CN103889556A - 在引入亲和性和大小两者的微流体芯片上的循环肿瘤细胞捕获 - Google Patents

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Abstract

本发明包括通过富集样品中的稀有细胞或其他颗粒而对患者的病症进行诊断、诊疗或预后的方法和装置。所述装置可以是包含障碍物阵列以及一种或多种结合部分的微流体装置。所述装置和方法可以允许根据大小和亲和性富集细胞、在微流体装置上的位置回收细胞或其他颗粒、从微流体装置释放细胞或其他颗粒、使样品流过微流体装置，以及使来自从患有病症的患者获得的样品的稀有细胞或其他颗粒滞留。

Description

在引入亲和性和大小两者的微流体芯片上的循环肿瘤细胞捕获
技术领域
本发明涉及医学诊断学和微流体学领域。
相关申请的交叉引用
本申请要求与2011年1月7日提交的美国临时申请61/430,897、于2011年1月7日提交的美国临时申请61/430,891、于2011年1月7日提交的美国临时申请61/430,930和于2011年1月6日提交的美国临时申请61/430,509的权益，这些申请均通过引用并入本文。
背景技术
癌症是一种以异常细胞的不受控增殖为特征的疾病。在正常组织中，细胞响应于周围细胞发出的信号而进行分裂和在组织中组织化。癌细胞不以同样的方式响应于这些信号，这导致它们增殖并在许多器官中形成肿瘤。随着肿瘤继续生长，遗传改变会积聚，而显现为一种更具侵略性的癌细胞生长表型。若不治疗，继而会发生转移，即癌细胞通过淋巴系统或血流扩散到身体远端区域。转移导致在多个部位形成继发性肿瘤，损伤健康组织。大多数癌症死亡是由这样的继发性肿瘤引起的。
尽管在癌症诊断和治疗方面有数十年的进展，但许多癌症只有发展到晚期才能被检测出来。举一个例子，大部分早期肺癌无症状，因而无法及时检测出来进行治愈性治疗，这导致肺癌患者的五年总存活率低于15%。然而，在那些肺癌在早期就检测出来并进行治疗的情况下，预后就更加有利。因此，需要开发用于在疾病发展的较早阶段检测癌症的新方法。
援引并入
本说明书中所提到的所有出版物和专利申请都通过引用以同样程度并入本文，犹如每个单独的出版物或专利申请特别地和单独地被指出为通过引用而并入。
发明内容
在本发明的一个方面，微流体装置包含输入端、输出端以及设置于其间的并且进一步包含支撑柱的障碍物阵列。每个支撑柱可具有至少100微米的直径和至少300微米的中心距。每个支撑柱可具有至少45微米或至少60微米的直径和至少150微米或至少200微米的中心距。每个支撑柱可具有至少60微米的直径，并且可与输入端间隔小于1000微米。支撑柱可具有与阵列中的障碍物不同的样式（pattern）。每个支撑柱可具有大于阵列中最大障碍物的直径，或可具有至少100微米的直径。支撑柱可以按照方形阵列样式化。支撑柱彼此之间可间隔至少30微米或比所述阵列中所述障碍物之间的任意距离大至少约50%的距离。支撑柱距输入端可小于200微米。
在另一方面，障碍物阵列可包含第一间隙和第二间隙。该第二间隙可以小于第一间隙，并且可按照重复样式位于阵列中。第二间隙可在阵列中均匀分布。
在本发明的一个方面，微流体装置包含样品输入端、样品输出端以及位于其间的障碍物阵列，其中该阵列可具有多个区域。该多个区域可包含第一区域，该第一区域包含位于所述第一区域中的多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙。第一间隙和第二间隙可以不同。该多个区域可包含第二区域，该第二区域具有均匀分布的、其间具有单一间隙的障碍物。位于第一区域下游的第二间隙可包含障碍物，其中每个障碍物的直径可小于第一区域中每个障碍物的直径。第二区域可位于第一区域的下游。该多个区域可进一步包含一个或多个位于第二区域下游的额外区域。该一个或多个额外区域可具有均匀分布的、其间具有单一间隙的障碍物，其中所述单一间隙可从第二区域到额外区域的每个下游阵列逐渐变小。位于第二区域下游的一个或多个额外区域中的每一个可包含具有某一直径的障碍物，其中障碍物直径可从第二区域到额外区域的每个下游阵列逐渐变小。第二间隙可以以对称样式、均一样式、重复样式或非均一样式分布。
在本发明的一个方面，微流体装置可包含输入端、输出端以及设置于其间的障碍物阵列，该阵列具有多个区域，第一区域包含位于该第一区域中多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙，其中第一间隙和第二间隙可以不同，而第二区域包含位于该第二区域中多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙，其中第一间隙和第二间隙可以不同，并且其中第一区域和第二区域中的第一间隙可以相同，且其中第二区域中的第二间隙可以小于第一区域中的第二间隙。第二区域可位于第一区域的下游。位于第一区域下游的第二区域可包含具有某一直径的障碍物，其中每个障碍物的直径小于第一区域中每个障碍物的直径。微流体装置可包含一个或多个位于第二区域下游的额外区域，其中该一个或多个额外区域中的每一个可包含位于多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙，其中第一间隙和第二间隙可以不同，其中多个区域中的每一个中的第一间隙可以相同，且其中第二间隙可从第二区域到额外区域的每个下游阵列逐渐变小。障碍物可以以非随机样式，重复样式或均一样式排布。
在本发明的一个方面，微流体装置包含输入端、输出端以及设置于其间的障碍物阵列，其中至少障碍物的子集可以成簇排布，其中每个簇可包含至少三个障碍物，其中簇中相邻障碍物间的距离可以小于该簇与其相邻簇之间的距离。所有或基本上所有障碍物可以成簇排布。
在另一方面，所考虑的任何微流体装置上的障碍物可用一种或多种结合部分涂覆。结合部分可以是亲和标记的配体。所考虑的任何微流体装置上的阵列可包含各种大小的障碍物。所考虑的任何微流体装置的阵列可包含至少100、200或300个彼此相邻的簇。簇内障碍物间的最大距离可以比第一簇和与第一簇相邻的第二簇之间的最小距离至少小三倍。所考虑的任何微流体装置上的簇在沿着流动方向的第一方向上可比垂直于流动方向的第二方向上具有更长的尺寸。所考虑的任何微流体装置上的簇可定位成使得第一簇位于第二簇的上游居中，其中第二簇的中心可偏离第一簇的中心。第一簇可位于第二簇的上游居中，其中第二簇的中心可以以与流动方向水平线呈约0°至90°或小于45°的角度偏离第一簇的中心。所考虑的任何微流体装置上的簇内障碍物间的距离可小于40、30、20或15微米。
在另一方面，所考虑的任何微流体装置上的阵列可包括多个串联区域或并联区域，其中每个区域的簇可具有不同的特征。该特征可选自簇内一个或多个障碍物之间的不同间距、簇之间的不同间距、连接角、簇之间的不同角度、同一个簇中障碍物之间的不同角度，或其组合。本文所述的任何装置或阵列可进一步包含位于第一区域和第二区域之间的过渡区，其中该过渡区可包含不同大小的障碍物。阵列可包含超过4个或5个区域。
所考虑的任何微流体装置上的输入端可流体连接至一个或多个额外阵列。簇可以以非均一的、非随机的或重复的样式排布。簇可由三个障碍物组成，该障碍物具有第一和第二迎角，每一个迎角小于45°、介于约10°-90°之间、介于约20°-40°之间或介于约30°-40°之间。
在另一方面，微流体装置可包含样品输入端、样品输出端以及位于其间的障碍物阵列，该障碍物阵列具有位于所述障碍物的子集之间的第一间隙和位于所述障碍物的第二子集之间的第二间隙，其中第一间隙可大于所述第二间隙，且其中第二间隙可以以非均一、非随机的样式分布于整个阵列。第二间隙可以对称或重复的样式分布。第二间隙可分布成使得第二间隙的中心形成穿过流动方向的虚拟线。
在一个方面，微流体流通式装置可包含输入端、输出端和障碍物阵列，其中该阵列可配置为当样品以约0.25mL/hr至约12.5mL/hr的速度流过装置时，捕获掺入血液样品中的至少80%的表达捕获实体例如EpCAM的细胞，该血液样品不含表达捕获实体例如EpCAM的细胞，体积为约1.5mL至约20mL。在一个方面，微流体装置包含输入端、输出端和障碍物阵列，其中该阵列可配置为当样品以约0.25mL/hr至约12.5mL/hr的速率流过装置时，捕获掺入体积为约1.5mL至约20mL的、不含CTC的血液样品中至少80%的CTC。在一个实施方案中，超过50%的被捕获细胞可在所考虑的任何微流体装置的阵列的上游半区中被捕获。在一个实施方案中，可使用所考虑的任何微流体装置基于大小而不是亲和性捕获超过10%的被捕获细胞。
在本发明的一个方面，用于富集CTC的方法可包括使包含CTC的样品流过本文所述的任何微流体装置。
在另一方面，用于监测癌症复发的方法可包括计数（enumerating）或表征从多个在不同时间点取自患者的样品中富集的CTC，计数或表征来自患者的CTC，以及利用该数据以至少80%的置信水平来确定患者癌症复发的可能性。
在本发明的一个方面，用于监测接受癌症治疗的患者的治疗效果的方法可包括以下步骤：计数或表征从治疗前取自患者的样品以及至少一个治疗后获取的样品中富集的CTC，以及利用该数据以至少80%的置信水平来确定治疗是否可能有效。
在本发明的一个方面，用于筛查患者中的癌症的方法可包括以下步骤：计数或表征从来自所述患者的样品中富集的CTC，以及利用该数据来确定该患者是否罹患癌症或是否应该寻求进一步的检测来确认癌症，其中该筛查的灵敏度为至少80%。
在本发明的另一方面，所述方法可进一步包括以下步骤：对捕获的CTC进行分子分析，或对捕获的CTC进行分类，以及利用该信息来确定患者癌症复发的可能性，以至少80%的置信水平确定治疗是否有效，或患者是否罹患癌症或是否应该寻求进一步的检测来确认癌症，或其任意组合。
分子分析可包括测序、SNP检测、基因表达分析、cDNA分析、mRNA分析、蛋白质表达分析、修饰蛋白质分析、翻译后修饰蛋白质分析、突变蛋白质分析、蛋白质修饰分析、miRNA谱分析、监测酶活性（例如，从细胞裂解液中）、显色原位杂交（CISH）分析或荧光原位杂交（FISH）分析。
在一些实施方案中，分类可包括鉴定CTC亚群，其中可以根据所进行的分子分析的结果或被对于表1中标记物特异性的结合部分所捕获的能力来表征该亚群。
本文所述的方法可进一步包括比较在所述微流体流通式装置的一个或多个区域中的每一个内所捕获的细胞，例如比较所捕获细胞的数目，或比较所进行的分子分析的结果。
本文所述的方法可进一步包括可至少为10mL且可在少于20小时内处理的样品。在一些方面，样品可以是至少7.5mL至约25mL且可以在少于20小时内处理。
任何包含障碍物阵列的微流体装置的表面可用一种或多种结合部分涂覆。结合部分可包含亲和标记的配体。结合部分可包含抗体。抗体可用碳水化合物例如葡聚糖或葡聚糖衍生物来功能化。在一个方面，本文所述的任何微流体装置可包含用抗体涂覆的障碍物阵列，其中所述装置的表面用葡聚糖或葡聚糖衍生物来功能化。在一个方面，本文所述的任何微流体装置可包含用抗体涂覆的障碍物阵列，其中所述装置的表面在至少10小时里具有小于15°的接触角。亲和标记的配体或结合部分能捕获上皮细胞、非上皮细胞、非上皮肿瘤细胞、经历上皮-间质转化的细胞、肿瘤干细胞、间充质细胞，或细胞碎片、蛋白质、核酸颗粒或其微粒，或其任意组合。
任何所述的微流体装置可包含用两种或多种不同聚合物功能化的表面，其中第一聚合物可以是碳水化合物而第二聚合物可以是聚乙二醇（PEG）。可采用单一的PEG连接体（linker）长度，或可采用两种或三种或更多种PEG连接体长度。碳水化合物可以是葡聚糖。碳水化合物的分子量可以是10K-70K。葡聚糖的浓度可以占表面的0.01%至5%或0.05%至2%(w/w)。PEG的分子量可以是1000-100000K。PEG的分子量可以是1000-20000K。PEG和碳水化合物的摩尔比可分别为1:10至10:1。表面可进一步包含结合部分。结合部分可包含抗生物素蛋白（avidin）、抗生物素蛋白衍生物、NeutrAvidin、链霉抗生物素蛋白（StreptAvidin）、CaptAvidin、其他生物素结合蛋白质、生物素、生物素衍生物或其他的抗生物素蛋白结合蛋白质。结合部分可共价地或非共价地与碳水化合物结合。结合部分可通过连接体与碳水化合物结合。连接体可包含生物素或生物素衍生物。连接体可包含官能团，例如酰亚胺或醇。连接体可包含生物素-PEG-NHS。连接体可包括核酸、氨基酸、生物素-PEG-马来酰亚胺、生物素-PEG-COOH或生物素-PEG-SH。在一个方面，微流体装置可包含由抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物涂覆的障碍物阵列。微流体装置可进一步包含抗体的结合部分。微流体装置可进一步包含DNA连接体。
任何微流体装置可包含与一种或多种抗体偶合的塑性表面，其中抗体距塑性表面可以平均超过PEG3长度。本文所述的任何装置的表面可以是塑料或环烯烃共聚物（COC）或环烯烃聚合物（COP）。用于制造本文所述的任何装置的器件（device）的方法可包括采用环烯烃共聚物（COC）材料或环烯烃聚合物（COP）材料来制造器件，其中COC或COP材料可用原坯（blank）塑模。
微流体装置可能能够捕获至少60%的掺入正常血液样品中的CTC，其中该装置用大量的抗体溶液功能化，例如20μg/mL的抗体溶液。抗体溶液的体积可为约100μL至约1mL，例如100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、550μL、600μL、650μL、700μL、750μL、800μL、850μL、900μL、950μL、或1mL。抗体溶液的浓度可为约1μg/mL至约100μg/mL，例如1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL或100μg/mL。
用于捕获和释放感兴趣的细胞或细胞碎片的方法可包括使包含感兴趣的细胞或细胞碎片的样品流过用碳水化合物和结合部分涂覆的表面，该结合部分能选择性结合特异地存在于感兴趣的细胞或细胞碎片上的细胞表面标记物，并采用选择性裂解碳水化合物的酶或竞争性释放生物素偶联物的生物素衍生物，或同时采用二者，从而使感兴趣的细胞或细胞碎片从表面释放。在一些实施方案中，选择性裂解碳水化合物的酶可包括葡聚糖酶、糖基转移酶、糖苷水解酶、转糖苷酶、磷酸化酶或裂合酶。在一些实施方案中，竞争性释放生物素或脱硫生物素偶联物的生物素或生物素衍生物可包括生物素、脱硫生物素或其他生物素偶联物。用于捕获和释放感兴趣的细胞或细胞碎片的方法可包括使包含感兴趣的细胞或细胞碎片的样品流过由DNA连接体和结合部分涂覆的表面，该结合部分能选择性结合特异地存在于感兴趣的细胞或细胞碎片上的细胞表面标记物，并采用选择性裂解（例如限制性内切酶）或非特异性裂解（例如DNA酶）DNA连接体的核酸序列内的核酸序列的酶，从而使感兴趣的细胞或细胞碎片从表面释放。用于捕获和释放感兴趣的细胞或细胞碎片的方法可包括使包含感兴趣的细胞或细胞碎片的样品流过用抗体、肽或蛋白质连接体以及结合部分涂覆的表面，该结合部分能选择性结合特异地存在于感兴趣的细胞或细胞碎片上的细胞表面标记物，并采用竞争性地从抗体或其他结合部分释放细胞或细胞碎片的蛋白质或肽，或采用裂解肽或蛋白质连接体的酶，例如诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶等蛋白酶，从而使感兴趣的细胞或细胞碎片从表面释放。
亲水性连接体可在水性环境中延伸，并可为固定的抗体提供最大的柔性/溶解度和活性。基于PEG和葡聚糖的交联体均可使用。除了如PEG的高亲水性，葡聚糖还具有独特的性质，因为它在对细胞、蛋白质、DNA或RNA几乎不造成损害至不造成损害的温和条件下可被葡聚糖酶溶解。该性质可用来从用于高级研究的芯片上释放捕获的稀有物质，如CTC，和其他癌症生物标记物。
另一种选择是亲水性的、可光裂解的交联体或仅仅是可光裂解的交联体。这二者均可用于物质从血液中的光诱导释放。
附图说明
图1——示出了具有示例性排布的障碍物阵列的T7.2微流体装置。
图2——示出了具有示例性排布的障碍物阵列的T7.3微流体装置。
图3——示出了C5.2微流体装置，其具有多个含有示例性排布的障碍物阵列的区域。还示出了位于端区（end zone）和仓室（plenum）之间以及阵列之间的过渡区。
图4——示出了C5.3微流体装置，其具有多个含有示例性排布的障碍物阵列的区域。
图5——示出了CS1.1微流体装置，其具有示例性排布的、以三个障碍物为一簇的障碍物阵列。
图6——示出了C5.4微流体装置，其具有示例性排布的、以三个障碍物为一簇的障碍物阵列。
图7——示出了C5.4微流体装置，其具有示例性排布的障碍物阵列以及包含支撑柱的仓室。示出了不同的柱子直径以及支撑柱之间的距离。
图8——示出了血液样品流过微流体装置中的障碍物阵列的放大视图，该障碍物阵列是以两个障碍物为一簇（上图）或三个障碍物为一簇（下图）排布的，且在其间具有夹点。
图9——示出了血液样品流过微流体装置中的障碍物阵列的放大视图，其中障碍物阵列是以三个障碍物为一簇（上图）或四个障碍物为一簇（下图）排布的，且在其间具有夹点。从一列中的一个障碍物簇到相邻一列中的障碍物簇的长度用A表示。从一列中的一个障碍物簇到同一列中的相邻障碍物簇的长度用B表示。从一列中的一个障碍物簇到相邻一列中的障碍物簇的宽度用C表示。障碍物簇中障碍物的直径用D表示。
图10——示出了血液样品流过微流体装置两个区域中的障碍物阵列的放大视图，该障碍物阵列是以三个障碍物为一簇排布的，在第一区域中的障碍物之间的夹点大于第二区域即下游区域中障碍物之间的夹点。
图11——示出了并联腔室设计中的微流体装置，每个腔室具有多个区域，该区域具有四种不同的夹点大小，具有示例性排布的障碍物阵列。
图12——示出了血液样品通过微流体装置的各种流动路径的计算机模拟，该微流体装置采用不同直径的立柱（post），具有以三个障碍物为一簇（上图）或四个障碍物为一簇（下图）的障碍物排布。
图13—图5——示出了血液样品流过微流体装置中的障碍物阵列的各种细胞迁移路径的放大视图。
图14——示出了显示微流体装置内捕获的细胞上的作用力随障碍物上细胞或颗粒相对于流动角度的角位置而变化的曲线图。细胞上的作用力在细胞位于障碍物的一侧时可能最大，当细胞直接位于障碍物相对于流动角度的前方或后方时最小。
图15——示出了显示微流体装置内细胞上的最大剪应力随间隙大小而变化的曲线图，还示出了显示针对各种微流体装置中具有各种流体动力学大小的细胞的最大剪应力的表格。
图16——示出了采用各种样品体积和流速，因亲和为主的捕获、亲和及大小混合的捕获和大小为主的捕获而导致的总捕获百分比随EpCAM（上图）和IgG（下图）芯片类型而变化的柱状图。
图17——示出了两张捕获图，其显示由C5.4-抗-EpCAM和C5.4-抗-IgG微流体装置所捕获的细胞的空间定位。
图18——示出了亲和捕获的曲线图，其作为具有各种示例性障碍物排布的微流体装置的每个区域中的总捕获的百分比。
图19——示出了采用各种流速的总捕获的百分比随芯片类型而变化的柱状图。
图20——示出了使用各种流速，因亲和为主的捕获、亲和及大小混合的捕获和大小为主的捕获导致的捕获百分比随芯片类型而变化的柱状图。
图21——示出了使用各种流速，各种体积的血液样品中细胞捕获百分比随抗-EpCAM和抗-IgG芯片类型而变化的柱状图。
图22——示出了在C5.3或C5.4芯片上使用各种流速和样品体积从多个血液样品中捕获的总捕获平均百分比的柱状图。
图23——示出了捕获图，其显示采用各种孵育时间、样品体积和流速，由C5.4-抗-EpCAM涂覆的微流体装置所捕获的细胞的空间定位。
图24——示出了捕获图，其显示由C5.3-抗-EpCAM微流体装置所捕获的、掺入到血液样品中的、具有高、中和低EpCAM表达的细胞（H1650、PC3和MDA-MB-231）的空间定位及其平均捕获百分比（回收百分比）。
图25——示出了捕获图，其显示由C5.4-抗-EpCAM微流体装置所捕获的、掺入到血液样品中的、具有高、中和低EpCAM表达的细胞（H1650、PC3和MDA-MB-231）的空间定位及其平均捕获百分比（回收百分比）。
图26——示出了通道边缘处的先前使用的阵列布图，其可导致一些障碍物接近通道边缘，这可导致可能撕裂的柔性工具（soft tool）。也示出了新的包含阵列的阵列布图设计，其中所有离边缘小于12微米的间隙都在通道边缘处被去除并如图所示排布。
图27——示出了根据患者中检测到的CTC的亚分类，随时间推移的总存活率的Kaplan-Meier曲线图。
图28——示出了用本发明的微流体装置捕获CTC和其他颗粒的总体方案（上图），以及用于微流体装置中捕获的细胞和颗粒的下游分析的表征策略（下图）。
图29——示出了用微流体装置表面上涂覆的两种上皮-间质转化（EMT）标记物对掺入血液样品中的Hs578t细胞的总捕获百分比曲线。这证明其他结合部分可用于捕获具有低EpCAM表达或无EpCAM表达的细胞。
图30A和30B——示出了具有两个（A，上图）或四个（B，下图）并联腔室设计的微流体装置，每个腔室包含多个具有多重特征的区域，每个区域具有各种不同排布的障碍物阵列，用以从同一样品中捕获细胞、颗粒或其任意组合。每个腔室显示为含有不同捕获部分，并用不同检测部分染色。
图31A和31B——示出了用本发明的微流体装置捕获CTC和其他颗粒的工作流程示例，以及用于微流体装置中捕获的细胞和颗粒的下游分析（A，上图）和用于生物标记物发现（B，下图）的表征策略。
图32A和32B——示出了细胞捕获后细胞在微流体装置中生长的步骤示例（A，上图），以及在微流体装置中捕获细胞，随后释放被捕获的细胞，随后细胞在培养物中生长的步骤示例（B，下图）。
图33——示出了可涂覆于所考虑的任何微流体装置的一个或多个表面上的各种表面化学、结合部分和连接体的示例。
图34——示出了在本发明的微流体装置中使用以提高亲和捕获的表面化学方法的三个示例。
图35——示出了比较采用用于亲和捕获的新表面化学方法、使用以不同浓度EpCAM抗体涂覆的微流体装置的细胞捕获百分比和性能的柱状图。
图36——是捕获图，比较了采用直接共价连接或生物素-PEG-NHS交联体，用抗-IgG和抗-EpCAM功能化的微流体装置捕获的血液样品中的细胞的空间定位和平均捕获百分比（回收百分比）。
图37——示出了由微流体装置所捕获的各种细胞系中四种基因的相对mRNA表达的热图。
图38——示出了可用于进一步表征所捕获的细胞或颗粒的下游分析方法的示例。
图39——示出了血液样品通过C5.4微流体装置的四个不同区域的各种流动路径的计算机模拟，该装置具有以三个障碍物为一簇的障碍物排布。
图40——示出了血液样品流过微流体装置中的障碍物阵列的放大视图的热图，显示出流速和剪切力分布。
图41——示出了包含示例性C5.4微流体装置的各种参数的表格。
图42——示出了MPS化学结构的示意图。
图43A和43B——示出了柱状图，其评价采用两种不同芯片设计对H1650和H29细胞系的总细胞捕获百分比和芯片性能以及在EpCAM抗体和IgG涂覆的芯片上的捕获百分比（A，上图），以及EpCAM抗体和IgG涂覆的芯片之间的捕获百分比差异（B，下图）。
图44A和44B——示出了比较使用不同分子量的葡聚糖和PEG作为连接体对减少WBC计数的影响的柱状图（A，上图），以及显示出用葡聚糖或用葡聚糖和PEG功能化的C5装置捕获的细胞的空间定位的捕获图（B，下图）。
图45——示出了通过碱性磷酸酶/PNPP试验量化的、所加入的BSA对芯片表面上固定的抗体量的影响的柱状图。
图46A和46B——示出了IgG对照芯片和EpCAM芯片在不同抗体浓度下的细胞捕获率的柱状图（A，上图），以及当NeutrAvidin共价连接于表面时这两种芯片的捕获率的差异的柱状图（B，下图）。
图47A和47B——示出了IgG对照芯片和EpCAM芯片在不同抗体浓度下的细胞捕获率的柱状图（A，上图），以及当NeutrAvidin通过亲水性交联体连接于表面时这两种芯片的捕获率的差异的柱状图（B，下图）。
图48——示出了显示出当NeutrAvidin共价连接于表面时以及当NeutrAvidin通过亲水性交联体连接于表面时，C5IgG对照芯片和EpCAM芯片所捕获的细胞的空间定位的捕获图。
图49——示出了微流体装置的阵列中各种可供选择的障碍物排布（上图），和列出具有四个腔室、用于多参数处理样品的微流体装置的各种参数的表格。
图50——示出了捕获图，显示由具有所示障碍物阵列排布的IgG对照芯片和EpCAM芯片所捕获的细胞的空间定位和总细胞百分比。
图51——示出了在25μL/min下，与原C5设计相比，采用C5.1和C5.2设计的总捕获百分比。
图52——示出了捕获图，其显示由IgG对照芯片和EpCAM芯片所捕获的、掺入PBS或血液样品中的细胞的空间定位和总细胞百分比。
图53——示出了采用C5.1和C5.2设计，采用各种流速、表面化学和血液样品类型的总捕获百分比。
图54——示出了捕获图，其显示采用C5.1和C5.2设计，采用各种流速和表面化学的细胞空间定位。
图55——示出了在C5.2芯片设计上处理的回收的细胞数相对于掺入样品中的细胞数的图，这表明掺入样品中的细胞的捕获在0-790个掺入细胞的范围内呈线性。
图56——示出了在IgG或EpCAM抗体功能化的C5.2、C5.3和C5.4设计芯片上以4μL/min或8μL/min的流速处理掺有已知数目CTC的样品的总捕获百分比图。
