CN110106069A - 一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片,涉及生化检测领域,包括:前置样本处理部分、红细胞筛离部分以及惯性聚焦部分,其中,所述前置样本处理部分由样品注入口、细胞过滤器和鱼骨型微通道构成;所述红细胞筛离部分由矩形微柱阵列框、红细胞上汇流微通道、红细胞下汇流微通道和血细胞流出口构成;所述惯性聚焦部分由惯性聚焦微通道和细胞分流岔口、CTCs富集处和废液口构成。采用本生物芯片能够适配多种捕获方法,确保了高捕获率,采用本生物芯片,用血量小,耗时短,1ml的血液样品预期可在20‑30分钟内完成,对于癌细胞免标记,可控性强,易操作。微流控芯片及其基底均可用聚二甲基硅氧烷制作,成本低。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测领域,尤其涉及一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)是指从原发肿瘤扩散进入外周循环血液系统中的肿瘤细胞,它的出现标志着肿瘤细胞已经开始从病灶组织向四周扩散,从而可能导致更多器官组织产生病变。CTCs可在肿瘤发生的早期出现,且研究表明约90% 的 癌 症 死 亡 案 例 与CTCs 扩 散 有关,因此,CTCs 检测在重大疾病的早期预防、治疗效果评估、药物敏感性测试及肿瘤复发监测等医学应用方面具有十分重要的意义。
现有的捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片因为不能同时实现所有的功能和要求,所以目前唯一应用于临床的只有捕获率不高的得到美国 FDA 认证的 Cell Search。仅局限于乳腺癌,结直肠癌和前列腺癌。还有可能的非上皮细胞或非肿瘤上皮细胞的上皮表达所致的假阳性结果。目前也由于微流控芯片的种种缺陷,局限了临床的应用仅限于美国FDA认证的 Cell Search。该方法也存在半自动,高成本,低效率的缺陷。假阳性比率高,富集后的 CTCs 没有生物活性,仅针对 EpCAM 阳性,无法检测不表达 EpCAM 的恶性 CTCs。为实现设计小型化、便于集成、芯片通道内流体流量、流向可控且不影响生物的原始特性和分析系统工作稳定性的微流控芯片,设计一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的生物芯片克服主动分选存在的耗时长、效果差、细胞活性受损以及其他被动分选存在的低效率和低纯度的缺点,而提出的一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片,包括:前置样本处理部分、红细胞筛离部分以及惯性聚焦部分,其中,所述前置样本处理部分由样品注入口、细胞过滤器和鱼骨型微通道构成,进行初步分离样品;所述红细胞筛离部分由矩形微柱阵列框、红细胞上汇流微通道、红细胞下汇流微通道和血细胞流出口构成,用于分离出大部分的红细胞;所述惯性聚焦部分由惯性聚焦微通道和细胞分流岔口、CTCs富集处和废液口构成,使CTCs单独成流束,进入CTCs富集处,剩下的进入废液口。
优选的,还包括基底和玻璃片,所述基底为聚二甲基硅氧烷 ,且基底设置于玻璃片上,所述前置样本处理部分、红细胞筛离部分以及惯性聚焦部分均设置于基底上。
优选的,所述前置样本处理部分的样品注入口与鱼骨微型通道的一端连接,所述鱼骨微型通道的另一端与矩形微柱阵列框连接,所述鱼骨微型通道上设置有细胞过滤器。
优选的,所述红细胞筛离部分的血细胞流出口与红细胞上汇流微通道、红细胞下汇流微通道的一端连接,所述红细胞上汇流微通道、红细胞下汇流微通道的另一端汇聚在矩形微柱阵列框处。
优选的,所述惯性聚焦部分中惯性聚焦微通道的一端与矩形微柱阵列框连接,另一端设置有废液口,且设置有废液口的一端分支出细胞分流岔口,所述细胞分流岔口的远端设置有CTCs富集处。
本发明的有益效果为:
(1) 采用本生物芯片能够适配多种捕获方法,确保了高捕获率。
(2) 采用本生物芯片,用血量小,耗时短,1ml 的血液样品预期可在 20-30分钟内完成。
(3) 本生物芯片适用于被动富集,对于癌细胞免标记,可控性强,易操作。
(4) 微流控芯片及其基底均可用聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 制作,成本低。
附图说明
图1为本发明微流控芯片微观视图;
