CN106796164A - 细胞的血小板靶向微流体分离 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于从样品流体，例如生物流体，如血液、骨髓、胸腔积液和腹水中分离血小板相关的有核靶细胞，例如循环上皮细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、循环内皮细胞(CEC)、循环干细胞(CSC)、中性粒细胞和巨噬细胞的方法和系统。该方法包括获得含有结合至该室的一个或多个壁的多个结合部分的细胞捕获室，其中该结合部分与血小板特异性结合；在使结合部分与样品中的任意血小板相关有核靶细胞结合的条件下使样品流体流过细胞捕获室以形成复合物；并从该复合物中分离和收集血小板相关的有核靶细胞。

Description

细胞的血小板靶向微流体分离
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月7日提交的美国临时申请序列号62/034,522的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院提供的编号为5-U01-EB012493-04和EB002503-06A1，以及美国癌症协会提供的编号为125929-PF-14-137-01-CCE的政府资助下进行的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及从流体如血液分离有核细胞。
背景技术
肿瘤细胞从原发部位向远端器官的转移、扩散和生长代表了癌症最具破坏性和致死性的属性，并且是90％癌症死亡的原因。虽然尚未建立对转移生物学的系统理解，但是越来越多地认识到循环肿瘤细胞(CTC)作为转移起始细胞的重要性，其将为癌症进展的早期诊断、表征和监测提供潜在的便捷来源。然而，从癌症患者的血液中可靠地检测和非侵入性分离CTC和其他有核细胞仍然在技术上具有挑战，这不仅是因为它们极其稀有地存在(低至在十亿或更多的血细胞中存在一个)，而且也是由于生物物理和生物化学性质的异质性水平。
就尺寸而言，CTC和其他稀有有核细胞可以小至5微米至8微米，例如红细胞的尺寸，或8微米至18微米，其与人白细胞大致具有相同尺寸，或者在CTC簇形式中大于100微米。就表面化学而言，已广泛用于在通常情况下在阳性选择方法中靶向CTC和上皮细胞的生物标记物上皮细胞粘附分子(EpCAM)的表达在临床样品之间已显示出较大差异，并且作为上皮-间质转化(EMT)的结果其还会随着癌症进展而显著下调。而且，已报道了肿瘤细胞在转移发展期间与微环境中的宿主细胞(例如血液细胞，如白细胞和血小板)存在活跃的相互作用，这可能使得CTC的检测和分离更具挑战性。
发明概述
本公开描述了使用与血小板特异性结合的结合部分从样品流体，例如生物流体，如血液、骨髓、胸腔积液和腹水中分离血小板相关的有核靶细胞，如循环上皮细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、循环内皮细胞(CEC)、循环干细胞(CSC)、中性粒细胞和巨噬细胞的方法和系统。该方法包括在使得结合部分与样品中的任何靶细胞例如CTC，例如包覆血小板的CTC结合的条件下使包含血小板相关靶细胞例如CTC的样品流体流过某室例如细胞捕获室以形成复合物；然后从这些复合物中分离和收集靶细胞，从而从样品流体中分离靶细胞。
在某些实施方式中，使用设计为实现血小板靶向靶细胞捕获的系统例如一阶段或二阶段微流体系统实施该方法。在一些实施方式中，在使样品流体通过细胞捕获室之前，可以首先使用微流体减积(debulking)装置处理流体例如血液样品以除去游离的、未结合的血小板和红细胞(RBC)。减积装置可以包括一个或多个微柱阵列以实现基于流体动力学尺寸的分选。然后可以使用使用抗血小板抗体官能化的细胞捕获室处理所得到的含有靶细胞和白细胞(WBC)的样品流体以高通量捕获血小板相关的靶细胞如CTC。在一些实施方式中，细胞捕获室可以包括能够增强样品流体中的任意血小板相关靶细胞与血小板抗体相互作用的混合结构。在一些实施方式中，此类混合结构以称为“人字形”微混合器的结构呈现。
在通常情况下，本公开涉及从如本申请所述的样品流体中分离血小板相关的有核靶细胞例如循环上皮细胞、CTC、CEC、CSC、中性粒细胞和巨噬细胞的方法。该方法包括获得细胞捕获室，该细胞捕获室含有结合至室的一个或多个壁的多个结合部分，其中该结合部分与血小板特异性结合；在使结合部分与样品中的任意血小板相关的有核靶细胞结合的条件下使样品流体流过细胞捕获室以形成复合物；以及从复合物分离和收集血小板相关的有核靶细胞，从而从样品流体分离靶细胞。
在一些实施方式中，本申请所述的方法还可以包括在使样品流体流过细胞捕获室之前使用血小板抑制剂处理样品流体，其中血小板抑制剂抑制来自粘附于其他细胞的未结合的血小板。例如，其他细胞可以是血小板、红细胞和/或白细胞。在不同的实施方式中，血小板抑制剂可以是茶碱、腺苷、双嘧达莫、阿加曲班或前列腺素I2。
在本申请所述的任意实施方式中，结合部分可以是与血小板特异性结合的抗体。
在一些实施方式中，该方法还可以包括在使样品流体流过细胞捕获室之前，选择性地除去来自样品流体的未结合血小板，同时保持样品流体中的血小板相关的有核靶细胞。例如，可以在包含含有微柱阵列的通道以执行确定性侧向位移的微流体装置中进行血小板消除。例如，微柱可以排布成多行，其中微柱在行内间隔开约30微米至约60微米的距离，例如约35微米至约56微米，随后的行与前一行间隔开约5微米至约15微米的距离，例如约5.6微米至约9.0微米，并且其中在每个随后的行中的微柱与在前一行中的微柱之间横向偏移的距离小于微柱在行内的间隔。
在其他实施方式中，在微流体装置中使用离心力或惯性力或者这两者或者通过密度梯度离心进行血小板消除。