图57——示出了捕获图，其显示在用IgG或EpCAM抗体功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片设计上以4μL/min或8μL/min的流速处理掺有已知数目CTC的样品所得到的细胞的空间定位。
图58——示出了采用7hr和4hr抗体孵育时间和各种流速，采用C5.3（上图）和C5.4（下图）芯片设计处理的各个区带中的总细胞捕获百分比图。
图59——示出了使用三种不同的血液样品，在相同的抗体孵育时间下，在用EpCAM功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片设计上以4μL/min、25μL/min和75μL/min的流速处理3.75mL血液样品得到的总细胞捕获百分比图。
图60——示出了捕获图，其显示在用EpCAM抗体功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片设计上以4μL/min的流速处理掺有已知数目CTC的3.75mL血液样品所获得的细胞的空间定位。
图61——示出了捕获图，其显示在用EpCAM抗体功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片设计上以25μL/min的流速处理掺有已知数目CTC的3.75mL血液样品所获得的细胞的空间定位。
图62——示出了捕获图，其显示在用EpCAM抗体功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片设计上以75μL/min的流速处理掺有已知数目CTC的3.75mL血液样品所获得的细胞的空间定位。
图63——示出了在相同的抗体孵育时间下，采用4μL/min、25μL/min和75μL/min的流速，在用EpCAM功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片设计上处理三个不同的3.75mL血液样品而从血液中捕获（非特异性捕获）的白细胞的总数图。
图64——示出了在相同的处理条件下，使用相同数目的掺入细胞，在用EpCAM功能化的C5.2和C5.4芯片设计上以4μL/min或8μL/min的流速处理体积为3.75mL的4种不同血液样品时，3种不同细胞系的总细胞捕获百分比的图。
图65——示出了捕获图，其显示在相同的处理条件下，使用相同数目的掺入细胞，在用EpCAM抗体功能化的C5.2芯片设计上以4μL/min的流速处理体积为3.75mL的血液样品，或以8μL/min的流速处理体积为7.5mL的血液样品时，3种不同细胞系的空间定位。
图66——示出了捕获图，其显示在相同的处理条件下，使用相同数目的掺入细胞，在用EpCAM抗体功能化的C5.4芯片设计上以4μL/min的流速处理体积为3.75mL的血液样品，或以8μL/min的流速处理体积为7.5mL的血液样品时，3种不同细胞系的空间定位。
图67——示出了一个表格，其总结了采用C5.2、C5.3和C5.4芯片设计比较各种参数的试验的一些重要结果。
定义
所谓“抗体”是指任何免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有能与抗原特异性结合的抗原结合位点的分子。能与本公开内容中的多肽特异性结合的分子是能与多肽或其片段结合，但基本不与天然含有多肽的样品如生物样品中的其他分子结合的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括可通过用诸如胃蛋白酶的酶处理抗体以及其他本领域中已知的技术生成的F(ab)和F(ab′)2片段。本公开内容提供了能与本公开内容中的多肽结合的多克隆抗体和单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一群抗体分子，它们只包含一种类型的能够与本公开内容中的多肽的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。
在长度、尺寸、面积或其它测量值的上下文中使用的“约”是指等于10%、5%、4%、3%、2%或甚至1%以内。
所谓“生物样品”是指生物来源的或含有或可能含有生物粒子的任何样品。优选的生物样品为细胞样品。
所谓“血液成分”是指全血的任何成分，包括宿主红细胞、白细胞、血小板或上皮细胞，特别是CTC。血液成分还包括血浆成分，例如，蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物，以及例如由于当前或过去的妊娠、器官移植、感染、损伤或疾病而可能存在于血液中的任何其他细胞。
所谓“细胞碎片或颗粒”是指在水性介质中不溶的任何生物来源的物质。其实例包括颗粒状的细胞组分、病毒和包括蛋白质、脂质、膜、核酸和碳水化合物的复合物。
所谓“细胞样品”是指含有细胞或其组分的样品。这类样品包括天然存在的流体（例如，血液、汗液、泪液、耳流出物（ear flow）、痰、淋巴、骨髓悬浮液、尿液、唾液、精液、阴道流出物、脑脊髓液、宫颈灌洗液、脑液、腹水、乳汁、呼吸道、肠道或泌尿生殖道分泌物、羊水和水样品）和其中已引入细胞的流体（例如，培养基和液化的组织样品）。该术语还包括裂解液。
所谓“通道”是指流体可以流动通过的间隙。通道可以是毛细管、导管或位于疏水性表面上的、其中可限制水性流体的亲水性样式。
所谓“循环肿瘤细胞”（CTC）是指从原发肿瘤器官的所在位置扩散出来的、包含非正常形态学、组织学和基因表达模式特征的任何稀有细胞。CTC可利用循环血液作为导管迁移到远端位置或次级转移部位，并可导致转移性疾病。CTC可包括上皮细胞、间充质细胞、经历上皮-间质转化（EMT）的细胞、经历间质-上皮转化（MET）的细胞、肿瘤干细胞或其他稀有的细胞谱系。其他稀有的细胞谱系可包括循环内皮细胞以及循环干细胞。
所谓细胞的“组分”是指采用本领域中已知的方法如裂解可以至少部分地从细胞中分离出来的细胞的任何组分。细胞组分可以是细胞器（例如细胞核、核周区室、核膜、线粒体、叶绿体或细胞膜）、聚合物或分子复合物（例如，脂质、多糖、蛋白质（膜蛋白、跨膜蛋白或细胞溶质蛋白质）、核酸（天然核酸、治疗性核酸或病原性核酸）、病毒颗粒或核糖体）、微粒（例如，各种细胞来源的颗粒）或其它分子（例如，激素、离子、辅因子或药物）。
所谓细胞样品的“组分”是指样品中所含的细胞的子集，或其组分。
关于障碍物阵列的“密度”是指每单位面积上障碍物的数目，或者这些障碍物所占的体积的百分比。抑或通过将障碍物更紧密地放置在一起，抑或通过增大障碍物相对于障碍物之间间隙的大小，或通过二者的组合，可以增加阵列密度。抑或通过相距较远地放置障碍物，抑或通过减小障碍物相对于障碍物之间间隙的大小，可以减小阵列密度。
所谓“富集的样品”是指这样一种含有组分的样品：其可被处理以增加感兴趣的组分相对于样品中通常存在的其它组分的相对总数。例如，可通过将感兴趣的细胞的相对总数增加至少10%、25%、50%、75%、100%，或至少1,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至100,000,000倍而富集样品。
所谓“间隙”是指流体或颗粒可以流动通过的开口。例如，间隙可以是毛细管，两个障碍物间的、流体可以在其中流动的空隙，或在其它疏水性表面上的、其中可限制水性流体的亲水性样式。
所谓“流体动力学大小”是指颗粒在与流、障碍物或其他颗粒相互作用时的有效大小。它被用作流中的颗粒体积、形状和可变形性的通用术语。
所谓“细胞内激活”是指导致转录因子激活的第二信使途径的激活，或激酶或其他代谢途径的激活。通过外部细胞膜抗原调节的细胞内激活还可导致受体运输的变化。
所谓“标记试剂”是指能与分析物结合、被内化或以其他方式吸收、并通过例如形状、形态、颜色、荧光、发光、磷光、吸光度、磁特性或放射性发射而被检测的试剂。
所谓“微流体”是指具有至少一个小于1mm的维度。
关于表面的“微结构”是指表面的显微结构，其包括一个或多个在至少一个维度上测量小于1mm的个体特性。示例性的微特征可以是微障碍物、微柱、微槽、微肋和微波纹。
所谓“障碍物”是指对通道中的流动的阻碍，例如，从一个表面上的突起或立柱。例如，障碍物可指在基板上突出的立柱或水性流体的疏水性屏障。障碍物可以是不可渗透的或部分渗透的。例如，障碍物可以是由多孔材料制成的立柱，其中的孔允许水性成分穿透，但其可能太小，而使被分离的颗粒无法进入。
发明详述
本发明特征性描述了用于检测、富集和分析循环肿瘤细胞（CTC）和其它颗粒的装置和方法。本发明还特征性描述了通过分析取自受试者的细胞样品来诊断受试者的病症例如癌症的方法。本发明的设备可包括障碍物阵列，该阵列允许发生CTC、其他稀有细胞、细胞衍生物、细胞组分、生物实体或其它流体组分的移位。该新设计的一些目的包括通过消除经常可能积存气泡的仓室角落以改进装置的预处理（priming），对胶带增加支撑物以防止其在组装和加工过程中塌陷到仓室中，对最小的柱子增加压印支撑物，通过结合目前设计中最有效的捕获区带以利用更多的捕获面积，探索对一系列细胞类型的捕获效率（特异性的和非特异性的）与间隙大小、夹点相对于流动的角度以及夹点密度之间的关系，构建并联捕获室几何结构以开始测试多腔室设计的预处理和操作，在降低通过阵列的细胞上的剪切力的同时仍保持C5设计的高捕获效率，降低对被捕获细胞的拖曳力以促进更多的亲和捕获，在相关的大小范围内提供捕获冗余度，以及依赖计算机模拟在流的可视化/模拟结果的基础上优化阵列几何结构。
尽管之前的C5和C5.1设计可具有高捕获效率，但捕获位置可能出现在阵列的最后区域。此外，这些设计对于压印制造来说可能是一个挑战，可能容易受损，芯片的特征大小可能不适合注射成型，并且可能显现出对细胞的高剪切力和对被捕获细胞的高作用力（图14和图15）。尽管适合于以计数为基础的比较研究，但是为了亲和捕获和表征，以及稳定的长期制造，设计了新的障碍物和间隙的几何结构。新间隙几何结构的一些优势包括对细胞的剪切力和拖曳力的降低（图40）、对于捕获机制的更大亲和组分（更容易清楚区分EpCAM-和EpCAM+细胞）、可降低细胞上的作用力从而使加工能在更高的流速下进行的基准间隙（base gap）区域，以及导致更加稳定的制造并且可能更适合于注射成型的更大的基础间隙和更大的障碍物。
微流体方法可能是为了诊断目的而探询（interrogate）生物流体成分的有效手段，这恰恰是因为他们可用于精确测量和分析其他分析过程，如药物筛选、核酸扩增和酶反应。对于CTC分析的特定微流体挑战在于，为了获得关于循环中稀有细胞的关键信息，必须评价相对大的样品体积。因此，芯片设计的小尺寸特征和复杂的流体动力学可能会干扰特定稀有细胞的有效、大规模捕获，除非其格式和微流体可以被设计成能满足特定要求。来自癌症的细胞可按照其任意分子特征而区分开来；但绝对地确定CTC可能是一个具有挑战性的难题。一个主要的困难在于CTC的属性是多样性的，因此基于细胞的特征的选择已提供了翔实的信息。
此外，尽管循环细胞、微粒、细胞碎片、蛋白质和核酸具有巨大的诊断潜能，但是要从生物流体中有效地捕获这些物质可能还是一个挑战。诸如血液的生物流体通常含有大量与诊断目的可能无关的正常细胞和物质。而且，这些物质的存在可能会提出由于低信噪比而出现这样的诊断困难的可能性。因此，需要有效地富集方法以允许非常高效地捕获有用的疾病相关物质，但最小化对其他无关生物物质的捕获。本公开内容特征性描述了用于处理细胞样品的、具有独特格式和结构的装置。
采用本文所述的装置和方法对一种或多种稀有细胞如CTC进行计数和表征可能在评估癌症诊断、诊疗和预后中是有用的，包括，例如，癌症早期检测和治疗失败的早期检测。采用本文所述的装置和方法对一种或多种稀有细胞进行计数和表征还可能对在患者中选择并监测治疗是有用的。
除了循环细胞、微粒、细胞碎片、蛋白质和核酸的富集，被捕获物质的表征可能对获得诊断信息是有用的。而且，为了得到可靠的诊断信息，可能需要在具有各种特征的循环细胞、微粒、细胞碎片、蛋白质、核酸或其任意组合之间进行定量比较。这通过采用有限量的、可常规取自患者的生物样品可能很难实现。本发明的方法和装置可以用于解决这些困难。
尽管稀有细胞如CTC或上皮细胞的检测、富集和分析是本申请的优选实施方案，但是本发明的装置和方法可用于处理众多的其他细胞、碎片、分析物和颗粒。这些细胞和颗粒可以是癌细胞、循环肿瘤细胞（CTC）、上皮细胞、循环内皮细胞（CEC）、循环干细胞（CSC）、干细胞、未分化的干细胞、肿瘤干细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、胚胎细胞、间充质细胞、循环上皮细胞、循环子宫内膜细胞、营养细胞、免疫系统细胞（宿主或移植物）、结缔组织细胞、细菌、真菌、病原体（例如细菌或原生动物）、微粒、细胞碎片、蛋白质、核酸（即DNA或RNA）、膜、细胞器、脂质体、核小体、外来体、其他细胞组分（例如线粒体和细胞核）和病毒。
各种来源的循环细胞可在患有各种疾病的患者的血流中检测到。例如，CTC和CSC可在癌症患者的外周血中识别出来。CEC和内皮祖细胞（EPC）数目增多可见于，例如患有癌症、心血管病、系统性红斑狼疮（SLE）、糖尿病和其他各种与内皮功能障碍相关的疾病的患者的血液中。
原发性肿瘤包含可由肿瘤细胞、支撑基质和内皮的正常组织以及炎症细胞组成的异质细胞群。所有这些都可导致大小的快速扩张、血管化能力、遗传不稳定性、营养物剥夺、常氧和缺氧、程序重排、坏死、脱落或其任意组合。因此，肿瘤的动态且异质的特征可形成令人生畏的一系列进入血液的生物分子、颗粒、细胞和细胞聚集体。许多由肿瘤释放的成分本身可能并不能形成转移的定殖细胞。尽管如此，这些物质可以提供肿瘤进展的相关指征，也可以是生物标记物和疾病症态和反应的其他指示物的来源。例如，肿瘤来源的微泡可以很容易地从癌症患者的血流中纯化得到，而没有任何细胞污染。这些微泡可以由肿瘤（细胞）不断脱落至循环中，而水平相当的非肿瘤来源的微泡产生可能极其少见。
本发明的装置和方法被设计成能够考察亚细胞组分、生物分子、颗粒、细胞和细胞聚集体，例如游离的或复合的蛋白质、脂质体、RNA、DNA、微粒或诸如核小体和外来体的亚细胞颗粒。虽然其他技术可以选择性地只探询从肿瘤释放的部分物质，但并不能允许对肿瘤细胞进行组合分离和分析以及对这些细胞的组分进行后续分析，而具有本文所述用途的微流体装置和方法可以提供灵活的平台，具有将CTC捕获与多种分子分析结合在一起的优点。
人血液中的微粒（MP）可以来源于血小板，也可以是从白细胞、红细胞、内皮细胞和其他细胞中释放出来。作为一个非限制性的实例，内皮微粒可以是可从内皮细胞释放的、并可发现在血液中循环的小囊泡。该微粒包含围绕少量细胞溶质的质膜。该内皮微粒的膜包含受体和其他细胞表面分子，该受体和分子能使微粒的内皮起源得到识别，并使其区别于来自其他细胞如血小板的微粒。它们可以是诸如癌症进展、炎症、凝血和血管内平衡等细胞过程的重要介质。此外，MP还可携带各种核酸种类作为负载，并可在正常个体的血液中少量检测到。几乎所有在静脉和动脉床中发生的血栓性疾病都记录了血小板源性MP（PDMP）、内皮细胞源性MP（EDMP）和单核细胞源性MP（MDMP）浓度的升高。在癌症患者中，MP允许“非遗传的”细胞间转移，该转移为性状在癌细胞之间的细胞获得和传播提供了途径，如多药耐药性（MDR）。
微粒（例如循环内皮微粒）数目的增加已在患有某些疾病（即高血压、心血管疾病、先兆子痫和各种形式的血管炎）的个体中得到鉴定。该内皮微粒在一些疾病症态中显示出具有一系列细胞表面分子，指示内皮功能障碍的状态。因此，内皮微粒可用作疾病中内皮的生物状态的指标或指数，并可能在某些疾病的发病机制中发挥作用。
本文所述的任何稀有细胞、颗粒或其任意组合可从来自患者的样品中获得。稀有细胞可以是最多可占样品中所有细胞的0.5%、1%、5%或10%的细胞。样品可以是取自患者的任何细胞样品，优选流体样品。
体液可以是血液（如外周血）、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液（CSF）、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液（Cowper’s fluid）、射精前液、女性喷射液（female ejaculate）、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊肿液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、月经血、脓液、皮脂、阴道流出物或分泌物、粘膜分泌物、大便水、胰液、鼻窦腔灌洗液、支气管肺吸出物、囊胚腔流体、骨髓悬浮液、脑脊髓液、脑液、腹水、乳汁、呼吸道、肠道或泌尿生殖道分泌物、羊水、水样或脐带血。生物样品还可以是囊胚腔或脐带血。生物样品还可以是组织样品或活检样品。典型的样品是血液样品。来自患者的流体样品或已经溶解的样品可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、20、50、75、100、200、500、1000或1500mL或大于5、7.5、10、50、75、100、500或750mL。本发明的示例性装置和方法在下文详细描述。
芯片设计
本发明的微流体装置独特地设计成有助于在复杂过程中通过微流体与表面的相互作用而对细胞或颗粒的捕获。捕获的主要因素可包括亲和性相关（例如，通过肿瘤抗原识别）、细胞或颗粒的大小以及细胞或颗粒的特定粘附性质。此外，对于被排除而言至关重要的细胞或颗粒的已知性质可能是重要的。
本文所描述的微流体装置的设计和已实现的特征可针对于CTC、颗粒和非肿瘤血细胞的已知性质。这些特征可包括循环癌细胞的不同大小、肿瘤表面抗原的不同表达水平和粘附性质的可变性。高表面：体积比的发展可能是微流体捕获的一个重要技术原理。本发明的微流体装置和捕获技术可以由双重捕获机制（亲和性和大小）组成。在一些方面，本发明的微流体装置和捕获技术可包含单一捕获机制，其中捕获机制可以是亲和性或大小。标准蛋白质化学可将抗体固定于塑性表面上，使经典的亲和捕获能够进行。具有递减的间隙间距的立柱梯度样式（C5设计）能够捕获肿瘤细胞，同时允许较小的红细胞和白细胞通过。通过两种机制对CTC的富集具有提高捕获效率的潜力，从而提供更广泛的一系列癌细胞用于随后的分析和表征。
以前及本文所述的微流体装置在中空腔室中包含立柱区域，微流体流使得含有细胞和微粒的样品通过其中以进行捕获。之前这些装置的设计引入交错分布的立柱以最大化细胞和表面间的接触。这种捕获表面通过构建在整个芯片表面以线性模式排布的圆柱体或微柱（直径100μm，高度100μm）而建立。这些之前的装置由深蚀刻的硅表面组成，该表面又由位于该装置捕获区中的78000个立柱的阵列构成。后来曾经使用塑料，提高了可靠性，并为表面化学提供了更多的多样性。
本发明的装置含有可根据所形成的原型进行调节的立柱尺寸。对立柱分布的描述中，一些最重要的特征可包括但不限于立柱数目、立柱直径、相同或不同大小的立柱之间的间隙大小、立柱的排布，以及该装置的入口和出口之间整个微流体立柱区域中相同或不同大小的立柱的区带。这些属性已经被工程设计到不同的装置设计中，并且在本文中描述。
本文所述的微流体装置提供了几项系统优势，因为该技术可针对于在不同癌症或其他疾病或病症中的应用。当流过塑料芯片并且通过立柱的迷宫、排列或阵列时，剪切力可被最小化（图40），以便减小对细胞的任何进一步损害，或防止细胞从它们与诸如抗体的表面结合部分的相互作用中脱离出来。在其流过芯片表面时，血液中以数十亿比一的比例在数目上超过CTC的正常细胞组分也可对被捕获的CTC施加巨大的物理力。障碍物阵列可排布成能保持之前设计的高捕获效率，并且进一步降低对通过阵列的细胞的剪切力（图15），降低对被捕获的细胞的拖曳力（图14），并提高捕获横截面以促进更强的亲和捕获（图13）。障碍物阵列可排布成能促进均一流体流过整个通道，并使细胞暴露于障碍物，以根据捕获发生的区域进行亲和捕获和大小捕获。而且，这些设计可允许保持高流速而不发生总捕获效率的显著降低（图19、图20和图21）。此外，微流体装置的表面可在比之前所用的方法更短的时间内用结合部分进行功能化（图22和图23）。另外，这些设计可在相关的大小范围内提供细胞捕获的冗余度，这可以提供关于细胞是通过何种方式被捕获的信息，例如通过大小或亲和性（图16和图17和图18和图20）。
本发明的装置可用于产生富含具有期望的流体动力学大小的细胞或颗粒的样品。此种富集的应用包括浓缩CTC或其他感兴趣的细胞，和大小分级分离，例如大小过滤（选择特定大小范围内的细胞）。装置还可用于富集细胞或颗粒的组分，例如，细胞核和本文所述的其他构成性碎片化细胞组分。理想地，本发明的方法可保留与初始混合物相比至少约50%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的期望颗粒，同时相对于一种或多种非期望的颗粒而言可能富集期望的颗粒至少约100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或甚至100,000,000倍。理想地，若装置除富集的样品以外还产生任何输出样品，则此额外的输出样品可包含与初始混合物相比少于约50%、25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的期望颗粒，或甚至不包含期望颗粒。富集还可导致富集的颗粒与原始样品相比的稀释，尽管富集颗粒的浓度相对于样品中的其他颗粒而言可能已经增加。优选地，稀释可以最多约为90%，例如，最多约为75%、50%、33%、25%、10%或1%。
本文所述的微流体装置可以结合诸如通过固定的结合部分（例如抗-EpCAM抗体）的亲和捕获和诸如通过具有各种间隙大小的立柱梯度系统的大小捕获两者。由于肿瘤细胞的异质性，这种双重捕获机制可能很有价值。此外，许多细胞或颗粒特异性的靶向部分的表达水平可能显著变化，例如，通过采用本文所述的装置的方法所捕获的肿瘤细胞在其表面上的EpCAM表达。例如，一些CTC可表达高水平的EpCAM，而其他CTC可表达低水平的或无法检测的水平的EpCAM。本发明的设计可允许对这些细胞和颗粒，甚至对具有靶向部分低表达的细胞和颗粒进行有效总捕获和亲和性介导的捕获（图24和图25）。这些设计不仅可以促进亲和捕获，而且允许对捕获的细胞和颗粒进行表征，并允许更加稳定的长期制造。
现已知不是所有的CTC都表达EpCAM（EpCAM-），因此不能采用涂覆在微流体装置表面上的EpCAM结合部分根据亲和性进行捕获。EpCAM-细胞及EpCAM+细胞都可在本发明的装置中被捕获，因为这些装置可以基于大小和亲和性来捕获细胞。因此，单独的基于亲和性的捕获可以选择CTC的高表达亚群。此外，肿瘤细胞还在大小上有所不同，小的细胞能够通过捕捉大于特定直径的细胞的过滤器。采用双重机制可以允许捕获任一单独机制可能漏过的细胞。捕获更多的细胞可以允许对这些细胞进行更多、更全面的表征。
本文所述的任何微流体装置可包含输入端、输出端和障碍物阵列，其中该阵列可以配置为在使掺杂样品以一定的流速流过本发明的任何装置时，捕获至少约80%的表达特定靶向部分的细胞或颗粒，这些细胞或颗粒已经掺入一定体积（例如7.5mL）的不含表达该靶向部分的细胞或颗粒的血液样品中。例如，该阵列可以配置为在使掺杂样品以0.25mL/hr或更高的流速流过本发明的任何装置时，捕获至少约80%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的表达特定靶向部分的细胞或颗粒，这些细胞或颗粒已掺入一定体积（例如7.5mL）的不含表达该靶向部分（如EpCAM）的细胞或颗粒的血液样品中。该靶向部分可以是表1中的任何靶向部分或任何可与期望捕获的细胞或颗粒特异性结合的部分，例如EpCAM。样品通过本文所述的任何微流体装置的流速可以是至少约0.01ml/hr或至少约0.25ml/hr，例如0.01mL/hr、0.02mL/hr、0.03mL/hr、0.04mL/hr、0.05mL/hr、0.06mL/hr、0.07mL/hr、0.08mL/hr、0.09mL/hr、0.1mL/hr、0.15mL/hr、0.2mL/hr、0.3mL/hr、0.4mL/hr、0.5mL/hr、0.6mL/hr、0.7mL/hr、0.8mL/hr、0.9mL/hr、1mL/hr、1.1mL/hr、1.2mL/hr、1.3mL/hr、1.4mL/hr、1.5mL/hr、1.6mL/hr、1.7mL/hr、1.8mL/hr、1.9mL/hr、2mL/hr、2.1mL/hr、2.2mL/hr、2.3mL/hr、2.4mL/hr、2.5mL/hr、2.6mL/hr、2.7mL/hr、2.8mL/hr、2.9mL/hr、3mL/hr、3.1mL/hr、3.2mL/hr、3.3mL/hr、3.4mL/hr、3.5mL/hr、3.6mL/hr、3.7mL/hr、3.8mL/hr、3.9mL/hr、4mL/hr、4.1mL/hr、4.2mL/hr、4.3mL/hr、4.4mL/hr、4.5mL/hr、4.6mL/hr、4.7mL/hr、4.8mL/hr、4.9mL/hr、5mL/hr、6mL/hr、6.5mL/hr、7mL/hr、7.5mL/hr、8mL/hr、8.5mL/hr、9mL/hr、9.5mL/hr、10mL/hr、10.5mL/hr、11mL/hr、11.5mL/hr、12mL/hr、12.5mL/hr、13mL/hr、13.5mL/hr、14mL/hr、14.5mL/hr或15mL/hr。微流体装置可以设计成使得超过约50%，例如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的被捕获细胞可在阵列的上游部分、区段或区域中被捕获。微流体装置可以设计成使得超过约10%，例如15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的被捕获细胞可以基于大小而不是基于亲和性被捕获。微流体装置可以设计成使得超过约10%，例如15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的被捕获细胞可以基于亲和性而不是大小被捕获。基于大小的捕获可通过确定发生捕获的阵列内的位置、部分、区段或区域来确定。作为一个非限制性实例，在阵列的下游半区内捕获的细胞可以称为是根据大小而不是亲和性被捕获的。
