성 비드(52)를 분리해 낼 수 있다. 이 경우에는 상기 자성 비드와 함께 샘플 용액 성분이 상기 버퍼액 챔버(20) 내로 섞여 들어오더라도 이를 버퍼액 챔버(20)의 출구(22)를 통해 배출하고, 상기 버퍼액 챔버(20)에는 정제된 자성 비드(52)만 남도록 할 수 있다. 이 경우에도 상기 연결부(15)를 통해 섞여 들어오는 샘플 용액 성분의 양이 매우 적기 때문에, 종래의 세정 방법에 비해 극히 적은 양의 버퍼액만으로 정제된 자성 비드(52)를 얻을 수 있다.
도 3a는 상기 도 1의 실시예에 따른 장치를 이용하여 자성 비드를 추출하는 과정의 초기상태를 보이는 사진이고, 도 3b는 상기 도 1의 실시예에 따른 장치에 의해 추출된 자성 비드를 보이는 사진이다. 전술한 바와 같이 샘플 용액의 흐름으로부터 자성 비드가 자성체 쪽으로 끌려가서, 샘플 용액을 2분간 흘려 보낸 후에는 버퍼액 챔버 내에 축적되어 있는 것을 확인할 수 있다.
<실험예: 본 발명의 자성 비드 추출 장치를 이용한 HBV(B형 간염 바이러스)의 분리 및 정제>
1) HBV, 프로브용 이차항체 및 자성 비드 준비
103 내지 106cell의 HBV를 포함하는 전혈(whole blood) 100㎕를 준비한다. 비오틴이 부착된 이차항체(Virostat, 1817, host animal: rabbit) 용액 10㎕를 준비한다. 스트렙트아비딘으로 레이블된 직경 2.8㎛의 Dynabeads®M-280 Streptavidin을 20㎕ 준비하였다.
2) 비드 세정
비드 용액을 혼합하여 균질 용액을 제조하였다. 제조된 용액 100㎕를 튜브에 담고, 자석에 놓고 2분 동안 방치하였다. 피펫으로 상층액을 취해서 제거하였다. 튜브를 자석에서 꺼내고, 완충액 1(0.1% BSA를 포함하는 PBS, pH7.4)을 100㎕ 첨가하고 혼합하였다. 다시 자석에 놓고 2분 동안 방치하였다. 피펫으로 상층액을 취해서 제거하였다. 튜브를 자석에서 꺼내고, 완충액 1(0.1% BSA를 포함하는 PBS, pH7.4)을 100㎕ 첨가하고 혼합하였다.
3) 항체를 이용한 비드의 예비코팅
상기와 같이 준비된 비드 용액 100㎕에 비오틴이 부착된 HBV 이차항체(Virostat, 1817) 8㎍ 를 넣고 혼합하였다. 수차례 뒤집어 혼합하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 자석을 이용하여 비드를 1분 동안 모으고, 상층액을 제거하였다. 세정 완충액(1% BSA를 포함하는 PBS, pH7.4) 2 ml 을 첨가하여 수차례 뒤집어 혼합하였다. 자석을 이용하여 비드를 1분 동안 모으고, 상층액을 제거하였다. 완충액 1(0.1% BSA를 포함하는 PBS, pH7.4) 100㎕를 첨가하여 예비코팅된 자성 비드를 재현탁하였다.
4) HBV를 포획한 자성 비드의 분리 및 정제
상기 1)에서 제조한 HBV가 포함된 전혈 100㎕에 상기 3)에서 제조한 대장균 항체가 결합된 비드 용액 100㎕를 혼합하였다. 수차례 뒤집어 혼합하면서, 2~8℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이후 용액을 원심분리하여 상층액을 160㎕를 제거하고, 도 1에 도시된 본 발명에 따른 자성 비드 추출 장치를 이용하여 10㎕/min의 유속으로 2분간 흘려줌으로써 HBV를 포획한 자성 비드를 분리 및 정제하였다.
5) 세포 용해
상기에서 분리된 HBV 용액 4㎕를 레이저 애블레이션(Laser ablation)에 의한 세포 파괴 장치(J.-G. Lee, K. H. Cheong, N. Huh, S. Kim, J.-W. Choi, C. Ko, Lab Chip 6, 886 (2006))를 이용하여 파괴한 후, 실시간 PCR을 수행하였다. 실시간 PCR은 GeneSpector
Figure 112006053068305-pat00003
Micro PCR TMC-1000(SAIT, Korea)(Y.-K. Cho, J. Kim, Y. Lee, Y.-A. Kim, K. Namkoong, H. Lim, K. W. Oh, S. Kim, J. Han, J. Park, Y. E. Pak, C.-S. Ki, J. R. Choi, H.-K. Myeong, C. Ko, Biosensors and Bioelectronics 21 (2006), 2161~2169)를 이용하여 수행하였다.
