CN110157609A - 一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及稀有细胞的检测技术领域，尤其涉及一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统及应用。所述系统的核心是一个包括“分离单元、聚焦单元、分选单元和流阻匹配单元”的微流控芯片器件，其特点在于它可以在连续的模式下将血液等体液中稀有细胞的分离、聚焦、单细胞分析和分选等操作集成到一块芯片完成，从而可广泛地应用于体液中稀有细胞的分离和分选，以及基于稀有细胞的疾病诊断、药物筛选和个性化治疗等领域。

Description

一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统及应用

技术领域

本发明涉及稀有细胞的检测技术领域，尤其涉及一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统及应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

人体血液等体液中存在着一些数量稀少却具有重要临床价值的稀有细胞，如循环肿瘤细胞(CTCs)、胎儿有核红细胞(Fetal NRBCs)以及病毒感染或者寄生的细胞等。这些稀有细胞可以直接或者间接反映出机体的健康状况，其中被称为“液体活检”的CTCs对于研究癌症的分期诊断和病程进展实时监测有着非常重要的意义。然而，由于稀有细胞的数量稀少(通常1mL血液中可能只含有几到几十个稀有细胞，却有高达约109个血细胞)，且具有较大的生物和物理异质性，使得如何从血液等体液中高效地分离和分选出这些稀有细胞面临着巨大的挑战。

为了应对这一挑战，近年来探讨了一些方法。已发展的CTCs检测方法大多是利用偶联在磁珠或微流控芯片上的上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体捕获CTCs，然后用传统的免疫荧光成像、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等手段对CTCs进行定性。有些方法根据肿瘤细胞与正常细胞在大小、密度等物理特性方面的差别，利用包括微孔过滤、密度梯度离心，以及基于微流控芯片的微结构过滤、惯性迁移、确定性侧向偏移(DLD)等方法对CTCs进行分离，然后对收集的CTCs重新进行定性。本发明人认为：尽管这些方法代表了这一领域的重要进展，但其技术瓶颈依旧存在；首先，当前依赖于上皮标志物EpCAM的单一抗体捕获，造成上皮源性缺失的CTCs无法被捕获，从而造成漏检。其次，基于抗体捕获的CTCs的释放困难，不利于CTCs的高通量分选和后续分析。再次，尽管基于物理特性的分离方法操作相对简单、通量高、不依赖细胞表面标志物表达，但受限于CTCs在物理特性上的异质性，这类方法往往会丢失尺寸小的CTCs，从而导致分离不完全且纯度不高。最后，目前这种分离和分析技术相互独立的CTCs检测方法，不仅无法将体液中稀有细胞的分离、聚焦、单细胞分析和分选等操作集成到一块芯片上完成，而且在细胞转移、容器更换等环节极易造成样品的损失和污染，导致较大的系统误差。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明人认为：提出一种用于稀有细胞的分离、聚焦和分选的系统，实现血液等体液中稀有细胞的分离、聚焦、单细胞分析和分选等操作与一体化集成，将在一定程度上解决上述问题。因此，本发明提供一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统及应用；该系统能够将血液等体液中稀有细胞的分离、聚焦、单细胞分析和分选等操作集成到同一芯片上完成。

本发明第一目的：提供一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统。

本发明第二目的：提供所述用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统的应用。

为实现上述发明目的，本发明公开了下述技术方案：

首先，本发明公开一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统。该系统的核心组成部分是一个包括“分离单元、聚焦单元、分选单元和流阻匹配单元”的微流控芯片器件；其中：

所述分离单元为顺时针或逆时针的“螺旋”流道结构，所述“螺旋”流道结构的一端设有样品入口，所述“螺旋”流道结构的另一端设有内出口和外出口；

所述聚焦单元为弯流道和直流道的直接耦合，所述弯流道的入口端与分离单元的内出口相连，所述直流道的出口端与分选单元的光学检测流道的入口端相连，构成对分离单元分离的稀有细胞在光学检测流道横断面中心的聚焦，并呈单排列方式流过光学检测流道；

所述分选单元为光学检测流道与稀有细胞分选流道和废液流道构成的“Y型”结构，所述稀有细胞分选流道和废液流道上分别设有第一微阀和第二微阀，所述稀有细胞分选流道和废液流道的出口端分别设有稀有细胞出口和第一废液出口，构成对经分离单元和聚焦单元处理的稀有细胞的单细胞分析和分选；