本文所述的任何微流体装置可包含输入端、输出端和障碍物阵列，其中该阵列可以配置为在使掺杂样品以一定的流速流过本发明的任何装置时，捕获至少约80%的细胞或颗粒，如CTC，这些细胞或颗粒已经掺入一定体积的样品中，例如1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL、8mL、8.5mL、9mL、9.5mL、10、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、21mL、22mL、23mL、24mL、25mL、26mL、27mL、28mL、29mL、30mL、31mL、32mL、33mL、34mL、35mL、36mL、37mL、38mL、39mL或40mL体积的样品中。例如，该阵列可以配置为在使掺杂样品以0.25mL/hr或更高的流速流过本发明的任何装置时，捕获至少约80%，例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的细胞或颗粒，这些细胞或颗粒已经掺入一定体积的样品中，例如1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL、8mL、8.5mL、9mL、9.5mL、10、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、21mL、22mL、23mL、24mL、25mL、26mL、27mL、28mL、29mL、30mL、31mL、32mL、33mL、34mL、35mL、36mL、37mL、38mL、39mL或40mL体积的样品中。该靶向部分可以是表1中的任何靶向部分，或例如EpCAM。流速可以是至少约0.01ml/hr或至少约0.25ml/hr，例如，0.01mL/hr、0.02mL/hr、0.03mL/hr、0.04mL/hr、0.05mL/hr、0.06mL/hr、0.07mL/hr、0.08mL/hr、0.09mL/hr、0.1mL/hr、0.15mL/hr、0.2mL/hr、0.3mL/hr、0.4mL/hr、0.5mL/hr、0.6mL/hr、0.7mL/hr、0.8mL/hr、0.9mL/hr、1mL/hr、1.1mL/hr、1.2mL/hr、1.3mL/hr、1.4mL/hr、1.5mL/hr、1.6mL/hr、1.7mL/hr、1.8mL/hr、1.9mL/hr、2mL/hr、2.1mL/hr、2.2mL/hr、2.3mL/hr、2.4mL/hr、2.5mL/hr、2.6mL/hr、2.7mL/hr、2.8mL/hr、2.9mL/hr、3mL/hr、3.1mL/hr、3.2mL/hr、3.3mL/hr、3.4mL/hr、3.5mL/hr、3.6mL/hr、3.7mL/hr、3.8mL/hr、3.9mL/hr、4mL/hr、4.1mL/hr、4.2mL/hr、4.3mL/hr、4.4mL/hr、4.5mL/hr、4.6mL/hr、4.7mL/hr、4.8mL/hr、4.9mL/hr、5mL/hr、6mL/hr、6.5mL/hr、7mL/hr、7.5mL/hr、8mL/hr、8.5mL/hr、9mL/hr、9.5mL/hr、10mL/hr、10.5mL/hr、11mL/hr、11.5mL/hr、12mL/hr、12.5mL/hr、13mL/hr、13.5mL/hr、14mL/hr、14.5mL/hr或15mL/hr。微流体装置可以设计成使得超过约50%，例如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的被捕获细胞可在阵列的上游半区内被捕获。微流体装置可以设计成使得超过约10%，例如15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的被捕获细胞可以基于大小而不是亲和性被捕获。基于大小的捕获可通过确定发生捕获的阵列内的位置、部分、区段或区域来确定。作为一个非限制性实例，在阵列的下游半区内捕获的细胞可以称为是根据大小而不是亲和性被捕获的。
本文所述的任何微流体装置可包含输入端、输出端和障碍物阵列，该障碍物阵列能够捕获至少约60%的掺入正常血液样品中的CTC，其中该装置用一定体积的、浓度为20μg/mL的一种或多种结合部分如抗体的溶液涂覆。抗体溶液的体积可以为约100μL至约1mL或2mL，例如100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、550μL、600μL、650μL、700μL、750μL、800μL、850μL、900μL、950μL、1mL、1.5mL或2mL。抗体溶液的浓度可以为约1μg/mL至约100μg/mL，例如1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL或100μg/mL。该微流体装置可能能够捕获至少约60%的掺入正常血液样品中的CTC，例如至少约65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的掺入正常血液样品中的CTC。
表1用于表征具有间充质特征的CTC的标记物
表1续
Figure BDA0000378240280000301
本发明的装置和方法可采用与各种细胞群的其他特异性标记物结合的其他结合部分捕获多种细胞群，例如EpCAM-和EpCAM+细胞（图29）。作为一个非限制性的实例，间充质细胞特异性的结合部分可用对于间充质特异性细胞受体为特异性的结合部分进行捕获。另外，在一些方面，EpCAM-和EpCAM+细胞可仅根据大小而不根据亲和性进行捕获。
泵送
可主动或被动地驱动流体通过本文所述的任何微流体装置。可采用电场、离心场、压力驱动的流体流动、电渗流动、毛细管作用或其任意组合来泵送流体。流体流动的平均方向可以平行于含有阵列的通道的壁。
该装置可采用负压泵送，例如使用注射泵、蠕动泵、抽吸器或真空泵。负压可允许处理全体积的临床血液样品，而不会在通道中残留未处理的样品。例如来自于注射泵、蠕动泵、容积式泵、流体柱或其他流体泵的正压力也可以用于泵送样品通过装置。与正压泵送有关的死体积问题所导致的样品损失可通过用缓冲液驱逐残留样品而克服。泵通常可以通过密封，例如使用硅胶垫圈与装置接合。
装置中并联通道内的流体的流速可以统一或单独控制。对一个或两个或更多个通道中的流速进行可变且差异的控制是可以实现的，例如通过采用多通道可单独控制的注射器歧管。可以修改输入通道分布以解耦所有并联网络。输出端可以通过连接至抽吸装置（对于空气密封则不需要）的单个歧管收集来自所有通道的输出物，以使其输出到收集瓶中或一个或多个其他微流体装置中。或者，来自一个或两个或更多个网络的输出物可单独收集以供下游处理。单独的输入端和输出端允许对取自一个或两个或更多个个体的多个样品进行并行处理。
多种策略可以运用于用微流体装置进行的样品处理，其中剪切力可被最小化而流速可以最佳地被最大化（图40）。在一种过程中，气压调节泵可附接于血液来源，并可推送血液通过微流体装置。一种替代方法还可与捕获兼容，并最小化剪切力。第二种方法包含微流体装置，其中血液可被调节流量泵（例如通过使用本文所述泵）牵引穿过芯片。该过程的另一个创新可能是在紧接装置入口端口之前引入了管道的混合部分。这种专门的入口管道配置可以促进细胞在进入前的悬浮和混合，这类似于血液的微涡旋现象。
制造
多种技术可用于制造本发明的装置，并且所采用的技术将部分根据所选的材料进行选择。用于制造本发明装置的示例性材料包括玻璃、硅、钢、镍、聚(甲基丙烯酸甲酯)（PMMA）、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚烯烃、硅酮（例如，聚(二甲基硅氧烷)）、环烯烃共聚物（COC）、环烯烃聚合物（COP）、绝缘体上硅（SOI）晶片及其组合。其他材料在本领域中是已知的。在一些上述这些材料中制造通道的方法在本领域中是已知的。这些方法可包括，光刻法（例如，立体光刻法或X射线光刻法）、模塑法、显微注射成型法、激光烧蚀、压印法、热及冷压印法、硅微加工、湿式或干式化学蚀刻、铣削、金刚石切割、光刻电镀成型（Lithographie Galvanoformung and Abformung，LIGA）和电镀。例如，对于玻璃，可采用光刻法的传统硅制造技术，随后进行湿式（KOH）或干式蚀刻（采用氟或其他反应性气体的反应性离子蚀刻）。诸如激光微加工的技术可用于光子吸收效率高的塑料材料。由于该过程的串行特性，此技术可适用于较低通量制造。对于大批量生产的塑料装置，热塑性注射成型和压缩成型可以适用。用于大批量制造光盘（其保留亚微米级的特征的保真度）的常规热塑性注射成型也可用于制造本发明的装置。例如，可通过本发明的任何技术，例如，传统的光刻法，采用原坯或玻璃母版来复制、制作或模塑该装置的特征。玻璃母版可被电铸以产生坚韧的、耐热冲击的、导热的硬模。模具，即成型的原坯，可作为用于将这些特征注射成型或压缩成型到塑料装置内的母版模板。根据用来制造装置的材料以及对制成品的光学质量和通量的需求，可以选择压缩成型或注射成型作为制造方法。
压缩成型（也称为热压印或凸版印刻）可具有与高分子量聚合物相容的优点，其对于小型结构可能非常出色，但是可能难以用于复制高纵横比的结构且可能具有较长的循环时间。注射成型对于高纵横比的结构可能表现良好，但可能最适用于低分子量聚合物。
装置可制造成一个或多个随后可组装的工件。该装置单独的层可包含用于单一流体的通道。装置的层可通过夹钳、粘合剂、热、阳极键合、紫外线暴露、紫外线/臭氧处理、电阻加热、感应焊接、溶剂粘合、激光焊接技术或表面基团之间的反应（例如，晶片键合）而结合在一起。或者，在多于一个平面上具有通道的装置可制成单件，例如，采用立体光刻或其他三维制造技术。
该装置可以是光学透明的，或者带有透明窗口，用于在细胞流过该装置之前、期间或之后的可视化。该装置的顶部和底部表面可以是彼此平行的。障碍物可以是底部或顶部表面的一部分，并且可以限定流动通道的高度。将障碍物的一部分放置在底部表面，其余部分放置在顶部表面也是可能的。障碍物可以同时接触腔室的顶部和底部，或者障碍物与一个表面之间可能存在间隙。这些障碍物可用结合部分涂覆，例如，抗体、带电荷聚合物、结合细胞表面受体的分子、寡核苷酸或多肽、病毒或细菌蛋白质、核酸或碳水化合物，该结合部分能结合混合物中的一群细胞，例如表达特异性表面分子的细胞群。其他可用的、对于特定类型细胞或颗粒特异性的结合部分在本领域中是已知的。这些障碍物可由能与特定类型细胞结合的材料制造而成。这类材料的非限制性实例可包括有机聚合物（带电荷或不带电荷的）和碳水化合物。一旦结合部分、连接体或其任意组合与障碍物偶合，也可以对该障碍物的任一暴露表面应用如本文所述的涂覆，以防止细胞与障碍物的非特异性粘附。
本文所述的富集装置还可包括可以选择性拆卸的、光学透明的、清晰的或者光学不透明的盖子。此外，装置的底层或侧面或者障碍物阵列也可以是光学透明的。这可以允许在障碍物附近或上方设置的光学检测装置分析滞留在阵列中的细胞。使用透明盖可以允许对该装置中与细胞或颗粒结合的可检测部分的可视化。任何微流体装置的盖子可密封于装置，或者可以是可移除的。例如，当细胞在捕获后将在装置中培养时，可以在装置中培养细胞前移开盖子，或可在采用别处及本文所述方法从装置中移取靶细胞后移开盖子。盖子可由塑料、胶带、玻璃或任何其他常规材料制成。该装置还可包含密封。密封可由粘合剂、闩扣或热成型连接中的至少一个组成。密封可用于细胞的后续捕获或装置中细胞的分析或计数/可视化。因此，优选地，该装置具有可拆卸的透明盖子、密封以及光学透明的底层和障碍物阵列。
支撑柱
本发明的一个目的在于，任何所述微流体装置可包含输入端、输出端和设置于其间的障碍物阵列，并且在阵列中进一步包含一个或多个支撑柱。该支撑柱阵列可以足够密集以提供结构支撑并防止较大的气隙出现，但可能不象等效于发生细胞捕获的装置区域那么密集。支撑柱可从由入口到阵列起点的区域（仓室）延伸，不留任何其中能困住空气的大间隙（即，小于500-1000μm的间隙），否则该装置的结构，例如盖子，可能在制造过程中或样品处理的压力积累过程中瓦解。与一个或多个阵列捕获区相比，支撑柱可具有较低的密度，因此具有较低的流体阻力。此设计可避免此区域中的高剪切力，因为支撑柱占据了腔室（例如，仓室）的一部分，该部分可能不是该装置的最宽处，因此细胞可以比在捕获区阵列中更快地移动通过含有支撑柱的区域。
支撑柱可以大于捕获区内的阵列中的最大障碍物。每个支撑柱可以具有至少约100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400微米的直径，和至少约300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600微米的中心距。
每个支撑柱可以具有至少约30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、28、290或300微米的直径，和至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500微米的中心距。
每个支撑柱可以具有至少约60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300微米的直径，并且与输入端可以间隔小于约1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550或500微米。支撑柱距离输入端可以小于约450、400、350、300、250、200、150、100或50微米。
支撑柱的排布可能依装置用途的应用或一个或多个捕获区内障碍物的排布而变化。支撑柱可具有与阵列中或装置的捕获区带中排列的障碍物不同的样式。支撑柱可具有与装置的捕获区带中排列的障碍物类似的样式。例如，支撑柱可以以有序阵列、随机阵列、正方形阵列、三角形阵列、交错阵列或者矩形阵列样式化。
支撑柱可以与一个或多个其他支撑柱间隔至少约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200微米，或比捕获区带内阵列中障碍物之间的任意间距大至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的距离。
仓室形状
本发明的任何微流体装置中的区域（其可以位于输入端与捕获区始端之间，或者位于捕获区末端与输出端之间）可被定义为仓室，且形状上可以不同。例如，这些区域的形状可以是圆形、正方形、矩形、三角形或其他任何形状。仓室形状可以设计成有助于铺开从入口端口到阵列全宽的流动，以使细胞可以在装置的整个宽度上均匀分布。仓室形状可以设计成有助于预处理装置，以使该装置可以填充，同时使气穴的形成和滞留达到最小化。仓室区域可被支撑柱占据，以使盖子可在装配和样品处理过程中得到支撑。这些支撑柱可以是较低密度的，这样细胞从入口（较高线性流速）移动到捕获区域（较低线性流速）时可以不用暴露于较高剪切力。
障碍物排布
本公开内容提供了用于从体液或其他细胞样品中回收稀有细胞或其他靶生物分子的微流体装置，其中并入了至少一个专门构建的微通道装置。这些装置可用基底来构建，该基底可形成具有通道样流动路径，在收集区域中引入多个横向固定的障碍物或立柱。这些障碍物可与基底成为一体，并且在通道的上下表面之间延伸。障碍物可以以各种阵列样式排布，以中断流过其间的直线（层）流，或其中正常通过阵列的流线流被中断，从而提高在整个收集区域与立柱的碰撞频率。障碍物在大小，例如横截面直径上可以是不同的。可选择用于捕获所需靶生物分子并由此将其在微通道的收集区域内进行收集的结合部分或螯合剂可附着于横向立柱表面，整个仓室，或其组合。可以在一个基底上制造多个微通道，并且通过使用连接通道和阀门，可使用单个设备进行细胞分离、分析、诊断或其任意组合的一体化操作。这种类型的多微通道排布也可用于两步或多步纯化过程，例如通过一连串通过含有障碍物的上游和下游收集区域的流动从同一液体样品中分离超过一种的靶细胞亚群，其中这些区域可用不同螯合剂涂覆。
本发明的微流体装置以可形成间隙网络的二维障碍物阵列为特征，其中障碍物阵列可位于离输入端最近的、含有支撑柱的区域的下游，并且包含多行障碍物。障碍物阵列的一些非限制性实例可见图49。
T7.2
T7.2阵列设计可包含升级的仓室几何结构和支撑柱和夹点或间隙，该夹点或间隙通过障碍物中的上下移动而创建，用于分布间隙位置（图1）。
微流体装置可包含样品输入端、样品输出端、支撑柱以及位于其间的障碍物阵列，其中障碍物阵列包含第一间隙和第二间隙，其中第二间隙可小于第一间隙并且可以以重复样式位于阵列中，使得第二间隙出现在阵列中每第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八列柱子以内，其中一列障碍物可包含微流体装置的宽度上的所有障碍物，或在微流体装置的任一给定长度处、垂直于流动方向的所有障碍物。障碍物间的第一间隙距离可以是至少约9、10、11、12、13、14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。障碍物间的第二间隙距离可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59微米。第二间隙距离可在制造过程中通过产生一列或多列障碍物的上下移动而采用，以使柱子可以放置得比标准阵列中更加靠近前一列，从而产生更小的间隙或夹点。这些间隙可见于该列的每个柱子处，并在整列可被移动时可延伸至通道的全宽，如图1所示。
障碍物可具有均一的或不同的直径，至少约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99,100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米。
C5.2
C5.2阵列设计可包含升级的仓室几何结构和支撑柱、阵列区域间的渐变过渡，并可包含通过障碍物中的上下移动或向上移动或向下移动而创建的夹点或间隙，以及位于最后一个捕获区域的障碍物之后的额外的支撑柱（图3）。
微流体装置可包含样品输入端、样品输出端、支撑柱以及位于其间的障碍物阵列，其中该阵列可具有多个区域（图3）。该多个区域可包含第一区域，该第一区域包含在第一区域中的多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙，其中第二间隙可小于第一间隙，并且可以以重复样式位于阵列中，使得第二间隙出现在阵列中每第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八列柱子以内，其中一列障碍物可包含微流体装置的宽度上的所有障碍物，或在微流体装置的任一给定长度处、垂直于流动方向的所有障碍物。第一区域中障碍物间的第一间隙距离可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第一区域中障碍物间的第二间隙距离可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。
第一区域中的障碍物可具有均一的或不同的直径，至少约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米。
多个区域可包含具有均匀分布的障碍物且其间有单一间隙的第二区域。第二区域可位于第一区域下游。多个区域可进一步包含一个或多个位于第二区域下游的额外区域。该一个或多个额外区域可具有均匀分布的、其间有单一间隙的障碍物，其中间隙距离可以从第二区域到额外区域的每个下游阵列逐渐变小。第一、第二或后续间隙可以以对称样式、均一样式、重复样式或非均一样式分布。
第二区域的特征可在于障碍物间的第二间隙距离可小于第一区域中的第一或第二间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第三区域的特征可在于障碍物间的第三间隙距离可小于第二间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第四区域的特征可在于障碍物间的第四间隙距离可小于第三间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第五区域的特征可在于障碍物间的第五间隙距离可小于第四间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第六区域的特征可在于障碍物间的第六间隙距离可小于第五间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第七区域的特征可在于障碍物间的第七间隙距离可小于第六间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。
一个或多个额外区域可具有均匀分布的、其间有单一间隙的障碍物，其中每个区域中障碍物的直径可以是均一的或不同的，并且可以从第一或第二区域到额外区域的每个下游阵列逐渐变小。例如，一个区域内的每个障碍物可具有均一的或不同的直径，至少约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米，其中障碍物直径可以从第一或第二区域到额外区域的每个下游阵列逐渐变小。
T7.3
T7.3阵列设计可包含升级的仓室几何结构和支撑柱、横穿整个阵列的均一的夹点或间隙，以及由数目减少的无活性障碍物列创建的增加的间隙密度（图2）。
微流体装置可包含样品输入端、样品输出端以及位于其间的障碍物阵列，该阵列具有位于障碍物的子集之间的第一间隙和位于障碍物的第二子集之间的第二间隙，其中第一间隙可大于所述第二间隙，并且其中第二间隙可在这个阵列中以均一的、非随机的样式分布（图2）。第二间隙可以以重复或对称的样式分布。第二间隙可以分布成使得第二间隙的中心形成穿过流动方向的虚拟线。第二间隙可在阵列的仓室中的每隔一列障碍物中出现，其中一列障碍物可包含微流体装置的宽度上的所有障碍物，或在微流体装置的任一给定长度处、垂直于流动方向的所有障碍物。障碍物间的第一间隙距离可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。障碍物间的第二间隙距离可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第二间隙距离可在制造过程中通过产生一列或多列障碍物的上下移动而采用，以使柱子可以放置得比标准阵列中更加靠近前一列，从而产生更小的间隙或夹点。这些间隙可见于该列的每个柱子处，并在整列被移动时可延伸至整个通道宽度。
障碍物可具有均一的或不同的直径，至少约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米。
C5.3
C5.3设计可包含升级的仓室几何结构和支撑柱，以及多个区域，在每个区域中具有两倍或三倍或四倍的间隙冗余度，其中可能存在间隙中较低的剪切力和对被捕获细胞的较低的拖曳力（图4）。在一个方面，C5.3阵列可被描述成梯度T7阵列。
微流体装置可包含样品输入端、样品输出端、支撑柱以及位于其间的障碍物阵列，其中阵列可具有多个区域（图4）。该多个区域可包含第一区域，该第一区域包含在第一区域中多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙。
第一间隙和第二间隙可以与上文描述的不同。所述多个区域可包含第二区域，该第二区域具有均一的障碍物分布，其具有可以与上游区域的第一间隙相同的第一间隙和第三间隙，其中第三间隙可以小于它们之间的上游区域的第二间隙。第二区域可位于第一区域的下游。所述多个区域可进一步包含一个或多个位于第一和第二区域下游的额外区域。该一个或多个额外区域可具有均一分布的、其间具有第一间隙和额外间隙的障碍物，该第一间隙可与直接上游区域的第一（较大的）间隙相同，而其中额外间隙距离可以从直接上游区域的第二（较小的）间隙到额外区域的每个下游阵列逐渐变小，如图4所示。第一、第二或后续间隙可以以对称样式、均一样式、重复样式或非均一样式分布。
一个或多个额外区域可具有均一分布的、其间具有单一间隙的障碍物，其中每个区域中障碍物的直径可以是均一的，并且可以从第一或第二区域到额外区域的每个下游阵列逐渐变小。例如，一个区域内的每个障碍物可具有均一的或不同的直径，至少约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米。
