TWI596327B - 有興趣之生物物質的收集與濃縮系統及其應用 - Google Patents

有興趣之生物物質的收集與濃縮系統及其應用 Download PDF

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TWI596327B
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Description

有興趣之生物物質的收集與濃縮系統及其應用 相關申請案之交叉參照
本申請案主張2012年10月29日提出申請之美國臨時專利申請案序號61/719,491之權利，該案以引用的方式併入本文中。
本發明大致係關於在樣本處理系統中用於收集及濃縮有興趣之生物物質的系統及裝置。本發明之系統可作為獨立式裝置使用，或與其他裝置，包括任何用於處理來自生物樣本之生物物質的裝置組合使用。更明確言之，本發明係關於自生物樣本收集及濃縮目標蛋白質、細胞及/或其他有興趣之材料以使用於微流體系統中之方法、組件、部件、及裝置。
已投注極大的心力來發展出可滿足自諸如血液、生物檢體樣本、及組織樣本等之不同來源收集、檢測、及處理生物樣本之逐漸成長需求的先進系統及平台。其中，舉例而言，免疫磁性系統(利用磁性奈米微粒及/或珠粒)及微流體晶片(利用特殊表面材料)對於自生物樣本(諸如抽取自人類受檢者之組織樣本或血液樣本等)收集有興趣之生物物質(例如，目標蛋白質或有興趣之細胞)提供高靈敏度。
此等系統及平台之特異性通常在於系統設計，其通常利用有興趣之標靶分子(諸如存於標靶細胞內或存於標靶細胞表面上之標靶蛋白質)與經特殊設計之檢測探針(例如，抗體、大分子、小分子、核酸及/或其他材料)之間的結合親和力。舉例來說，因大多數循環腫瘤細胞(CTC)為上皮細胞，故已發展出利用抗-EpCAM抗體作為檢測探針來檢測人類血液樣本中之循環腫瘤細胞的微流體晶片，該抗-EpCAM抗體對上皮細胞黏著分子 (EpCAM)提供高特異性結合親和力。
細胞的脫落，尤其上皮細胞脫落至血液循環中，係惡性腫瘤的固有特性，因此它提供了關於疾病階段診斷、監控治療計畫、及癌症患者最終存活率的重要資訊。舉例來說，經發現一些類型細胞之數量(例如，循環罕見細胞(CRC)、循環腫瘤細胞(CTC)等)及存於人類血液樣本中之其他生物物質與癌症轉移(例如，腫瘤細胞之侵略性)以及癌症療法之效力相關聯。
然而，就大多數癌症而言，脫落於血液中之相關循環腫瘤細胞(CTC)相當稀少，以致此等CTC的檢測、分離、及收集相當困難且極具技術挑戰性。即使就患有末期轉移性癌症的患者而言，存於血液中的CTC數量亦可能少至一個CTC/109個血細胞。因此需要富集過程。此外，需要除去血細胞與其他物質的非特異性結合以改良檢測靈敏度及特異性。
再者，大多數用於罕見細胞檢測之系統的主要瓶頸在於收集得有興趣之標靶生物物質(例如，罕見細胞或CTC)後的成像技術。大多數用於收集目標蛋白質或細胞的免疫磁性系統及微流體平台需要笨重且昂貴的設備，諸如自動化載台顯微鏡、自動化掃描器(例如，用於掃描及自動對焦於微流體通道)及/或讀取器(例如，用於定量掃描影像)。此外，可能仍然需要由受過訓練的專業人員勞力密集地人工檢查收集得之生物樣本及/或影像最少數小時。
因此，需要經簡化及較廉價的系統來收集及濃縮有興趣之生物物質供諸如疾病診斷、疾病治療監控、及藥物篩選的各種應用。
本發明大致係關於用於收集及濃縮目標生物物質供微流體應用之裝置。更明確言之，本發明係關於用於收集及濃縮可能存於各種生物樣本中之細胞諸如罕見細胞(例如，循環罕見細胞(CRC)、循環腫瘤細胞(CTC)等)、蛋白質、及其他有興趣之生物物質的方法及系統。
在一具體例中，一種用於處理來自生物樣本之有興趣之生物物質的系統包括經組態以接收該生物樣本之樣本入口、連接至該樣本入口之收集裝置、與該收集裝置流體連通之濃縮裝置、及樣本出口。在另一具體例中，提供一種生物樣本處理系統，其具有經整合在一起以收集及濃縮來自 生物樣本之有興趣之生物物質的收集裝置及濃縮裝置。在又另一具體例中，系統之濃縮裝置係經組態以接收來自收集裝置之有興趣之生物物質及濃縮有興趣之生物物質。
在又另一具體例中，提供一種利用具有樣本入口、收集裝置、與收集裝置流體連通之濃縮裝置、及樣本出口之系統處理來自生物樣本之有興趣之生物物質的方法。該有興趣之生物物質係以第一濃度存於該生物樣本內，且可由該收集裝置經該樣本入口接收以與偶合至抗垢(nonfouling)組合物(例如，經由偶合至連結(linker)組合物)形成為表面塗層之生物活性組合物相互作用。該表面塗層可包含該生物活性組合物、該抗垢組合物及該連結組合物，且係附著至該收集裝置之一或多個表面的至少一部分。
該處理來自生物樣本之有興趣之生物物質的方法一般包括利用系統之收集裝置捕集以第一濃度存在之有興趣之生物物質，使該有興趣之生物物質自該收集裝置釋放，及將該有興趣之生物物質以第二濃度傳遞至該濃縮裝置，且進一步提高該有興趣之生物物質之濃度至第三濃度。
在一態樣中，該第三濃度係大於該第一濃度。在另一態樣中，該第三濃度係大於該第二濃度。在又另一態樣中，該有興趣之生物物質係經由在該收集裝置內引入氣泡而自該收集裝置釋放。在一具體例中，該方法可進一步包括自該生物樣本棄置一或多種不想要之組分。在另一具體例中，該方法可進一步包括將該有興趣之生物物質侷限在濃縮區域，及/或使流體溶液過濾通過設置於該濃縮裝置內之一或多個薄膜過濾元件，其中該流體溶液包含該有興趣之生物物質。
在另一具體例中，該方法可進一步包括於培養基中培養該有興趣之生物物質。此外，該方法可進一步包括執行一或多項檢定，包括，但不限於，一或多項檢測、表徵、計算、免疫染色、檢驗、成像、培養、分子分析、以上之組合、及/或其他定性及定量檢定，以分析所獲得之有興趣之生物物質。
100‧‧‧系統
110‧‧‧收集裝置
110A‧‧‧收集裝置
110B‧‧‧收集裝置
112‧‧‧樣本入口
114‧‧‧微結構
118‧‧‧出口
120‧‧‧濃縮裝置
120A‧‧‧濃縮裝置
120B‧‧‧濃縮裝置
120C‧‧‧濃縮裝置
120D‧‧‧濃縮裝置
300‧‧‧微流體晶片裝置
302‧‧‧基板
304‧‧‧黏著層
305‧‧‧流體通道
306‧‧‧基板
308‧‧‧固體表面
410A‧‧‧收集裝置
410B‧‧‧收集裝置
410C‧‧‧收集裝置
410D‧‧‧收集裝置
410E‧‧‧收集裝置
410F‧‧‧收集裝置
120E‧‧‧濃縮裝置
122‧‧‧入口
124‧‧‧微特徵
126‧‧‧過濾元件
128‧‧‧樣本出口
128A‧‧‧樣本出口
128B‧‧‧樣本出口
130‧‧‧導管
132‧‧‧閥
200‧‧‧方法
210‧‧‧步驟
220‧‧‧步驟
230‧‧‧步驟
240‧‧‧步驟
250‧‧‧步驟
260‧‧‧步驟
410G‧‧‧收集裝置
502‧‧‧抗垢組合物
504‧‧‧生物活性組合物
506‧‧‧連結組合物
510‧‧‧表面連結體
514‧‧‧細胞表面蛋白質
516‧‧‧膜層
518‧‧‧目標細胞
602‧‧‧頂部基板
606‧‧‧底部基板
610‧‧‧目標濃縮區域
622‧‧‧膜孔
626‧‧‧通道
628‧‧‧不想要之組分
為能詳細理解本發明之以上所引述特徵，可經由參考具體例更特定地描述簡要概述於上之本發明，其中一些具體例說明於附圖中。然而， 應注意附圖僅說明本發明之典型具體例，因此不應將其視為限制其範疇，因本發明可容許其他同等有效的具體例。
圖1A係根據本發明之一具體例整合於捕集及濃縮有興趣之生物物質之系統中之收集裝置及濃縮裝置的示意圖。
圖1B係收集及濃縮有興趣之生物物質之示例性系統之另一具體例的示意圖。
圖1C係收集及濃縮有興趣之生物物質之另一示例性系統之又另一具體例的示意圖。
圖2說明利用具有至少一收集裝置及至少一濃縮裝置之系統收集及濃縮有興趣之生物物質之方法之流程圖的一具體例。
圖3A係根據本發明之一具體例適用於圖1A-1C之系統中用來捕集及收集有興趣之生物物質之示例性收集裝置的俯視圖。
圖3B係根據本發明之另一具體例之另一示例性收集裝置的俯視圖。
圖3C說明根據本發明之一具體例之示例性收集裝置之各個組件之組裝的透視圖。
圖3D係根據本發明之一具體例之示例性收集裝置之微流體部分的橫截面圖，其顯示設置於微流體通道內之微結構(經由將基板表面蝕刻或雕刻成台面、凹穴、特徵等等形狀所形成)，該等微流體通道係藉由在收集裝置內將兩個或更多個基板層疊在一起所產生。
圖4A說明適用於圖1A-1C之系統中之示例性收集裝置之一具體例的俯視圖，該收集裝置具有複數個經形成為線條圖案的微結構。