<비교예>
A. 정제된 HBV 용액 샘플:
순수하게 정제된 HBV DNA를 PBS버퍼액에 희석하여 농도가 1×103cell/㎕인 용액을 마련하고, 세정 과정 없이 실시간 PCR을 수행하였다.
B. 종래의 세정 방법에 따라 세정된 샘플;
1×103cell/㎕인 HBV 용액을 세럼에 1:3의 부피비로 혼합하였다. 상기 2) 내지 3)과 유사한 단계들을 거치고, 4)의 단계에서 종래의 세정 방법에 따라 세정을 수행하였다. 자석을 이용하여 비드를 2분 동안 모으고, 상층액을 제거하였다. 다시 세정 완충액 100㎕를 첨가하여 수차례 뒤집어 혼합하였다. 자석을 이용하여 비드를 모으고, 상층액을 제거하였다. 이러한 세정 과정을 세 차례 반복하고, 세포 파괴 과정을 거친 뒤 실시간 PCR을 수행하였다.
C. 세럼과 혼합후 세정하지 않은 샘플:
1×103cell/㎕인 HBV 용액을 세럼에 1:3의 부피비로 혼합하였다. 상기 2) 내지 3)과 유사한 단계들을 거치고, 4)의 단계에서 세정 과정 없이 세포 파괴 과정을 거친 뒤 실시간 PCR을 수행하였다.
도 4는 비교예에 대한 실시간 PCR 결과를 보이는 그래프이다. 표 1은 상기 도 4의 결과를 정리한 것이다.
SAMPLE TYPE TARGET SEPARATION & WASHING STEP Ct
PURIFIED HBV DNA (103cell/㎕) X(A) 21.79
HBV(103cell/㎕):SERUM MIXTURE (VOLUME RATIO 1:3) 100㎕ O(B) 22.22±0.77
X(C) X
비교예 A는 비교의 기준이 되는 값으로 Ct(threshold cycle)가 21.79 였다. Ct는 실시간 PCR 반응에서 검출 가능한 형광 신호가 나타나는 사이클 수를 말한다. 즉 초기 DNA 농도가 높을수록 낮은 Ct에서 형광 신호가 검출가능하고, 초기 DNA 농도가 낮을수록 Ct가 크다. Ct는 또한, DNA 정제와도 관련 있는데, DNA의 순도가 높을수록 Ct가 낮고, DNA의 순도가 낮을수록 Ct는 높다. 따라서, Ct가 낮을수록 용액 속의 DNA 는 더욱 정제된 형태라는 것을 알 수 있다.
비교예 B의 샘플은 Ct가 22.22(오차범위 ±0.77)로서 상기 비교예 A와 유사한 결과가 나왔음을 알 수 있다. 반면, 세정 과정을 거치치 않은 비교예 C의 경우에는 PCR이 이루어지지 않았다.
도 5는 상기 도 1의 실시예에 따른 장치를 이용하여 분리 및 정제된 샘플에 대한 실시간 PCR 결과를 보이는 그래프이다. 전술한 실험예에 따른 것으로서, 여섯 번의 반복실험으로 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있었다. 얻어진 Ct값은 26.95±0.12이다. 그런데, 이 결과는 초기 HBV 농도가 102cell/㎕인 샘플을 이용하여 얻어진 값이다. 따라서, 상기 비교예 A 및 B와의 비교를 위해 초기 농도가 1×103cell/㎕인 것으로 가정하면, 26.95보다 3.3이 작은 23.65에 유사한 결과가 나왔을 것임을 쉽게 예상할 수 있다. Ct는 PCR 초기 주형 농도와 관련되기 때문이다. Ct가 낮을수록 초기 농도가 높음을 뜻한다. PCR 효율이 100%인 경우 △Ct 3.3은 10배의 초기 농도 차이가 있음을 뜻한다.