图2为微流控芯片及分选细胞的3D视图;
图3为细胞在鱼骨型微通道运动情况示意图;
图4为细胞在矩形微柱阵列框运动情况示意图;
图5为细胞在惯性聚焦微通道运动情况示意图;
图6为实验过程中细胞在芯片中的运动情况;
图7为CTCs富集处、废液口提取的细胞形态示意图。
图中标号:1-样品注入口;2-血细胞流出口;3-CTCs 富集处;4-废液口;5-细胞过滤器;6-鱼骨型微通道;7-矩形微柱阵列框;8-红细胞上汇流微通道;9-红细胞下汇流微通道;10-惯性聚焦微通道;11-细胞分流岔口;12-红细胞;13-CTCs; 14-基底;15-玻璃片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
实施例一
参照图1和2,一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片,包括:前置样本处理部分、红细胞筛离部分以及惯性聚焦部分,其中,前置样本处理部分由样品注入口1、细胞过滤器5和鱼骨型微通道6构成,前置样本处理部分的样品注入口1与鱼骨微型通道6的一端连接,鱼骨微型通道6的另一端与矩形微柱阵列框7连接,鱼骨微型通道6上设置有细胞过滤器5,进行初步分离样品;红细胞筛离部分由矩形微柱阵列框7、红细胞上汇流微通道8、红细胞下汇流微通道9和血细胞流出口2构成,红细胞筛离部分的血细胞流出口2与红细胞上汇流微通道8、红细胞下汇流微通道9的一端连接,红细胞上汇流微通道8、红细胞下汇流微通道9的另一端汇聚在矩形微柱阵列框7处,用于分离出大部分的红细胞;惯性聚焦部分由惯性聚焦微通道10和细胞分流岔口11、CTCs富集处3和废液口4构成,惯性聚焦部分中惯性聚焦微通道10的一端与矩形微柱阵列框7连接,另一端设置有废液口4,且设置有废液口4的一端分支出细胞分流岔口11,细胞分流岔口11的远端设置有CTCs富集处3,使CTCs单独成流束,进入CTCs富集处3,剩下的进入废液口4,还包括基底14和玻璃片15,基底14为聚二甲基硅氧烷 ,且基底14设置于玻璃片15上,前置样本处理部分、红细胞筛离部分以及惯性聚焦部分均设置于基底14上。
本实施例中,前置样本处理部分:待检测样本通过样品注入口1、细胞过滤器5和鱼骨型微通道6,大的细胞团被阻隔,CTCs稳定在通道流场中部,其他小的细胞(RBCs、WBCs等)分居于通道两侧,实现初步分离。红细胞筛离部分:通道两侧的小细胞通过矩形微柱阵列框7的上下端口,由红细胞上汇流微通道8和红细胞下汇流微通道9汇流至血细胞流出口2,分离出大部分的红细胞。惯性聚焦部分:经过初步筛离过后的细胞液通过惯性聚焦微通道10和细胞分流岔口11,使CTCs单独成流束,进入CTCs富集出3,剩下的进入废液口4,完成最终分离。本实施例中如果要求CTCs纯度较高,可以再次利用芯片分离,直到符合要求为止。本生物芯片利用基于大小的尺寸惯性聚焦的原理,多种方法的结合确保了高的捕获效率,并且有效地实现高捕获率下的高通量及高纯度,以满足临床的需求。
其中,(1)关于微柱阵列中微柱的排数、直径等可以根据需要进行调整;(2)除了可以用于血液样品中循环肿瘤细胞的检测之外,本发明的微流控芯片还可以用于其他可包被磁性粒子、并且待测粒子与其之外的其他粒子在尺寸上存在差异的待测粒子检测上;(3)本文可提供包含特定值的参数的示范,但这些参数无需确切等于相应的值,而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应值。
实施例二
在本发明的另一个实施例中,还提供了一种利用实施例一微流控芯片的捕获循环肿瘤细胞的方法。
原理解释:当流体在直线形通道中呈层流流动时, 靠近通道壁的流体会受到通道壁的摩擦力作用, 阻碍其运动, 使得靠近通道壁的流体速度最低.由于靠近通道壁的流体与其他层间流体存在速度的差异,使得靠近通道壁的流体与邻近层的流体产生内摩擦力,降低邻近层流体速度.这种效应进一步在离通道壁较远的流体层中传递.最终,使得流速呈现一种抛物线状的分布:通道中间的流体速度最大,然后随着流体层靠近通道壁速度以一定比例降低,离通道壁最近的流体速度最小。
如图3所示,伴随这种抛物线状的流速分布产生了一种剪切力梯度,这种剪切力梯度诱导产生的升力(shear-induced lift force)会将悬浮在流体中的颗粒推向通道壁.当颗粒移到距离通道壁足够近的位置, 通道壁诱导产生的升力(wall-induced liftforce)又会将颗粒推离通道壁. 这两种方向相反的升力的合力被称为惯性升力(inertiallift force or net-lift force)。