圖4B說明根據本發明之另一具體例之另一示例性收集裝置之俯視圖，該收集裝置具有經形成為複數個線條的複數個微結構，該複數個線條又經形成為預設計的線條圖案。
圖4C說明根據本發明之另一具體例之另一收集裝置之俯視圖，該收集裝置具有經形成為複數個預配置線條的複數個微結構，該複數個預配置線條又經形成為另一預設計的線條圖案。
圖4D說明另一具體例的另一示例性收集裝置之俯視圖，該收集 裝置具有經形成為複數個預配置線條的複數個微結構，該複數個預配置線條又經形成為又另一預設計的線條圖案。
圖4E說明又另一具體例的示例性收集裝置之俯視圖，該收集裝置具有經形成為複數個預配置線條的複數個微結構，該複數個預配置線條又經形成為馬蹄形圖案。
圖4F說明又另一具體例的示例性收集裝置之俯視圖，該收集裝置具有經形成為複數個預配置魚骨狀線條的複數個微結構，該複數個預配置魚骨狀線條又經形成為馬蹄形圖案。
圖4G說明又另一具體例的示例性收集裝置之俯視圖，該收集裝置具有經形成為複數個預配置線條的複數個微結構，該複數個預配置線條又經形成為多重線條圖案，其入口及出口相互連接。
圖5A顯示根據本發明之各種具體例附著於收集裝置之表面上以與存於生物樣本中之有興趣之生物物質相互作用之示例性表面塗層的示意圖。
圖5B顯示根據本發明之另一具體例附著於收集裝置之表面上以與存於生物樣本中之有興趣之生物物質相互作用之另一示例性表面塗層的示意圖。
圖6A係根據本發明之一具體例適用於圖1A-1C之系統中用來濃縮有興趣之生物物質之示例性濃縮裝置的俯視圖。
圖6B係根據本發明之另一具體例之圖6A之示例性濃縮裝置之一部分的橫截面圖，其顯示濃縮裝置內之微特徵的側壁。
圖6C係根據本發明之另一具體例適用於圖1A-1C之系統中之另一示例性濃縮裝置的俯視圖。
圖6D係根據本發明之一具體例之圖6C之示例性濃縮裝置之一部分的橫截面圖，其顯示有興趣之生物物質移動通過濃縮裝置內之示例性過濾薄膜。
圖6E係根據本發明之一具體例適用於圖1A-1C之系統中之示例性濃縮裝置的俯視圖，其說明有興趣之生物物質移動通過濃縮裝置內之複數個微特徵，藉此將有興趣之生物物質濃縮至其出口之細分。
圖6F係根據本發明之另一具體例之圖6E之示例性濃縮裝置之一部分的透視側視圖，其顯示濃縮裝置內之微特徵及通道及其出口之細分。
圖6G係根據本發明之一具體例適用於圖1A-1C之系統中之另一示例性濃縮裝置的透視側視圖，其說明有興趣之生物物質移動通過濃縮裝置內之內部空間，藉此濃縮有興趣之生物物質。
圖6H係根據本發明之一具體例適用於圖1A-1C之系統中之另一示例性濃縮裝置之一部分的透視圖，其說明有興趣之生物物質移動通過濃縮裝置內之例示性過濾薄膜以濃縮有興趣之生物物質。
本發明之具體例大致提供一種用於收集可能以低的第一濃度存於生物樣本中之有興趣之生物物質的系統及其方法。有興趣之生物物質可經設置於系統內之收集裝置捕集，且生物樣本內之不想要之組分經移除(例如，經由利用洗滌緩衝液、溶液、及其他流體洗滌及沖洗系統等)。經捕集於收集裝置內之後，有興趣之生物物質可經釋放及以相當高純度收集成大於第一濃度之第二濃度(例如，濃度及/或純度富集至少10倍至50,000倍)。此外，有興趣之生物物質經傳遞至連結至系統內之收集裝置的濃縮裝置中，且有興趣之生物物質可經進一步濃縮至第三濃度。因此，於透過整合至少一個收集裝置及至少一個濃縮裝置之系統處理生物樣本後，以甚大於第一濃度之第三濃度以及以高度純化狀態獲得有興趣之生物物質，藉此有利於進一步分析所獲得之有興趣之生物物質。此處提供之系統尤其係呈簡單且靈活的形式，以提供小規模、適用於各種有興趣之生物物質、可容易處理而無需額外且複雜的儀器之優勢。
在一態樣中，系統係為兩部分微流體系統，其中液體、流體、溶液等流動通過微流體收集裝置(例如，微流體晶片等)內之複數個微結構的一或多個流動路徑，然後進入微流體濃縮裝置內之複數個微特徵的一或多個流動路徑，利用流體動力來驅動有興趣之生物物質及生物樣本之各種組分流動通過系統內之收集裝置及濃縮裝置。在另一態樣中，濃縮裝置可包括經配置以捕獲及濃縮有興趣之生物物質的一或多個薄膜過濾元件、目標濃縮區域、出口通道、或其組合。
在一具體例中，微流體濃縮裝置係直接連結至微流體收集裝置以形成整合封閉式系統。在另一具體例中，濃縮裝置係經由具有可選閥之導管連接至微流體收集裝置。舉例來說，不想要的材料(例如，不想要的蛋白質、血清、細胞、及其他來自生物樣本之組分及不想要的廢棄物、緩衝液及溶液)可經由三向閥轉向離開系統，因此經分離及棄置，而不流入濃縮裝置中，藉此確保所獲得之有興趣之生物物質的品質。此外，取決於連結至收集裝置與濃縮裝置之間之導管之閥的類型，可調整自收集裝置傳遞至濃縮裝置中之任何流體或溶液的流率。
可用於文中所述系統中之適宜的有興趣之生物物質(或目標生物物質)可包括，但不限於，罕見細胞、循環罕見細胞(CRC)、循環胎兒細胞、腫瘤細胞(例如，循環腫瘤細胞(CTC)、上皮腫瘤細胞、上皮指標陰性腫瘤細胞、及其類似物)、幹細胞(例如，循環幹細胞、腫瘤幹細胞、肝幹細胞及骨髓幹細胞等)、骨髓中之細胞、尿液、糞便或其他體液中之細胞、上皮細胞(例如，循環上皮細胞及其類似物)、循環內皮細胞、滋胚層細胞、細菌、病毒、病毒表面蛋白質、蛋白質、核酸、胎兒細胞、內皮細胞、及其組合。適宜的生物樣本尤其包括，但不限於，血液樣本、組織樣本、骨髓、尿液、排泄物、生物檢體樣本、及其組合，且係獲自包括人類或動物的來源。生物樣本內之不想要之組分尤其可包括，但不限於，白細胞、淋巴球、白血球、紅血球、血清蛋白質、血小板、各種血細胞或血液組分、非目標蛋白質、洗滌緩衝液或溶液、試劑、及任何非目標生物物質。
圖1A說明系統100，其大致包括整合在一起且流體相通以用來捕集、收集及濃縮有興趣之生物物質的收集裝置110及濃縮裝置120。其中具有有興趣之生物物質的生物樣本係以流體、液體、溶液或其他形式經由設置於收集裝置110之一部分上的樣本入口112傳遞至系統100中。生物樣本內之有興趣之生物物質可經捕集於收集裝置110內之一或多個表面上，洗滌，然後經由出口118釋放離開收集裝置。
於經捕集及自收集裝置110釋放後，有興趣之生物物質可經由導管130傳遞(例如，以流體流動及其類似形式)至濃縮裝置120之入口122中。視情況，可經由設置於導管130上之閥132監控或調整傳遞至濃縮裝 置120中之一或多個有興趣之生物物質的流體流動。有興趣之生物物質流動通過濃縮裝置120經濃縮至較高濃度，然後經由樣本出口128傳遞離開系統100。
圖1B-1C呈現根據本發明之各種具體例將收集裝置110及濃縮裝置120整合成用於收集及濃縮有興趣之生物物質之系統100的其他實例。在圖1B中，涵蓋可改變收集裝置110及濃縮裝置120之定位，只要兩裝置流體相通(例如，經由導管130連結在一起)即可。在圖1C中，收集裝置110及濃縮裝置120係連結在一起而無需導管，且來自收集裝置110之流體可直接流動及傳遞至濃縮裝置120中，即收集裝置110係與濃縮裝置120直接相通。系統100之材料並無限制，且系統100可由各種材料製成，包括，但不限於，聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚乙烯(PE)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、環烯烴共聚物(COC)、矽、玻璃、熱塑性材料、及其類似物。
此外，樣本入口112及出口118可經設計為位於收集裝置110內之不同位置(例如，如圖1A所示位在相對端)或大約相同部分(例如，如圖1B所示，以容易操作系統100)。同樣地，入口122及樣本出口128之位置可經設計位在濃縮裝置之不同部分(例如，如圖1A-1B所示)或大約相同部分以有助於操作系統100。
在一態樣中，收集裝置110包括一或多個其之一部分上附著有表面塗層的表面(例如，玻璃表面、塑膠表面等)。在另一態樣中，該表面塗層包括抗垢組合物(例如，脂質、脂質雙層、表面脂質雙層、脂質微脂粒等)及生物活性組合物。表面塗層之生物活性組合物特異性地與存於生物樣本內之有興趣之生物物質相互作用，以致收集裝置110自經傳遞至其中之生物樣本選擇性地收集有興趣之生物物質。
系統100之收集裝置110包括一或多個其上具有以一或多種圖案(例如，一或多個線條、馬蹄圖案、魚骨圖案、一或多個魚骨圖案線條、一或多個叢集微結構線條、及其各種組合等)配置之複數個微結構114的表面。在一態樣中，收集裝置110係微流體裝置。在另一態樣中，系統100進一步包括連接至收集裝置110之出口118及濃縮裝置120之入口122的 導管130。在另一態樣中，位於收集裝置110與濃縮裝置120之間的導管130係連結至可經組態以自生物樣本棄置一或多種不想要之組分(例如，血清、非特異性組分、及其他不想要的細胞及蛋白質等)的閥132。舉例來說，可棄置大部分的不想要之組分及防止其進入濃縮裝置120中。有興趣之生物物質可自表面塗層釋放及經運送至濃縮裝置120並被其接收。表面塗層之一實例係脂質雙層。