在一些实施方式中，细胞捕获室和微流体装置可以均位于单一基底上或者其可以位于分离的基底上并且经由导管流体连接。在一些实施方式中，细胞捕获室包含在其内表面上排布的多个人字形结构以便在样品流体内产生微涡流。
在设计用于选择性除去靶细胞的一些实施方式中，结合部分结合至包含结合对的第一构件的纳米结构，其中细胞捕获室的一个或多个内表面结合至使用结合对的多个第二构件官能化的明胶层，且其中纳米结构通过结合对的第一和第二构件的结合相互作用结合至明胶的顶层。在这些方法的一些实施方式中，血小板相关的有核靶细胞通过结合部分结合至纳米结构，并且通过在升高的温度下熔化明胶从明胶释放纳米结构分离血小板相关的有核靶细胞。或者，可以通过对明胶层施加局部剪切应力或者通过使用光靶向光热效应从明胶释放纳米结构分离靶细胞。
在另一个方面，本公开涉及从样品流体中分离血小板相关的有核靶细胞如CTC的系统，例如两阶段微流体系统。这些系统包括第一室、第二室以及将两个室流体连接的导管。特别地，导管将第一室产物出口与第二室入口流体连接。
在这些系统中，第一室包括具有入口、废物出口、产物出口的微通道，和排布在入口和出口之间的微柱阵列，其中微柱排布成行并间隔开一定距离，该距离使得红细胞和未结合的血小板能够流过装置到达废物出口并引起血小板相关的有核靶细胞被微柱阵列横向位移至产物出口，其中在每个随后的行中的微柱与在前一行中的微柱之间横向偏移的距离小于微柱在行内的间隔。
第二室包括具有入口和出口的微通道，其中流体通过微通道从入口流动到出口，以及界定于其中和排布在微通道的一个或多个壁、底板和顶板的内表面上的多个凹槽以便在所述样品流体内产生微涡流；以及固定到至少一个内表面的结合部分，其中结合部分与血小板特异性结合。例如，结合部分可以是与血小板特异性结合的抗体。
在这些系统的不同实施方式中，微柱在行内间隔开约30微米至约60微米的距离，例如约35微米至约56微米，且随后的行与前一行间隔开约5微米至约15微米的距离，例如约5.6微米至约9.0微米。在不同的实施方式中，第一室和第二室均位于单一基底上或者其可以位于分离的基底上并且经由导管流体连接。
在一些实施方式中，在第二室中的凹槽包括尖端和与尖端连接以形成V形的两个臂，并且凹槽被排布成使得样品流体从臂流向尖端。
在这些系统的某些实施方式中，结合部分结合至包含结合对的第一构件的纳米结构，其中第二室的一个或多个内表面结合至使用结合对的多个第二构件官能化的明胶层，且其中纳米结构通过结合对的第一和第二构件的结合相互作用结合至明胶的顶层。
如在本申请中使用的，术语“结合部分”指能够粘附至靶点如颗粒、分子或细胞的任意分子或试剂。结合部分包括例如配体结合对、抗体、适体或核酸分子成员。一些结合部分特异性结合至靶分子或试剂，如在细胞表面上的受体或细胞表面标记物，以及一些非特异性结合至可以共享共同特征的多个靶点。
如在本申请中使用的，术语“特异性结合”指结合部分在包含其他颗粒或分子的样品中选择性和优选结合至特定靶点如颗粒、分子或细胞，例如结合至细胞表面上的分子。
与依赖于癌细胞特殊生物物理和/或生物化学性质的现有CTC分选技术相比，本申请所述的方法和系统着眼于癌症转移过程中活跃的细胞间相互作用，其不受规模、癌症类型或肿瘤表面抗原表达水平的限制。更重要的是，这种新方法和系统能够分离非常特殊的有核靶细胞亚群如CTC，其与较高的转移可能性相关，但是难以由其他技术靶向，并且因此其为早期癌症诊断和更好了解癌症是如何扩散的提供了有价值的信息。
特别地，本申请所述新方法和系统的一个益处是其不依赖于靶细胞表面上的特异性生物标记物。很多目前的技术依赖于上皮细胞粘附分子(EpCAM)的表达，这是一种在阳性选择方法中广泛使用的靶向上皮细胞和CTC的生物标记物。然而，EpCAM的表达在临床样本之间的差异较大并且作为上皮-间质转化(EMT)的结果其还会随着癌症进展而显著下调。本发明方法和系统克服了现有方法存在的这个困难。
除非另有定义，否则本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。尽管可以将与本申请中描述的那些相似或等同的方法和材料用于本发明的实施或测试中，但是适宜的方法和材料如下文所述。本申请中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。如有冲突，以本说明书及其所包括的定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是示例性的并且并非旨在限制。本发明一个或多个实施方式的细节列于附图和下述说明书中。本发明的其他特征、目的和优点将是从说明书和附图以及从权利要求中显而易见的。
附图说明
图1A是经由血小板相关的CTC肿瘤转移的示意图。
图1B是为实现血小板靶向CTC捕获设计的两阶段微流体平台一个实施方式的示意图。
图2A是减积芯片一个实施方式的示意图。
图2B是在减积芯片上的微柱阵列的一个实施方式的示意图。
图3是微涡流“人字形”芯片一个实施方式的示意图。
图4A至图4D是颗粒例如细胞或细胞簇流过图3所示的微涡流“人字形”芯片的流动模式的一系列示意图。
图5是显示分别使用EpCAM和CD41抗体捕获的来自转移性肺癌患者血液样品的CTC计数的图。
图6是显示单个细胞、1或2个WBC簇以及2个以上WBC簇形式的CTC计数的图。
图7是显示加入EDTA和前列腺素I2降低血小板-白细胞聚集形成的图。
图8A和图8B是针对未经处理(8A)和经前列腺素I2处理(8B)血液样品在微流体“人字形”芯片上捕获的WBC的热图。
相同附图标记在不同附图中表示相同元件。
具体实施方式
如图1A中所示意的，认为肿瘤细胞与血小板之间的相互作用在血源性转移中发挥作用。最引人注目的证据是在几个独立的小鼠研究中发现的通过血小板消耗抑制转移和通过血小板重建恢复转移潜能。恶性肿瘤细胞在表面上激活和聚集血小板的独特能力为肿瘤的成功转移提供了很多优势，该过程称为肿瘤细胞诱导的血小板聚集(TCIPA)。血小板可能不仅有助于血管新生中的血管重塑过程，而且还可以通过使其逃避剪切力和免疫监视显著增强肿瘤细胞在血液中的存活。