所述流阻匹配单元为“蛇形”流道结构，所述“蛇形”流道结构的入口与分离单元的外出口相连，所述“蛇形”流道结构的出口为第二废液出口，构成对分离单元的内、外两个出口的流阻匹配。

作为进一步的技术方案，所述微流控芯片器件为“玻璃-PDMS-玻璃”或“PDMS-PDMS-玻璃”构成的三层结构芯片。

作为进一步的技术方案，所述弯流道为非对称正弦线流道结构。

作为进一步的技术方案，所述直流道、光学检测流道、稀有细胞分选流道和废液流道均为深宽比大于或等于2:1的高深宽比的直流道结构。

作为进一步的技术方案，所述微流控系统还包括微型注射泵、激光诱导荧光多色检测装置、微型气动泵和系统控制器；其中，所述微流控芯片器件的样品入口与微型注射泵和系统控制器依次连接，所述激光诱导荧光多色检测装置与系统控制器和光学检测流道均连接，所述第一微阀和第二微阀分别与微型气动泵和系统控制器依次连接，从而构成对血液等体液中稀有细胞的分离、聚焦、实时单细胞分析与荧光激活分选等功能。

作为进一步的技术方案，所述激光诱导荧光多色检测装置为至少包括“单色激光激发、双色荧光检测”的激光诱导荧光检测装置。

最后，本发明公开所述用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统在生物、医疗等领域中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下显著特点与有益效果：

(1)本发明的集成“分离单元、聚焦单元、分选单元和流阻匹配单元”的微流控芯片器件的设计，不仅将将体液中稀有细胞的分离分析和分选等操作有效整合到一块芯片上完成，而且兼顾了灵敏和通量这两个指标，便于在数以亿计的背景细胞中敏感、高通量地分离和分选出稀有细胞。具体来讲，分离单元在保持高通量实现稀有细胞分离与显著提高稀有细胞浓度的同时，避免了小尺寸稀有细胞(如尺寸大小为10μm的CTCs)的丢失，从而提高了稀有细胞分离的灵敏度；聚焦单元将经分离单元处理的细胞聚焦于光学检测流道横断面中心，从而提高了稀有细胞检测和分选的灵敏度与稳定性。

(2)本发明的系统将微流控芯片器件与微型注射泵、激光诱导荧光多色检测装置、微型气动泵和系统控制相结合，不仅可以对经分离和聚焦单元处理的多种不同荧光抗体标记的稀有细胞进行高灵敏、多参数、实时原位的单细胞分析，而且根据检测到的稀有细胞的荧光检测峰信号同步触发执行机构(微型气动泵和微阀)，从而实现稀有细胞的在线检测和快速分选。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中微流控芯片器件的结构示意图。

图2为本发明实施例1的用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统的组成示意图。

图3为用本发明系统实施例测试直径5μm(黄色)、10μm(红色)和15μm(绿色)的三种荧光微球混合液的流型成像叠加图。其中，A代表直径5μm、10μm和15μm的三种荧光微球在分离单元的样品入口处随机分布的流型成像叠加图；B代表10μm及更大尺寸(15μm)的荧光微球与5μm荧光微球在分离单元的出口处分离的流型成像叠加图；C、D分别代表分离单元内出口流出的10μm及更大尺寸(15μm)的微球在聚焦单元出口下游的光学检测流道横断面上的水平聚焦和垂直聚焦的流型成像叠加图；白色实线剪头指示的为10μm和15μm的荧光微球；白色虚线剪头指示的为5μm荧光微球。

图4为用本发明实施例在线检测与快速分选三种荧光微球混合液中10μm和15μm荧光微球的统计结果图。其中，A为10μm和15μm荧光微球的检出效率图；B为分选出的15μm荧光微球数量与检出的10μm荧光微球数量的统计结果图。

上述附图中标记分别代表：I-微流控芯片器件；1-分离单元；2-聚焦单元；3-分选单元；4-流阻匹配单元；101-样品入口；102-内出口；103-外出口；201-弯流道；202-直流道；301-光学检测流道；302-稀有细胞分选流道；303-废液流道；304-第一微阀；305-第二微阀；306-稀有细胞出口；307-第一废液出口；401-“蛇形”流道；402-第二废液出口；5-微型注射泵；6-激光诱导荧光多色检测装置；7-微型气动泵；8-系统控制。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如，在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如前文所述，人体血液等体液中存在着一些数量稀少却具有重要临床价值的稀有细胞，然而，由于稀有细胞的数量稀少，且具有较大的生物和物理异质性，使得如何从血液等体液中高效地分离和分选出这些稀有细胞面临着巨大的挑战。因此，本发明提出一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统；现结合附图和具体实施方式对本发明进一步进行说明。