在一態樣中，系統100之濃縮裝置120包括複數個微特徵124(示於圖6A、6B、6E、6F)，其等係以位於濃縮裝置120之一或多個表面上的一或多種圖案配置且經組態以濃縮由濃縮裝置120自收集裝置110所接收之有興趣之生物物質518(示於圖5A、6A-6H)。在另一態樣中，濃縮裝置120內之複數個微特徵124尤其係以包括，但不限於，一或多個線條、馬蹄圖案、魚骨圖案、一或多個魚骨圖案線條、一或多個叢集微特徵線條、及其各種組合之圖案配置。
在一替代具體例中，系統100之濃縮裝置120包括位在樣本出口128附近適於收集有興趣之生物物質518的目標濃縮區域610(示於圖6B及6G)。在一態樣中，目標濃縮區域610係具有介於約1mm2與約100mm2之間(例如，介於約1mm2與約20mm2之間)之表面積的井。
在另一替代具體例中，系統100之濃縮裝置120之一或多個表面包括一或多個過濾元件126，諸如過濾薄膜。在一態樣中，至少一個過濾元件係空間配置在樣本出口128附近。在另一態樣中，至少一個過濾元件126包括夾在由一或多個室壁包圍之兩相鄰腔室之間的過濾薄膜，且係由選自由聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、環烯烴共聚物(COC)、矽、玻璃、熱塑性材料、及其組合組成之群之材料製成。
在又另一替代具體例中，系統之濃縮裝置包括空間配置在樣本出口附近之一或多個通道。本發明之另一替代具體例提供將一或多個薄膜過濾元件與複數個微特徵、目標濃縮區域、一或多個通道中之至少一者或其組合整合於系統之濃縮裝置內。
圖2說明利用文中所述之系統100收集及濃縮有興趣之生物物質 的方法200。首先，在方法200之步驟210，可藉由設置於收集裝置110內之一或多個表面上的表面塗層捕集以第一濃度存於生物樣本內之有興趣之生物物質。一般而言，存於生物樣本中之有興趣之生物物質的起始第一濃度可能相當低，以致若不透過文中所述之系統100或任何其他捕集或富集過程富集便無法利用一般的檢測檢定法來檢測。舉例來說，據估計於轉移性癌症患者中存在少至一個循環腫瘤細胞(CTC)/109個血細胞。經顯示在約7.5ml第四期轉移性癌症患者之血液樣本中可能存在約四(4)個CTC。此外，在健康受檢者中通常不存在諸如循環腫瘤細胞之罕見細胞。在此，系統100提供用來收集及濃縮以極低濃度存於癌症患者之血液樣本中之罕見細胞(諸如CTC)的高敏感性系統。
收集裝置110內之表面塗層一般可包括抗垢組合物及生物活性組合物。表面塗層可經安置、併入、或附著至基板之表面，該基板可包括載片內之含玻璃或塑膠材料、盤狀細胞培養皿、微流體通道、微流體晶片、過濾器、毛細管、管、珠粒、奈米微粒或其類似物。
一般而言，生物活性組合物提供對透過分子辨識、化學親和力、或幾何/形狀辨識檢測及結合有興趣之生物物質具有選擇性的結合部分。用於檢測生物物質之結合部分的實例包括，但不限於，合成聚合物、分子拓印聚合物、細胞外基質蛋白質、結合受體、抗體、DNA、RNA、抗原或任何其他對生物物質呈現高親和力的表面標記。
在一實例中，可使用諸如抗-EpCAM(上皮細胞黏著分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule))之抗體作為用於檢測有興趣之生物物質的生物活性組合物，該有興趣之生物物質諸如CRC及CTC，其係通常不存在於健康受檢者之血液樣本中，但可能由於腫瘤上皮細胞脫落至血液循環中而存於癌症患者之血液樣本中的上皮細胞。一種例示性抗體係抗-EpCAM膜蛋白質抗體(可購自許多來源，包括R&D Systems,MN,USA)，其對CTC提供高特異性，因EpCAM經常於肺部、結腸直腸、乳房、攝護腺、頭頸、及肝臟的惡性腫瘤中過度表現，但不存在於血液細胞中。另一例示性抗體係抗-HER2。可使用其他對細胞表面標記、病毒蛋白質、及各種目標蛋白質具特異性之抗體來偶合至抗垢組合物，以形成為塗布於收集裝置110內之一或 多個表面上的表面塗層。
表面塗層內之抗垢組合物係經選擇以提供其對收集裝置110之表面的結合親和力及其於收集裝置110之表面上的高移動性、以及其對蛋白質之低親和力。舉例而言，抗垢組合物之高移動性及流體特性可增進生物活性組合物與有興趣之生物基質之間(例如，在抗體及其特異性表面蛋白質抗原及其類似物之間)之特異性及協力結合及減少不想要的其他蛋白質於收集裝置110之表面上的吸附，因此可利用通過收集裝置110內之各種流體流動路徑的低剪切力來純化有興趣之生物基質。抗垢組合物可偶合至表面，諸如收集裝置110之一或多個固體表面，且佔據收集裝置110之表面以防止不想要之組分(例如，來自血液樣本之血細胞及血清蛋白質等)於收集裝置表面上之非特異性結合及吸附。抗垢組合物亦充作「潤滑」表面劑，以致可使用流體流動之低剪應力來自表面塗層洗去、移除、及/或棄置不想要的非特異性血細胞，同時使有興趣之生物物質保持完整且結合至表面塗層。
舉例來說，抗垢組合物可為脂質，諸如經負載的脂質雙層(SLB)，尤其包括1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-(封端生物素基(cap biotinyl))(鈉鹽)(b-PE)及1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(POPC)。抗垢組合物之其他實例包括脂質雙層、微脂體、多肽、聚電解質多層(PEM)、聚乙二醇(PEG)、水凝膠聚合物、細胞外基質蛋白質、碳水化合物、高分子刷、兩性離子材料(例如，聚(磺基甜菜鹼)(pSB)及聚(羧基甜菜鹼)(pCB))等、小的有機化合物、及其組合。適宜的PEM可包括聚-L-離胺酸/聚-L-麩胺酸(PLL/PLGA)共聚物、聚-L-離胺酸/聚-L-天冬胺酸共聚物、或類似的相對離子性聚電解質。適宜的高分子刷可包括氯化[2-(丙烯醯氧基)乙基]三甲基銨(TMA)及丙烯酸2-羧乙酯(CAA)之共聚物。適宜的PEG可具有自100至100,000之分子量且展現抗垢性質(對蛋白質之低親和力，拒斥或抵抗蛋白質)。抗垢組合物一般對蛋白質具有低親和力(拒斥或抵抗蛋白質)，其可由其在寬廣pH範圍內存在中性及兩性離子性磷脂醯膽鹼頭端基，且在親水性脂質頭端基與本體溶液之間形成水性薄膜來解釋(參見Johnson等人，Biophy J 1991，59：289-94)。一般而言，表面塗層可包括單層或多層抗垢組合物。 此外，抗垢組合物可形成自數奈米至數百微米之厚度。
抗垢組合物及生物活性組合物可偶合在一起或直接(例如，透過抗垢組合物及生物活性組合物之一或多個官能基，因此形成結合對)或間接(例如，透過連結組合物)連結。舉例來說，抗垢組合物、生物活性組合物、及連結組合物可具有相容的官能基，其等能夠透過共價結合相互作用、非共價相互作用、靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、DNA互補DNA結合相互作用、磁力、或其組合將此等組合物連結在一起。
在共價結合之前可能存在於抗垢組合物、生物活性組合物、及/或連結組合物上之官能基包括，但不限於，羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環氧基或環氧乙烷基、肼基及硫醇基。其他在非共價相互作用之前可能存在的官能基或部分包括特異性結合/辨識對，諸如生物素、抗生物素蛋白(avidin)、抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)、DNA、RNA、配體、受體、抗原及抗體與存於生物活性組合物上之結合對之第一成員及存於抗垢組合物及/或連結組合物上之結合對之第二成員的特異性結合辨識。特異性結合對之一實例使用互補DNA片段，其中第一股DNA係附著至生物活性組合物且與第一股DNA部分或完全互補之第二股DNA係附著至連結組合物或抗垢組合物。適宜的DNA長度可為15、20、25、35、50、100或更多個鹼基長度。連結組合物上之官能基亦可為可裂解官能基，包括，但不限於，可藉由紫外輻照裂解之光敏性官能基、可藉由電脈衝機制裂解之電敏性官能基、可藉由不存在磁力裂解之磁性材料、可藉由中斷靜電相互作用裂解之聚電解質材料、可藉由雜交裂解之DNA、及其類似官能基。