根据本申请所述的新方法和系统，可以将在血小板上的一大类粘附受体用于从样品流体如血液例如全血中分离血小板相关的有核靶细胞，如上皮细胞、CTC、中性粒细胞和巨噬细胞。此外，最近关于血小板与肿瘤细胞之间信号传导的研究揭示了来源于血小板的生长因子/细胞因子有助于诱导上皮-间质转化(EMT)并进一步增强转移潜能。因此，新方法和系统能够分离具有增强的转移潜能的CTC，并因而与同血小板无关的其他CTC相比其可能提供更好的诊断信息。
从样品流体分离靶细胞-血小板簇的方法
本方法和系统利用了某些有核细胞例如CTC与血小板之间独特的相互作用以及利用与此类靶细胞结合(例如结合至如包覆于靶细胞表面上)的血小板作为普遍存在的基于细胞的标记物靶向并从样品流体如血液例如全血中分离这些靶细胞。
在通常情况下，新方法使用含有多个结合部分的室，结合部分结合至该室的一个或多个壁，其中结合部分与血小板特异性结合；在使结合部分与样品中的任意血小板相关靶细胞结合的条件下使含有靶细胞(如有)的样品流体流过该室以形成复合物；以及从复合物分离和收集靶细胞，从而从样品流体分离靶细胞。而且，该方法还可以包括以下步骤：在使样品流体流过该室之前从样品流体中选择性除去未结合的血小板和/或其他污染细胞如红细胞(RBC)同时在样品流体中保持血小板相关的靶细胞和/或在该室中进行混合以增加血小板与结合部分之间的接触。
由于TCIPA是源自肿瘤细胞与宿主微环境之间内在相互作用的一般现象，因而血小板靶向的方法具有不依赖于肿瘤膜表位检测和分离血源性转移中的广谱有核靶细胞的潜力。
为减少WBC的污染和增加CTC的纯度，可以在检测前向血样中加入血小板抑制剂以稳定血液。可以使用多种血小板抑制剂如茶碱、腺苷、双嘧达莫、阿加曲班和前列腺素I2用于稳定血液。EDTA与前列腺素I2的组合在抑制血小板-白细胞聚集物(PLA)形成方面特别有效，其能够使血样中污染WBC的数量减少90％。
与血小板相关靶细胞结合的结合部分
可以将多种结合部分用于结合样品流体中的血小板。例如，多种已知靶向不同血小板表面受体的抗体，包括CD41和CD61(整合蛋白α2bβ3的亚基)；CD42b和CD42c(vonWillibrand因子(γWF)的主要受体)；糖蛋白VI(GP VI)(胶原受体)；以及血小板生成素受体(TPO-R)。这些抗CD41抗体能够有效地使用，因为其对血小板具有较高的捕获效能和较低的非特异性结合。
可以使用多种方法如硅烷化学将结合部分官能化于固体支持物如PDMS或玻璃表面上。具有胺、醛或巯基端基的不同硅烷前体能够与经氧等离子体处理的PDMS/玻璃表面交联，可以将其进一步与不同结合部分缀合。在一个特定示例中，微流体通道形式的固体支持物经3-巯基丙基三甲氧基硅烷修饰，然后加入N-y-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯作为接头，最后与NeutrAvidin(中性抗生物素蛋白)缀合。然后任何生物素化的结合部分如生物素化的血小板抗体能够通过抗生物素蛋白-生物素化学容易地官能化于该装置上。
使样品流体流过具有结合部分的室
在表面官能化后，通常使用试剂封闭该装置以避免非特异性结合，例如使用有效量的牛血清白蛋白(BSA)，例如3％BSA。随后，使特定体积例如1至10mL，例如2、3、4、5或6mL样品流体，例如血液，例如全血或血沉棕黄层流入该系统。通常在室温条件下以设定压力例如0.03至0.15psi，例如0.05、0.075或0.1psi以及1-5mL/小时，例如1、2、3或4mL/小时的流速处理样品流体。
使样品流体减积以除去未结合的血小板
由于全血中存在大量血小板(～105/μL)并且其具有使结合部分饱和的潜在作用，可以先对血样进行处理以除去游离的、未结合的血小板。此外，除去一些或大部分红细胞(RBC)是有利的。可以使用例如密度梯度离心或基于微流体的细胞分离实现减积。
密度梯度离心通常使用收集于CPT管中的血样进行，该管中含有抗凝剂以及聚酯凝胶和密度梯度液体。离心后，然后通过从液体界面小心吸出收集有核的细胞，其中存在来自红细胞和血小板的微量污染。
可以使用本领域公知的不同设计和技术实现基于微流体的血液减积。例如，可以在弯曲的例如蛇形微流体通道中利用惯性力，以通过离心或惯性力(例如惯性聚焦)或者这两者基于其尺寸的差别聚焦和分选细胞(参见例如美国专利号8,807,879)。此外，也可以利用疏水过滤和/或声学驻波分选不同尺寸的细胞。
在另一个实施方式中，可以使用微流体减积装置从样品流体中除去未结合的血小板。此类装置可以由一个或多个微柱阵列组成，以实现基于流体力学尺寸的分选，如下面进一步详细描述的。在通常情况下，这些微流体减积装置使用基于流体力学尺寸的分选以实现全血的低剪切微流体减积。将RBC、血小板和血浆蛋白弃去，但保留有核细胞(WBC和CTC)并将其呈递至进行靶细胞例如CTC捕获的第二阶段。微流体减积的操作原理是基于依赖于流体力学尺寸的确定性横向位移，其中含细胞和无细胞溶液同时流过微柱阵列导致了快速的基础尺寸的分离(参见例如美国专利号8,986,966和美国专利号8,585,971)。亦参见，Ozkumur等，“Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and-IndependentSorting of Rare Circulating Tumor Cells,”Science Translational Medicine,5(179):179ra47(DOI:10.1126/scitranslmed.3005616)(2013)。
通过优化阵列配置(包括微柱之间的空隙或空间以及相邻行之间的位移)和流速，能够实现超过5-log的游离未结合血小板的消耗，同时保持大部分有核细胞。然后可以将含有有核靶细胞和白细胞(WBC)的流体产物直接导入如本申请所述的含有血小板特异性结合部分的室。
混合样品流体以增强结合相互作用