도 6은 본 발명에 따른 미세유동 장치의 실시예를 도시한 평면도이다. 본 발명에 따른 미세유동 장치는 전술한 자성 비드 추출 장치에 해당하는 유닛을 적어도 하나 이상 가질 수 있다. 상기 도 6은 그 중 두 개의 자성 비드 추출 유닛(100, 200)을 도시한 것이다. 다수의 자성 비드 추출 유닛은 자성 비드의 분리 및 정제를 여러 차례 반복할 수 있도록 연쇄적으로 배치되는 것이 바람직하다.
연쇄적으로 배치된 다수의 자성 비드 추출 유닛들(100, 200) 중에서 1순위의 유닛(100)의 버퍼액 챔버 출구(122)가 2순위 유닛(200)의 샘플 용액 채널(210)의 입구로 연결된다. 도면에 도시되지는 않았으나 상기 1순위 유닛(100)의 버퍼액 출구(122)와 상기 2순위 유닛(200)의 샘플 용액 채널(210)의 입구 사이에는 밸브가 구비될 수도 있다.
이하에서는 상기 도 6에 도시된 미세유동 장치의 동작을 살펴봄으로써 본 발명의 특징이 더 명확하게 드러날 수 있도록 설명한다.
1순위 유닛(100)의 버퍼액 챔버(120)에 내에 버퍼액이 채워져 있고, 샘플 용액 채널(110)의 입구(111)를 통해 자성 비드가 혼합된 샘플 용액을 주입하면, 상기 샘플 용액이 유로를 따라 흐르며 상기 연결부(115)를 지나게 된다. 이 때, 상기 자성 비드는 상기 자성체(130)의 자기력에 의해 유인되어 상기 버퍼액 챔버(120) 내에 포집된다. 한편, 자성 비드를 제외한 샘플 용액의 다른 성분들은 유로를 따라서 상기 연결부(115)를 그대로 통과하여 출구(112)를 향한다. 이렇게 해서 1차적으로 정제된 자성 비드를 얻을 수 있다. 상기 자성체(130)는 탈부착이 가능하게 설치되는 것이 바람직하며, 상기 자성체(130)를 탈락시킨 상태에서 정제된 자성 비드를 포함하는 버퍼 용액을 배출할 수 있다.
상기 1순위 유닛(100)으로부터 이렇게 배출된 자성 비드 버퍼 용액은 2순위 유닛(200)의 샘플 용액 채널(210)로 주입된다. 2순위 유닛(200)의 버퍼액 챔버(220) 역시 버퍼액으로 채워져 있는 상태에서 전술한 과정을 다시 거치게 된다. 따라서, 상기 1순위 유닛(100)에서 버퍼액 속으로 확산 되어 들어간 이물질이 존재하더라도, 2순위 유닛(200)에서 샘플 용액 채널(210)의 출구(215)로 빠져나가게 되고, 2순위 유닛(100)의 자성체(230)의 자기력에 의해 연결부(215)를 통해 버퍼액 챔버(220)에 포집된 자성 비드는 더 높은 순도를 가질 수 있다.
이 때, 1순위 유닛(100) 및 2순위 유닛(200) 모두 상기 샘플 용액 채널(110, 210) 내의 샘플 용액 흐름은 층류를 유지하는 것이 바람직하다. 그렇게 함으로써 샘플 용액의 층류로부터 정체되어 있는 버퍼액 내로 확산되어 들어오는 물질의 양을 최소화 할 수 있기 때문이다.
이상에서 본 발명에 따른 바람직한 실시예가 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 정해져야 할 것이다.
전술한 발명의 구성에 의하여 본 발명에 따른 자성 비드 추출 장치는 미세유동 장치 내에서 샘플 용액과 자성 비드의 혼합액으로부터 자성 비드만을 효과적으로 분리하여, 적은 양의 버퍼액만으로 표적 생체분자를 포획한 자성 비드를 신속하게 분리 및 정제할 수 있도록 하는 효과가 있다.

Claims (19)

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  5. 버퍼액 챔버;
    입구와 출구 및 상기 입구와 출구 사이에 샘플 용액이 흐르는 V자형으로 굴절된 유로를 가지고, 상기 V자형의 유로의 굴절된 부분에 상기 버퍼액 챔버와 접하는 연결부를 가지는 샘플 용액 채널; 및
    상기 버퍼액 챔버에 인접하게 배치되고, 상기 샘플 용액 중에 혼합된 자성 비드가 상기 연결부를 통해 버퍼액 챔버로 유인되도록 자기력을 인가하는 자성체;를 포함하고,
    상기 버퍼액 챔버는 작동시에 버퍼액을 가두어 두는 것을 특징으로 하는 자성 비드 추출 장치.
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