多个区域可包含两个或更多个区域，每一个都具有均一分布的、其间具有第一和第二间隙的障碍物，其中这两种间隙距离的第二种可从第一区域中这两种间隙距离的第二种到额外区域的每个下游阵列逐渐变小。所有区域中的障碍物之间的第一间隙距离在所有区域中可以是均一的，且可以是至少约14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第一区域中的障碍物之间的第二间隙距离可以是至少约14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44微米。第二间隙距离可在制造过程中通过产生一列或多列障碍物的向上或向下移动而采用，以使柱子可以放置得比标准阵列中更加靠近前一列，从而产生更小的间隙或夹点。这些间隙可见于该列的每个柱子处，并在整列被移动时可延伸至整个通道宽度。
第二区域的第二间隙的特征可在于每隔一列障碍物之间的第三间隙距离可小于直接上游区域的第二（较小的）间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第三区域的第二间隙的特征可在于每隔一列障碍物之间的第四间隙距离可小于直接上游区域的第二（较小的）间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第四区域的第二间隙的特征可在于每隔一列障碍物之间的第五间隙距离可小于直接上游区域的第二（较小的）间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第五区域的第二间隙的特征可在于每隔一列障碍物之间的第六间隙距离可小于直接上游区域的第二（较小的）间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第六区域的第二间隙的特征可在于每隔一列障碍物之间的第七间隙距离可小于直接上游区域的第二（较小的）间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。第七区域的第二间隙的特征可在于每隔一列障碍物之间的第八间隙距离可小于直接上游区域的第二（较小的）间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60微米。
包含第二较小间隙的障碍物可具有迎角。迎角可以是间隙相对于流动方向的角度。迎角可随间隙大小增加或减小而改变，例如，迎角可随间隙大小增加或减小而变得更大或更小。迎角可以是90°或小于90°、89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、79°、78°、77°、76°、75°、74°、73°、72°、71°、70°、69°、68°、67°、66°、65°、64°、63°、62°、61°、60°、59°、58°、57°、56°、55°、54°、53°、52°、51°、50°、49°、48°、47°、46°、45°、44°、43°、42°、41°、40°、39°、38°、37°、36°、35°、34°、33°、32°、31°、30°、29°、28°、27°、26°、25°、24°、23°、22°、21°、20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在一些方面，迎角可以是约20°-40°、21°-40°、22°-40°、23°-40°、24°-40°、25°-40°、26°-40°、27°-40°、28°-40°、29°-40°、20°-39°、20°-38°、20°-37°、20°-36°、20°-35°、20°-34°、20°-33°、20°-32°、20°-31c、20°-30°、20°-29°、20°-28°、20°-27°、20°-26°、20°-25°、20°-24°、20°-23°、20°-22°或20°-21°。迎角可以是约30°-40°、30°-39°、30°-38°、30°-37°、30°-36°、30°-35°、30°-34°、30°-33°、30°-32°、30°-31°、31°-40°、32°-40°、33°-40°、34°-40°、35°-40°、36°-40°、37°-40°、38°-40°或39°-40°。
CS1.1
CS1.1设计可包含支撑柱和升级的仓室几何结构，其中支撑柱在仓室中可具有中等密度以协助预处理过程，且其中阵列的始端和末端可以是100%的通道宽度（图5）。
微流体装置可包含样品输入端、样品输出端、支撑柱以及位于其间的障碍物阵列，其中至少障碍物的子集可排布成簇。所有的或几乎所有的障碍物可以成簇，如图5所示。簇可以以非均一的、非随机的或重复的样式排布。
每个簇可包含至少三个障碍物，其中簇中相邻障碍物间的距离可以小于该簇与其相邻簇间的距离。每个簇可包含至少三个或至少四个或至少五个障碍物，其中簇中相邻障碍物间的距离可以小于该簇与其相邻簇间的距离。簇中相邻障碍物间的距离在阵列中可以是均一的。例如，簇中相邻障碍物间的均一距离可以小于约40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9或8微米。
簇中障碍物间的最大距离可以比第一簇和与第一簇相邻的第二簇之间的最小距离小至少三倍、四倍、五倍、六倍、七倍或八倍。
簇与其相邻簇之间的距离可以为约24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245或250微米，其中簇中相邻障碍物间的距离可以小于该簇与其相邻簇之间的距离。
阵列中的障碍物可包含具有各种不同大小，例如各种不同直径或横截面的障碍物。阵列中的每一个障碍物可具有均一的或不同的直径，至少约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米。
阵列可包含至少约80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400个彼此相邻的簇。
簇在沿流动方向的第一方向上可比垂直于流动方向的第二方向上具有更长的尺寸。簇在垂直于流动方向的第一方向上可比沿流动方向的第二方向上具有更长的尺寸。簇可以定位成使得第一簇可位于第二簇的上游居中。第二簇的中心可以以与流动方向水平线呈90°或小于约90°、89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、79°、78°、77°、76°、75°、74°、73°、72°、71°、70°、69°、68°、67°、66°、65°、64°、63°、62°、61°、60°、59°、58°、57°、56°、55°、54°、53°、52°、51°、50°、49°、48°、47°、46°、45°、44°、43°、42°、41°、40°、39°、38°、37°、36°、35°、34°、33°、32°、31°、30°、29°、28°、27°、26°、25°、24°、23°、22°、21°、20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°的角度偏离第一簇的中心。
由至少三个或至少四个或至少五个障碍物组成的簇可以具有第一和第二迎角。该第一和第二迎角各自可以为90°或小于约90°、89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、79°、78°、77°、76°、75°、74°、73°、72°、71°、70°、69°、68°、67°、66°、65°、64°、63°、62°、61°、60°、59°、58°、57°、56°、55°、54°、53°、52°、51°、50°、49°、48°、47°、46°、45°、44°、43°、42°、41°、40°、39°、38°、37°、36°、35°、34°、33°、32°、31°、30°、29°、28°、27°、26°、25°、24°、23°、22°、21°、20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在一些方面，该第一和第二迎角各自可以为约20°-40°、21°-40°、22°-40°、23°-40°、24°-40°、25°-40°、26°-40°、27°-40°、28°-40°、29°-40°、20°-39°、20°-38°、20°-37°、20°-36°、20°-35°、20°-34°、20°-33°、20°-32°、20°-31°、20°-30°、20°-29°、20°-28°、20°-27°、20°-26°、20°-25°、20°-24°、20°-23°、20°-22°或20°-21°。该第一和第二迎角各自可以为约30°-40°、30°-39°、30°-38°、30°-37°、30°-36°、30°-35°、30°-34°、30°-33°、30°-32°、30°-31°、31°-40°、32°-40°、33°-40°、34°-40°、35°-40°、36°-40°、37°-40°、38°-40°或39°-40°。这些描述和样品流动路径的实例可以参见图9、图12、图13和图39。
C5.4
C5.4设计可包含升级的仓室几何结构和支撑柱，以及多个区域，在每个区域中具有四倍或五倍或六倍或七倍或八倍的间隙冗余度，其中可能存在间隙中更低的剪切力和对被捕获细胞的更低的拖曳力，并且其中阵列的始端和末端可以是100%的通道宽度以增加捕获长度（图6）。
微流体装置可包含样品输入端、样品输出端、支撑柱以及位于其间的障碍物阵列，其中该阵列可包含多个区域，其中至少障碍物的子集可以成簇排布（图6）。一个或多个区域中所有的或基本上所有的障碍物可以成簇。区域可以串联排布。在一个方面，区域可以成并联排布。在一个方面，如图11所示，区域可以分成两个或更多个单独的腔室或部分。每个腔室或在每个腔室的阵列中的区带内的障碍物簇可具有不同的特征。例如，每个区域中的簇可具有不同直径大小的柱子、簇内一个或多个障碍物之间不同的间隙距离、簇间不同的间隙（间隔）距离、不同的连接角、上游或下游簇之间的不同角度、一个或多个簇中的障碍物之间的不同角度、不同的功能化（例如，连接体和结合部分）或其组合。
阵列可包含多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个区域。簇可以以非均一的、非随机的或重复的样式排布。每个簇可包含至少三个或至少四个或至少五个障碍物。其他簇排布的非限制性实例可参见图8、图9和图10。
阵列中的障碍物可包含各种大小（例如各种直径或横截面）的障碍物。阵列中的每个障碍物可具有均一的或不同的直径，至少约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米。
阵列区域中的每个障碍物的直径可以是非均一的或均一的，并且在每个下游阵列区域中可以是相同大小的或逐渐变小的。例如，任何区域中的每个障碍物可具有均一的或不同的直径，至少约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米，其中障碍物直径可从第一或第二区域到额外区域的每个下游阵列逐渐变小。
障碍物簇中的一个或多个障碍物的直径可以是非均一的。如图8（下图）所示，障碍物簇中的一个或多个障碍物可以大于或小于障碍物簇中的一个或多个其他障碍物的直径。例如，障碍物簇中的一个或多个障碍物的直径可以是至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米，并且障碍物簇中的一个或多个其他障碍物的直径可以是至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145或150微米，其中该簇中其他障碍物的直径具有比相同簇中一个或多个障碍物更大的直径。
每个区域中的簇可具有不同的特征。例如，每个区域中的簇可具有不同直径大小的柱子、簇中一个或多个障碍物之间不同的间隙距离、簇间不同的间隙（间隔）距离、不同的连接角、上游和下游簇之间的不同角度、一个或多个簇中障碍物之间的不同角度或其组合。
所述多个区域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的区域，每个区域具有均一分布的障碍物簇，在簇中的一个或多个障碍物之间具有间隙距离，其中区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离可从区域的簇内的一个或多个障碍物之间的间隙距离到额外区域的阵列的每个下游区域逐渐变小，如图10和图41中所示。
在所有区域中的障碍物簇之间的间隙距离在所有区域上可以是均一的，并且可以为至少约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245或250微米。
每个区域中障碍物簇之间的间隙距离可不同于任何其他区域中障碍物簇之间的间隙距离，并且可以为至少约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、76、77、78、79、80、81、82、83、84、88、86、87、88、89、90、91、92、93、94、99、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245或250微米，其中区域中障碍物簇之间的间隙距离可以与直接上游区域的障碍物簇之间的间隙距离相同，或比之更小或更大。例如，第一区域中的障碍物簇之间的间隙距离可以是140微米，第二区域中的障碍物簇之间的间隙距离可以是130微米，第三区域中的障碍物簇之间的间隙距离可以是120微米，第四区域中的障碍物簇之间的间隙距离可以是110微米，第五区域中的障碍物簇之间的间隙距离可以是100微米，第六区域中的障碍物簇之间的间隙距离可以是90微米，第七区域中的障碍物簇之间的间隙距离可以是80微米，而第八区域中的障碍物簇之间的间隙距离可以是70微米。
第一区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离可以是至少约14、15、15.75、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44微米。第二区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离可以小于直接上游区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离，并且可以是至少约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43微米。第三区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离可以小于直接上游区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离，并且可以是至少约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42微米。第四区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离可以小于直接上游区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离，并且可以是至少约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41微米。第五区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离可以小于直接上游区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离，并且可以是至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40微米。第六区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离可以小于直接上游区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离，并且可以是至少约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39微米。第七区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离可以小于直接上游区域的簇中的一个或多个障碍物之间的间隙距离，并且可以是至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38微米。
簇在沿流动方向的第一方向上可比垂直于流动方向的第二方向上具有更长的尺寸。簇在垂直于流动方向的第一方向上可比沿流动方向的第二方向上具有更长的尺寸。簇可以定位成使得第一簇可以位于第二簇的上游居中。第二簇的中心可以以与流动方向水平线小于90°、89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、79°、78°、77°、76°、75°、74°、73°、72°、71°、70°、69°、68°、67°、66°、65°、64°、63°、62°、61°、60°、59°、58°、57°、56°、55°、54°、53°、52°、51°、50°、49°、48°、47°、46°、45°、44°、43°、42°、41°、40°、39°、38°、37°、36°、35°、34°、33°、32°、31°、30°、29°、28°、27°、26°、25°、24°、23°、22°、21°、20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°的角度偏离第一簇的中心。
由至少三个或至少四个或至少五个障碍物组成的簇可具有第一和第二迎角。第一和第二迎角各自可以小于90°、89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、79°、78°、77°、76°、75°、74°、73°、72°、71°、70°、69°、68°、67°、66°、65°、64°、63°、62°、61°、60°、59°、58°、57°、56°、55°、54°、53°、52°、51°、50°、49°、48°、47°、46°、45°、44°、43°、42°、41°、40°、39°、38°、37°、36°、35°、34°、33°、32°、31°、30°、29°、28°、27°、26°、25°、24°、23°、22°、21°、20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在一些方面，第一和第二迎角各自可以为约20°-40°、21°-40°、22°-40°、23°-40°、24°-40°、25°-40°、26°-40°、27°-40°、28°-40°、29°-40°、20°-39°、20°-38°、20°-37°、20°-36°、20°-35°、20°-34°、20°-33°、20°-32°、20°-31°、20°-30°、20°-29°、20°-28°、20°-27°、20°-26°、20°-25°、20°-24°、20°-23°、20°-22°或20°-21°。第一和第二迎角各自可以为约30°-40°、30°-39°、30°-38°、30°-37°、30°-36°、30°-35°、30°-34°、30°-33°、30°-32°、30°-31°、31°-40°、32°-40°、33°-40°、34°-40°、35°-40°、36°-40°、37°-40°、38°-40°或39°-40°。这些描述和样品流动路径的实例可见于图9、图12、图13和图39。
过渡区
所述的任何阵列可进一步包含位于第一区域和第二区域之间的过渡区。过渡区（图3）可以是其中包含不同障碍物大小、直径、间距或样式的2个区域或阵列结合在一起的区域，并且阵列之间的空间可包含排布为从一个区域或阵列到另一个区域或阵列形成逐渐的或非逐渐的变化的柱子。过渡区可允许流体从一个区域到另一个区域运动，同时最小化或防止预处理或装置操作期间气穴的形成。过渡区可包含不同大小的障碍物。过渡区可位于仓室内的一个区域和仓室内的另一区域之间。过渡区可以位于仓室的区域和包含支撑柱的一个或多个区域之间。过渡区可以位于装置中的任意两个区域之间。过渡区可包含能够捕获细胞和本文所述的其他颗粒的障碍物。
入口/出口
端口是指装置中的开口，流体样品或任何其他流体可通过其进入或离开该装置。端口可以具有任何尺寸，但优选地可以具有允许通过泵送流体穿过导管（或管或管道）或借助于移液管、注射器或其他分配或输送样品的工具将样品或期望的流体或两者分配至腔室中的形状和尺寸。
入口可以是样品、溶液、缓冲液或试剂进入流体室如本文所述的微流体装置的入口点。入口可以是端口，或者可以是直接或间接通向自动化系统的腔室中的导管中的开口。
出口是指样品、样品成分、试剂、液体或废物离开流体室如本文所述的微流体装置的开口。离开腔室的样品成分和试剂可以是废物，即，不能进一步使用的样品成分，或者可以是待回收的样品成分或试剂，例如可重复使用的试剂或有待进一步分析、操作或捕获的靶细胞。出口可以是腔室如本文所述的微流体装置的端口，或者是直接或间接地从自动化系统的腔室引来的导管中的开口。
装置可包含与障碍物的单个阵列和流体样品相关联的多个入口、多个出口或其组合。装置可包含与用于串联或并联地或以这两种方式处理单个样品或多个样品或两者的障碍物的多个阵列相关联的多个入口、多个出口或其组合。
本文所述的任何微流体装置阵列的入口和出口可流体连接至一个或多个额外的阵列。例如，入口或出口可流体连接至一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个额外的阵列。
顶层可由玻璃制成，并且可具有为了入口和出口流动而超声钻出的两个狭缝。狭缝入口/出口尺寸可以是，例如，2cm长0.5mm宽。然后可将歧管并至入口/出口狭缝上。入口歧管例如通过柔性、生物相容性管道接收来自输注注射泵或其他任何递送装置的血液样品。类似地，出口歧管可连接至储器以收集离开该装置的溶液和细胞。
可以多种方式设计入口和出口配置和几何结构。例如，可采用圆形入口和出口。然后可将无障碍物的入口区并入该设计内，以确保当血液细胞到达障碍物所位于的区域时能够均匀分布。类似地，出口可以设计为具有无障碍物的出口区域，以便均匀地、无损害地收集离开的细胞。
本文的富集装置还可包括一个或多个入口端口和一个或多个出口端口。端口可以是用于将流体递送至富集模块（如障碍物阵列）或从富集模块移取流体的任何区域。入口或入口端口是指可用于将流体递送至富集模块的模块或开口。出口或出口端口是指可用于从富集模块移取流体的模块或开口。装置可包括入口和出口，并且具有等于或小于第二宽度的流动路径宽度的障碍物区域可以围绕出口。
表面化学
传统上，用于将蛋白质固定至载体如板上的技术涉及在聚L-赖氨酸表面上物理吸附蛋白质，或通过将醛、羧基或环氧基引入玻璃、硅、塑料等的表面、随后使这些官能团与蛋白质的氨基反应制备基底材料来固定蛋白质。前一方法具有以下缺点：由于物理吸附的弱作用力，蛋白质容易从基底上剥离；由于高的非特异性吸附而具有较高的背景噪声。后一方法同样具有以下缺点：虽然共价键的使用消除了固定化的蛋白质的剥离，但该过程涉及有害试剂，并且固定化的蛋白质通常遭受结构和功能的损害；由于高的非特异性吸附，也常常观察到高背景噪声。更重要的是，这些技术是针对蛋白质-蛋白质相互作用开发的，它们在蛋白质-细胞相互作用中的表现不是最佳的（例如，与固体载体表面的空间干扰）。
本发明涉及对表面进行涂覆并随后用捕获剂（例如抗体）对表面进行功能化的过程，以及这类固定化的捕获剂用于从血液和其他生物流体中基于亲和性地富集细胞、颗粒和其他分析物的应用。捕获剂可以是蛋白质（如抗体）以及核酸和其他化合物。该过程可以针对蛋白质-细胞/颗粒相互作用进行特别优化。非特异性吸附可能很低，而细胞的特异性亲和捕获可能很高。该过程还可设计为提供捕获剂的最优空间呈现。
对于该过程的一部分，本发明可利用生物素-抗生物素蛋白相互作用，并因此提供了与该相互作用相关的额外益处。通过将抗生物素蛋白（或链霉抗生物素蛋白或NeutrAvidin）固定至固体载体上，可在使用前将生物素化的蛋白质或其他化合物正确固定。这可消除对保持捕获剂的生物活性的需要，为最终用户提供了根据他们的需求、没有额外过程和成本地选择捕获剂如特异性抗体或不同抗体的混合物的灵活性，并且可提供通过使用脱硫生物素（其可与常规生物素有效地竞争）温和地释放被捕获的材料以供进一步分析的机会。
本文所述的任何微流体装置的阵列、障碍物、表面或其任意组合可偶合至一个或多个结合部分，该一个或多个结合部分选择性地结合一个或多个细胞或颗粒或一种或多种类型的细胞或颗粒。例如，结合部分可以是选择性结合一种或多种上皮细胞、癌细胞、骨髓细胞、胚胎细胞、祖细胞、干细胞、泡沫细胞、间充质细胞、免疫系统细胞、内皮细胞、子宫内膜细胞、结缔组织细胞、营养细胞、细菌、真菌或病原体的抗体（例如，单克隆抗-EpCAM抗体或其片段）。该装置的所有障碍物可包括这些结合部分，或者备选地，障碍物的子集可包含这些结合部分。