为了增强样品流体中任意血小板相关靶细胞与室中结合部分的相互作用，可以在室内包含混合结构。例如，包括锯齿形、蛇形或扭曲通道的不同通道结构设计可用于被动混合。此外，还可以通过引入由声学、压力扰动或介电泳技术实现的主动微混合进一步增强混合性能。
一种有用的设计称为“人字形”微混合器，其包括在使用血小板抗体官能化的用于高通量捕获血小板相关的靶细胞如CTC的室的一个或多个内壁、底板或顶板上(参见例如，PCT申请号WO 2010/036912)。在通常情况下，将1-10mL样品流体例如血沉棕色层或经减积的血液流入该系统。通常在0.03-0.15psi例如0.05、0.075或0.1psi下于室温条件下以1至2mL/hr的流速使连续摇动的样品流体通过该装置。
处理在室中捕获的靶细胞
可以对细胞捕获装置中捕获的所有细胞进行处理以进行鉴定，例如使用染色测定，例如四色染色测定，以同时进行靶细胞鉴定和血小板表征。将针对肿瘤标记物(例如EpCAM、细胞角蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、钙粘蛋白-11以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI))为阳性的捕获细胞，且任选地针对造血标记物(如CD45、CD14、CD16)也为阴性的那些评分为CTC。可以使用计数范围从0.4至8.5个CTC/mL全血样品的新方法实现可靠的CTC捕获。可以使用其他标记物鉴定其他靶细胞。例如，可以使用CD24、CD133和CD326检测上皮细胞；使用CD15、CD16和CD66b检测中性粒细胞；以及使用CD11b、CD68和CD163检测巨噬细胞。此外，可以使用CD34和CD146鉴定循环内皮细胞(CEC)以及使用CD44、CD90和ALDH1鉴定循环干细胞(CSC)。
当使用现有技术如使用抗上皮标记物抗体如EpCAM抗体官能化的装置将CTC捕获于微流体装置上时，结果显示出一致的与本发明方法相比减少的阳性命中。参见图5，其如下文实施例2中更加详细讨论的，显示出本申请所述的细胞捕获系统能够可靠地捕获来自具有上皮(肺、乳腺)或非上皮(黑色素瘤)肿瘤来源的转移性癌症患者的单细胞或细胞簇形式的CTC。使用本血小板靶向方法具有更高的CTC计数部分地是由于该新方法能够从肺和其他上皮肿瘤类型捕获CTC，上述肿瘤类型可能失去其上皮性质并且因此变得更加难以使用抗上皮标记物抗体如EpCAM抗体靶向。
此前的EpCAM靶向方法通常产生有限地与血小板相关的CTC，而使用本申请所述的新方法捕获的CTC显示出宽范围的血小板覆盖，包括完全被血小板/纤维蛋白包覆的CTC的特殊亚群。已将这些血小板覆盖的CTC假设为高转移潜能前体，因为血小板增强了肿瘤细胞的存活和增殖，但是其很难通过靶向肿瘤表面抗原的常规阳性选择方法捕获。可以使用定量成像方法进一步研究CTC表型与血小板分布之间的相关性。结合我们小组最近开发的受控细胞释放策略，也可能实现单细胞水平的基因型研究，这预期将进一步拓展我们在癌症转移方面的知识。
一旦使用新方法捕获了血小板相关的CTC，可以使用与肺癌样品相同的方案鉴定乳腺癌CTC，而通过使用靶向黑色素瘤特异性抗原的抗体或抗体混合物染色鉴定黑色素瘤CTC(例如，抗CSPG4、MCAM、TYRP1和α-SMA抗体中的任意一种或多种)。
通过选择性释放纯化所捕获的靶细胞
在一些样品流体如陈化全血中，可能存在大量血小板相关的WBC，其是使用新方法与血小板相关的靶细胞一起分离的。
在一些实施方式中，新方法可以包括选择性释放与含有结合部分的室结合的靶细胞如CTC的步骤。例如，如国际申请公开号WO 2014/121204中所描述的，细胞捕获室可以包括与纳米结构结合的结合部分，纳米结构本身包括结合对的第一构件，其中该室的一个或多个内表面结合至使用多个结合对的第二构件官能化的明胶层，并且其中该纳米结构通过结合对的第一和第二构件的结合相互作用结合至明胶的顶层。然后靶细胞(通过其相关的血小板结合至与纳米结构结合的结合部分)可以通过两种释放机制中的一种从室中释放。
在第一种释放机制中，可以通过例如在升高的温度下融化明胶将纳米结构从明胶上释放从细胞捕获室分离和除去靶细胞如CTC。通过升高温度，例如超过30℃，例如37℃，所捕获的靶细胞可以以批量的方式释放。或者，在第二种释放机制中，通过对明胶层施加局部剪切力，可以使靶细胞从明胶上释放。通过在明胶中增加局部剪切力，例如通过使用振动装置施加控制频率的力，例如在PCT WO 2014/121204中描述的微尖装置，可以从细胞捕获室选择性释放单细胞。
除了单个CTC(约55％)以外，新方法还分离血小板靶向平台上不同尺寸的细胞簇。事实上，超过40％所捕获的CTC是CTC/WBC簇形式。见图6，其显示了约30％的CTC与1或2个WBC成簇，以及约15％的CTC与2个以上WBC成簇。相互作用WBC的数量随着CTC周围的血小板覆盖而增加。目前的方法靶向单一CTC和CTC/WBC簇的能力(后者非常难以通过常规的基于亲和性的阳性或阴性选择方法分离)将使得能够通过非侵入性血液活检对癌症转移进行全面表征，并且其还在下游应用中开辟了新机会，如CTC培养，因为在特定微环境中会改善CTC的存活/增殖。
分离CTC/WBC的能力使得能够分离在其他现有的CTC分离技术中会失去的细胞群。例如，阴性选择CTC分离技术利用基于抗体的结合使用磁性材料靶向WBC。在这些方法中，将磁性材料官能化以使其与WBC特异性结合并且在进入微流体系统前将其引入流体样品。然后流体样品进入“偏转通道”经受定向的磁性梯度以使得磁性颗粒以及与其结合的任意细胞沿一定方向偏转。当将含有与一个或多个磁性颗粒结合的靶细胞/颗粒的流体样品引入偏转通道时，由附近磁体产生的磁力沿磁性梯度方向牵拉磁性颗粒(以及所附着的细胞/颗粒)。在阴性选择CTC分离的情况下，这种分离将WBC以及附着于WBC的任意其他颗粒/细胞转移至“废物”通道，并分离“产物”通道中未结合的CTC。这种方法导致了与WBC结合的任意CTC的损失，其与磁性颗粒结合又进入了废物通道。