表面塗層之兩個實例顯示於圖5A-5B中。兩實例皆適用於自諸如血液樣本之生物樣本捕集諸如循環腫瘤細胞(CTC)、循環幹細胞等之循環罕見細胞(CRC)。在圖5A中，表面塗層大致包括生物活性組合物504、連結組合物506、及抗垢組合物502。根據本發明之各種具體例，表面塗層係附著於收集裝置110內之基板306的固體表面308上，以與存於生物樣本中之有興趣之生物物質(例如，目標細胞518)相互作用。
如圖5A所示，涵蓋生物活性組合物504且其經設計以特異地結合至有興趣之生物物質(諸如目標細胞518(例如，CRC、CTC))的細胞表面 蛋白質514。目標細胞518通常經膜層516(例如，內膜層及外膜層)封閉，且細胞表面蛋白質514位於其膜表面上。生物活性組合物504之厚度不會影響表面塗層的功能或效能。在一具體例中，抗垢組合物502及生物活性組合物504係藉由利用生物素/抗生物素蛋白作為官能基之結合對之連結組合物506的一個實例來結合。在另一具體例中，抗垢組合物502及生物活性組合物504係藉由EDC/NHS結合。在又另一具體例中，抗垢組合物502及生物活性組合物504係藉由磺基-SMCC結合。
細胞表面蛋白質514之實例可包括EpCAM膜蛋白質、HER2蛋白質、癌症標記、細胞激素、趨化激素(chemokines)、細胞表面受體、細胞激素受體、及其類似物。生物活性組合物504之一實例係抗-EpCAM抗體，諸如生物素化EpAb4-1單株抗體或藉由針對EpCAM膜蛋白質之肽序列培育而產生的生物素化OC98-1單株抗體。生物活性組合物504之另一實例係具有生物素官能基的生物素化抗-HER2抗體。當生物活性組合物504係生物素化抗體時，連結組合物506可係抗生蛋白鏈菌素(SA)，其可與生物活性組合物504之生物素結合部分相互作用。此外，連結組合物係偶合至抗垢組合物502。舉例來說，抗生蛋白鏈菌素(SA)可偶合至抗垢組合物504，例如，經負載的脂質雙層(SLB)。抗垢組合物502係附著至收集裝置110內之基板306的固體表面308。
圖5B顯示附著於收集裝置110內之基板306的固體表面308上，以與存於生物樣本中之有興趣之生物物質相互作用之另一示例性表面塗層。在圖5B中，表面塗層包括透過連結組合物506偶合至抗垢組合物502之生物活性組合物504，且可進一步包括表面連結體510以使抗垢組合物502連結至固體表面308。
表面連結體510可包括能夠非共價、共價或其組合，以直接連接至存於抗垢組合物502及/或基板306之固體表面308中之官能基的官能基。舉例來說，表面連結體510可包括可裂解官能基，諸如可藉由紫外輻照裂解之光敏性官能基、可藉由電脈衝機制裂解之電敏性官能基、在不存在磁力時釋放抗垢組合物502的鐵或磁性材料、可藉由中斷靜電相互作用裂解之聚電解質材料、可藉由雜交裂解之DNA、及其類似官能基。表面連 結體510之實例包括，但不限於，矽烷、胺丙基三乙氧基矽烷、胺丙基三甲氧基矽烷、矽烷-PEG-NH2、矽烷-PEG-N3(PEG分子量係約1000至約30000道爾頓)及矽烷-PEG生物素。
具有連結組合物之表面塗層可藉由使抗垢組合物(例如，SLB或PEG)與適宜官能基(例如，生物素)偶合及使連結組合物上之相應對之官能基(例如，抗生蛋白鏈菌素)連接至抗垢組合物上之官能基(例如，生物素)來形成。接下來，形成生物活性組合物，使其官能基(例如，生物素)連接至連結組合物上之官能基(例如，抗生蛋白鏈菌素)。不具有連結組合物之表面塗層可藉由形成具有適宜官能基(例如，NGPE)之抗垢組合物，及形成且使生物活性組合物上之官能基(例如，一級胺)連接至抗垢組合物上之官能基來形成。
回來參照圖2，在步驟210結束時，一旦有興趣之生物物質透過其與塗布於收集裝置110之一或多個表面上之表面塗層之生物活性組合物相互作用而經收集裝置110捕集，即將生物樣本內之不想要之組分自收集裝置110洗去(例如，透過緩衝液清洗，用洗滌緩衝液或其他溶液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液、流體等)沖洗)，及經由出口118傳遞離開收集裝置110。
經結合及捕集於表面塗層上之有興趣之生物物質可經由移除在抗垢組合物上或其附近之不想要的非特異性結合細胞及不想要的血液組分來進一步純化。由於抗垢組合物係經選擇為對非目標特異性細胞及其他血液組分具有低黏著親和力，因此低剪應力(例如，低於約15達因(dyne)/cm2)可能即足以移除在附著至收集裝置110之一或多個表面之抗垢組合物附近的非特異性血細胞及其他血液組分，同時有興趣之生物物質仍留在表面塗層上且間接偶合至收集裝置110之表面，而未被洗去。用緩衝溶液清洗表面塗層產生足以移除抗垢組合物上之非特異性結合材料的剪應力。
由測試在約3.3達因/cm2下之緩衝液洗滌流動之最佳剪應力的結果顯示可移除約80%的非特異性血細胞(即白血球)，同時沒有有興趣之生物物質(例如，HCT116癌細胞)自表面塗層被移除。不希望受限於理論，涵蓋藉由使微結構114以特定圖案配置且連接在一起而於收集裝置內形成流體 流動，可在通過收集裝置時產生血液、體液或生物樣本之擾動流動，且可提高有興趣之生物物質的捕集率。
在步驟220，有興趣之生物物質隨後自收集裝置110釋放。在一實例中，有興趣之生物物質係藉由在溶液或油相中引入氣泡以中斷抗垢組合物與生物活性組合物之偶合來自收集裝置110釋放。在另一實例中，藉由諸如利用UV輻射中斷抗垢組合物與生物活性組合物之偶合來達成釋放。
如抗垢組合物502包含脂質或脂質之混合物，則可藉由引入氣泡溶液來釋放經捕集之生物物質。舉例來說，有興趣之生物物質(諸如CRC及CTC)可結合至生物活性組合物504，而其他細胞則經抗垢組合物502拒斥。隨著氣泡接近抗垢組合物502之脂質雙層，脂質雙層之疏水性尾端由於其與氣泡中空氣(其亦為疏水性)之高親和力而變得上下顛倒。此中斷脂質雙層表面處之親水-親水相互作用且容許氣泡「離開」脂質雙層之頂層，同時帶走結合於生物活性組合物504上之CTC目標細胞。
如抗垢組合物包含除脂質或脂質之混合物外的組合物，則可藉由中斷連結組合物或表面連結體中之可裂解官能基來釋放經捕集之生物物質。可將釋放機制之一實例應用於具有含可裂解官能基之連結組合物的表面塗層中。當目標CTC細胞結合至生物活性組合物，且表面塗層附著至固體基板時，不想要的非目標細胞可經抗垢組合物拒斥。具有含可裂解官能基之連結組合物的表面塗層可經(例如)365nm紫外光輻照，其裂解連結組合物上之可裂解官能基且釋放CTC供隨後分析用。
有興趣之生物物質亦可藉由其他機制來釋放。舉例來說，如連結組合物或表面連結體包含電敏性官能基，則生物物質可藉由電脈衝機制來釋放。如連結組合物或表面連結體包含磁性材料，則不存在磁場或磁力將釋放生物物質。如連結組合物或表面連結體包含PEM，則生物物質可藉由改變層間的靜電相互作用來釋放。如連結組合物或表面連結體包含DNA片，則有興趣之生物物質可藉由DNA雜交來釋放。
在步驟230，自收集裝置110釋放之有興趣之生物物質經由通過出口118及入口122而傳遞至濃縮裝置120中。有興趣之生物物質之遞送可經一或多種流體、緩衝液或溶液之流動輔助，而將有興趣之生物物質以 第二濃度運送至濃縮裝置120中。一般而言，有興趣之生物物質之第二濃度甚大於起始第一濃度；例如，就罕見細胞相對總有核細胞之數目而言，可有高至10倍至50,000倍的差異。
在步驟240，有興趣之生物物質可經濃縮裝置120濃縮至第三濃度，藉此以高純度及量獲得有興趣之生物物質。在一具體例中，第三濃度係大於存於生物樣本中之有興趣之生物物質的第一濃度。在另一具體例中，獲自濃縮裝置120之有興趣之生物物質的第三濃度係大於自收集裝置110釋放之有興趣之生物物質的第二濃度。此等具體例中之濃度可係指罕見細胞相對總有核細胞之數目或每單位液體體積之罕見細胞數目。
視需要，於步驟250，可將所獲得之有興趣之生物物質於(例如)經補充抗生素(諸如盤尼西林、鏈黴素、慶大黴素(gentamicin)等)之含血清培養基中進行培養。舉例來說，可利用5mM EDTA緩衝溶液(亦可使用其他緩衝液)將濃縮裝置120內之目標細胞518於37℃下培養5至10分鐘，然後經由使培養基流入系統100中而釋放。此外，可於培養溶液中添加胰蛋白酶或其他蛋白酶、酵素。或者，可藉由氣泡沖洗使有興趣之目標細胞直接自收集器110釋放並收集。可將所獲得之目標細胞連同含血清培養基及抗生素(盤尼西林+鏈黴素+慶大黴素)一起置於48孔聚苯乙烯組織培養盤上進行細胞培養。已獲得培養18個目標CTC細胞(例如，colo205細胞)長達至少10至14天的結果。結果顯示自系統100獲得之有興趣之生物物質(諸如目標CTC)仍保有其生存力可供隨後細胞培養用。