实施例1

参考图1和2，一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统，其核心组成部分是一个包括“分离单元1、聚焦单元2、分选单元3和流阻匹配单元4”的微流控芯片器件I；其中：

所述分离单元1为顺时针或逆时针的“螺旋”流道结构，所述“螺旋”流道结构的一端设有样品入口101，所述“螺旋”流道结构的另一端设有内、外两个出口，所述内出口102与聚焦单元2的入口相连，所述的外出口103与流阻匹配单元4的入口相连，构成对体液中稀有细胞与其它细胞的分离，并通过内、外两个出口将稀有细胞和其它细胞分别导入聚焦单元2和流阻匹配单元4；

所述聚焦单元2为弯流道201和直流道202的直接耦合，所述弯流道201的入口端与分离单元1的内出口102相连，所述直流道202的出口端与分选单元3的光学检测流道301的入口端相连，构成对分离单元1分离的稀有细胞在光学检测流道301横断面中心的聚焦，并呈单排列方式流过光学检测流道；

所述分选单元3为光学检测流道301与稀有细胞分选流道302和废液流道303构成的“Y型”结构，所述稀有细胞分选流道302和废液流道303上分别设有第一微阀304和第二微阀305，所述稀有细胞分选流道302和废液流道303的出口端分别设有稀有细胞出口306和第一废液出口307，构成对经分离单元和聚焦单元处理的稀有细胞的单细胞分析和分选；

所述流阻匹配单元4为“蛇形”流道结构，所述“蛇形”流道结构401的入口与分离单元1的外出口103相连，所述“蛇形”流道结构401的出口为第二废液出口402，构成对分离单元的内、外两个出口的流阻匹配。

所述微流控系统还包括微型注射泵5、激光诱导荧光多色检测装置6、微型气动泵7和系统控制器8；其中，所述微流控芯片器件I的样品入口101与微型注射泵5和系统控制器8依次连接，所述激光诱导荧光多色检测装置6与系统控制器8和光学检测流道301均连接，所述第一微阀304和第二微阀305分别与微型气动泵7和系统控制器8依次连接，从而构成一套完整的用于血液等体液中稀有细胞的分离、聚焦、实时单细胞分析与荧光激活分选等功能的测试系统。其中：所述微型注射泵的功能是将血液等体液样品输送到微流控芯片器件的样品入口，并对体液样品的流速与流量进行调节与控制；所述激光诱导荧光多色检测装置的功能是对经过分离单元和聚焦单元处理的多种不同荧光抗体标记的稀有细胞(或多色荧光微球)进行高灵敏、多参数、实时原位的单细胞分析，以获取稀有细胞的荧光检测峰信号；所述系统控制器的主要功能是根据获取到的稀有细胞的荧光检测峰信号，同步触发微型气动泵和微流控芯片器件上的微阀，从而实现目标稀有细胞的“荧光激活”分选。

实施例2

作为进一步的技术方案，在实施例1所述的一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统中：所述微流控芯片器件I为“玻璃-PDMS-玻璃”或“PDMS-PDMS-玻璃”构成的三层结构芯片；所述弯流道201为非对称正弦线流道结构；所述直流道202、光学检测流道301、稀有细胞分选流道302和废液流道303均为深宽比大于或等于2:1的高深宽比的直流道。

实施例3

本实施例以实施例1所述的微流控系统为测试装置，并以直径5μm(黄色)、10μm(红色)和15μm(绿色)的三种荧光微球混合液(混合比例为1×10⁹/mL：1×10⁶/mL：1×10³/mL)，来模拟血液样品及血液样品中的红细胞、白细胞和CTCs，并通过对三种荧光微球混合液的测试来阐述本发明设计的微流控系统的工作流程与基本原理。