本申请所述的两阶段微流体平台不存在上述缺陷。
从样品流体分离靶细胞的微流体系统
如上所述，用于从样品流体分离血小板相关的有核靶细胞如CTC的方法使用细胞捕获室，细胞捕获室含有与该室的一个或多个壁、底板和/或顶板结合的多个结合部分，其中结合部分与血小板特异性结合。在使得结合部分与样品中的任意血小板相关的靶细胞结合的条件下使含有靶细胞的流体样品流过该室以形成复合物。该过程使得靶细胞如CTC从复合物中分离和收集，从而从样品流体中分离靶细胞。而且，如图1B中所示，该系统可以包括上游部件(第一阶段110)，其在使样品流体流过细胞捕获室(第二阶段120)之前，从样品流体中选择性地除去未结合的血小板和其他细胞例如红细胞(RBC)，同时保持样品流体中的血小板相关的CTC。
如图1B中所示，向该系统的输入流体可以是全血130。第一阶段110将未结合的血小板以及其他细胞例如RBC 140与有核细胞(150)分离，有核细胞(150)继续通过该系统进入血小板靶向捕获室(120)。
第一阶段——从样品流体除去红细胞和血小板的减积装置
对于第一阶段而言，整个系统可以包括减积装置200，例如由一个或多个微柱阵列组成的微流体装置，以便通过基于流体力学尺寸的分选从全血中除去RBC和游离的血小板，其使得较小的血小板和RBC作为废物离开该装置，同时使得较大的WBC和CTC以及细胞簇进入第二阶段，即细胞捕获室。
如图2A中所示，第一阶段系统可以在单一芯片200上生产。在一些实施方式中，芯片可以包括入口202，一个或多个微柱阵列205(在本图中是两个)以及出口203。
如图2B中所示，该系统中的第一阶段可以是使用微柱阵列205分离细胞的流体力学分选装置，微柱阵列205基于其尺寸、形状或可变形性选择性地使颗粒通过。微柱阵列中空间的尺寸、形状或可变形性决定了能够通过该阵列的细胞类型。可以将两个或多个微柱阵列串联或平行排布，例如以连续除去尺寸递增的细胞。对于这种微流体系统的描述，参见例如美国专利号8,986,966、美国专利号8,585,971和Ozkumur等(2031)，如上所述。
在本申请所述的装置中可以使用多种微柱210尺寸、几何形状和排布。可以使用不同形状的微柱，例如具有圆形、正方形、矩形、椭圆形或三角形截面的微柱。可以对微柱之间空隙220的尺寸和微柱的形状进行优化以确保迅速和有效的分离。例如，RBC的尺寸范围为5-8μm量级，以及血小板的尺寸范围为1-3μm量级。所有WBC的尺寸均大于10μm。考虑到这些尺寸，尽管使用更大的微柱之间的空隙能够增加RBC和血小板通过阵列的速率，但是增加空隙的尺寸也会增大损失WBC的风险。较小的空隙尺寸确保了更有效的捕获WBC，但是也会减慢RBC和血小板的通过速率。根据应用的类型，可以使用不同的几何形状。对于本方法而言，可以使用的微柱直径为约10至30μm，例如约15至24μm，例如10、12、15、17、20、22、24、25或27μm。微柱之间的空隙或间隔为约10至40μm，例如20至32μm，例如15、20、25、30、35或40μm是有效的。
可以使用多种方法生产微柱阵列。例如，可以通过对基底如玻璃、金属或聚合物进行模制、电铸、蚀刻或钻孔来形成微柱阵列。例如，可以使用简单的微制造技术如聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)软光刻、聚合物铸造(例如使用环氧树脂、丙烯酸树脂或聚氨酯)、注射模制、聚合物热压花、激光显微机械加工、薄膜表面显微机械加工、对玻璃和硅进行深蚀刻、电铸以及3-D制造技术如立体光刻制造本申请所述装置的通道和微柱阵列。这些装置中的大部分使用光掩模复制微特征。
对于大于5μm的特征尺寸而言，可以使用基于透明度的乳液掩膜。特征尺寸为2至5μm之间可能需要基于玻璃的铬光掩膜。对于更小的特征而言，可以使用基于玻璃的电子束直写掩膜。然后将掩膜用于在硅或玻璃的情况下定义蚀刻的光致抗蚀剂图样或者定义复制阴模，例如使用SU-8光致抗蚀剂，然后可以将其用作聚合物材料如PDMS、环氧树脂和丙烯酸树脂的复制模制母版。然后可以将预制的通道连接至刚性基底如玻璃上以完成该装置。其他制造方法是本领域公知的且本申请所述的装置可以由单一材料或材料的组合制造。
使用深反应性离子蚀刻在硅晶片上设计和制造特定的第一阶段流体力学分选芯片。使用阳极结合玻璃盖密封芯片以形成微流体减积部件。使用定制的聚碳酸酯歧管形成与基底和第二阶段细胞捕获室的流体连接。
第二阶段——细胞捕获室
在不同实施方式中，细胞捕获室可以是使用血小板结合部分将一个或多个壁和/或底板官能化的简单的微流体通道，或者可以是更精细的且包括混合结构以增强和增加样品流体中的血小板相关CTC与血小板结合部分接触的数量。
如图3中所示，细胞捕获室可以形成使用抗血小板抗体官能化的产生微涡流的“人字形”室(或“芯片”)，用于高通量捕获血小板相关的CTC(参见PCT申请公开号WO 2010/036912)。在这种实施方式中，该室形成在微流体装置中形成的微通道，其中形成延伸进入(或离开)微通道的壁的凹槽(或突起)，以便在流过通道的流体中产生促进在流体中悬浮的任意细胞与通道壁的内表面之间相互作用的流动模式。增加的相互作用可以导致在通道中捕获的CTC数量的增加，并因此导致微流体装置的总捕获效率提高。在这种实施方式中，将微流体装置的捕获效率定义为在通道中捕获的CTC数量与流过通道的细胞总数的比值。
通过调整微流体装置的结构特征(包括例如装置基底材料、通道和凹槽尺寸等)以及流体流动参数(如基于颗粒类型和其中混悬了颗粒的流体类型的流动速率)能够进一步提高效率。
图3描述了使用软光刻技术生产的此类微流体装置的示例。如下文所述，通过在微通道的一个或多个壁、底板和/或顶板中形成凹槽，将血小板结合部分包覆于微通道的壁、底板和/或顶板的内表面上以及使样品流体流过微通道将血小板相关的CTC捕获于细胞捕获室的微通道中。