另外，在步驟260，可進行一或多項檢測、表徵、計算、免疫染色、檢驗、成像、培養、分子分析、及/或其他檢定，以進一步定性及定量地檢驗及表徵有興趣之生物物質。示例性的檢定包括，但不限於，利用生物標記進行免疫螢光染色、PCR、qPCR、RT-PCR或次世代定序(NGS)。
圖3A-3B提供可置於圖1A-1C之系統100內用來捕集及收集有興趣之生物物質之收集裝置110A、110B之兩實例的俯視圖。收集裝置110A、110B可包括複數個微結構114(例如，溝渠、通孔、孔洞、凹穴、溝槽、傾斜溝槽、台面、及其他可為微米尺寸或其他尺寸之特徵等)。微結構114可經蝕刻或雕刻且形成於收集裝置(例如，收集裝置110、110A、110B 等)之一或多個表面上，並可以各種圖案配置。
在圖3A中，複數個微結構114係以線條圖案形成及配置，例如，微結構114之叢集分4列配置。在圖3B中，複數個微結構114係以線條魚骨圖案形成及配置，例如，微結構114之叢集以魚骨形狀配置並形成為2列，其隨後再連接成4組。
圖3C說明收集裝置(諸如微流體晶片裝置300)之各個組件之組裝的透視圖。微流體晶片裝置300大致包括樣本入口112、出口118，其連結至於其表面上雕刻有微結構114之圖案的基板302。基板302係與黏著層304一起黏著至基板306。舉例來說，基板302之底表面可附著至基板306之頂表面，使黏著層304夾於其間，因而形成微流體流動路徑(例如，形成於收集裝置內之流體流動通道)之高度。
基板302、306尤其可由包括，但不限於下列之材料製成：羥基化聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、玻璃、金屬、塑膠、矽晶圓、及其組合。基板302、306之形狀可變化且可為平面、圓形、或不規則。在抗垢組合物502包含經表面連結體矽烷官能化之PEG的實例中，基板306之固體表面308可包括諸如矽、玻璃、羥基化聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、氧化鋁、TiO2及其類似物的材料。此外，基板302、306可包括其他微米或奈米結構，諸如奈米微粒、奈米線、及其組合。
黏著層304被切割成對應於基板302之表面(例如，底表面)上之複數個微結構114之圖案的形狀，以容納複數個微結構114之圖案並形成為複數個密封流體通道(由複數個微結構114之尺寸及黏著層304之經切割部分之厚度成形)。舉例來說，黏著層304可經切割成一或多個圖案或形狀(例如，如圖3C中所圖解顯示的馬蹄形)以形成一或多個流體通道305。在一態樣中，黏著層304之經切割部分的圖案可對應於基板302上之複數個微結構114的整體圖案及形狀。黏著層304之一實例係厚度小於0.1mm(諸如約63μm)之3M膠帶(購自3M,USA)。一旦形成收集裝置，即可將具有或不具有表面連結體之表面塗層附著至一或多個固體基板之一或多個表面(例如，基板302、306或黏著層304之表面)。
圖3D係沿微流體晶片裝置300之短邊部分(寬度)切割穿越”C”部 分之微流體晶片裝置300之微米尺寸部分的橫截面圖。如圖3D所示，微結構114之側壁的尺寸及高度及黏著層304之切割圖案及厚度可界定微流體晶片裝置300內之複數個流體通道305的尺寸、形狀、及高度。舉例來說，複數個微結構114之尺寸可具有介於約50mm及約120mm之間之長度、介於約1.5mm及約5.5mm之間之寬度、及約30-120μm之高度。
如圖3C-3D所示，於基板302表面上之複數個微結構114之切割部分(高度)之寬度及方向可垂直於流動方向，且在血液、體液或生物樣本通過微流體晶片裝置300內之密封通道時產生其等之混沌或擾動流動。擾動流動增進表面塗層與有興趣之生物物質之間的接觸。兩項因素決定微流體晶片裝置於捕集有興趣之生物物質方面的效用。首先，血液、體液或生物樣本之流率可能影響生物物質與表面塗層之接觸時間。經顯示約0.1-1ml/hr(諸如約0.5ml/hr)之流率可確保生物物質與表面塗層之最大結合。其次，由基板306之固體表面308上之微結構114所產生之流體流動的擾動亦會影響捕集效率。擾動會增加有興趣之生物物質與表面塗層之間的接觸時間。
在一具體例中，使用具有大表面積之收集裝置110來進行收集過程及使有興趣之生物物質之捕集敏感度最大化，而不考慮成像效率。舉例來說，藉由使收集裝置之表面積增加4倍(例如，增加其表面上之微結構114之數目)，收集裝置110之操作時間降低75%，同時可增加經捕集之有興趣之生物物質的總數。
圖4A-4G說明已形成於固體基板上且經測試以確定收集裝置410A-410G之捕集效率之微結構114的各種雕刻圖案。在圖4A中，適用於圖1A-1C之系統100之收集裝置410A包括複數個經形成為線條圖案之微結構114。在圖4B中，收集裝置410B包括複數個經形成為預設計線條圖案之微結構114，即將微結構114形成為一組雙線條，其又形成為一大組單一線條。在圖4D中，將收集裝置410D之複數個微結構114形成為三線條及雙線條之群組，其又形成為又另一預設計線條圖案。在圖4E中，將收集裝置410E之複數個微結構114形成為三線條及雙線條之群組，其又形成為馬蹄圖案。在圖4F中，將收集裝置410F之複數個微結構114形成為魚骨線條之群組，其又形成為線條魚骨圖案化群組及最終形成為馬蹄圖案。在 圖4G中，收集裝置410G包括經形成為預配置線條之群組的複數個微結構，其又形成為4列圖案。
測試收集裝置410A-410G對經摻入血清或血液樣本中之不同癌細胞株的捕集效率。捕集率係定義為經捕集之有興趣之生物物質相對測試樣本中之原始生物物質的百分比。收集裝置410G具有最佳的微結構114之圖案配置，其達成最高的生物物質捕集率。
圖6A-6H顯示適用於圖1A-1C之系統100中用來濃縮有興趣之生物物質之濃縮裝置120的實例。系統100之濃縮裝置120可包括以一或多個圖案配置的複數個微特徵124，其係設置於濃縮裝置120之一或多個表面上且經組態以濃縮由濃縮裝置120自收集裝置110接收之有興趣之生物物質518。
圖6A係濃縮裝置120A之一實例之俯視圖。圖6B係圖6A之濃縮裝置120A之一部分之橫截面圖，其顯示微特徵124之側壁。流體、樣本、緩衝液、及溶液可以主要流體流動自入口122傳遞通過樣本出口128。根據本發明之另一具體例，主要流體流動之方向係夾於濃縮裝置120內之頂部基板602與底部基板606之間。
濃縮裝置120內之複數個微特徵124可包括溝渠、通孔、孔洞、凹穴、台面、溝槽、傾斜溝槽、及其他可為微米尺寸或其他尺寸之特徵等，且尤其以包括，但不限於下列之圖案配置：一或多個線條、馬蹄圖案、魚骨圖案、一或多個魚骨圖案線條、一或多個叢集微特徵線條、及其各種組合。
不希望受限於理論，涵蓋微特徵124之圖案於濃縮裝置內提供定向流體流動路徑，其中來自生物樣本之細胞、蛋白質及其他組分於流體動力下經運送及傳遞通過微特徵124之通道。在一實例中，微特徵124之魚骨圖案可幫助驅動有興趣之生物物質518朝向濃縮裝置120A內之魚骨尖端移動，藉此將有興趣之生物物質濃縮於魚骨中心尖端區域中。此外，由於有興趣之生物物質518及不想要之組分628之尺寸及重量的差異，因此使用流體動力來驅動流體流動及將有興趣之生物物質518運送至目標區域或位置(例如，目標濃縮區域610)之複數個微特徵124內之淨驅動力將達到平 衡及固定其運送目標(例如，有興趣之生物物質518)，藉此將有興趣之生物物質518濃縮及收集於濃縮裝置120A內之一個細分或一個區域中。
可使用微特徵124之圖案來引導一或多個有興趣之生物物質518的流動。來自生物樣本或洗滌緩衝液之不想要之組分628可流動及經一或多個流體流動運送而經由樣本出口128流出濃縮裝置120A，藉此針對有興趣之生物物質518及不想要之組分628產生不同的流動路徑。
在一具體例中，複數個微特徵124可幫助將有興趣之生物物質518傳遞至目標濃縮區域610及將有興趣之生物物質518侷限於其中。經累積及滯留於目標濃縮區域610之表面上的有興趣之生物物質518稍後可經取出(例如，使用吸管或其他構件)及/或帶出濃縮裝置120。目標濃縮區域610可形成於樣本出口128附近，且其適於收集有興趣之生物物質518。在一態樣中，目標濃縮區域610係具有介於約1mm2與約100mm2之間(例如，介於約1mm2與約16mm2之間，或介於約1mm2與約20mm2之間)之表面積的井。目標濃縮區域610之深度可變化，諸如介於數微米至底部基板606之厚度之間。