在接下来的第二个功能单元中,由于流动的惯性效应和两个吸取侧通道的平衡,较大的颗粒仍然稳定在通道中心附近。图4所示为抽取少量小颗粒到出口完成预处理。
如图5所示,当流体在弯形通道中流动时,情况比直线形通道中的更复杂。呈抛物线流动的流体,在通道中间速度最大。在经过通道转弯处时,通道中间流体受到的离心力最大,从而流向通道外侧边缘。靠近通道壁的流体流速最小,所受离心力也最小, 从而受到中间流体的挤压。为了保持流体中各处质量守恒,在垂直于流体流动的方向上,形成一对反向旋转且对称的涡流,分别位于通道横截面的上部和下部, 由此产生一种被称作迪恩涡流(Dean vortices)的二次流。
芯片工作原理验证性实验
如图6所示,细胞液由样品进样口1进入,CTCs在预处理完成之前始终位于通道中部,预处理步骤完成之后,CTCs在惯性聚焦通道中随着通道的延伸,聚焦在管道外侧,直到细胞分流岔口11,进入CTCs收集口。
收集样品在显微镜下的细胞形态学检查
如图7所示,收集到的红细胞尺寸在6.34~7.32微米之间;富集的CTCs尺寸在15.90~16.51微米之间。
实施例三
分离癌细胞的生物芯片的制作方法
其具体过程如下:
一、通过软光刻和快速成型技术,加工出PDMS微流控芯片,结合图1,对加工成型的芯片进行打孔,所得通孔用于形成微流控芯片的进样孔和检测孔。
二、再次将表面处理后芯片置于等离子氧化30-35s,氧化完成后,立即与之前清洗好的洁净的载玻片进行牢固封接。
在本发明的描述中,需要理解的是,术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、 “右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“ 顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
此外,术语“第一”、 “第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片,其特征在于,包括:前置样本处理部分、红细胞筛离部分以及惯性聚焦部分,其中,所述前置样本处理部分由样品注入口(1)、细胞过滤器(5)和鱼骨型微通道(6)构成,进行初步分离样品;所述红细胞筛离部分由矩形微柱阵列框(7)、红细胞上汇流微通道(8)、红细胞下汇流微通道(9)和血细胞流出口(2)构成,用于分离出大部分的红细胞;所述惯性聚焦部分由惯性聚焦微通道(10)和细胞分流岔口(11)、CTCs富集处(3)和废液口(4)构成,使CTCs单独成流束,进入CTCs富集处(3),剩下的进入废液口(4)。
2.根据权利要求1所述的一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片,其特征在于,还包括基底(14)和玻璃片(15),所述基底(14)为聚二甲基硅氧烷 ,且基底(14)设置于玻璃片(15)上,所述前置样本处理部分、红细胞筛离部分以及惯性聚焦部分均设置于基底(14)上。
3.根据权利要求1所述的一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片,其特征在于,所述前置样本处理部分的样品注入口(1)与鱼骨微型通道(6)的一端连接,所述鱼骨微型通道(6)的另一端与矩形微柱阵列框(7)连接,所述鱼骨微型通道(6)上设置有细胞过滤器(5)。
4.根据权利要求1所述的一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片,其特征在于,所述红细胞筛离部分的血细胞流出口(2)与红细胞上汇流微通道(8)、红细胞下汇流微通道(9)的一端连接,所述红细胞上汇流微通道(8)、红细胞下汇流微通道(9)的另一端汇聚在矩形微柱阵列框(7)处。
5.根据权利要求1所述的一种基于流体动力学的免标记分离癌细胞的生物芯片,其特征在于,所述惯性聚焦部分中惯性聚焦微通道(10)的一端与矩形微柱阵列框(7)连接,另一端设置有废液口(4),且设置有废液口(4)的一端分支出细胞分流岔口(11),所述细胞分流岔口(11)的远端设置有CTCs富集处(3)。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190809 |