图3显示了具有延伸入装置300的通道315的上壁(或顶板)的凹槽335、340的微流体装置300。在一些实施方式中，细胞捕获室包括从壁向外延伸的突起(例如，V形突起)，而不是延伸入通道315的壁中的凹槽。在一些实施方式中，对称凹槽335包括两个臂，其分别跨过第一末端350和顶点345以及第二末端355和顶点345之间的长度。在示例性的实施方式中，两个臂之间的角α为90°。在一些实施方式中，两臂之间角α的范围在10°至170°之间。在一些实施方式中，微流体装置300可以包括与下基底310结合的上基底305，其均可以使用适宜材料制造。例如，上基底305可以使用弹性体制造，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，以及下基底可以使用玻璃、PDMS或其他弹性体制造。
或者或此外，可以使用塑料生产基底，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、环烯烃共聚物(COC)等。在通常情况下，选择制造上基底和下基底的材料可以是易于生产例如易于蚀刻且能够提供便于测试的光学性质例如可以是光学透明的，并且可以是无毒的，以使得对于附着于基底上的细胞不具有负面影响。此外，该材料优选无自发荧光或具有有限的自发荧光。而且，该材料能够易于管能化，使得分析物可以附着于基底。此外，该材料可以具有机械强度，以便向微流体装置300提供强度。上基底305可以牢固地紧固至下基底310，其间形成微通道，如下文所述。
在一些实施方式中，微通道315可以具有包括两个侧壁320和325以及在上基底305中形成的上壁330的矩形横截面。使用相对位置的术语例如“上”和“下”以便于描述和表示附图中的位置而不是特征的必要相对位置。例如，可以将该装置定向以使得凹槽位于通道的底表面上或者使得通道的中心轴线垂直延伸。或者，微通道315的横截面可以是几种形状中的一种，包括但不限于三角形、梯形、半月形等。一旦连接至上基底305，下基底310可以形成微通道315的下壁。在一些实施方式中，微通道315包括在微通道315的上壁330中形成的多个凹槽335。或者，凹槽335可以在任意壁中形成，和/或可以在微通道315的一个以上壁中形成。凹槽335可以跨过壁的整个长度，或者仅跨过壁的一部分。
图4A-4D是显示颗粒悬液流过具有平壁的微通道和具有在壁中形成的凹槽的另一个微通道的示意图。图4A显示了包括具有矩形横截面的微通道405的微流体装置400。微通道405的壁不包括如对于微流体装置300所描述的那些凹槽，即壁的表面是平的。图中显示了流过微通道405的含有悬浮于流体中的血小板相关的靶细胞425的颗粒悬液。而相反的是，图4B显示了流过微流体装置300的类似悬液。
当流体流过由凹槽335在微通道315内排成一列形成的人字形图案时，在流体路径中的凹槽335破坏了流体流动。在一些实施方式中，根据流速和凹槽的尺寸，特别是例如凹槽的大小以及凹槽两臂之间的角度，对流体流动的破坏导致在流体中产生了微涡流。产生微涡流是由于凹槽引起流体沿着横向于流体流动的主方向(即轴向方向)的方向流动。在一些实施方式中，尽管未产生微涡流，但是凹槽335，340诱导了足够的破坏以改变部分流体的流动路径，从而增加了壁与颗粒之间的相互作用。
没有任何凹槽时，如图4C中所示，混悬于流体中的血小板相关的靶细胞425以基本上线性的形式通过平的微通道405，使得仅靠近流场边缘(例如紧邻微通道405的壁)的那些颗粒425可能与结合至微通道205的壁的抗体发生了相互作用。而相反的是，如图4D中所示，穿过人字形凹槽图案的血小板相关的靶细胞425的流径被流体中的微涡流所破坏，增加了细胞与结合至壁和/或凹槽的抗体之间相互作用的数量。微涡流受到在微流体装置300的上壁315中形成的各凹槽335的结构特征的影响。
第二阶段的人字形芯片可以使用如此前所述的软光刻技术由结合至玻璃基底的PDMS制成。然后可以利用抗生物素蛋白-生物素化学使用抗-CD41抗体(Abcam)将芯片表面官能化。
可以在单一芯片上制备第一阶段流体力学分选芯片和第二阶段人字形芯片，或者可以将其制成单独的芯片并通过导管连接，如塑料管或其他管。
实施例
在下述实施例中对本发明进行进一步描述，其对于在权利要求中描述的本发明的范围不构成限制。
实施例1——从临床样本中分离CTC
对本方法进行测试以确定其从不同类型的癌症中分离CTC的效率。
根据经机构审查委员会(TRB)批准的方案招募晚期肺癌、乳腺癌和黑色素瘤患者。将所有标本收集至含有抗凝剂EDTA的(Becton-Dickinson)管中，并在抽血4小时内使用微流体芯片对其进行处理。收集血液后立即加入额外的血小板抑制剂如茶碱、腺苷、双嘧达莫、阿加曲班和前列腺素I2。将固定的血液样品直接收集至BCT管(Streck)中。
将样品在上文所述的两阶段微流体系统上运行。特别地，使用深反应性离子蚀刻在硅晶片上制造第一阶段流体力学分选芯片。使用阳极结合玻璃盖密封芯片以形成微流体室。使用定制的聚碳酸酯歧管形成与微芯片的流体连接。我们测试了微柱之间的空隙为20或32μm的两个不同的阵列配置。具有20-μm空隙的阵列几乎保留了所有的有核细胞且具有极少的污染RBC，但是其将大于21μm的细胞截留并因此可能失去较大的CTC或CTC簇。而相反的是，具有32-μm空隙的阵列对于8至30μm之间的细胞具有扩展的操作范围，但是仅保留了60％的WBC。由于在32-μm空隙的阵列中失去的细胞是小于所报道的CTC尺寸的粒细胞和淋巴细胞，因而我们选择该阵列作为CTC的分离系统。
第二阶段的人字形芯片是使用如此前所述的软光刻技术由结合至玻璃基底的PDMS制成。利用抗生物素蛋白-生物素化学使用抗-CD41抗体(Abcam)将芯片表面官能化。
结果如图5中所示，其以图形的形式显示了(左侧)分别使用EpCAM和CD41抗体捕获的来自转移性肺癌患者的32个血液样品的CTC计数。使用同时进行CTC鉴定和血小板表征的四色染色测定对芯片上捕获的所有细胞进行了处理。将针对肿瘤标记物(EpCAM、钙粘蛋白-11)和DAPI为阳性，同时针对造血标记物(CD45)为阴性的所捕获的细胞评分为CTC。在32例的21例中(66％)实现了可靠的CTC捕获，其计数范围从0.4至8.5CTC/mL。