由於微特徵124將有興趣之生物物質518之流動引導朝向中線，因此有興趣之生物物質518的濃度在目標濃縮區域610附近的中心區域周圍最高。將濃縮裝置120用於有興趣之生物物質的濃縮過程可包括使用設置於表面(例如，濃縮裝置之頂部之底表面)上之微特徵124來排列有興趣之生物物質，及捕獲或濃縮有興趣之生物物質。
圖6C顯示根據本發明之另一具體例適用於圖1A-1C之系統之另一實例的濃縮裝置120B。圖6D係圖6C之濃縮裝置120B之一部分的橫截面圖。濃縮裝置120B可包括設置於濃縮裝置120B附近任何位置處(諸如接近有興趣之生物物質518之流動路徑)的一或多個過濾元件126(諸如過濾薄膜)。
一般而言，一或多個過濾元件126可水平及/或垂直地安置於濃縮裝置內。可引導有興趣之生物物質518自過濾元件126之頂表面移動至過濾元件126之底表面，及/或自濃縮裝置120之頂表面移動至濃縮裝置120之底表面。在一具體例中，可將過濾元件126設置在鄰近於濃縮裝置 120A之目標濃縮區域610。
如圖6C所示，過濾元件126可包括膜孔622或穿孔，其中可使用膜孔622之尺寸來滯留有興趣之生物物質518(只要選擇膜孔622之尺寸(截止尺寸)使其小於有興趣之生物物質518的尺寸即可)，使來自樣本或流體流動之不想要之組分628通過膜孔622，因而將有興趣之生物物質518濃縮於過濾元件126之表面上。舉例來說，過濾元件126可包含許多直徑尺寸約2微米至約8微米之膜孔622來作為過濾器。過濾元件可水平或垂直地設置。如圖6D所示，自入口122之流體流動係在平行於離開樣本出口128之流體流動的路徑上，因而有助於自樣本或流體流動移除不想要之組分628，及將有興趣之生物物質518濃縮於過濾元件126之表面上。過濾元件126尤其可由包括聚乙烯(PE)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(pMMA)、環烯烴共聚物(COC)、聚二氟亞乙烯(PVDF)、聚醚碸(PES)、纖維素酯、PTFE、耐綸、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、矽、及玻璃之材料製成。
濃縮裝置之過濾元件126可夾於PDMS與PMMA基板之間，以形成由過濾元件126隔開的兩相鄰腔室。頂部PMMA基板可具有將流體樣本引入至上方腔室中之入口，而底部PMMA基板具有使經過濾之流體樣本自底部腔室釋放的出口。PDMS基板具足夠撓性來密封兩腔室以防止流體洩漏，因而使其實質上無電元件或可脫離的機械部件，而降低製造成本，且使可能不利地影響所獲得CTC目標細胞之生存力的電化學反應減至最小。
不希望受限於理論，涵蓋使用一或多個以下機制來排列及捕獲有興趣之生物物質：基於尺寸之過濾(參見Tan SJ等人，「用於檢測來自癌症患者周邊血液之循環腫瘤細胞的多功能免標記生物晶片(Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients)」，Biosensors and Bioelectronics，2010，1701-1705，其以全文引用的方式併入本文中)、介電泳(參見Hsiung LC等人，「透過介電泳使細胞均勻圖案化的平面指叉式環形電極陣列(A planar interdigitated ring electrode array via dielectrophoresis for uniform patterning of cells)」， Biosensors and Bioelectronics.2008，869-875，其以全文引用的方式併入本文中)、流體動力(諸如慣性聚焦；參見Bhagat AAS等人，「使用彎管流及差異遷移於螺旋形微通道中之連續微粒分離(Continuous particle separation in spiral microcharmels using Dean flows and differential migration」，Lab on a Chip.2008 Nov；8(11)：1906-14，其以全文引用的方式併入本文中，及魚骨結構)、沈降及其類似機制。使用流體動力之流體動力濃縮過程的一實例說明於如圖6A-6B所示之濃縮裝置120A中，且基於尺寸之過濾過程說明於如圖6C-6D所示之濃縮裝置120B中。
圖6E係適用於圖1A-1C之系統100中之濃縮裝置120C的俯視圖。濃縮裝置120C可包括一或多個空間配置在樣本出口128附近的通道626。通道626係經設置用來滯留及幫助將有興趣之生物物質518濃縮在中心區域附近。圖6F係濃縮裝置120C之一部分的透視側視圖，其顯示微特徵114及通道626之側壁。藉由經滯留及收集在中心區域中，可容易地回收有興趣之生物物質518供進一步分析用。不想要的組分628可經由通道626棄置及自濃縮裝置120C移除。
本發明之另一具體例提供將一或多個薄膜過濾元件與複數個微特徵、目標濃縮區域、一或多個通道中之至少一者或其組合整合於系統之濃縮裝置內。在一態樣中，至少一個過濾元件空間配置於樣本出口128附近。在另一態樣中，至少一個過濾元件126包括夾在經一或多個室壁包圍之兩個相鄰腔室之間的過濾薄膜，且係由選自由下列組成之群之材料製成：聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、環烯烴共聚物(COC)、矽、玻璃、熱塑性材料、及其組合。
圖6G係適用於圖1A-1C之系統100中之濃縮裝置120C的透視側視圖。在圖6G中，顯示有興趣之生物物質移動通過濃縮裝置內之內部空間，且有興趣之生物物質518經濃縮及滯留於目標濃縮區域610中。不想要之組分628流動且經由通過一或多個過濾薄膜126自濃縮裝置120D棄置。
圖6H顯示另一實例且係適用於圖1A-1C之系統100中之濃縮裝 置120E之一部分的透視圖。在圖6H中，自收集裝置110接收之流體進入且通過過濾元件126之膜孔622，以致有興趣之生物物質518可滯留於過濾元件126之表面上，藉此將有興趣之生物物質518濃縮於其上。
本發明之系統100的收集及濃縮裝置可於非常小的表面(諸如目標濃縮區域610之表面或過濾元件126之表面)上捕集、釋放、收集及濃縮有興趣之生物物質。此改良濃縮後分析之效率，因與市售微流體晶片所需之數千個影像相比，小的表面僅需要放大約10至約100倍的影像。此外，此等有興趣之生物物質經濃縮及捕集於其上之小表面多半為平坦表面。此種平坦表面設計免除z維度掃描之需求，改良識別焦平面的能力而無需特殊的演算法，且使模糊影像減至最少。結果，使經捕集、濃縮、及/或獲得之生物物質之結果成像以供進一步分析用的時間自數小時(其他類型市售微流體晶片通常所需者)有效地減少至僅數分鐘(例如，約1至20分鐘或更短)。
有興趣之生物物質經重力濃縮及捕獲於濃縮裝置之目標濃縮區域610中，因此，避免固定及離心(其可能影響細胞生存力)來用於隨後的免疫染色、檢驗、表徵、分子分析、及/或其他檢定及分析。因此，藉由使用如文中所述具有收集裝置110及濃縮裝置120之系統100，可使用文中所述之系統及方法自生物樣本獲得高產率(例如，高濃度或高細胞數目)及高純度、及在捕集、收集及濃縮有興趣之生物物質方面具高敏感度及高特異性的一致系統效率。
實施例
以下實施例進一步說明本發明。此等實施例僅意欲說明本發明，而不應解釋為具限制性。
實施例1：雙層表面塗層之製備
抗垢組合物之製備：經由在乾淨的玻璃管中將POPC及b-PE(可購自Avanti Polar Lipids,USA)以5mg/mL之最終脂質濃度溶解於氯仿中來製備經負載的脂質雙層(SLB)。經由使POPC/b-PE溶液於緩慢氮氣流下渦旋乾燥，而形成均勻的POPC/b-PE薄膜。使POPC/b-PE膜於真空室中乾燥過夜以移除殘留的氯仿。將經乾燥的POPC/生物素-PE膜分散於含10mM磷 酸鹽緩衝鹽水、150mM氯化鈉水溶液、及0.02%(w/v)疊氮化鈉(NaN3，可購自Sigma-Aldrich,USA)之磷酸鹽緩衝液中並與其混合，將pH調整至7.2。在室溫於150psi下將混合溶液過濾通過100nm、隨後50nm的Nuclepore®徑跡蝕刻聚碳酸酯薄膜(Whatman Schleicher & Schuell,Germany)至少10次。使經過濾的溶液通過LIPEXTM Extruder(Northern Lipids,Inc.Canada)，以產生單層微脂粒的均勻族群。經動態雷射光散射(Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments,Germany)測定，POPC/生物素-PE微脂粒之尺寸約為65±3nm。