结合部分可包括但不限于抗体、抗体衍生物、蛋白质、肽、拟肽、类肽、核酸（例如，DNA、RNA、PNA或寡核苷酸）、DNA和RNA适体、肽适体、配体、蛋白质（例如，受体、肽、酶、酶抑制剂、酶底物、抗体或免疫球蛋白）、抗原、凝集素、修饰的蛋白质、修饰的肽、生物胺、复合糖、合成分子或与细胞或颗粒结合以便捕获至本发明的任何微流体装置的任何其他形式的分子。基于抗体的结合部分可以是抗体的任何合适的形式，例如，单克隆的、多克隆的或合成的。基于抗体的结合部分可包括任何结合靶标的抗体片段以及肽体（peptibodies），肽体是工程化的治疗分子，可与人药物靶标结合并且含有与抗体恒定域连接的肽。
一个或两个或三个或四个或五个或六个或七个或八个或更多个不同的结合部分可位于阵列中的相同障碍物上、阵列中的不同障碍物上、阵列中的不同位置处或其任意组合。同样，两个或三个或四个或五个或六个或七个或八个区域可具有相同的一组结合部分，但具有不同的浓度。
为了将结合部分偶合至障碍物表面，在表面修改之前可将基底暴露于氧等离子体以产生层，例如结合部分可附着至其上的二氧化硅层。存在除上述方法之外的多种技术，通过这些技术可将结合部分固定至障碍物以及装置的表面上。可使用向表面上的简单物理吸附。另一种方法可使用可以用多种结合部分进行功能化的自组装单层（例如，金上的硫醇）。可根据所结合的结合部分和用于制造该装置的材料而使用其他方法。表面修饰方法是本领域已知的。此外，某些细胞可优先结合至未改变的材料表面。例如，一些细胞可优先结合至带正电荷的、带负电荷的、亲水性的或疏水性的表面，或结合至某些聚合物中存在的化学基团上。本文所述的任何装置的表面可以是塑料或COC。
一个或多个结合部分可直接地或间接地附着至富集装置。在一些情况下，结合部分（或其子集）可通过连接体或更优选地通过可裂解的连接体附接至该装置。连接体可包含官能团。官能团可包括缩醛、乙酰氧基、乙炔化物、酸酐、活化基团、酰氯、酰卤、缩羰酯（acylals）、偶姻、酰基硅烷、醇、醛、醛亚胺、烷烃、烯烃、醇盐、烷基环烷烃、烷基亚硝酸酯、炔烃、丙二烯、酰胺、脒、缩醛胺、胺、氧化胺、叠氮化物、吖嗪、氮丙啶、氧化偶氮化物、双官能团的、二硫代缩氨基脲、缩二脲、硼酸、氨基甲酸酯、卡巴肼、卡宾、甲醇、碳酸酯、羰基、甲酰胺、甲酰亚胺（carboximidates）、羧酸、氯甲酸酯、累积多烯、氰酸酯、氰亚胺、氰醇、氨甲酰基、去活化基团、缩酚酸、重氮基、二醇、二硫代氨基甲酸酯、烯胺、烯二炔、烯醇、烯醇醚、烯酮、烯炔、环硫化物、环氧化物、酯、醚、氟磺酸盐、卤代醇、卤代酮、半缩醛、半缩醛胺、半硫缩醛、酰肼、羟肟酸、羟基、羟胺、亚胺、亚胺鎓（iminiums）、烯酮、烯酮亚胺、酮、羰游基、内酰胺、内半缩醛、内酯、次甲基、甲基、硝酸盐/酯、腈内鎓盐、腈亚胺、硝基化合物、硝基胺、氮酸酯、硝酮、硝鎓离子、亚硝胺、亚硝基、原酸酯、脎、氧杂吖丙啶、肟、n-氧代铵盐、过氧化物、过氧酸、稳定卡宾、苯酚、磷酸烯烃、磷酸炔烃、磷酸盐、亚磷酸盐、膦、氧化膦、次膦酸盐（phosphinites）、膦酸盐、亚膦酸盐、磷鎓、正膦、s-亚硝基硫醇、席夫碱、硒醇、硒酸、selones、氨基脲、缩氨基脲、烯醇硅醚、硅醚、次磺酰胺、次磺酸、烃基硫化氯、硫化物、硫亚胺、亚磺酰胺、亚磺酸、亚硫酸酯、磺酰胺（化学）、磺酰苯胺、磺酸盐、磺酰基、磺酰卤、亚砜、磺酸内酯、碲醇（tellurols）、硫醛、硫缩醛、硫代酰胺、硫代氨基甲酸酯、硫代羧基、硫氰酸酯、硫代酸酯、硫醚、酮缩硫醇、硫酮、硫醇、硫代内酯、硫脲、甲苯磺酰腙、三氮烯、三醇、脲、香草基、黄原酸盐、内鎓盐、ynolates或其任意组合。
如本领域所知，连接体可具有不同的长度和不同的结构；通常，参见Hermanson,G.T.,"Bioconjugate Techniques",Academic Press:New York,1996；和S.S.Wong,"Chemistry of Protein Conjugation andCross-linking",CRC Press,1993以及美国专利7,138,504，每一个均并入本文。连接基团可具有一系列结构、取代基、取代模式或其任意组合。例如，它们可以用含有氮、氧或硫的基团衍生化，这些基团可以从连接基团主链伸出或者可以是连接基团主链的组成部分。实例包括聚醚、多元酸（聚丙烯酸、聚乳酸）、多元醇（例如，甘油）、多胺（例如，精胺、亚精胺）和含有多于一个氮、氧或硫部分的分子（例如，1,3-二氨基-2-丙醇、牛磺酸）或其任意组合。参见，例如，Sandler等人.Organic Functional Group Preparations第二版,Academic Press,Inc.San Diego1983。众多的单功能化、二功能化和双功能化聚（乙二醇）分子是可购买到的。参见，例如，1997-1998Catalog,ShearwaterPolymers,Inc.,Huntsville,Ala。此外，本领域技术人员在它们的合成库中可获得大量容易实施的、有用的修改策略。参见，例如，Harris,Rev.Macromol.Chem.Phys.,C(3),325-373(1985)；Zalipsky等人,Eur.Polym.J.,19(12),1177-1183(1983)；1992年6月16日授予Zalipsky的美国专利5,122,614；1997年7月22日授予Dolence等人的美国专利5,650,234，以及其中的参考文献。
众多的连接化学法可用于将分子连接至各种各样的固体或半固体颗粒载体元件上。预期技术人员可根据预期应用选择适当的化学法。连接体可通过多种化学键中的任何一种而附接至固体基底上。例如，连接体可使用碳-碳键任选地连接至固体基底上，例如通过具有(聚)三氟氯乙烯表面或硅氧烷键（使用例如玻璃或二氧化硅作为固体基底）的基底。可通过带有三氯硅烷基或三烷氧基硅烷基的衍生化试剂的反应来形成与基底表面的硅氧烷键。可基于例如其亲水/疏水性质来选择特定连接基团，其中连接的聚合物在溶液中的呈现可以是令人满意的。能够适合于附接至连接基团的基团可包括但不限于胺、羟基、硫醇、羧酸、酯、酰胺、异氰酸酯和异硫氰酸酯。其他衍生化基团包括氨基烷基三烷氧基硅烷、羟基烷基三烷氧基硅烷、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇及其组合。使用本领域已知的方法可将许多硅氧烷功能化试剂上的反应性基团转化为其他有用的官能团。参见，例如，Leyden等人,Symposium on Silylated Surfaces,Gordon&Breach1980；Arkles,Chemtech7,766(1977)和Plueddemann,Silane CouplingReagents,Plenum,N.Y.,1982。其他的起始材料和反应方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的（美国专利6,632,655）。
对于某些抗体的Fc部分展现出高亲和力的适体、亲和体或其他连接体可用于将抗体或抗体片段连接至固体物上（例如，美国专利5,831,012）。
细胞结合装置可用于消耗某些细胞群体的出口流，或用于捕获表达某种表面分子的细胞或大于某一大小的细胞的特定群体以供进一步分析，该大小取决于微流体装置的障碍物的一个或多个间隙大小。可从腔室中去移取与障碍物结合的细胞以进行均一细胞群体的进一步分析。可通过引入一个或多个额外的与流动方向正交的入口和出口来完成这种移取。可通过在具有较高剪切力的增加的流速下净化该腔室而从腔室中移取细胞，以克服细胞和障碍物之间的结合力。其他方法可涉及偶合具有可逆结合性质的结合部分，例如，该结合部分可由pH、温度或电场来驱动。结合部分或结合在细胞表面上的分子还可通过酶促或其他化学手段来切割。
许多可裂解的连接体，包括酸可裂解的连接体、光或“光照（photo）”可裂解的连接体和酶可裂解的连接体等，是本领域已知的。阵列中的测定组分的固定化通常可通过可裂解的连接体基团例如光不稳的、酸或碱不稳的连接体基团来进行。因此，例如可在细胞流入输出装置之前通过暴露于释放剂如光、酸、碱等而使细胞从装置或障碍物阵列中释放出来。通常，连接基团可用于在装置的合成期间连接聚合物或其他测定组分。因此，在有机或水性条件或其组合下连接体可工作良好，但在特定裂解条件下容易裂解。任选地，连接体上可设有具有活性可裂解位点的间隔区。促进固体载体上聚合物合成的连接基团和提供其他有利于生物学测定的性质的连接基团是已知的。连接体通过例如暴露于酸或碱的方式提供可裂解功能。此外，连接体任选地在连接体与阵列中固体基底连接处相对的一端具有活性位点。在聚合物合成期间可任选地使用保护基保护活性位点。在众多可能有用的保护基中有硝基藜芦基（NV OC）、a-甲基硝基藜芦基（Menvoc）、烯丙氧基羰基（ALLOC）、芴甲氧基羰基（FMOC）、cc-甲基硝基-胡椒基氧羰基（MeNPOC）、-NH-FMOC基、叔丁酯、叔丁醚等。各种示例性保护基在例如Atherton等人,(1989)Solid Phase Peptide Synthesis,IRLPress和Greene,等人.(1991)Protective Groups In Organic Chemistry,第二版,John Wiley&Sons,New York,N.Y.中有所描述。用于将材料偶合至本发明的颗粒上的偶合化学可以是可光控的，即，利用光反应性化学。使用光反应性化学和掩蔽策略来激活分子与基底的偶合以及其他光反应性化学是公知的（例如，用于将生物聚合物偶合至固相材料上）。光可裂解的保护基和光掩蔽的使用允许所固定的阵列膜的类型转换，即，通过改变存在于装置上的基底的存在（即，响应于光）（美国专利6,632,655）。
可裂解的连接体可包含生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/NeutrAvidin、生物素/CaptAvidin Ig-蛋白A、光不稳定的连接体、酸或碱不稳定的连接体基团、适体、亲和体或对于某些抗体的Fc部分展现出高亲和力的其他连接体中的至少一种，可用于将抗体或抗体片段连接至固体物（例如，美国专利5,831,012）。本文所述的任何富集装置可用可裂解的连接体来覆盖，所述可裂解的连接体包含NeutrAvidin、抗生物素蛋白、CaptAvidin或链霉抗生物素蛋白。例如，可裂解的连接体可包含连接至微流体装置的NeutrAvidin、抗生物素蛋白、CaptAvidin或链霉抗生物素蛋白和生物素-多核苷酸-抗-EpCAM部分。生物素可用于脱硫生物素偶联物和捕获的细胞或结合在其上的颗粒的竞争性释放。脱硫生物素可用于生物素或其他生物素偶联物和捕获的细胞或结合在其上的颗粒的竞争性释放。在一个实例中，抗EpCAM抗体如下：将生物素-多核苷酸-抗-EpCAM部分连接至覆盖有抗生物素蛋白的富集装置上。可裂解的连接体可包含DNA连接体。选择性裂解（如限制性内切酶）或非特异性裂解（如DNA酶）DNA连接体的核酸序列中的核酸序列的酶可用于从表面释放细胞、细胞碎片或感兴趣的颗粒。
微流体装置的表面，包括障碍物阵列的表面、盖子、端口或其一些组合，可以涂覆（例如直接或间接地连接）或偶合至至少一种或两种或更多种结合部分。可将两种或更多种此类试剂的组合固定至微流体装置的表面上作为两种或更多种实体的混合物或可连续加入。微流体装置的表面可用一种或更多种阻断剂进行处理。例如，微流体装置的表面可用过量的Ficoll或任何其他合适的阻断剂进行处理，以当检测可被微流体装置滞留的一个或多个稀有细胞时降低产生背景信号的颗粒滞留。
本文所述的任何微流体装置可包含用抗体涂覆的障碍物阵列，其中装置的表面在至少约10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48小时内具有小于约15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°的接触角。本文所述的任何微流体装置的表面可用碳水化合物涂覆或功能化。碳水化合物可包括葡聚糖、葡聚糖-水凝胶、其他葡聚糖衍生物、壳多糖、壳聚糖、藻酸盐、纤维素、甲基纤维素、HA、淀粉、肝素、琼脂糖、伴刀豆球蛋白A、胼胝质或昆布多糖、金藻昆布多糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖、半乳甘露聚糖或其衍生物。碳水化合物在表面上可具有以下浓度：约0.01%-5%，例如，0.01%-4%、0.01%-3.75%、0.01%-3.5%、0.01%-3.25%、0.01%-3%、0.01%-2.75%、0.01%-2.5%、0.01%-2.25%、0.01%-2%、0.01%-1.75%、0.01%-1.5%、0.01%-1.25%、0.01%-1%、0.01%-0.75%、0.01%-0.5%、0.01%-0.25、0.05%-2%、0.05%-1.9%、0.05%-1.8%、0.05%-1.7%、0.05%-1.6%、0.05%-1.5%、0.05%-1.4%、0.05%-1.3%、0.05%-1.2%、0.05%-1.1%、0.05%-1%、0.05%-0.9%、0.05%-0.8%、0.05%-0.7%、0.05%-0.6%、0.05%-0.5%、0.05%-0.4%、0.05%-0.3%、0.05%-0.2%或0.05%-0.1%（w/w）。
碳水化合物可具有以下分子量：约1K-70K或约10K-70K道尔顿，例如，15K-70K、20K-70K、25K-70K、30K-70K、35K-70K、40K-70K、45K-70K、50K-70K、55K-70K、60K-70K、65K-70K、10K-15K、10K-20K、10K-25K、10K-30K、10K-35K、10K-40K、10K-45K、10K-50K、10K-55K、10K-60K或10K-65K道尔顿。表面可用PEG涂覆。PEG可具有以下分子量：约1K-100K道尔顿，例如，5K-100K、10K-100K、15K-100K、20K-100K、25K-100K、30K-100K、35K-100K、40K-100K、45K-100K、50K-100K、55K-100K、60K-100K、65K-100K、70K-100K、75K-100K、80K-100K、85K-100K、90K-100K、95K-100K、1K-5K、1K-10K、1K-15K、1K-20K、1K-25K、1K-30K、1K-35K、1K-40K、1K-45K、1K-50K、1K-55K、1K-60K、1K-65K、1K-70K、1K-75K、1K-80K、1K-85K、1K-90K、1K-95K、5K-15K、5K-20K、5K-25K、5K-30K、5K-35K、5K-40K、5K-45K、5K-50K、5K-55K、5K-60K、5K-65K、5K-70K、5K-75K、5K-80K、5K-85K、5K-90K、5K-95K、10K-15K、10K-20K、10K-25K、10K-30K、10K-35K、10K-40K、10K-45K、10K-50K、10K-55K、10K-60K、10K-65K、10K-70K、10K-75K、10K-80K、10K-85K、10K-90K或10K-95K道尔顿。本发明还涉及聚合物水凝胶涂覆的固体载体，该载体可包含用于附接PEG或双功能PEG的活性位点。本发明还涉及使用PEG或双功能PEG固定蛋白质（抗体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、CaptAvidin、NeutrAvidin）和使用抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、CaptAvidin或NeutrAvidin固定生物素化的生物分子（例如生物素化的抗体）。
表面可用两种或三种或四种或五种或六种或七种或八种或更多种不同的聚合物涂覆。第一种聚合物可以是碳水化合物，第二种聚合物可以是聚乙二醇（PEG），例如，第一种聚合物可以是葡聚糖，第二种聚合物可以是PEG。PEG和碳水化合物可分别具有以下摩尔比：约1:10、2:10、3:10、4:10、5:10、6:10、7:10、8:10、9:10、10:1、10:2、10:3、10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9或1:1。在一些方面，表面可进一步包含结合部分，例如抗生物素蛋白、NeutrAvidin、链霉抗生物素蛋白、CaptAvidin或任何生物素结合蛋白质。NeutrAvidin上的氨基可与氧化的葡聚糖反应并形成共价双键，当其被还原为单键时对于长期储存来说是稳定的。结合部分可与碳水化合物（例如，葡聚糖）共价或非共价结合。结合部分可通过连接体例如生物素-PEG-NHS、生物素-PEG-COOH或生物素-PEG-SH、生物素-PEG-X（其中X可以为胺结合基团或本文所述的其他基团）与碳水化合物结合。本文所述的任何微流体装置可包含用抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物涂覆的障碍物阵列。作为非限制性实例，生物素-PEG-NHS交联体的NHS基团可与氨基-葡聚糖反应并形成稳定的键。NeutrAvidin然后可结合至生物素-PEG-NHS交联体的生物素端（图33和图34）。该方法可提供直接共价连接的优势，例如，由于NeutrAvidin通过NeutrAvidin上的一个或多个NH2基团而连接，因此可降低NeutrAvidin的功能性和结合效率。如图35、图36和图48以及图53所示，生物素-PEG-NHS交联体可消除该因素，并因此NeutrAvidin可更好地起作用。PEG的长度和柔性可通过将位阻最小化来促进亲和结合事件和稀有细胞的捕获，并减少非特异性结合事件。表面涂层的功能性和方法的非限制性实例在图34中示出。
本文所述的任何微流体装置可包含偶合至一种或多种结合部分例如抗体的塑性表面，其中该结合部分距塑性表面可以平均大于或约大于PEG2或PEG3长度。
用于捕获和释放感兴趣的细胞、细胞碎片或颗粒的方法可包括使包含感兴趣的细胞、细胞碎片或颗粒的样品流过用碳水化合物和配体涂覆的表面，该碳水化合物和配体能选择性结合在感兴趣的细胞、细胞碎片或颗粒上选择性存在的细胞表面标记物，以及使用选择性裂解该碳水化合物的酶或化学品，从而从表面释放感兴趣的细胞或细胞碎片。例如，葡聚糖酶可用于释放如上所述利用连接至葡聚糖的结合部分而捕获的细胞和颗粒。选择性裂解碳水化合物的其他酶和化学品可包括但不限于糖基转移酶、糖苷水解酶、转糖苷酶、磷酸化酶、裂合酶或酸如高碘酸。在一些方面，在通过本文公开的任何方法释放后，细胞保持存活并可在培养中生长（图32，下图）。
亲水性连接体在水性环境中可伸展并可提供最大的柔性/溶解度以及对固定化抗体的活性。可以使用基于PEG和葡聚糖二者的交联体。除了PEG的高亲水性之外，葡聚糖具有独特的性质，因为其在对细胞、蛋白质、DNA和RNA几乎不造成损害至不造成损害的温和条件下可被葡聚糖酶溶解。该性质可用来从用于高级研究的芯片上释放捕获的稀有物质，如CTC，和其他癌症生物标记物。
另一种选择可以是亲水性的、光可裂解的交联体或仅仅是光可裂解的交联体。二者均可用于物质从血液中的光诱导释放。
制造
微流体装置可在多步制造过程中制造。可通过几种关键技术来实施该过程。在蚀刻的母版形成后，可以塑成硅胶模具。然后可执行一系列定制的过程步骤，包括热压印、表面预处理和结合部分功能化、抗体稳定化、输入/输出端口组装和胶带组装。可指定倒装硅胶模具或其他模具并用于生产运行，并可定期更换。可使用热压印过程对塑料微流体装置进行模塑。在从模具中取出后，可从柔性芯片上剪掉多余的塑料，而后准备进行功能化。微流体装置的外部尺寸可与下游成像相匹配。
细胞结合装置可由不同的材料制成。根据材料的选择，也可使用不同的制造技术。装置可使用热压印技术由塑料如聚苯乙烯制成。可将障碍物和其他结构压印入塑料中以产生底面。而后可将顶层与底层粘合。注射成型是可用于产生这种装置的另一种方法。软光刻技术也可用于产生由聚(二甲基硅氧烷)（PDMS）制成的整个腔室，或仅可在PDMS中产生障碍物，而后将其粘合至玻璃基底以产生密闭室。再另一种方法涉及利用环氧树脂浇铸技术，通过在具有预期结构的复制阴模的母版上使用UV或温度可固化的环氧树脂而产生障碍物。激光或其他类型的微加工方法也可用于产生流动室。在装置的制造中可使用的其他合适的聚合物可以是聚碳酸酯、聚乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)。此外，金属如钢和镍也可用于例如通过传统的金属加工来制造本发明的装置。可采用三维制造技术（例如，立体光刻法）制造一体式装置。其他制造方法是本领域已知的。
流动装置还可通过将顶层粘合至含有障碍物的微制造的硅上而产生。顶部基底可以是玻璃，以在捕获期间及之后提供对细胞的目视观察。热粘合或UV固化的环氧树脂可用于产生流动室。顶部和底部也可以压缩配合，例如，使用硅橡胶垫圈。这种压缩配合可以是可逆的。其他粘合方法（例如，晶片键合）是本领域已知的。所采用的方法可以取决于所用材料的性质。
下游分析
在用一个或多个本发明的装置富集之后，可通过多种方法例如核酸分析对细胞、细胞组分（例如，蛋白质、DNA和RNA）、细胞碎片（例如，细胞膜和细胞器）或其他微粒（例如，具有含EpCAM表面的微粒）进行计数、收集或分析（图28、图31A和31B以及图38）。在分析之前还可对样品进行处理。在一个非限制性实例中，可将细胞收集在平面基板上以进行荧光原位杂交（FISH），而后进行细胞固定和成像。可用于标记感兴趣的细胞的标记试剂的实例包括但不限于抗体、量子点、噬菌体、适体、含荧光团的分子、核酸结合剂、能够进行可检测的化学反应的酶或功能化珠。通常，标记试剂小于感兴趣的细胞，或与珠结合的感兴趣的细胞；因此，当将与标记试剂组合的细胞样品引入该装置时，游离的标记试剂无偏转地穿过该装置并从一个或多个出口端出来，而结合的标记试剂可与细胞一起保留。在引入装置之前标记样品可促进下游样品分析，而无需释放步骤或破坏性的分析方法。非靶细胞不会干扰依赖于结合的标记试剂的检测的下游样品分析，因为该试剂选择性地与感兴趣的细胞结合。通过本领域已知的多种方法，例如酶促反应、核酸杂交、聚合酶链反应（PCR）、等温DNA扩增等，可增强本发明的检测方法。
可增强一种或多种细胞的富集。例如，可用免疫亲和珠来标记一种或多种细胞，从而增加该一种或多种细胞的大小。在上皮细胞例如循环肿瘤细胞的情况下，这可进一步增加它们的大小，并因此可导致更有效的富集。或者，可将更小的细胞的大小增加至一定程度，以致它们成为溶液中最大的物体或与细胞样品的其他组分相比占据独特的大小范围，或使得它们能与其他细胞共纯化。标记的靶细胞的流体动力学大小可比缺乏标记的这种细胞的流体动力学大小大至少约10%、100%或甚至1,000%。珠可由聚苯乙烯、磁性材料或可粘附于细胞的任何其他材料制成。此类珠可具有中性浮力以致不会破坏标记的细胞通过本发明装置的流动。
分析方法可包括核酸分析、蛋白质分析或脂质分析。分析方法还可包括如图28（下图）所示的细胞计数、细胞形态学、复型（pleomorphism）、体细胞突变、细胞粘附、细胞迁移、结合、分裂、RNA表达、核酸突变、微小RNA表达和谱分析、来自细胞裂解物或个体细胞中的酶活性、蛋白质表达、蛋白质修饰（例如，磷酸化和糖基化）、线粒体异常、细胞谱分析、遗传谱分析或核基质蛋白的端粒酶活性或水平中一种或多种的分析。
细胞计数可导致对所分析的样品中靶细胞数目的精确确定。为了产生精确的定量结果，在感兴趣的细胞上所靶向的表面抗原通常具有已知的或可预测的表达水平，并且标记试剂的结合应以可预测的方式进行，而避免干扰性物质。因此，在引入标记试剂之前产生高度富集的细胞样品的本发明方法可能是有用的。此外，由于血流中的靶细胞如上皮细胞（例如，CTC）具有小迎角，所以可使用允许放大所产生的信号的标记试剂。允许信号放大的试剂包括酶、蛋白质、核酸和噬菌体。不允许方便的放大但却会产生强信号如量子点的其他标记试剂也可在本发明的方法中使用。
可确定样品中两种细胞类型的比值，例如，癌细胞与内皮细胞的比值。该比值可以是每种类型的细胞的数目的比值，或者可以是每种类型细胞的任何测定的特征的比值。
用来执行分析方法的分析技术可包括许多分析技术。标记可用于检测细胞样品的组分。标记可以是与针对表1中所列的任何标记物的抗体相偶联的标记。标记可与被内化或吸收的分析物结合。标记可包括可检测标记并且是本领域已知的。可基于电磁学、机械性质、电性质、形状、形态、颜色、荧光、发光、磷光、吸光度、磁特性或放射性发射或其任意组合来检测可检测的标记。
作为非限制性实例，光敏标记可包括量子点、荧光染料或吸光分子。荧光染料可包括Cy染料、Alexa染料或其他含有荧光团的分子。量子点，例如来自QuantumDot Corp.的
Figure BDA0000378240280000681
也可用作标记。Qdots耐受光漂白并且可与双光子激发测量结合使用。而后可使用荧光计或荧光显微镜检测荧光染料。还可使用表面增强共振拉曼散射（SERRS）特异性的标签。基于电、磁、视觉、放射性、机械和光的检测技术是本领域公知的，并且可用于检测本公开内容中的多种标记。或者，含有发色团的标记可与分光计例如UV分光计或可见光分光计结合使用。获得的测量值可用于量化样品中靶细胞或所有细胞的数目。或者，可确定样品中两种细胞或颗粒类型的比值，例如，癌细胞与内皮细胞的比值。该比值可以是每种类型的细胞或颗粒的数目的比值，或者可以是每种类型细胞或颗粒的任何测定的特征的比值。