相比之下，在使用EpCAM抗体官能化的微流体装置上平行进行的CTC捕获显示了持续较低的阳性命中(图5，右侧)。血小板靶向的方法具有更高的CTC计数是由于本方法具有捕获可能失去其上皮性质从而难以通过EpCAM抗体靶向的肺CTC的能力。
使用CD61抗体对血小板进行染色以表征其在CTC表面周围的分布。使用新系统捕获的CTC显示出宽范围的血小板覆盖，包括完全被血小板/纤维蛋白包覆的CTC亚群。已将这些血小板覆盖的CTC假设为高转移潜能前体，因为血小板增强了肿瘤细胞的存活和增殖，但是其很难通过靶向肿瘤表面抗原的常规阳性选择方法捕获。因此，新的系统和方法为捕获这些CTC提供了新的和改进的技术。
实施例2——不同类型癌症的分离
对微流体平台进行扩展以便从具有上皮(乳腺)和非上皮(黑色素瘤)肿瘤来源的不同类型癌症患者中分离CTC。使用与肺癌患者的样品相同的方案对乳腺CTC进行鉴定，但根据此前的报道使用靶向黑色素瘤特异性抗原(CSPG4、MCAM、TYRP1和α-SMA)的抗体混合物对黑色素瘤CTC进行染色。初步的结果表明针对这两种癌症类型均具有可靠的CTC捕获(5例乳腺样品中的3例，计数范围从0.9至2.7CTC/mL；6例黑色素瘤样品中的5例，计数范围从1.4至17CTC/mL)。与肺癌的结果类似，使用目前方法捕获的所有CTC均与不同程度的血小板覆盖相关。
如上文所讨论的，使用EpCAM/钙粘蛋白-11(绿色)作为上皮和间叶标记物对肺和乳腺CTC进行鉴定，但使用CSPG4、MCAM、TYRP1和α-SMA(绿色)抗体的混合物对黑色素瘤CTC进行染色。分别使用CD45(红色)和CD61(绿色)对WBC和血小板进行染色。显微镜成像清楚地显示了所捕获的各种类型的CTC(结果未显示)。
因此，所测试的系统能够从具有上皮(肺、乳腺)和非上皮(黑色素瘤)肿瘤来源的转移性癌症患者中以单个细胞或细胞簇的形式可靠地捕获CTC。这些结果表明血小板靶向的CTC捕获对多种类型的癌症是有效的。
实施例3——抗凝剂和CTC纯度
潜在地限制血小板靶向方法性能的一个关键问题是与其他技术相比相对较低的CTC纯度。在芯片上观察到了大量的污染WBC(>105/mL)，这使得下游的分析非常具有挑战性。使用血小板特异性抗体染色显示大部分捕获的WBC还被血小板包覆。这些称为血小板-白细胞聚集物(PLA)的形成源自自发性的血小板活化和随后的p-选择素的表达，其然后将结合至白细胞表面上的PSGL-1受体。PLA无法通过基于尺寸的分选除去，并且其与血小板相关的CTC一起被抗血小板抗体捕获。
为了减少WBC的污染和提高CTC的纯度，我们测试了多种用于稳定血液的血小板抑制剂，如茶碱、腺苷、双嘧达莫、阿加曲班和前列腺素I2。使用基于EpCAM的捕获作为对照以评估每mL血液样品中的WBC数量。这些结果如图7的左侧一列所示。基于EpCAM的捕获通常导致较少的WBC污染，尽管这种CTC分离方法具有上文讨论的多种缺陷。使用多种血小板抑制剂对基于血小板的捕获进行测试，结果如图7中的右侧一列所示(实心圈表示未处理的样品)。发现EDTA与前列腺素I2的组合(如图中的空心三角所示)有效抑制PLA形成，并且使污染WBC的数量减少90％(图7)。
为了完全抑制PLA形成，在处理前将血液样品在BCT管中固定24小时，其产生用于基于血小板的捕获的最佳CTC纯度。将这些样品称为“固定的血液”(空心圈)。
图8A和图8B显示了含有映射至其在微流体装置上的相对位置的各个所捕获的WBC(黑点)的微流体装置的热图。未处理的血液样品存在较强的衰减图案，大多数所捕获的细胞位于装置入口处，这表明WBC与CD41抗体之间通过表面的血小板存在特异性相互作用(图8A)。而相反的是，经前列腺素I2处理的血液样品的热图显示出明显更少的捕获细胞，其随机分布于整个装置中(图8B)。
而且，通过使用市售血液稳定溶液(例如Streck的BCT管)轻柔固定血液样品，能够抑制大部分处理过程中形成的PLA，因为其使得血小板完全失活，从而将CTC的纯度基本上提高至与常规EpCAM靶向捕获相当。在这些研究中，CTC捕获不受影响，因为TCIPA已在体内条件下发生并且这些血小板相关的聚集物已在采血前形成。
对于血小板-WBC聚集物的这种解决方案改进了设计用于实现血小板靶向的CTC捕获的两阶段微流体平台的结果。
其他实施方式
已描述了多个本发明的实施方式。然而，应当理解，在不脱离本发明的主旨和范围的前提下可以进行各种修改。因此，其他实施方式在所附权利要求的范围内。

Claims (29)

1.一种用于从样品流体分离血小板相关的有核靶细胞的方法，所述方法包括：
获得细胞捕获室，所述细胞捕获室含有结合至所述室的一个或多个壁的多个结合部分，其中所述结合部分与血小板特异性结合；
在使所述结合部分与所述样品中的任意血小板相关的有核靶细胞结合的条件下使所述样品流体流过所述细胞捕获室以形成复合物；以及
从所述复合物分离和收集血小板相关的有核靶细胞，从而从所述样品流体分离所述血小板相关的有核靶细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血小板相关的有核靶细胞包括循环上皮细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、循环内皮细胞(CEC)、循环干细胞(CSC)、中性粒细胞和巨噬细胞的任意一种或多种。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述样品流体包括生物流体。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，所述方法还包括在使所述样品流体流过所述细胞捕获室之前使用血小板抑制剂处理所述样品流体，其中所述血小板抑制剂抑制未结合的血小板粘附至其他细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述其他细胞包括血小板、红细胞和白细胞。