經由將PLGA(MW=3000-15000)(Sigma,USA)或PLL(MW=15000-30000)(Sigma,USA)溶解於含有150mM NaCl之10mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)中來製備得聚電解質多層(PEM)膜。多肽之濃度為1mg/mL。在室溫下將tPLL於1mL PLGA相對離子性溶液中浸泡10分鐘來形成t-(PLL/PLGA)1。於偶合反應後，用pH 7.4 Tris-HCl緩衝液洗滌樣本以移除任何未偶合的多肽。依照相同的偶合/洗滌循環，製備一系列的t-(PLL/PLGA)i(i=1至7.5)膜，其中i=1係指t-(PLL/PLGA)1，i=1.5係指t-(PLL/PLGA)1-PLL，依此類推。
生物活性組合物之製備。使用由Chen等人(Clin Vaccine Immunol 2007；14：404-11)所述之方法產生的抗-EpCAM單株抗體(OC98-1或EpAb4-1)製備得生物素化EpCAM抗體。將抗體溶解於含有10mM PBS及150mM NaCl、pH約7.2的緩衝溶液中。經Nanodrop 1000光譜儀(Thermo Scientific,USA)測定，抗體緩衝溶液之濃度約為0.65mg/mL。將抗體緩衝溶液與10mM Sulfo NHS-LC-Biotin混合(以1比10之莫耳比)，並在室溫下於Milli-Q水(Milli-Q RO system,USA)中溶解30分鐘。經由在4℃下於磷酸鹽緩衝鹽水中透析，且每隔12小時更換緩衝液來移除過量的生物素。使用生物素定量套組(Pierce,USA)經HABA檢定法測定，生物素化抗體(bOC98-1或bEpAb4-1)具有1.5莫耳生物素比1莫耳抗體之比例。或者，可自R and D Systems(Minneapolis,MN)獲得生物素化山羊抗人類抗-EpCAM抗體。
固體基板之製備。將玻璃顯微鏡蓋片(可購自Deckglaser,Germany)用10% DECON 90(Decon Laboratories Limited,England)清潔，用Milli-Q水 清洗，於氮氣下乾燥，及於電漿清潔器(Harrick Plasma,Ithaca,NY,U.S.A.)中在100mtorr下暴露至氧電漿歷時10分鐘。玻璃基板係於經乙醇清洗及於氮氣流下乾燥後立即使用。
將基於氧化矽的固體基板(例如，矽晶圓或玻璃蓋片)以食人魚溶液(70%硫酸及30%過氧化氫(v/v))在120℃下清潔40分鐘，以蒸餾水洗滌及以丙酮清洗。將固體基板於氮氣流下乾燥及以電漿清潔器處理。為進行氣相矽烷化反應，將乾淨的氧化矽基板及含有150μL 3-(胺丙基)三乙氧矽烷(Sigma,USA)之培養皿置於處於~0.3Torr減壓下之乾燥器(Wheaton乾式密封乾燥器，100nm)中歷時16小時。將基板用丙酮清潔及用氮氣流乾燥。
於固體基板上構造SLB表面塗層。將0.25mg/ml來自段落[0078]之POPC/b-PE微脂粒混合物添加至經清潔的固體基板以形成經負載的脂質雙層(SLB)，隨後再用含10mM PBS及150mM NaCl之磷酸鹽緩衝液(pH=7.2)大量清洗，以移除過量的POPC/b-PE微脂粒。將0.1mg/mL之抗生蛋白鏈菌素(SA)溶液(可購自Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)添加至經SLB塗布的固體基板並培養1小時，隨後用PBS緩衝液清洗以移除過量的SA溶液。將約0.05mg/mL之b-抗-EpCAM溶液添加至經SA-SLB塗布之固體基板以形成本發明之表面塗層。
於固體基板上構造PEG表面塗層。將生物素化PEG矽烷溶液(Si-bPEGs)添加至乾淨的基板並培養1小時以於固體基板上形成Si-bPEG抗垢組合物，隨後進行乙醇清洗以洗去過量的Si-bPEGs。將0.1mg/mL之SA溶液添加至經Si-bPEGs塗布的固體基板並培養1小時，隨後進行PBS緩衝液清洗以移除過量的SA。添加0.05mg/mL之b-抗-EpCAM溶液並使其與SA-Si-bPEGs表面塗層結合，隨後進行PBS緩衝液清洗以移除過量的b-抗-EpCAM。
SLB表面塗層之QCM-D表徵。利用含消散的石英晶體微量天平(QCM-D)監測表面塗層之構造。圖11之QCM-D響應顯示經SiO2預處理之石英晶體上之表面塗層的構造。首先，將0.25mg/ml之POPC/b-PE微脂粒混合物(存於磷酸鹽緩衝液中)在點(I)處分配至QCM室中。正規化頻率變化F及消散位移(dissipation shift)D分別為26.0±0.7Hz及0.19±0.03 x 10-6，其 係高度均勻脂質雙層之特徵。於兩次緩衝液洗滌(指示為*)後，在點II處分配0.1mg/mL之抗生蛋白鏈菌素(SA)溶液。SA結合在F=52.8±5.4Hz及D=3.84±0.54 x 10-6處達到飽和。在點(III)，將0.025mg/mL之OC98-1抗體溶液分配至QCM室中，且沒有頻率或消散變化。此顯示在OC98-1抗體與SA脂質雙層表面之間沒有相互作用。相對地，在點(IV)添加生物素化抗體溶液(bOC98-1或bEpAb4-1)導致頻率及消散變化，且平衡位移F=39.4±6.8Hz及D=1.63±0.28 x 10-6。此證實生物素化抗體與SA-脂質雙層表面結合。
使用QCM-D檢驗表面塗層上之SLB抗垢組合物的特徵(圖12)。將牛血清白蛋白(BSA，可購自Sigma-Aldrich,USA)添加至表面塗層且頻率及消散發生突變，其中平衡位移F=6.9Hz及D=3.35 x 10-6。此指示立即的BSA吸附。緩衝液清洗導致頻率增加及消散減少，其中飽和位移F=6.1Hz及D=3.16 x 10-6。此指示經吸附的BSA可輕易地自表面塗層移除且BSA與SLB的相互作用極弱。
實施例2：微流體晶片之製備
可藉由使用商業的CO2雷射劃線器(Helix 24,Epilog,USA)來雕刻微溝渠，以於PMMA基板上形成微結構而製備得微流體晶片。將微流體晶片、螺帽、PMMA基板及載玻片用MeOH、清潔劑及水清潔，隨後再進行10分鐘超音波震盪。將螺帽及固體基板用氮氣乾燥並於60℃下烘烤10分鐘。藉由氯仿處理使PMMA基板與螺帽結合。使用黏著劑(例如，來自3M,USA之3M膠帶)將PMMA基板及載玻片結合在一起。利用塑膠尖頭刮擦經組裝的晶片以擰緊經結合的組件。
實施例3：CTC與表面塗層之結合
使用總共8個血液樣本來測定實施例2中微流體晶片之表面塗層的CTC捕集效率。各血液樣本包含2ml來自第IV期結腸癌患者之血液樣本，且該樣本係經注射泵控制，以0.5ml/hr引入微流體晶片之密封通道中。隨後用0.5ml PBS緩衝液以1ml/h之流率清洗微流體晶片中之密封通道，接著進行原位免疫染色。
比較緩衝液清洗之前及之後的表面塗層。在緩衝液清洗前，表面塗層經非特異性血細胞(左上方之低濃度紅色螢光)及四個CTC(左下方之紅 點)覆蓋。於緩衝液清洗後，幾乎所有非特異性血細胞皆經移除(右上方)，但四個CTC(右下方)殘留於表面塗層上。此8個樣本中每ml血液所捕集的CTC數目為26、34、36、39、47、67、79、及99。25%的血液樣本具有79或更高的CTC計數，及中間CTC計數為43/ml。於緩衝液清洗後非特異性血細胞有最小的結合。作為比較，FDA認可之Veridex CellSearch的CTC計數如下：25%的樣本具有3個或更多個CTC/7.5ml之測試樣本，及中間CTC計數為0。結果顯示本發明之表面塗層可有效捕集CTC及降低非特異性細胞結合。
實施例4：各種表面狀況之捕集效率及抗垢性質的比較
比較六種不同表面狀況之HCT116細胞(生物物質)的捕集效率及對非特異性血細胞(白血球或WBC)之抗垢性質。結果顯示本發明之表面塗層(脂質/SA/b-抗-EpCAM及PEG(15mM)/SA/b-抗-EpCAM)對於捕集生物物質及降低非特異性血細胞於表面塗層上之結合更有效。
實施例5：經由流動純化
差異的流動剪力可基於非特異性血細胞對抗垢組合物之親和力選擇性地「沖」出此等細胞，同時生物物質仍保留在表面塗層上。在此研究中，表面塗層包含SLB、連結組合物及作為生物活性組合物的纖維黏結蛋白(fibronectin)。使來自兩細胞株(纖維母細胞3T3及結腸癌細胞株HCT116)之細胞於表面塗層上培養4小時。用具有3達因/cm2之剪應力的緩衝溶液清洗表面塗層。