首先，三种荧光微球混合液(或被多色荧光标记的体液样品)由样品入口被微型注射泵注入到微流控芯片器件的分离单元。在这个单元(即基于螺旋通道的惯性分离)中，利用惯性升力F_L和迪恩拖拽力F_D与微球大小的依赖关系(F_L/F_D∝a_P ³)，可以将样品入口处随机分布的三种荧光微球(参见图3，A)，在出口处形成三种不同的粒子流(参见图3，B)，5μm荧光微球在外出口流出，而10μm和15μm荧光微球则在内出口流出，因此分离单元可以将10μm及更大尺寸(15μm)的微球与5μm微球在出口处分离(参见图3，B),同时可以避免小尺寸(10μm)的微球或CTCs的丢失和漏检。与此同时，来自于分离单元内出口的10μm和15μm荧光微球的两束粒子流进入聚焦单元(即基于非对称正弦线形流道的垂直聚焦和高深宽比直流道的水平聚焦)后，两束粒子流在非对称正弦线形流道中随迪恩拖拽力F_D运动，在水平方向逐渐汇聚，并最终在非对称正弦线形流道的出口实现水平聚焦，同时在高深宽比的直流道的出口实现垂直聚焦，从而在聚焦单元出口下游的光学检测流道的横断面上实现水平聚焦和垂直聚焦(参见图3，C、D)。

其次，对于经过分离和聚焦单元处理的、并被运输到光学检测流道的每一个微球(或稀有细胞)，由激光诱导荧光多色检测装置进行激光激发和高灵敏、实时原位的多色荧光同步检测，并获取微球(或稀有细胞)的荧光检测峰信号；同时由系统控制根据获取到的荧光检测峰信号，同步触发微型气动泵和微流控芯片器件上的微阀，从而实现目标微球(或稀有细胞)的在线检测和快速分选。如图4所示，本发明对三种荧光微球混合液中10μm和15μm荧光微球的检出效率近98％(参见图4A)，且分选出的15μm荧光微球数量与检出的10μm荧光微球数量的比例(1：1982)与本发明的实验条件相吻合(参见图4B)。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统，其特征在于，所述系统的核心组成部分是一个包括分离单元、聚焦单元、分选单元和流阻匹配单元的微流控芯片器件；其中：

所述分离单元为顺时针或逆时针的“螺旋”流道结构，所述“螺旋”流道结构的一端设有样品入口，所述“螺旋”流道结构的另一端设有内出口和外出口，所述内出口与聚焦单元的入口相连，所述的外出口与流阻匹配单元的入口相连，构成对体液中稀有细胞与其它细胞的分离，并通过内、外两个出口将稀有细胞和其它细胞分别导入聚焦单元和流阻匹配单元；

所述聚焦单元为弯流道和直流道的直接耦合，所述弯流道的入口端与分离单元的内出口相连，所述直流道的出口端与分选单元的光学检测流道的入口端相连，构成对分离单元分离的稀有细胞在光学检测流道横断面中心的聚焦，并呈单排列方式流过光学检测流道；

所述分选单元为光学检测流道与稀有细胞分选流道和废液流道构成的“Y型”结构，所述稀有细胞分选流道和废液流道上分别设有第一微阀和第二微阀，所述稀有细胞分选流道和废液流道的出口端分别设有稀有细胞出口和第一废液出口，构成对经分离单元和聚焦单元处理的稀有细胞的单细胞分析和分选；

所述流阻匹配单元为“蛇形”流道结构，所述“蛇形”流道结构的入口与分离单元的外出口相连，所述“蛇形”流道结构的出口为第二废液出口，构成对分离单元的内、外两个出口的流阻匹配。

2.如权利要求1所述的用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统，其特征在于，所述微流控系统还包括微型注射泵、激光诱导荧光多色检测装置、微型气动泵和系统控制器；其中，所述微流控芯片器件的样品入口与微型注射泵和系统控制器依次连接，所述激光诱导荧光多色检测装置与系统控制器和光学检测流道均连接，所述第一微阀和第二微阀分别与微型气动泵和系统控制器依次连接，从而构成对血液等体液中稀有细胞的分离、聚焦、实时单细胞分析与荧光激活分选等功能。

3.如权利要求1或2所述的用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统，其特征在于，所述微流控芯片器件为“玻璃-PDMS-玻璃”或“PDMS-PDMS-玻璃”构成的三层结构芯片。

4.如权利要求1或2所述的用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统，其特征在于，所述弯流道为非对称正弦线流道结构。

5.如权利要求1或2所述的用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统，其特征在于，所述直流道、光学检测流道、稀有细胞分选流道和废液流道均为深宽比大于或等于2:1的高深宽比的直流道结构。

6.如权利要求1或2所述的用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统，其特征在于，所述激光诱导荧光多色检测装置为至少包括“单色激光激发、双色荧光检测”的激光诱导荧光检测装置。

7.如权利要求1-6任一项所述的用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统，其特征在于，所述用于稀有细胞分离、聚焦和分选的微流控系统在生物、医疗领域中的应用。