物理技术如大小过滤、密度梯度离心和微观形态学可与诸如以下的任何生物技术或分析技术结合使用：免疫磁性分离、流式细胞术、免疫荧光显微镜检查、逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）、聚合酶链反应（PCR）、荧光显微镜检查、荧光原位杂交（FISH）、比较基因组杂交（CGH）、基于PCR的技术、生物标记物免疫荧光染色技术和本领域已知的其他技术（在Sun等人,Journal of Cancer Researchand Clinical Oncology,137:1151-1173(2011)中综述）。
标记可具有能裂解底物的共价结合的酶。底物一旦被裂解，就可在给定波长下具有改变的吸光度。而后可例如利用分光计对裂解的程度进行量化。根据所使用的底物，可进行比色或发光读取。测定的信号可能高于检测阈值。酶标记的使用可使测定的信号显著放大并可降低检测阈值。
因此，本发明涉及包含一个或多个本文的富集模块以及选自以上所述的任何标记的一组标记的试剂盒。装置还可包括可流动连接的额外模块，例如，细胞计数模块或检测模块。例如，检测模块可配置为用于可视化该装置的输出样品。本发明的装置每小时可处理超过20mL的流体或甚至每小时50mL流体。
理想地，下游分析导致对所分析的样品中靶细胞数目的精确确定。为了产生精确的定量结果，在感兴趣的细胞上所靶向的表面抗原通常具有已知的或可预测的表达水平，并且标记试剂的结合也应以可预测的方式进行，以避免干扰性物质。因此，在引入标记试剂之前产生高度富集的细胞样品的本发明方法可能是特别有用的。此外，由于血流中的靶细胞如上皮细胞（例如，CTC）具有小迎角，所以允许放大所产生的信号的标记试剂是优选的。允许信号放大的试剂包括酶和噬菌体。不允许方便的放大但却会产生强信号如量子点的其他标记试剂也是期望的。
本发明的方法允许同一组细胞的富集、量化和分子生物学分析。在本发明的装置中对细胞的温和处理与所述的批量测量（bulkmeasurement）方法相结合可维持细胞的完整性，以使得需要时可进行进一步的分析。例如，在批量测量之后可执行破坏细胞完整性的技术；这类技术包括DNA或RNA分析、蛋白质组分析或代谢物组分析。例如，可测定样品中DNA或RNA的总量；或者，可检测DNA或RNA中特定序列或突变如缺失的存在，例如，编码多肽的基因中的突变。此外，可分析样品中的线粒体DNA、端粒酶或核基质蛋白（关于癌症中的线粒体突变，参见，例如，Parrella等人,Cancer Res.61:7623-7626(2001)，Jones等人,Cancer Res.61:1299-1304(2001)和Fliss等人,Science287:2017-2019(2000)；关于端粒酶，参见，例如，Soria等人,Clin.Cancer Res.5:971-975(1999)）。例如，可分析样品以确定是否存在任何线粒体异常（参见，例如，Carew等人,Mol.Cancer1:9(2002)和Wallace,Science283:1482-1488(1999)）或核周区室。用于分析DNA的一种有用的方法可以是PCR，其中将细胞裂解，并扩增特定DNA序列的水平。当分离的靶细胞的数目非常低时，这类技术可能是特别有用的。可采用细胞内PCR；此外，可使用基因表达分析（参见，例如，Giordano等人,Am.J.Pathol.159:1231-1238(2001)和Buckhaults等人,Cancer Res.63:4144-4149(2003)）或荧光原位杂交，例如，用以确定作为所分析的细胞的来源的一种或多种组织。可使用任何上述技术测定众多的细胞特征，如蛋白质磷酸化、蛋白质糖基化、DNA甲基化（参见，例如，Das等人,J.Clin.Oncol.22:4632-4642(2004)）、微小RNA水平（参见，例如，He等人,Nature435:828-833(2005)，Lu等人,Nature435:834-838(2005)，O'Donnell等人,Nature435:839-843(2005)和Calin等人,N.Engl.J.Med.353:1793-1801(2005)）、细胞形态或其他结构特征，例如，复型、粘附、迁移、结合、分裂、基因表达水平和体细胞突变的存在。可对许多细胞，包括感兴趣的单个细胞例如癌细胞，进行该分析。此外，可分析细胞的大小分布。可对来自同一受试者或不同受试者的一个以上的样品进行下游分析，例如，检测。
在血液中发现的细胞为各种各样的类型并跨越一系列的大小。使用本发明的方法，可能区分、按大小分类和计数血液细胞群，例如，CTC。例如，可使用Coulter计数器。在一些条件下，例如，在体内存在剥落肿瘤细胞的肿瘤的情况下，非血液原有的细胞可出现于外周循环中。分离和计数可出现在血液中的大细胞或其他期望的细胞的能力为诊断疾病症态提供了很好的机会。理想地，Coulter计数器或其他细胞检测器可以流体连接至本发明装置的出口，并且细胞样品可引入本发明的装置中。流过流体连接至Coulter计数器的出口的细胞随后通过Coulter孔口，其包括由细胞所通过的开口隔开的两个电极，并且当每个细胞通过该开口时测量位移的体积。优选地，Coulter计数器确定富集样品中细胞体积大于500fL的细胞的数目。或者，Coulter计数器优选地确定富集样品中直径大于14pm的细胞的数目。Coulter计数器或其他细胞检测器也可以是本发明装置的组成部分，而并非构成单独的装置。计数器可利用任何细胞特征，例如，阻抗、光吸收、光散射或电容。通常，产生细胞计数的任何手段在本发明的方法中可能是有用的。这类手段包括光学如散射、吸收或荧光手段。此外，无孔电学手段如确定电容可能是有用的。
可基于对从患者获得的第一样品的核酸分析和对从患者获得的第二样品中稀有细胞的计数进行诊断、预后或诊疗。第一样品可以是活检样品、血液样品或其他样品。活检样品可来自于原发肿瘤或继发肿瘤。第二样品可以是血液样品，或者第一和第二样品可以是相同的样品（即，均为血液样品）。稀有细胞可以是CTC并且使用微流体装置进行富集。可对使用微流体装置富集的稀有细胞进行核酸分析。微流体装置可包含一种或多种结合部分和障碍物阵列。一种或多种结合部分可包含抗-EpCAM。可使用如本文所述的任何方法进行计数。
可对第一血液样品例如来自肿瘤的样品进行核酸分析，核酸分析可包括RT-PCR、miRNA谱分析、单核苷酸多态性（SNP）分析、基因表达分析、cDNA分析、mRNA分析、测序、基因组分析或其任意组合。核酸分析还可包括染色体拷贝数、体细胞突变、遗传异常DNA甲基化、微小RNA水平或其任意组合的分析。可使用本领域技术人员已知的任何方法进行RT-PCR和mRNA分析。核酸分析可包括遗传异常的分析。可使用能结合核酸的标记例如荧光标记或比色标记来检测遗传异常。可使用FISH、原位杂交、SNP、PCR或mRNA微阵列或本领域已知的其他方法来检测或分析遗传异常。在一个非限制性实例中，该方法还包括检测稀有细胞中的遗传异常。细胞中遗传异常的检测可发生在所述的微流体装置中。可使用独特标签序列的标记来鉴定DNA多态性。在一些情况下，核酸标签包含分子倒置探针（MIP）。用于分析核酸的方法可包括进行一种或多种测定以分析一个或多个核酸分子的体细胞突变或染色体拷贝数变化。体细胞突变可包括例如缺失、插入或点突变。染色体拷贝数变化可以是非整倍性或染色体区段性非整倍性。
用于分析核酸或核酸修饰（例如，甲基化和乙酰化）的方法可包括扩增样品中基因组DNA的一个或多个区域。在一种这样的方法中，基因组DNA的所述一个或多个区域中的每一个可包含一种或多种多态性。扩增后可以接着进行例如超深序列分析或定量基因分型（例如，使用一个或多个MIP）。可使用本领域技术人员已知的任何方法进行核酸扩增。用于进行核酸分析的试剂可包括核酸或一个或多个引物。引物可用于扩增一种或多种核酸序列或可用作互补核酸的探针。核酸可用作互补核酸的探针或用作其他核酸方法的模板。核酸和引物可以是单链的、双链的或与一个或多个官能团或可检测基团偶联。官能团可以是可检测的标记或结合部分。核酸可包括本文所述的任何核酸或标记物。引物可包括与本文所述的任何核酸或标记物互补的部分。
而后可对富集的细胞进行分析以检测稀有细胞或颗粒或其组分的一个或多个亚型。基于细胞的表型、基因型或其任意组合，稀有细胞亚型可包括任何类型的细胞分类，包括但不限于，循环肿瘤干细胞、循环肿瘤非干细胞、致瘤细胞、非致瘤细胞、凋亡细胞、非凋亡细胞、终末细胞、非终末细胞、增殖细胞、非增殖细胞、来源于特定组织的细胞、来源于特定癌组织的细胞、散播性癌细胞、微转移的癌细胞或与病症相关的细胞。稀有细胞亚型的其他实例包括特定来源组织的细胞亚型如循环内皮细胞或循环肺癌、肝癌、乳腺癌或前列腺癌细胞。其他细胞分类和细胞亚型可包括具有特定癌症表型的细胞。例如，已知乳腺癌细胞具有至少6种不同的表型，如腔/上皮的、基底/肌上皮的、间充质的、ErbB2、激素的和遗传的。在专利申请公开US2004/0191783中讨论了癌细胞的表型。在一些情况下，稀有细胞亚型的计数其本身可用作癌症的诊断或预后。
稀有细胞亚型的分析可包括计数、核酸分析、蛋白质组成分析等。可使用选择性结合至稀有细胞亚型的可检测标记进行计数。而后可使用本领域已知的任何方法检测和计数标记的细胞。稀有细胞亚型的核酸分析可包括对这类细胞进行基因表达分析、SNP分析和超深测序分析。
在两个不同时间点对稀有细胞亚型的计数可用于监测治疗。例如，如果在治疗前或在治疗开始时采集的第一样品和在后面的时间点（例如，治疗之后）采集的第二样品之间循环肿瘤干细胞（CTC的亚型）的数目增加，则可以断定该治疗是无帮助的。同样，在治疗方案结束时测定循环肿瘤干细胞的基线，并且随后获得的样品具有数目增加的循环肿瘤干细胞；这可能是癌症复发的迹象。
还可使用本领域已知的或本文所述的任何方法（例如，通过使样品流过覆盖有选择性结合稀有细胞亚型的结合部分如抗-CD44的障碍物阵列）来分离稀有细胞亚型如循环肿瘤干细胞。富集的或分离的稀有细胞亚型可用于治疗选择，或通过从来自患者的样品富集稀有细胞、使来自富集的稀有细胞的一种或多种稀有细胞亚型经受治疗剂、观察效果并根据观察到的效果确定疗法而用于监测治疗。在治疗过程中可重复上述步骤以持续监测治疗的效果。在治疗过程中癌细胞可能发生突变，并且亚型中的细胞数可能增加，或亚型的核酸组成可能改变，这表明需要改变治疗。
在一些情况下，稀有细胞亚型的计数可与本文所述的一种或多种其他方法（如测量血清标记物或对肿瘤活检样品进行核酸分析）结合。在一些情况下，可对富集的或分离的稀有细胞亚型进行核酸分析。这类核酸分析的结果可与稀有细胞亚型的计数结合以对受试者进行诊断、预后或诊疗。如上所述，可使用微流体装置（包括本文所述的任何微流体装置）对稀有细胞进行富集。可随时间推移重复对细胞亚型（即来自从患者获得的样品富集的一个或多个稀有细胞的一部分）的分析以对患者的病症进行诊断、预后或诊疗。
用于诊断、预后或诊疗（theranosing）的方法
本发明的方法可包括基于本文所述分析方法的诊断、预后或诊疗。用于诊断、预后或诊疗的方法可包括从患者获得样品、分析从患者获得的样品、富集从患者获得的样品的一种或多种细胞，分析从获自患者的样品中富集的一种或多种细胞，或其任意组合。
诊断可包括确定患者的病症。例如，基于从患者获得样品、富集样品的一种或多种稀有细胞以及分析一种或多种稀有细胞的结果，患者可被诊断为患有癌症或另一种疾病。
预后可包括确定患者疾病的后果、痊愈的机会或疾病将如何进展。例如，基于从患者获得样品、富集样品的一种或多种稀有细胞以及分析一种或多种稀有细胞的结果，患者可以获得具有50%痊愈机会的预后。
诊疗可以包括确定治疗方法。例如，可基于已培养并用治疗剂处理的一种或多种富集的细胞的反应来选择患者的治疗方法。
如本文所述，从实体瘤上剥落的上皮细胞已在乳腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌患者的循环系统中发现。通常，治疗后CTC的存在已经与肿瘤进展和扩散、对治疗的低反应、疾病的复发、在几年时间内存活率的降低或其任意组合相关联。因此，对CTC的计数、表征和分析可以提供一种按基线特征来对患者进行分层的手段，这些基线特征可基于对治疗的反应而预测初始风险和后续风险。本发明的装置和方法可用于，例如，评估癌症患者和那些具有患癌症风险者。
在本文所述的任何诊断方法中，存在或不存在癌症指示物（例如，癌细胞、颗粒、核酸或蛋白质）或其他任何疾病的指示物，都可用于生成诊断。在一个实例中，可从患者抽取血液样品，并将其引入具有适当选择的临界尺寸的本发明装置中，以从其他血液细胞中富集上皮细胞，例如CTC。采用本发明的方法可以确定血液样品中上皮细胞的数目。例如，细胞可用能结合EpCAM的抗体来标记，而该抗体可具有共价结合的荧光标记。然后可以对该装置产生的富集样品进行批量测量，通过这种测量，可以确定最初血液样品中存在的上皮细胞的数目。可采用显微镜技术来视觉量化细胞，以将批量测量与血液样品中被标记的细胞的相应数目相关联。除了上皮肿瘤细胞，也有其他细胞类型可以参与转移性肿瘤形成。研究已提供了造血骨髓祖细胞和内皮祖细胞参与转移的证据（参见，例如，Kaplan等人，Nature438:820-827(2005)，和Brugger等人，Blood83:636-640(1994)）。可以确定第二细胞类型的细胞数，例如，造血骨髓祖细胞，例如，内皮祖细胞，并且可以计算上皮肿瘤细胞与该第二细胞类型数目的比例。这种比例在选择适当的疗法和监测治疗效果方面可能具有诊断价值。参与转移性肿瘤形成的细胞可以使用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以使用特定细胞表面标记物特异性的抗体。有用的内皮细胞表面标记物包括但不限于CD105、CD106、CD144和CD146；有用的肿瘤内皮细胞表面标记物包括但不限于TEM1、TEM5和TEM8（参见，例如，Carson-Walter等人,Cancer15Res.61:6649-6655(2001)）；有用的间充质细胞表面标记物包括但不限于CD133。这些或其他标记物的抗体可以从，例如，Chemicon、Abcam和R&D Systems获得。通过进行一系列的测量（任选地以固定间隔诸如一天、两天、三天、一周、两周、一个月、两个月、三个月、六个月或一年进行），可以追踪患者血流中存在的上皮细胞随时间变化的水平。就现有的癌症患者来说，这提供了一种有用的疾病进展指标，并帮助医务工作者基于患者血流中上皮细胞例如CTC的增加、减少或缺乏来作出恰当的治疗选择。对于那些有患癌症风险的人来说，检测到细胞数的突然增加可以提供患者已形成肿瘤的早期预警。较之诊断信息的缺乏，这种早期诊断配合随后的治疗干预有可能导致患者结果的改善。
一种监测癌症复发的方法可包括，计数或表征自多个在不同时间点从患者取得的样品中富集的CTC，计数和表征来自患者的CTC，以及使用该数据以至少80%的置信度来确定所述患者癌症复发的可能性。
另一种所考虑的方法是用来监测正在接受癌症治疗的患者的治疗效果，可包括计数或表征从治疗前获自所述患者的样品和至少一个在治疗后获得的样品中富集的CTC，并且使用该数据以至少80%的置信度来确定治疗是否可能有效。
另一种所考虑的方法是用来筛查患者中的癌症，包括计数或表征从来自所述患者的样品中富集的CTC，并采用该数据来确定该患者是否有癌症或是否应当寻求进一步的检测来确认癌症，其中该筛查具有至少80%的灵敏度。
任何前述的方法可以进一步包括，对捕获的CTC进行分子分析或对捕获的CTC进行分类，并采用此信息来确定癌症复发的可能性，治疗是否可能有效，或患者是否患有癌症或是否应当寻求进一步检测来确认癌症，或其任意组合。任何前述的方法可以进一步包括，比较在本文所述的任何微流体装置的一个或多个区域或区带中的每一个内捕获的细胞。
本文所述的一种或多种装置和方法可以与至少约1mL或至少约10mL能够在少于约20小时内处理的样品一起使用。例如，使用至少约1mL或至少约10mL，例如，至少约2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、21mL、22mL、23mL、24mL、25mL、26mL、27mL、28mL、29mL、30mL、31mL、32mL、33mL、34mL、35mL、36mL、37mL、38mL、39mL或40mL能够在少于约20小时内，例如在少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19小时内处理的样品，可以作出如上所述的诊断、预后或诊疗决定。其他已知的微流体装置无法提供在如此短的时间内用如此大体积的样品作出这种决定的手段。因此，由于患者可以快速得到诊断、预后或诊疗，本文所述的方法和装置提供了优于以前的设计的独特优势。
诊断方法可包括对被标记的分离自血液的上皮细胞（例如CTC）进行批量测量以及破坏细胞完整性的技术。例如，可以对其中分离的靶细胞数目非常低的样品进行PCR，并且通过采用特定癌症标记物特异性的引物，可以获得关于所分析的细胞来源于哪种肿瘤类型的信息。此外，可以进行RNA分析、蛋白质组分析或代谢物组分析，作为诊断该患者体内存在的癌症的一种或多种类型的手段。例如，一种针对肺癌和其他癌症的重要诊断指标可以是EGFR中特定突变的存在或不存在（参见，例如，国际公开WO2005/094357）。使用本发明的装置和方法，可以通过频繁抽取血液样品并确定每个样品中上皮细胞例如CTC随时间变化的数目，对服用这类药物的患者进行监测。这提供了关于疾病进程的信息。例如，循环上皮细胞数目随着时间推移的减少提示疾病严重程度和一个或多个肿瘤大小的减小。在对上皮细胞定量后，可以通过PCR分析这些细胞，以确定在上皮细胞中表达的该特定基因中可能存在何种突变。上述的本发明的方法并不限于上皮细胞和癌症，而是可以用于诊断任何病症。可以使用本发明的方法进行诊断的示例性病症可以是血液学病症、炎性病症、缺血性病症、肿瘤病症、感染、创伤、子宫内膜异位症和肾功能衰竭（参见，例如，Takahashi等人,Nature Med.5:434-438(1999)，Healy等人,Hum.Reprod.Update4:736-740(1998)，以及Gill等人,Circ.Res.88:167-174(2001)）。肿瘤病症可以包括急性淋巴细胞白血病、急性或慢性淋巴细胞或粒细胞瘤、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞白血病、腺癌、腺瘤、肾上腺癌、基底细胞癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管癌、宫颈发育不良、慢性髓性白血病、结肠癌、表皮样癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、尤因肉瘤、胆囊癌、胆囊结石肿瘤、巨细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、毛细胞肿瘤、头部癌症、增生、增生性角膜神经肿瘤、原位癌、肠神经节瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性类癌瘤、恶性高钙血症、恶性黑色素瘤、马方样体型瘤、髓样癌、转移性皮肤癌、粘膜神经瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、颈癌、神经组织癌、神经母细胞瘤、成骨性肉瘤、骨肉瘤、卵巢肿瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、真性红细胞增多症、原发性脑肿瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、甲状腺癌、局部皮肤病损、网状细胞肉瘤和肾母细胞瘤。
取自患者的细胞样品可以通过本文公开的任何装置进行处理，以产生富集了任何感兴趣的细胞例如稀有细胞的样品。对富集样品中这种细胞的检测随后可以使本领域技术人员能够诊断该患者中特定病症的存在或不存在。此外，确定样品中细胞数的比值，例如癌细胞与内皮细胞之比，可用于产生诊断。或者，检测和/或量化癌症生物标记物，例如，EpCAM或表1中列出的任一种，或与癌症有关的核酸，例如，编码表1中所列出的任何标记物的核酸，可以导致对癌症或其他病症的诊断。例如，对这样的多肽或核酸（例如细胞表面标记物、基因组DNA、mRNA或微小RNA）的表达水平或模式的分析或量化可以导致诊断。
细胞检测可以结合其他信息，例如对患者的影像学研究，以便对患者进行诊断。例如，可以使用计算机轴向断层摄影术、正电子发射断层摄影术或磁共振成像。还可以使用与特定病症相关的细胞模式来作出诊断。例如，通过将富集样品（例如，含有流体动力学大小大于12微米的细胞的样品）中细胞的大小分布和与病症例如癌症相关的大小分布进行比较，可基于这种比较作出诊断。用于比较的细胞模式可以通过任何方法产生。例如，可以进行相关性研究，其中可以处理取自多个对照受试者（例如50个）以及取自具有感兴趣的病症的多个病例受试者（例如50个）的细胞样品，例如，通过富集流体动力学大小大于12微米的细胞，可以对所得样品进行分析，并且可以对分析结果进行比较。为了进行这样的研究，分析富集细胞中的RNA水平（例如mRNA、核糖体RNA（rRNA）、snoRNA、rasiRNA、微小RNA、siRNA、长非编码RNA（长ncRNA、lncRNA）和piRNA水平）可能是有用的。或者，例如通过使用显微镜、细胞计数器或者微阵列装置，对每种情况下富集的细胞数进行计数，或确定细胞大小分布也可能是有用的。也可以鉴定特定细胞类型例如稀有细胞的存在。一旦对患者施用药物治疗，就有可能使用本发明的方法来确定药物治疗的效果。例如，可以采用本发明的方法处理在药物治疗之前取自患者的细胞样品，以及在药物治疗的同时或之后取自患者的一个或多个细胞样品。通过比较每个处理过的样品的分析结果，可以确定药物治疗的效果。例如，可以使用富集装置来从其他细胞中富集流体动力学大小大于12微米的细胞，或流体动力学大小大于或等于6微米且小于或等于12微米的细胞。可以进行上述任何其他检测或分析，例如，特定细胞类型的存在或数量的鉴定。
附加部件
在微流体装置的制造过程中，阵列布图可导致一些障碍物接近（即，小于12微米）通道的边缘，这可导致可撕裂的柔性工具。本发明的新设计可包含其中所有距边缘小于12微米的间隙都可去除并如图26所示排布的阵列。
除了间隙阵列，本发明的装置还可以包括附加的元件或模块，例如，用于对例如CTC的分离、富集、收集、操作或检测。此类元件是本领域中公知的。例如，装置可以包括一个或多个用于样品或缓冲液输入的入口，和一个或多个用于样品输出的出口。阵列也可以在一个20装置上使用，该装置具有用于其他类型的富集或其他操作（包括亲和富集、磁性富集、电泳富集、离心富集和双向电泳富集）的部件。本发明的装置还可以与用于对该装置的输出物进行二维成像的部件（例如，孔阵列或平表面）一起使用。优选地，本文所述的间隙阵列可以与亲和富集联用。在一个实例中，检测模块可以流体连接至本发明的分离或富集装置。该检测模块可以采用本文公开的任何检测方法或其他本领域已知的方法进行操作。例如，该检测模块包括显微镜、细胞计数器、磁铁、生物腔激光器（参见，例如，Gourley等人,J.Phys.D:Appl.Phys.36:R228-R239(2003)）、质谱仪、PCR装置、RT-PCR装置、矩阵、微阵列或高光谱成像系统（参见，例如，Vo-Dinh等人,IEEE Eng.Med.Biol.Mag.23:40-49(2004)）。
计算机终端可以与该检测模块连接。比如，该检测模块可以检测选择性结合感兴趣的细胞的标记。在另一个例子中，捕获模块可以流体连接至本发明的分离或富集装置。例如，捕获模块包括一个或多个选择性结合特定细胞类型，例如癌细胞或其他稀有细胞的结合部分。在包括障碍物阵列的捕获模块方面，障碍物可以包括这样的结合部分。此外，细胞计数模块，例如库尔特计数器，可以流体连接至本发明的分离或富集装置。备选地，可以流体连接其他模块，例如可编程的加热单元。
本发明的方法可以与任何富集或分析装置或者在相同的装置上或者在不同的装置中结合使用。实例包括亲和柱、颗粒分选仪例如荧光激活细胞分选仪、毛细管电泳、显微镜、分光光度计、样品存储装置和样品制备装置。微流体装置与本文所述的系统相结合可能特别有意义。示例性分析装置包括可用于对颗粒进行基于大小、形状或可变形性的富集的装置，包括过滤器、筛子以及富集或分离装置，例如国际公开号2004/029221和2004/113877，Huang等人Science304:987-990(2004)，美国公开号2004/0144651，美国专利号5,837,115和6,692,952，和美国申请号60/703,833、60/704,067和11/227,904所述的那些装置；可用于亲和捕获的装置，例如国际公开号2004/029221和美国申请号11/071,679所述的那些装置；可用于样品中细胞优先裂解的装置，例如，国际公开号2004/029221，美国专利号5,641,628，和美国申请号60/668,415所述的那些装置；可用于排列细胞的装置，例如国际公开号2004/029221，美国专利号6,692,952，和美国申请号10/778,831和11/146,581所述的那些装置；以及可用于流体递送的装置，例如美国申请号11/071,270和11/227,469所述的那些装置。两个或多个装置可以串联组合，例如，如国际公开号2004/029221中所述。