HCT116細胞在緩衝液清洗的5分鐘內被自表面塗層沖掉。纖維母細胞3T3細胞由於其與纖維黏結蛋白之特異性結合親和力，因而於30分鐘之緩衝液清洗後仍保留於表面上。結果顯示約3達因/cm2之低剪應力足以純化表面塗層上之生物物質。比較各別剪應力及沖洗時間對HCT116及NIH-3T3細胞族群(非特異性血細胞)的結果。N/N0係使用各種剪應力保持附著於表面塗層上之細胞的百分比。N係最終細胞數目及N0係起始細胞數目。
實施例6：CTC自表面塗層之釋放
經由引入氣泡使實施例3中於表面塗層上之經捕集CTC釋放。結果顯示使用氣泡方法CTC於3秒內自表面塗層移除。
實施例7：自表面塗層釋放之癌細胞的培養
用5mM之EDTA使經捕集之癌細胞於37℃下培養5至10分鐘，及經由使培養基流入至微流體晶片之密封通道中而使其釋放。將總計約18個經釋放的colo205細胞、連同含血清培養基及抗生素(盤尼西林+鏈黴素+慶大黴素)一起置於48孔聚苯乙烯組織培養盤上進行培養。經釋放colo205細胞培養之結果顯示自表面塗層釋放之colo205細胞在第10天及第14天保有其對於後續細胞培養的生存力。
實施例8：通過CTC過濾裝置捕集CTC
可將任何薄膜、管、毛細管、或通道塗布表面塗層。可使用過濾裝置，其中將過濾器塗布表面塗層。過濾器可容納大量的血液流動且捕集生物物質供診斷或治療目的用。為取得患者的血液或體液，將導管插入患者的靜脈或瘻管中，且使患者血液流過CTC過濾裝置，其中過濾器上之表面塗層捕集CTC。經過濾的血液隨後流回患者體內。
雖然前述係關於本發明之具體例，但可設想本發明之其他及進一步的具體例而不脫離其基本範疇，且其範疇係由隨後之申請專利範圍所決定。
200‧‧‧方法
210-260‧‧‧步驟

Claims (16)

  1. 一種用於富集來自一生物樣本之循環腫瘤細胞(CTC)的微流體系統，該微流體系統包括：一收集裝置，該收集裝置包括：(a)一樣本入口，該樣本入口在該收集裝置的一近端處經組態以接收一第一濃度的CTC；(b)一流體通道，該流體通道流體連結至至該樣本入口，其中該流體通道包括一或多個表面以及一表面塗層，該一或多個表面包括實質上與一主要流體流動方向垂直的複數個微結構，該表面塗層附著至該一或多個表面的一部分，其中該表面塗層包括：(1)一抗垢脂質雙層組合物；及(2)一抗體，該抗體選擇性結合至存於該生物樣本內之CTC；以及(c)一出口，該出口在該收集裝置的一遠端；一三向閥，該三向閥與該收集裝置流體相通，該三向閥包括：(a)一閥入口，該閥入口流體連結至該收集裝置的該出口；(b)一第一閥出口，該第一閥出口用於送走不想要的材料；以及(c)一第二閥出口，其中該三向閥進一步包括一第一狀態及一第二狀態，其中在該第一狀態，該三向閥容許來自該收集裝置的流體流動通過該第一閥出口而不是該第二閥出口，以及其中在該第二狀態，該三向閥容許來自該收集裝置的流體流動通過該第二閥出口而不是該第一閥出口；一濃縮裝置，該濃縮裝置與該三向閥流體相通，其中該濃縮裝置經組態以接收一第二濃度的CTC以及將該CTC濃縮至一第三濃度，該第二濃度高於該第一濃度，該第三濃度高於該第二濃度，其中該濃縮裝置包括：(i)一入口，該入口與該三向閥的該第二閥出口流體相通；(ii)一濃縮流體通道，該濃縮流體通道包括以一圖案配置的微特徵，該濃縮流體通道將CTC引導朝向該通道內的一窄區域，而不是將不想要的組分引導朝向該窄區域；(iii)一單一井，該單一井在該濃縮裝置的一遠部且在該通道的該窄區域內，其中該單一井位在一流體流動路徑下方，該流體流動路徑導向(d)一樣本出口，其中該單一井經組態以在流體經由該流體流動路徑流動越過單一井而朝向該樣本出口的同時，經由重力捕獲在該通道的該窄區域內流動的CTC，其中通到該單一井的一基部的一通路實質上與該流體流動路徑垂 直，其中該單一井朝該濃縮裝置的一中線設置，以及該單一井的該基部具有實質上平坦的表面，該表面具有介於約1mm2與約100mm2之間的一面積，及其中該樣本出口安置在該濃縮裝置的一遠端且經組態以容許從該系統移除該不想要的組分。
  2. 如申請專利範圍第1項之微流體系統，其中該收集裝置之該一或多個表面包括複數個微結構，其中一或多種圖案配置於該微結構上，以及該收集裝置係一微流體裝置。
  3. 如申請專利範圍第2項之微流體系統，其中該收集裝置內之該複數個微結構係以選自由下列圖案所組成之群組配置：一或多個線條、馬蹄圖案、魚骨圖案、一或多個魚骨圖案線條、一或多個叢集微結構線條及前述各種組合。
  4. 如申請專利範圍第1項之微流體系統，其中該微結構的該圖案是選自由下列所組成的群組：一或多個線條、馬蹄圖案、魚骨圖案、一或多個魚骨圖案線條、一或多個叢集微特徵線條及前述各種組合。
  5. 如申請專利範圍第1項之微流體系統，其中該單一井包括在該樣本出口附近適於收集CTC的目標濃縮區域。
  6. 如申請專利範圍第1項之微流體系統，其中該濃縮裝置之一或多個表面包括一或多個薄膜過濾元件。
  7. 如申請專利範圍第6項之微流體系統，其中至少一個薄膜過濾元件空間配置在該樣本出口附近。
  8. 如申請專利範圍第6項之微流體系統，其中該濃縮裝置之至少一個薄膜過濾元件包括一過濾薄膜，該過濾薄膜夾在由一或多個室壁包圍之兩相鄰 腔室之間，該過濾薄膜是由選自由以下所組成的群組之材料所製成：聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、環烯烴共聚物(COC)、矽、玻璃、熱塑性材料、及前述組合。
  9. 如申請專利範圍第1項之系統，其中該濃縮裝置進一步包括一或多個空間配置在該樣本出口附近的通道。
  10. 一種富集來自一生物樣本之循環腫瘤細胞(CTC)的方法，該方法包括：利用一收集裝置捕集來自該生物樣本之該CTC，該收集裝置包括：一樣本入口，該樣本入口在該收集裝置的一近端處經組態以接收一第一濃度的CTC；一流體通道，該流體通道流體連結至該樣本入口，其中該流體通道包括一或多個表面以及一表面塗層，該一或多個表面包括實質上與一主要流體流動方向垂直的複數個微結構，該表面塗層附著至該一或多個表面的一部分，其中該表面塗層包括：(1)一抗垢脂質雙層組合物；及(2)一抗體，該抗體選擇性結合至存於該生物樣本內之CTC；及一出口，該出口在該收集裝置的一遠端；自該收集裝置釋放該CTC；將一第二濃度的CTC運送至一三向閥，該三向閥與該收集裝置流體相通，該三向閥包括：一閥入口，該閥入口流體連結至該收集裝置的該出口；一第一閥出口，該第一閥出口用於送走不想要的材料；以及一第二閥出口，其中該三向閥進一步包括一第一狀態及一第二狀態，其中在該第一狀態，該三向閥容許來自該收集裝置的流體流動通過該第一閥出口而不是該第二閥出口，以及其中在該第二狀態，該三向閥容許來自該收集裝置的流體流動通過該第二閥出口而不是該第一閥出口；將該第二濃度的CTC運送至與該三向流體相通的一濃縮裝置，該第二濃度比該第一濃度高；利用該濃縮裝置將該CTC濃縮至一第三濃度，該第三濃度高於該第二 濃度，其中該濃縮裝置包括：一入口，該入口與該三向閥的該第二閥出口流體相通；一濃縮流體通道，該濃縮流體通道包括以一圖案配置的微特徵，該濃縮流體通道將CTC引導朝向該通道內的一窄區域，而不是將不想要的組分導向該窄區域；一單一井，該單一井在該濃縮裝置的一遠部且在該通道的該窄區域內，其中該單一井位在一流體流動路徑下方，該流體流動路徑導向一樣本出口，其中該單一井經組態以在流體經由該流體流動路徑流動越過該單一井而朝向該樣本出口的同時，經由重力捕獲在該通道的該窄區域內流動的CTC，其中通到該單一井的一基部的一通路實質上與該流體流動路徑垂直，其中該單一井朝該濃縮裝置的一中線設置，以及該單一井的該基部具有實質上平坦的表面，該表面具有介於約1mm2與約100mm2之間的面積。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該CTC係自該收集裝置經由引入氣泡於該收集裝置中而釋放。
  12. 如申請專利範圍第10項之方法，進一步包括自該生物樣本棄置一或多種不想要之組分。
  13. 如申請專利範圍第10項之方法，進一步包括將該CTC侷限於一濃縮區域。
  14. 如申請專利範圍第10項之方法，進一步包括一使流體溶液過濾通過一或多個設置於該濃縮裝置內之薄膜過濾元件，其中該流體溶液包含該CTC。
  15. 如申請專利範圍第10項之方法，進一步包括在一培養基中培養該CTC。
  16. 如申請專利範圍第10項之方法，進一步包括執行一或多項選自由下列所組成的群組之檢定：檢測、表徵、計算、免疫染色、檢驗、成像、培養、分子分析、及前述組合。
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