6.根据权利要求4和5中任意一项所述的方法，其中所述血小板抑制剂包括茶碱、腺苷、双嘧达莫、阿加曲班或前列腺素I2。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其中所述结合部分包含与血小板特异性结合的抗体。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的方法，所述方法还包括在使所述样品流体流过所述细胞捕获室之前，从所述样品流体中选择性地除去未结合的血小板，同时保持在所述样品流体中的血小板相关的有核靶细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在微流体装置中进行血小板消除，所述微流体装置包含含有微柱阵列的通道以执行确定性侧向位移。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述微柱排布成多行，其中所述微柱在行内间隔开约30微米至约60微米的距离，例如约35微米至约56微米，随后的行与前一行间隔开约5微米至约15微米的距离，例如约5.6微米至约9.0微米，并且其中在每个随后的行中的所述微柱与在前一行中的微柱之间横向偏移的距离小于所述微柱在所述行内的间隔。
11.根据权利要求8所述的方法，其中在微流体装置中使用离心力或惯性力或者这两者进行所述血小板消除。
12.根据权利要求8所述的方法，其中通过密度梯度离心进行血小板消除。
13.根据权利要求9至11中任意一项所述的方法，其中所述细胞捕获室和所述微流体装置均位于单一基底上。
14.根据权利要求9至11中任意一项所述的方法，其中所述细胞捕获室和所述微流体装置位于分离的基底上并且经由导管流体连接。
15.根据权利要求1至14中任意一项所述的方法，其中所述细胞捕获室包含在其内表面上排布的多个人字形结构以便在所述样品流体内产生微涡流。
16.根据权利要求1至15中任意一项所述的方法，其中所述结合部分结合至包含结合对的第一构件的纳米结构，其中所述细胞捕获室的一个或多个内表面结合至使用所述结合对的多个第二构件官能化的明胶层，且其中所述纳米结构通过所述结合对的第一和第二构件的结合相互作用结合至所述明胶的顶层。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述血小板相关的有核靶细胞通过所述结合部分结合至所述纳米结构，并且通过在升高的温度下熔化所述明胶从所述明胶释放所述纳米结构分离所述血小板相关的有核靶细胞。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述血小板相关的有核靶细胞通过所述结合部分结合至所述纳米结构，并且通过对所述明胶层施加局部剪切应力从所述明胶释放所述纳米结构分离所述血小板相关的有核靶细胞。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述血小板相关的有核靶细胞通过所述结合部分结合至所述纳米结构，并且通过利用光靶向光热效应从所述明胶释放所述纳米结构分离所述血小板相关的有核靶细胞。
20.根据权利要求1至19中任意一项所述的方法，其中血小板相关的有核靶细胞是循环肿瘤细胞(“CTC”)。
21.根据权利要求3至20中任意一项所述的方法，其中所述生物流体包括血液、骨髓、胸腔积液或腹水。
22.根据权利要求3至20中任意一项所述的方法，其中所述生物流体包括血液。
23.一种用于从样品流体分离血小板相关的有核靶细胞的两阶段微流体系统，所述系统包括：
第一室，包括
具有入口、废物出口、产物出口的微通道，和排布在所述入口和所述出口之间的微柱阵列，其中所述微柱排布成行并间隔开一定距离，所述距离使得红细胞和未结合的血小板能够流过所述装置到达废物出口并引起血小板相关的有核靶细胞被微柱阵列横向位移至产物出口，其中在每个随后的行中的所述微柱与在前一行中的微柱之间横向偏移的距离小于所述微柱在所述行内的间隔。
第二室，包括
具有入口和出口的微通道，其中流体通过所述微通道从所述入口流动到所述出口，以及界定于其中和排布在所述微通道的一个或多个壁、底板和顶板的内表面上的多个凹槽以便在所述样品流体内产生微涡流；以及固定到至少一个内表面的结合部分，其中所述结合部分与血小板特异性结合；以及
将所述第一室产物出口流体连接至所述第二室入口的导管。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述微柱在行内间隔开约30微米至约60微米的距离，例如约35微米至约56微米，且随后的行与前一行间隔开约5微米至约15微米的距离，例如约5.6微米至约9.0微米。
25.根据权利要求23和24中任意一项所述的系统，其中所述第一室和所述第二室均位于单一基底上。
26.根据权利要求23和24中任意一项所述的系统，其中所述第一室和所述第二室位于分离的基底上并经由所述导管流体连接。
27.根据权利要求23至26中任意一项所述的系统，其中所述凹槽包括尖端和与所述尖端连接以形成V形的两个臂，并且其中所述凹槽被排布成使得所述样品流体从所述臂流向所述尖端。
28.根据权利要求23至27中任意一项所述的系统，其中所述结合部分结合至包含结合对的第一构件的纳米结构，其中所述细胞捕获室的一个或多个内表面结合至使用所述结合对的多个第二构件官能化的明胶层，且其中所述纳米结构通过所述结合对的第一和第二构件的结合相互作用结合至所述明胶的顶层。
29.根据权利要求23至28中任意一项所述的系统，其中所述结合部分包含与血小板特异性结合的抗体。
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