本发明的装置可以加以改造以用于植入受试者中。例如，这样的装置可以加以改造以用于放置在受试者的循环系统中或附近，以便能够处理血液样品。这类装置可以是可流体连接至受试者循环系统（例如通过置管或动静脉短路）的本发明可植入系统的一部分。在一些情况下，包括可植入装置的本发明的系统，例如一次性系统，可以从循环系统中移取一种或多种分析物、成分或材料。这些系统可以加以改造以适于通过该装置的连续血流。
该阵列可以偶合到基板，并可存在于容器中，该容器可以偶合到透明的盖子。在一些方面，样品储器可以流体连接至该阵列，并且在一些方面，检测器可以流体连接至该阵列。检测器可以包括但不限于显微镜、细胞计数器、磁铁、生物腔激光器、质谱仪、PCR装置、RT-PCR装置、矩阵、微阵列或高光谱成像系统。该阵列可用于通过处理样品，优选地连续处理，从细胞样品中移取分析物。处理可以发生在体外或体内，并可包括通过往装置中加入高渗溶液而从装置中释放分析物，并且检测装置流出物中的分析物。
为了减少细胞或颗粒向通道壁上的非特异性吸附，可以将一个或多个通道壁化学修饰为非粘附的或排斥性的。壁上可以涂覆诸如那些用来形成水凝胶的市售非粘性试剂的薄膜涂层（例如单层）。其他可用于修饰通道壁的化学物质的例子包括低聚乙二醇、氟化聚合物、有机硅烷、硫醇类、聚乙二醇、透明质酸、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、粘蛋白、聚HEMA、甲基丙烯酸酯化PEG和琼脂糖。也可以使用带电聚合物来排斥带有相反电荷的物质。用于排斥的化学物质的类型和附着到通道壁的方法将取决于被排斥物质的性质，以及壁和被附着的物质的性质。此类表面修饰技术是本领域熟知的。壁可在装置组装之前或之后进行功能化。通道壁也可以进行涂覆以便捕获样品中的物质，例如膜碎片或蛋白质。
以上说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请特此通过引用并入本文。本发明所述的方法和系统的多种修改和变化，在没有脱离本发明的范围和精神的情况下对本领域技术人员来说将是显而易见的。虽然本发明已经结合具体实施方案进行了描述，但应当理解，所请求保护的本发明不应该被不恰当地限制于这些具体实施方案。事实上，对于本领域技术人员来说显而易见的、对所述用于实施本发明的方式的各种修改，均预期处于本发明的范围之内。其他实施方案在权利要求书中。
除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同的含义。以下参考文献包含可在本文中使用的方法和组合物的实施方案：The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy,第18版，由Merck Research Laboratories出版,2006(ISBN0-911910-18-2)；Benjamin Lewin,Genes IX，由Jones&Bartlett Publishing出版,2007(ISBN-13:9780763740634)；Kendrew等人(编),The Encyclopedia of Mol.Biology，由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编),Mol.Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由VCHPublishers Inc.出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。
本公开内容的标准程序描述于，例如，Maniatis等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1982)；Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual(2ed.),Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1989)；Davis等人,BasicMethods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,NewYork,USA(1986)；或Methods in Enzymology:Guide to MolecularCloning Techniques Vol.152,S.L.Berger和A.R.Kimmerl(编),Academic Press Inc.,San Diego,USA(1987))。Current Protocols inMolecular Biology(CPMB)(Fred M.Ausubel等人编,John Wiley andSons,Inc.),Current Protocols in Protein Science(CPPS)(John E.Coligan等人编,John Wiley and Sons,Inc.),Current Protocols inImmunology(CPI)(John E.Coligan等人编,John Wiley and Sons,Inc.),Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等人编,John Wiley and Sons,Inc.),Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique，出自R.Ian Freshney,出版商:Wiley-Liss;第5版(2005),以及Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology,Vol.57,编者为Jennie P.Mather和David Barnes,Academic Press,第1版,1998)，这些均通过引用完整并入本文。
应理解，以下的实施例不应该解释为仅限于本文所述的特定的方法学、试验方案和组合物等，而是可以变化的。本文使用的以下术语仅是出于描述特定实施方案的目的，并非意在限制本文公开的实施方案的范围。
本文公开了分子、材料、组合物和组分，它们可以用于本文公开的方法和组合物，可以与之结合使用，可以用于其制备，或者是其产物。应当理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、基团等被公开，并且当这些分子和化合物的每个不同的个体和集体的组合及排列的特定参考物不能得到明确公开时，每个都在本文得到具体地涉及和描述。例如，如果公开且讨论核苷酸或核酸，并且讨论可对许多分子（包括该核苷酸或核酸）进行的许多修饰，那么核苷酸或核酸的每一个组合和排列以及可能的修饰都会具体地涉及，除非明确指出不是这样。这个概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的分子和组合物的方法中的步骤。因此，如果存在多个可以进行的附加步骤，那么可以理解这些附加步骤中的每一个都可以与所公开的方法的任何具体实施方案或实施方案组合一起进行，并且每个这样的组合都具体涉及且应该认为已经披露。
本领域技术人员仅使用常规实验就可以识别或者能够确定本文所述方法和组合物的特定实施方案的多种等效实施方案。此类等效实施方案旨在被以下权利要求所包含。
应当理解，所公开的方法和组合物并不仅限于所述的特定的方法学、试验方案和试剂，因为这些可以不同。也应当理解，本文使用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的，并非意在限制本公开内容的范围，该范围只由所附的权利要求书来限制。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本领域技术人员根据本说明书的上下文通常将会理解的含义。
应指出，如本文和所附的权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”，除非上下文另有明确说明，都包括其复数指代物。因此，例如，提到“一种核苷酸”，就包括多种此类核苷酸；提到“该核苷酸”，是指代本领域技术人员已知的一种或多种核苷酸及其等效物，等等。
术语“和/或”在本文上下文中应理解为是指包括由其连接的两项中的任一项或两者。虽然本发明的优选实施方案已在本文中展示和描述，但是对于本领域技术人员来说明显的是，此类实施方案仅以举例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员现在可以想到大量的变化、改变和替换。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可以在实施本发明中采用。以下权利要求旨在限定本公开内容的范围，由此涵盖落入这些权利要求的范围内的方法和结构及其等效物。
实施例
实施例1
活细胞捕获
使前列腺癌细胞系PC-3在体外生长，并将细胞掺入正常患者的血液中。该血液在微流体装置上运行。RPMI-1640细胞生长培养基不是固定，而是加入该芯片，然后将整个芯片于37℃孵育。1.5周后，在立柱的表面可见生长着的细胞集落（图32）。该装置捕获活细胞的能力允许进行采用在捕获前固定细胞的平台无法获得的额外的分子表征。
在另一个实验中，使小鼠异种移植血液流过微流体装置，清洗，去除密封带，并将芯片置于处于5.0%CO2下含有RPMI1640/10%FBS/青霉素-链霉素的组织培养皿中。通过荧光和相差显微镜检查对细胞进行成像。在孵育期终止时，加入Hoechst33342和碘化丙啶以分别显现细胞核及鉴别死细胞。所分离的肿瘤细胞的离体生长在孵育期是明显的，因为细胞铺开并呈现扁平形态。培养12天后，集落扩大到装置障碍物的顶端。几乎所有细胞（>99%）是GFP阳性且有核的，而<1%是死的。所培养的细胞还用瑞氏姬姆萨（Wright-Giemsa）染色，以允许对细胞形态进行更清晰的检查。这些方法与活细胞的捕获相适应，并且这些细胞可以在微流体装置上保留并生长以进行进一步的分析步骤。因为捕获的细胞是活的，所以系统不仅可用于对CTC进行计数，而且然后适应于针对多种分子标记物对捕获细胞进行表征。另外，该方法具有灵活性，可在实验室的一个位置处理血液样品，而将微流体装置运到另一个位置以进行成像或其他分子分析。
此外，使用合适的连接体，例如葡聚糖，在捕获细胞或颗粒后，加入试剂，例如葡聚糖酶，其去除或剪切连接体并使细胞从障碍物释放。释放的活细胞将被收集并在生长培养基中生长以用于进一步的分析。
实施例2
微流体装置的功能化
微流体装置用氧等离子体清洁和活化，与4%的11-(琥珀酰亚胺氧基)十一烷基二甲基乙氧基硅烷（Gelest）的乙醇溶液一起孵育，用乙醇清洗，与10μg/mL的NeutrAvidin（Pierce）一起孵育并用PBS清洗。这个化学过程创建了修饰的塑性表面，该表面利用抗生物素蛋白-生物素结合适合于生物分子附着。或者，该被氧化的芯片可与短葡聚糖链一起孵育。最初的化学活化后，将该芯片与10μg/mL的小鼠单克隆抗-EpCAM抗体一起孵育。另外的其他肿瘤抗原抗体也已经在这个步骤中应用。在处理到储存缓冲液中之前，洗去未结合的抗体。通过使用糖缓冲液保护功能化的微流体装置批次，使该微流体装置表面以稳定化的形式储存。许多医疗器械采用大量的糖基缓冲液以使抗体稳定于活性形式。在本申请中，采用由2mM L-组氨酸和60mM海藻糖（Sigma）组成的糖缓冲液。微流体装置已在抗体偶联后立即被组装，或已于4℃储存，防腐剂的使用是可选的。装置于4℃干燥储存直至使用（最多1个月）。然后，通过首先打开两个充当流动入口和出口的小端口完全组装功能化芯片。将端口与
Figure BDA0000378240280000851
管道连接用于样品和缓冲液流动。将胶带机械地固定在立柱上表面上，创建用于样品流动、清洗和处理的腔室。
实施例3
将结合部分功能化到障碍物上的方法
微流体装置的基板在去离子蒸馏水中冲洗两遍，并进行风干。硅烷向暴露的玻璃上的固定如下进行：将样品浸入新鲜配制的2%v/v的3-[(2-氨乙基)氨基]丙基三甲氧基硅烷水溶液中30秒，然后用去离子蒸馏水进一步清洗。然后在氮气中干燥和烘烤基板。接下来，在环境温度下，将基板在2.5%v/v的戊二醛的磷酸盐缓冲盐水溶液中浸泡1小时。然后再次冲洗基板，并在含0.5mg/mL结合部份（例如，抗EpCAM、抗CD71、抗CD36、抗GPA或抗CD45）的去离子蒸馏水溶液中于环境温度浸泡15分钟，从而使结合试剂与障碍物偶联。然后将基板在去离子蒸馏水中冲洗两遍，并在70%乙醇中浸泡过夜来消毒。
实施例4
生物样品的多参数分析
采用具有多种捕获实体和多重表征方式的配置对生物样品的多参数分析包括对取自癌症患者的生物学血液标本的富集和表征，包括：
a）循环肿瘤细胞（具有上皮特征）
b）循环肿瘤细胞（具有间充质细胞特征）
c）循环癌症干细胞
d）循环成熟内皮细胞
e）循环内皮祖细胞
采用具有单一捕获实体和多重表征方式的配置对生物样品的多参数分析包括对取自癌症患者的生物学血液标本的富集和表征（具有单一捕获实体和多重表征方式的配置）。
a）循环肿瘤细胞（具有细胞凋亡特征——例如，胱天蛋白酶染色）
b）循环肿瘤细胞（具有DNA损伤——例如，H2AX染色）
c）循环肿瘤细胞（具有多药耐药性——例如，P糖蛋白染色）
d）循环肿瘤细胞（具有高侵入潜能—例如，MMP2或(MT1)-MMP染色）
具有多种特征的生物材料之间的比值可用作诊断标准。微流体多通道富集芯片允许计算自同一血液样品（或其他生物流体）中富集的不同亚群的细胞、片段、微粒等之间的比例。如图27所示，这些比例可以作为疾病表征、疗法的选择和成功、长期存活率的预测和疾病复发的诊断标准。作为一个非限制性实例，具有间充质细胞特征的循环肿瘤细胞数目增加的患者有可能具有较差的预后并需要增强的疗法。
举一个例子来说，循环内皮祖细胞数目增加的患者表明活跃的新血管生成过程，而成熟的循环内皮细胞（CEC）的数目增加与肿瘤的侵袭性和大小正相关，很可能反映了肿瘤血管总容量。
实施例5
用于表征CTC和其他循环细胞的新标记物的鉴定
自血液富集的细胞的表征利用在天然血细胞中具有最低表达的表面标记物的细胞表达。能够成功地确定靶细胞群但在血液中不能显著表达的标记物的鉴定可能是一个挑战。鉴定了一组标记物，它们允许表征具有间充质细胞特征的循环肿瘤细胞。在多通道微芯片的情况下（但不限于此），这些标记物用于鉴定具有间充质细胞特征的循环肿瘤细胞。
作为NCI-60癌细胞系表征计划的一部分，通过基因表达数据的比较生物信息学分析来完成选择，NCI-60是美国国家癌症研究所（U.S.National Cancer Institute）的Developmental Therapeutics Program所使用的一组60种不同的人类癌细胞系（http://discover.nci.nih.gov/cellminer/）。如图37所示，将该数据与对取自健康供体的外周血细胞获得的基因表达数据进行数字化比较（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。已知数种表征为NCI-60计划的一部分的细胞系具有间充质细胞特征。具有间充质细胞特征的细胞通常具有波形蛋白（VIM）和N-钙黏着蛋白（CDH2）的高表达和EpCAM和角蛋白19（KRT19）的低表达（图37）。通过鉴定那些在具有间充质细胞特征的细胞系中高表达（Hs578，MDA-N等）但在外周血和在具有上皮细胞特征的细胞中最低表达的基因（Colo205，HT29），我们能够确定对检测和表征具有间充质细胞特征的循环肿瘤细胞有用的标记物（表1）。
实施例6
微流体装置的制造
采用标准光刻法以及随后的电镀将微流体装置的形状特征（features）转移到电铸成形模上。使用该模具在接近其玻璃化转变温度（105℃）的温度以及压力（5至20吨）（调节压力和温度以能够确保该装置中最深处形状特征的高保真复制）下，将形状特征热压印至PMMA中。然后冷却模具以使PMMA装置可以去除。采用真空辅助热粘合技术，将由相似的或不相似的材料组成的、用于密封该装置的第二部件粘合到第一部件上。真空避免在粘合区域中形成空气隙。
实施例7
在一个非限制性实施例中，利用标准光刻法在绝缘体上硅（SOI）晶片上创建光刻胶模式的障碍物。SOI晶片可以是在500μm厚的Si（100）晶片上有一层1μm厚的SiO2层，其顶部还有一层100μm厚的Si（100）层。为了优化光刻胶粘附，可以在光刻胶涂覆前将SOI晶片暴露在六甲基二硅氮烷的高温蒸汽下。紫外线敏感的光刻胶可旋涂到晶片上，于90℃烘烤30分钟，通过铬接触面具暴露于紫外线300秒，在显影剂中显影5分钟，然后于90℃后烘烤30分钟。该工艺参数可根据光刻胶的性质和厚度而改变。铬接触面具的样式被转移到光刻胶上，并决定障碍物的几何结构。
一旦形成了与障碍物样式相同的光刻胶样式，可以启动蚀刻。SiO2可以用作蚀刻过程的终止剂。在不使用终止剂层的情况下，蚀刻也可以控制为在给定的深度处终止。光刻胶样式可以在等离子体蚀刻机中被转移到100Pm厚的Si层上。可以利用多重深度蚀刻术达得到均一的障碍物。例如，将基板暴露于富含氟的等离子流SF615秒，然后将系统切换到富含碳氟化合物的等离子流（仅C4F8）10秒，这使得所有表面都覆盖上了保护膜。在接下来的蚀刻循环中，暴露于离子轰击优先从水平表面上清除聚合物，然后重复该循环多次直至例如达到SiO2层。
实施例8
在固相载体上产生蛋白质涂覆的水凝胶层的过程
本发明提供了在固相载体上产生蛋白质涂覆的水凝胶层的过程，包括以下步骤：
1.用氧等离子体处理固相载体（玻璃或塑料）以打开反应性结合位点；
2.制备包含单功能葡聚糖和PEG的溶液，并将此溶液引入（1）中处理过的固相载体的表面；
3.制备双功能PEG的溶液，并将此溶液引入（2）中处理过的固相载体的表面；
4.制备蛋白质（例如，抗体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、NeutrAvidin或CaptAvidin）溶液，并将此溶液引入（3）中处理过的固相载体的表面；
5.任选的：制备生物素化生物分子（例如，生物素-抗体）的溶液，并将此溶液（有或无流动）引入到如（4）中制备的、用抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、NeutrAvidin或CaptAvidin处理过的固相载体表面。
实施例9
用共价键NeutrAvidin产生基于葡聚糖/PEG的表面化学的方法
步骤1：用氧等离子体处理芯片表面（COC），以产生用于下一步的羰基。
步骤2：通过其氨基和表面羰基之间的相互作用将氨基葡聚糖结合至该表面。出于稳定性考虑，随后将形成的N=C键还原成单键。
步骤3：然后氧化该葡聚糖并打开环，以形成两个能与蛋白质的氨基相结合的醛基。
步骤4：将NeutrAvidin加入被氧化的葡聚糖中。NeutrAvidin的氨基与醛基相互作用而形成C=C键，随后还原该C=C键以保持NeutrAvidin结合稳定性。
步骤5：通过生物素-NeutrAvidin相互作用固定一种或多种生物素化抗体。这可以以两种方式完成。可通过将生物素化抗体溶液流入完全组装的芯片中，就在样品处理前在线（in-line）固定生物素抗体。或者，生物素化抗体可以在制造过程中离线（off-line）固定。可以加入抗体防腐剂以保护抗体的功能性。
直接偶联的另一种方式是，通过受控的还原将抗体在特定S-S键处拆分成两个Fab’部分。然后，将该Fab’与交联体连接。由于这些S-S键的位置，大多数固定的Fab’处于有利于与抗原相互作用的方向。
实施例10
用交联的NeutrAvidin产生基于葡聚糖/PEG的表面化学的方法
步骤1：用氧等离子体处理芯片表面（COC），以产生用于下一步的羰基。
步骤2：通过其氨基和表面羰基之间的相互作用将氨基葡聚糖结合至该表面。出于稳定性考虑，随后将形成的N=C键还原成单键。
步骤3：葡聚糖保持完整。然后使用诸如NHS-PEG-生物素的亲水性交联体，其中氨基PEG可具有2,000至20,000的分子量，且双功能PEG可具有PEG3或更高的PEG长度，比例（葡聚糖：PEG）为10:1至1:10，其中NHS基团与葡聚糖（氨基葡萄糖）上的氨基反应。
步骤4：将NeutrAvidin加入葡聚糖中。利用生物素基团将NeutrAvidin固定在表面上。
步骤5：通过生物素-NeutrAvidin相互作用固定一种或多种生物素化抗体。这可以以两种方式完成。可通过将生物素化抗体溶液流入完全组装的芯片中，就在样品处理前在线固定生物素抗体。或者，生物素化抗体可以在制造过程中离线固定。可以加入抗体防腐剂以保护抗体的功能性。这两种功能化方法都显著降低非特异性吸附，因为样品处理后，芯片不再象MPS化学法中那样显示出显著的蓝色背景。白细胞计数在1000-3000/mL血液的范围内，而不是数万，这表明非特异性吸附显著降低。亲和捕获也得到显著改善。EpCAM抗体涂覆的芯片比IgG涂覆的芯片多捕获超过40%的细胞。如图43所示，评价了对H1650和HT29细胞系使用两种不同的芯片设计的细胞捕获表现。（A）IgG和EpCAM抗体涂覆的芯片上的细胞捕获百分比。（B）EpCAM抗体和IgG涂覆的芯片之间捕获百分比的不同。在包括共价连接和使用交联体连接的两种方法中，交联体方法更加有效，因为它使用较少的抗体能达到相同的亲和捕获水平。在T7上对HT29细胞的捕获是一种亲和捕获为主的芯片，其具有最低的基于大小的捕获。仅有1-4%的CTC在IgG涂覆的芯片上被捕获，这表明非常少的细胞通过非特异性吸附而捕获。C5被设计成通过大小和亲和性两者进行捕获。与T7芯片相比，IgG芯片捕获明显更多的细胞，并且IgG芯片主要根据大小捕获细胞。当C5芯片用EpCAM抗体涂覆时，多捕获了50-70%的细胞。IgG C5芯片捕获了48%的H1650细胞，但仅捕获了26%的HT29细胞。EpCAM抗体芯片以同等的效率捕获两种细胞类型。由于HT29细胞在大小上小于H1650细胞，HT29细胞更难以根据大小进行捕获。T7的结果已经显示通过非特异性吸附的捕获非常小。这两个因素结合在一起导致基于大小的捕获降低了22%。另一方面，HT29细胞具有比H1650更高的EpCAM高表达。增加的EpCAM水平以及强大的基于亲和性的捕获补偿了基于大小的捕获的下降。
实施例11
交联体方法与直接连接方法的比较
图46示出了当NeutrAvidin共价连接到表面时的细胞捕获结果。（A）不同浓度下IgG对照芯片和EpCAM芯片的细胞捕获率。（B）两种芯片（C5）在捕获率方面的不同。图47示出了当NeutrAvidin通过亲水性交联体连接到表面时的细胞捕获结果。（A）不同浓度下IgG对照芯片和EpCAM芯片的细胞捕获率。（B）两种芯片（C5）在捕获率方面的不同。图47中的交联体方法比图46中的直接连接方法更好的原因是因为在蛋白质上的随机氨基位点处发生直接共价连接，这导致了随机取向并由于位阻现象造成的蛋白质的较低自由度而引起固定的效率较低。直接连接方法的其他不利方面在于每个NeutrAvidin的多重连接的可能性，这可能会导致非特异性吸附的增加。如图48所示，直接连接的IgG芯片主要通过非特异性吸附来捕获显著数量的CTC。如图48中的EpCAM芯片所示，亲水性交联体也改善了亲和捕获。在直接连接方法中，EpCAM芯片的入口侧比IgG芯片捕获更多的CTC，但只多出很小的百分数。虽然捕获率显著较高，但是捕获在整个芯片发生，并集中向出口侧。这表明在直接连接方法中，为使亲和捕获有效工作，大小因素仍起到重要作用。在交联体方法中情况却不是这样，其中观察到捕获机制的重大转变。与IgG芯片相比，交联体方法的EpCAM芯片在入口侧捕获大量的细胞，而在此处大小捕获却最低。交联体方法的IgG芯片在入口侧几乎没有捕获细胞的事实，使该现象更为明显。比较两种EpCAM芯片，这种转变也是明显的。直接连接芯片主要在以大小为主的一侧捕获细胞。交联体芯片主要在以亲和性为主的一侧捕获细胞。这证明了交联体方法的优越性能。
实施例12
氨基-葡聚糖的功能化
天然的葡聚糖没有氨基。使用胺功能化的葡聚糖，因为其氨基将与经等离子体氧化的COC上的表面羰基反应。通常地，一厚层葡聚糖涂层（较高分子量的葡聚糖）更加理想，因为它完全覆盖塑性表面，阻断塑料对分析物的干扰。市售的氨基葡聚糖当葡聚糖的分子量（MW）增加时每个葡聚糖具有更多的氨基。例如，10K MW的氨基葡聚糖具有2-5个氨基。40K的氨基葡聚糖具有约10个氨基而70K的氨基葡聚糖具有将近20个氨基。氨基有助于在表面上固定氨基葡聚糖，但是每个葡聚糖分子有过多的氨基可能是有害的，正如70K的葡聚糖比40K的葡聚糖多捕获约20%的白细胞（WBC），而CTC细胞捕获却没有改善。虽然准确指出引起WBC吸附增多的确切机制是困难的，但可以推测当一个葡聚糖分子与更多的表面位点结合时，葡聚糖涂层的构型也许会变得不太有利。10K的氨基葡聚糖比40K的氨基葡聚糖吸附少30%的WBC。但是较高MW的葡聚糖在改善抗体性能方面具有优势。除阻断非特异性结合之外，较高MW的葡聚糖也将抗体推至更加远离表面，并赋予抗体更大的柔性，从而在3D空间中旋转，并更好地与细胞表面抗原相互作用。这两个因素增加了对血液样品中稀有细胞或其他分析物的有效捕获。因此，40K的葡聚糖可具有优于10K的葡聚糖的优势。
解决这个问题的一种方法是加入与葡聚糖的氨基竞争的试剂。已经利用了PEG-胺，因为当其氨基末端与葡聚糖的氨基相竞争时，其亲水性长链有利于阻断非特异性吸附。图44示出了加入PEG对于降低WBC计数的效果，即与等摩尔量的PEG-胺混合的40K-MW葡聚糖捕获约少25%的WBC。加入PEG的另一个好处是CTC的非特异性捕获减少。当含有CTC的样品从右向左流过C5芯片时，CTC首先进入亲和捕获区带（虚线区域），然后进入大小捕获区带。在IgG-葡聚糖涂覆的芯片上，少数细胞由于非特异性吸附在亲和捕获区带被捕获。如图44所示，当PEG加入到葡聚糖层时，这种非特异性捕获连同WBC一起减少。
PEG水凝胶已经用于微流体芯片上的免疫分析型应用。大多数通过商业过程产生的PEG聚合物作为分布的链长而存在。许多商业PEG和PEG衍生物的分子量是平均分子量。表面涂层中使用的PEG通常具有至少两个官能团。一个官能团与试验基板相结合，另一个则用于固定分析物的捕获模块。因此，PEG作为基底的传统用途与PEG在本公开内容中的用途存在差异。在本公开内容中，PEG胺的氨基头基与氨基-葡聚糖的氨基头基相竞争，减少了每个葡聚糖分子与塑性表面之间的键的数目。这就增加了葡聚糖层的有效厚度，并提高了葡聚糖链的柔性，这两者对于最佳抗体性能都很重要。当用双功能PEG代替葡聚糖/PEG层时，产生的芯片在C5.4芯片上捕获88.6%的CTC，而葡聚糖/PEG芯片则捕获96.3%的CTC。
实施例13
加入的BSA对抗体固定的影响
图45示出了如通过碱性磷酸酶/PNPP试验所定量的，所加入的BSA对固定于芯片表面的抗体量的影响。不同量的BSA与EpCAM混合以达到10、50和100μg/mL的BSA浓度，而抗体的浓度保持在20μg/mL。然后对表面结合的抗体进行定量，并与纯抗体溶液和纯BSA溶液比较。如图45所示，在这个浓度范围内，BSA并不导致任何显著数量的假阳性信号，但通过定量活性抗体量的试验来定量，其确实增加了抗体量。使用500μL20μg/mL的抗体溶液。这意味着约有10%（1/0.5*20）的抗体被有效固定。BSA的加入显著地改善了这个过程。50μg/mL的BSA与20μg/mL的抗体一起产生了三倍之多的活性抗体。EpCAM抗体涂覆的芯片比IgG涂覆的对照芯片多捕获19%的CTC，这相对于之前的5%差异而言是显著的提高。
实施例14
MPS功能化化学过程
图42示出了MPS化学过程的原理图。简单地说，该过程包括以下步骤：
步骤1：用氧等离子体氧化COC表面
步骤2：将(3-巯丙基)三甲氧基硅烷（MPS）加至芯片的表面，与等离子处理过的表面结合，并提供硫醇官能团
步骤3：加入马来酰亚胺-PEG2-生物素，其通过马来酰亚胺与硫醇之间的相互作用结合到硫醇基团，并呈递生物素。
步骤4：加入NeutrAvidin，并与生物素部分结合
步骤5：加入生物素化EpCAM抗体，并与NeutrAvidin部分结合
步骤6：加入抗体防腐剂。
与玻璃不同，MPS化学过程是在载玻片上的适当过程。与亲水性的玻璃或硅/二氧化硅不同，COC塑料是疏水性的，并可能对在MPS化学过程中使用的有机试剂和溶剂敏感。高度疏水性的体系（service）通过提供有益的表面环境在阻断非特异性结合和提高抗体活性方面运行良好。MPS过程能够改善表面的亲水性，尽管非特异性结合仍然发生。
实施例15
C5.2的验证
在单独两天里，用以前的C5设计或新的C5.1和5.2设计处理含有CTC的血液样品。所测试的芯片用IgG或EpCAM抗体涂覆，然后以25μL/min的流速处理样品。如图51所示，较之原始的C5设计，C5.1和C5.2设计在25μL/min的流速下显示出等效或更高的捕获效率。如图52所示，C5.2设计展现出了在入口附近更好的对PBS或血液样品中的细胞的捕获，因此展现出了比C5和C5.1设计更好的对整个芯片面积的利用。
实施例16
捕获条件的优化
为了提高整体捕获效率、抗体捕获和芯片面积利用，以区分亲和性和大小捕获，探究了一系列的条件：25μL/min、7.6μL/min和4μL/min的捕获流速，旧表面化学对比新表面化学，以及运行全血对比从样品中去除血清。在以前的处理条件（25μL/min）下，C5.1和C5.2设计之前展示出与C5等效，因此选择C5.1作为运行新条件并与C5.2进行比较的平台。如图53所见，在所有测试条件下，C5.2设计捕获了更高百分比的掺入样品中的细胞。此外，如图54所示，较之C5.1设计，C5.2设计在较低的流速下展现出提高的芯片面积利用（更好的入口处捕获，整个芯片中更好的细胞分布），以及提高的入口捕获（说明是通过亲和性的捕获）。此外，C5.2展现出可靠的再现性（数据未示出）。而且，如图55所示，C5.2芯片设计对以0-750个掺入细胞掺入样品中的细胞展现出线性捕获。
实施例17
C5.3和C5.4验证实验
进行多项实验以验证C5.3和C5.4设计，并与先前的设计进行比较。这些实验测试了各种参数，包括样品体积、流速、结合部份孵育和表面偶联时间，以及对具有高、低和中等EpCAM表达的多种细胞系的捕获效率。该实验的概要、进行该实验背后的动机、所测试的芯片和结果可见于图67。
在一项实验中，掺有已知数目的CTC的样品以4μL/min或8μL/min的流速在用IgG或EpCAM抗体功能化的C5.2、C5.3和C5.4设计的芯片上进行处理。如图56所示，所有EpCAM功能化的设计在4μL/min下都具有90%+的捕获率。该数据表明C5.2和C5.4在8μL/min下可以处理更大的体积，同时还能保持90%+的捕获率。如图57的捕获图所示，所有芯片设计在4μL/min和8μL/min下都显示了IgG和EpCAM捕获之间细胞空间定位的转变，这可能是甚至在更高的体积/流动组合下发生亲和捕获的正向指示。为了量化基于亲和性的捕获、基于大小的捕获或其组合，如图16和图18所示，可以确定芯片类型的阵列中每个区带的捕获率。总捕获等于根据亲和性捕获的细胞加上根据大小捕获的细胞之和，这取决于细胞被捕获的区域。亲和捕获可以计算为占总捕获的比例或占每个区带中总捕获的比例。从EpCAM功能化的芯片对亲和捕获进行定量，数据可见于图16（上图）。与C5.2芯片相比，使用EpCAM的C5.3和C5.4芯片显示出提高的亲和捕获，并且捕获的主要部分（C5.3中>70%，C5.4中>80%）可归因于亲和捕获，而其余的捕获则是以大小为主的，并且甚至在更高的体积/流速下，C5.3和C5.4二者均以亲和捕获为主。当使用采用IgG的芯片（图16，下图）时，在所有这三种芯片类型上，大小捕获占主导，而亲和捕获则减少。较之EpCAM和IgG在每个区带中的捕获率，如图18所示，亲和捕获可以计算为占每个区带中总捕获的比例。较之C5.2芯片设计，C5.3和C5.4芯片设计显示出横跨所有区带的更强的亲和捕获，因为在C5.3和C5.4的区带1和2中，超过80%的捕获可以归功于亲和性。总之，C5.4芯片设计相对于C5.2芯片设计具有等效的总捕获，比C5.3芯片设计具有提高的捕获，C5.4芯片设计具有比C5.2芯片设计好得多的亲和性，并且C5.4和C5.2芯片设计展现了在更高的体积/流速下，整体捕获%没有损失，但亲和捕获有轻微减少（～10%）。
实施例18
C5.3和C5.4验证实验
在另一项实验中，测试了流速/样品体积和EpCAM孵育时间以确定是否可以采用少于7小时的孵育时间。该实验背后的动机是为了通过变为较短的孵育时间及在每次运行24小时下提高血液处理中的通量。这些实验用EpCAM功能化的C5.3和C5.4芯片测试了3.75mL和4μL/min以及7.5mL和8μL/min的样品体积和流速，每天使用3种不同的血液样品，测试3天。如图22所示，在三天里，对于所测试的条件，4小时与7小时的EpCAM抗体孵育时间相比，总平均捕获没有显著差异。在C5.4芯片设计上捕获的细胞的空间定位可见于图23。对于C5.3和C5.4芯片设计，如图58所示（C5.3-上图，C5.4-下图），7小时和4小时孵育看似是不同的。在亲和性最为主导的捕获区域（区带1）中和最低流速（4μL/min）下显示的效果是捕获率降低。差异在8μL/min下减小，因为两个孵育时间的亲和捕获率都下降。由此实验得出的总体结果表明，孵育时间从7小时转变为4小时时，整体捕获效率有轻微下降，但所有都在误差范围内，并且对于C5.3和C5.4，以及对于所有体积/流速组合来说，这些结果都是明显的，
实施例19
C5.3和C5.4验证实验
在第三项实验中，使用三种不同的血液样品以较高的流速（包括3.75mL血液样品，以4μL/min、25μL/min和75μL/min的流速）在相同的抗体孵育时间下评价了EpCAM功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片设计的性能。如图59所示，在25μL/min下，3.75mL血液中300个总掺入H1650细胞的捕获百分比在C5.2和C5.3设计上显著减少，但在C5.4上却不是这样。在这些条件下捕获的细胞的空间定位可见于图60、图61和图62。对在这些条件下来自这些EpCAM功能化的芯片的亲和捕获、大小捕获和混合（亲和以及大小）捕获百分比进行量化，数据可见于图20。总体来说，亲和成分随着流速的增加而减少，但是大小成分弥补了亲和捕获的这种损失。在25μL/min下，C5.4芯片设计上的亲和捕获加上混合捕获成分是C5.2芯片设计上的大约两倍。还对上述条件下在芯片上从血液中捕获的白细胞（非特异性捕获）的数目进行了评价，发现使用3.75mL样品，在较高流速下，白细胞背景显著降低（图63）。总而言之，C5.4芯片优于C5.2和C5.3芯片，并且在所有测试的流速下均显示出最大的亲和捕获。在25μL/min的流速下没有观察到捕获效率的统计学损失，但在75μL/min的流速下观察到约20%的捕获效率下降。
实施例20
C5.3和C5.4验证实验
在第四项实验中，用4种体积为3.75mL的不同血液样品以4μL/min或8μL/min的流速，采用相同数目的掺入细胞，在相同的处理条件下，评价了3个细胞系在EpCAM功能化的C5.2和C5.4芯片设计上的表现。在这些实验中，将已知表达高EpCAM水平的H1650细胞、已知表达中等至低EpCAM水平的PC3细胞和已知表达极低EpCAM水平的MDA-MB-231细胞掺入血液样品中。量化细胞捕获百分比，结果可见于图64。总体来说，对于H1650细胞（与之前的结果一致）和PC3细胞，C5.4芯片显现出比C5.2芯片略低的细胞捕获百分比。对于MDA-231细胞，观察到在两种芯片类型上的表现有更明显的差异，推测大小捕获起了更大的作用。然而，对表达较低EpCAM水平的细胞（PC3和MDA-231）而言，流速从4μL/min到8μL/min的改变导致C5.2芯片上的捕获降低了8-9%，而C5.4芯片上的捕获没有降低，这提示C5.4芯片设计更能处理较高的流速。在这些条件下捕获的细胞的空间定位可见于图24（3.75mL正常全血，以4μL/min处理）、图25（7.5mL正常全血，以8μL/min处理）、图65和图66。对于以4μL/min处理的3.75mL血液样品，有一个值得注意的与EpCAM表达降低相关的、朝向出口的捕获转变，但在整体捕获上却没有显著的不同。对于以8μL/min处理的7.5mL血液样品，有一个值得注意的与EpCAM表达降低相关的、朝向出口的捕获转变，以及与使用C5.2芯片设计和以4μL/min处理的3.75mL血液样品的捕获相比，减少的MDA-MB-231细胞的捕获。总而言之，对于所有测试的细胞系而言，C5.2芯片设计的表现优于C5.4芯片设计。在4μL/min的流速下，较之C5.4芯片设计上25%的减少，C5.2芯片设计在高表达和低表达的细胞系之间显示10%的捕获减少。在8μL/min的流速下，在C5.2芯片上观察到更大的捕获效率降低，而在C5.4芯片上观察到相同的降低。

Claims (78)

1.一种微流体装置，其包含：
输入端，
输出端，和
设置于其间的障碍物阵列，其进一步包含支撑柱，其中(i)每个支撑柱具有至少100微米的直径和至少300微米的中心距；(ii)具有至少45微米的直径和至少150微米的中心距；或(iii)具有至少60微米的直径并且与所述输入端间隔小于1000微米。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述支撑柱与所述阵列中的障碍物具有不同的样式。
3.根据权利要求1所述的装置，其中每个所述支撑柱具有大于所述阵列中的最大障碍物的直径，或具有至少100微米的直径。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述支撑柱以方形阵列样式化。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述支撑柱彼此间隔至少30微米或比所述阵列中障碍物之间的任何距离大至少约50%的距离。
6.根据权利要求1所述的装置，其中所述支撑柱距离所述输入端小于200微米。
7.根据权利要求1所述的装置，其中所述障碍物阵列包含第一间隙和第二间隙，其中所述第二间隙是由所述障碍物的上下移动而创建的，所述第二间隙小于所述第一间隙并以重复样式位于所述阵列中。
8.根据权利要求1所述的装置，其中所述障碍物阵列包含第一间隙和第二间隙，其中所述第二间隙是由所述障碍物的向上或向下移动创建的，所述第二间隙小于所述第一间隙并以重复样式位于所述阵列中。
9.一种微流体装置，其包含：
样品输入端，
样品输出端，和
位于其间的障碍物阵列，所述阵列具有多个区域，
第一区域，包含在所述第一区域中的多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙，其中所述第一间隙和所述第二间隙是不同的，和
第二区域，具有均匀分布的、其间具有单一间隙的障碍物。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述第二区域处于所述第一区域的下游。
11.根据权利要求10所述的装置，其中处于所述第一区域下游的第二区域包含具有某一直径的障碍物，其中每个障碍物具有的直径小于所述第一区域中的每个障碍物的直径。
12.根据权利要求9所述的装置，进一步包含处于所述第二区域下游的一个或多个额外区域，其中所述一个或多个额外区域中的每一个具有均匀分布的、其间具有单一间隙的障碍物，其中所述单一间隙从所述第二区域到所述额外区域的每个下游阵列逐渐变小。
13.根据权利要求12所述的装置，其中处于所述第二区域下游的所述一个或多个额外区域中的每一个包含具有某一直径的障碍物，其中所述障碍物直径从所述第二区域到所述额外区域的每个下游阵列逐渐变小。
14.根据权利要求7、8或9所述的装置，其中所述第二间隙以对称样式、均一样式、重复样式、非均一样式分布。
15.一种微流体装置，其包含：
输入端，
输出端，和
位于其间的障碍物阵列，所述阵列具有多个区域，
第一区域，包含在所述第一区域中的多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙，其中所述第一间隙和所述第二间隙是不同的，和
第二区域，包含在所述第二区域中的多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙，其中所述第一间隙和所述第二间隙是不同的，并且其中在所述第一和第二区域中的所述第一间隙是相同的，并且其中在所述第二区域中的所述第二间隙小于在所述第一区域中的所述第二间隙。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述第二区域处于所述第一区域的下游。
17.根据权利要求16所述的装置，其中处于所述第一区域下游的所述第二区域包含具有某一直径的障碍物，其中每个障碍物具有的直径小于所述第一区域中每个障碍物的直径。
18.根据权利要求15所述的装置，进一步包含处于所述第二区域下游的一个或多个额外区域，其中所述一个或多个额外区域中的每一个具有位于多个障碍物之间的第一间隙和第二间隙，其中所述第一间隙和所述第二间隙是不同的，其中所述多个区域中的每一个的所述第一间隙是相同的，并且其中所述第二间隙从所述第二区域到所述额外区域的每个下游阵列逐渐变小。
19.根据权利要求18所述的装置，其中处于所述第二区域下游的所述一个或多个额外区域中的每一个包含具有某一直径的障碍物，其中所述障碍物直径从所述第二区域到所述额外区域的每个下游阵列逐渐变小。
20.根据权利要求15所述的装置，其中所述间隙以非随机样式、重复样式或均一样式排布。
21.一种微流体装置，其包含：
输入端，
输出端，和
位于其间的障碍物阵列，其中至少所述障碍物的子集成簇排布，每个簇包含至少三个障碍物，其中簇中相邻障碍物之间的距离小于所述簇与其相邻簇之间的距离。
22.根据权利要求21所述的装置，其中所有的或基本上所有的所述障碍物均成簇。
23.根据权利要求1、7、8、9、15或21所述的装置，其中所述障碍物用一种或多种结合部分涂覆。
24.根据权利要求23所述的装置，其中所述结合部分是亲和标记的配体。
25.根据权利要求1、7、8、9、15或21所述的装置，其中所述阵列包含不同大小的障碍物。
26.根据权利要求21所述的装置，其中所述阵列包含至少100、200或300个彼此相邻的簇。
27.根据权利要求21所述的装置，其中簇中障碍物之间的最大距离比第一簇与邻近所述第一簇的第二簇之间的最小距离至少小3倍。
28.根据权利要求21所述的装置，其中所述簇在沿流动方向的第一方向上比垂直于所述流动方向的第二方向上具有更长的尺寸。
29.根据权利要求21所述的装置，其中所述簇定位成使得第一簇位于第二簇的上游居中，并且其中所述第二簇的中心以与流动方向水平线呈约0°-90°的角度偏离所述第一簇的中心。
30.根据权利要求21所述的装置，其中簇中障碍物之间的距离小于40、30、20或15微米。
31.根据权利要求21所述的装置，其中所述阵列包含串联或并联的多个区域，其中每个区域中的簇具有不同的特征。
32.根据权利要求31所述的装置，其中所述特征选自：(a)簇内一个或多个障碍物之间的不同间距，(b)簇之间的不同间距，(c)连接角，(d)簇之间的不同角度，(e)相同簇中的障碍物之间的不同角度，或其组合。
33.根据权利要求1、9、15或21所述的装置，其中所述阵列进一步包含位于第一区域和第二区域之间的过渡区，其中所述过渡区包含不同大小的障碍物。
34.根据权利要求31所述的装置，其中所述阵列包含多于4个或5个区域。
35.根据权利要求1、9、15、21或31所述的装置，其中所述输入端流体连接至一个或多个额外阵列。
36.根据权利要求21所述的装置，其中所述簇以非均一、非随机或重复样式排布。
37.根据权利要求21所述的装置，其中所述簇由具有各为(i)约10°-90°(ii)约20°-40°，或(iii)约30°-40°的第一和第二迎角的三个障碍物组成。
38.一种微流体装置，其包含样品输入端、样品输出端和位于其间的障碍物阵列，该障碍物阵列具有在所述障碍物的子集之间的第一间隙和在所述障碍物的第二子集之间的第二间隙，其中所述第一间隙大于所述第二间隙，并且其中所述第二间隙在整个所述阵列中以非均一、非随机样式分布。
39.根据权利要求38所述的微流体装置，其中所述第二间隙以重复样式分布。
40.根据权利要求38所述的微流体装置，其中所述第二间隙分布成使得所述第二间隙的中心形成横穿流动方向的虚拟线。
41.一种微流体流通式装置，其包含：
输入端，
输出端，和
障碍物阵列，其中所述阵列被配置为当样品以约0.25mL/hr至约12.5mL/hr的速度流过所述装置时，捕获掺入该血液样品中的至少80%的EpCAM表达细胞，该血液样品不含EpCAM表达细胞，体积为约3.75mL至约20mL。
42.一种微流体流通式装置，其包含：
输入端，
输出端，和
障碍物阵列，其中所述阵列被配置为当样品以约0.25mL/hr至约12.5mL/hr的速度流过所述装置时，捕获掺入体积为约3.75mL至约20mL的、不含CTC的血液样品中至少80%的CTC。
43.根据权利要求41或42所述的装置，其中超过50%的被捕获细胞在所述阵列的上游半区被捕获。
44.根据权利要求41或42所述的装置，其中超过10%的被捕获细胞是基于大小而不是亲和性被捕获的。
45.一种用于富集CTC的方法，包括使含有CTC的样品流动通过以上任一权利要求所述的微流体装置。
46.一种用于监测癌症复发的方法，包括：(a)计数或表征从多个在不同时间点取自患者的样品中富集的CTC，并计数或表征来自所述患者的CTC，和(b)使用来自(a)的数据以至少80%的置信水平确定所述患者中癌症复发的可能性。
47.一种用于监测接受癌症治疗的患者的治疗效果的方法，包括：(a)计数或表征从治疗前取自患者的样品和至少一个在治疗后取得的样品中富集的CTC，和(b)使用来自(a)的数据以至少80%的置信水平确定治疗是否有效。
48.一种用于筛查患者中的癌症的方法，包括：(a)计数或表征从来自所述患者的样品中富集的CTC，和(b)使用来自(a)的数据确定所述患者是否患有癌症或是否应该寻求进一步的检测来确认所述癌症，其中所述筛查具有至少80%的灵敏度。
49.根据权利要求45、46、47或48中任一项所述的方法，进一步包括：(c)对捕获的CTC进行分子分析或将捕获的CTC分类，并且使用来自步骤(c)的信息作出决定。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述分子分析包括：测序、SNP检测、基因表达分析、cDNA分析、mRNA分析、蛋白质表达分析、修饰蛋白质分析、翻译后修饰蛋白质分析、突变蛋白质分析、蛋白质修饰分析、miRNA谱分析、监测酶活性、显色原位杂交（CISH）分析或荧光原位杂交（FISH）分析。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述分类包括鉴定CTC的亚群，其中所述亚群根据所进行的分子分析的结果或被对于表1中标记物特异性的结合部分所捕获的能力来表征。
52.根据权利要求45、46、47或48中任一项所述的方法，进一步包括比较在微流体流通式装置的一个或多个区域的每一个中捕获的细胞。
53.根据权利要求45、46、47或48中任一项所述的方法，其中在少于20hr的时间内处理至少10mL的样品。
54.一种微流体装置，其包含用抗体涂覆的障碍物阵列，其中所述装置的表面用葡聚糖或葡聚糖衍生物进行功能化。
55.一种微流体装置，其包含用抗体涂覆的障碍物阵列，其中所述装置的表面在至少10小时里具有小于15°的接触角。
56.一种微流体装置，其包含用两种或更多种不同的聚合物功能化的表面，其中所述第一聚合物是碳水化合物且所述第二聚合物是聚乙二醇（PEG）。
57.根据权利要求56所述的装置，其中所述碳水化合物是葡聚糖。
58.根据权利要求56所述的装置，其中所述碳水化合物具有10K-70K的分子量。
59.根据权利要求57所述的装置，其中所述葡聚糖的浓度为所述表面的0.01%-5%(w/w)或0.05%-2%(w/w)。
60.根据权利要求56所述的装置，其中所述PEG具有1,000-100,000道尔顿的分子量。
61.根据权利要求56所述的装置，其中所述PEG具有1,000-20,000道尔顿的分子量。
62.根据权利要求56所述的装置，其中所述PEG和所述碳水化合物分别具有1:10-10:1的摩尔比。
63.根据权利要求54或56所述的装置，其中所述表面进一步包含结合部分。
64.根据权利要求63所述的装置，其中所述结合部分选自抗生物素蛋白、NeutrAvidin、链霉抗生物素蛋白或CaptAvidin。
65.根据权利要求63所述的装置，其中所述结合部分与所述碳水化合物共价结合。
66.根据权利要求63所述的装置，其中所述结合部分通过连接体与所述碳水化合物结合。
67.根据权利要求66所述的装置，其中所述连接体是生物素-PEG-NHS。
68.一种微流体装置，其包含用抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物涂覆的障碍物阵列。
69.一种微流体装置，其包含与一种或多种抗体偶合的塑性表面，其中所述抗体距所述塑性表面平均大于PEG3长度。
70.以上所述的任何装置，其中所述装置的表面是塑料或环烯烃共聚物（COC）或环烯烃聚合物（COP）。
71.一种微流体装置，其能够捕获掺入正常血液样品中的至少60%的CTC，其中所述装置用约10μg/mL至约100μg/mL的抗体溶液进行功能化。
72.一种用于捕获和释放感兴趣的细胞或细胞碎片的方法，包括：(a)使包含感兴趣的细胞或细胞碎片的样品流过用碳水化合物和结合部分涂覆的表面，该结合部分能与选择性地存在于所述感兴趣的细胞或细胞碎片上的细胞表面标记物选择性地结合，和(b)使用选择性裂解所述碳水化合物的酶和/或竞争性释放生物素偶联物的生物素衍生物，从而使所述感兴趣的细胞或细胞碎片从所述表面上释放下来。
73.根据权利要求72所述的方法，其中竞争性释放生物素偶联物的生物素衍生物包括脱硫生物素。
74.根据权利要求72所述的方法，其中选择性裂解所述碳水化合物的酶包括葡聚糖酶、糖基转移酶、糖苷水解酶、转糖苷酶、磷酸化酶或裂合酶。
75.根据权利要求64、65、66和67所述的装置，进一步包含抗体的结合部分。
76.根据权利要求64、65、66和67所述的装置，进一步包含DNA连接体。
77.根据权利要求24所述的装置，其中所述亲和标记的配体使得能够捕获上皮细胞、间充质细胞、经历上皮-间质转化（EMT）的细胞、经历间质-上皮转化（MET）的细胞、肿瘤干细胞或其任意组合。
78.一种用于制造权利要求1的装置的方法，其中使用环烯烃共聚物（COC）材料或环烯烃聚合物（COP）材料来制造所述装置，其中使用原坯模塑所述COC或COP材料。
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