CN101726585A - 一种基于微流控芯片的流式细胞仪 - Google Patents

一种基于微流控芯片的流式细胞仪 Download PDF

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刘威
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Abstract

本发明公开了一种基于微流控芯片的流式细胞仪，涉及一种生物医学检测的流式细胞仪。本发明的结构是：细胞进样单元(10)、激光诱导荧光检测单元(30)和光信号检测和处理单元(50)分别与细胞分选芯片单元(20)连接；细胞分选芯片单元(20)和侧向和前向散射光检测单元(40)连接；激光诱导荧光检测单元(30)和侧向和前向散射光检测单元(40)分别与光信号检测和处理单元(50)连接。本发明与商用的流式细胞仪相比，具有以下优点和积极效果：集成度高、操作方便、体积小、高通量、灵敏度高、速度快、微型化、专用化、分选力多样化，适合个性化流式细胞分析。

Description

一种基于微流控芯片的流式细胞仪
技术领域
本发明涉及一种生物医学检测的流式细胞仪，尤其涉及一种基于微流控芯片的流式细胞仪。
背景技术
流式细胞仪(Flow Cytometer，简称FCM)是一项集激光技术、电子物理技术、光电检测技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。流式细胞仪就是对处于快速直线流动状态中的细胞、生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。流式细胞仪的结构一般包括为四部分：(1)流动室及液流驱动系统；(2)光学系统；(3)信号检测与存储、分析、显示系统；(4)细胞分选系统。细胞分选的原理是：鞘流形成一定频率的信号，此信号加在压电晶体上使之产生不同频率的机械振动，流动室也随之振动，于是鞘流就断裂成直线排列的均匀的液滴。如果细胞的特性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷，带有电荷的液滴在高压静电场的作用下偏转落入指定的容器，从而实现对细胞及其他生物颗粒的分类收集。一般的流式细胞仪只装有一个激发光源(488nm)，单光源会限制荧光染料的选择和使用，同时流式细胞仪中装备的都是体积比较大的气体激光器、离子激光器等，占用体积大。目前商用的流式细胞仪体积大，结构复杂，操作不便。
微型化是当今科技发展的一个趋势。集成电路的出现使得芯片的尺寸越来越小，已经出现了掌上电脑和各种微型化的生化分析仪。微流控芯片技术的发展使得生化分析进入了一个新阶段。微流控技术由于其样品用量少、样品反应快、成本低、集成度高、体积小等优点，已经在分析化学、细胞生物学、疾病诊断、药物分析、基因测序等领域得到广泛应用。在微流控芯片上，已经能够实现目的基因的PCR反应、全血分析、免疫分析、细胞培养、化学合成和DNA电泳分离等。微流控芯片上的微泵、微阀技术的大规模集成实现了对流体的精确流动控制，也为高通量的药物分析、生化分析、基因测序和基因诊断等提供技术手段。微流控芯片技术现在已经成为当今社会的研究热点和趋势。
微流控芯片技术中一个典型的样品处理方法就是通过两不相溶的液体来实现样品的区域化、微型化。将样品分散成一个个体积只有nL数量级大小的液滴，可以使得样品之间不污染。由于液滴表面积与体积比很大，使得样品里的化学反应速度快，缩短了生化反应测试周期。由于是纳升级的液滴，所以样品的用量比常规用量少了很多。微流控芯片中的样品流动会受到沟道的限制，沟道的设计会影响样品流动的方向。在微流控芯片中已经可以集成多种检测器，比如各种电化学检测器、光学检测器。同时也可以利用电场、磁场、超声波、表面波和介电场等作用力来控制微量液滴的流动方向，这已经在各种生化医学分析中得到广泛的研究。
随着微流控芯片技术以及半导体激光器技术以及光电检测技术的发展，各种检测仪器的微型化也相继实现。比如，基于毛细管电泳分析仪而产生的微流控激光诱导荧光分析仪。目前商用流式细胞仪体积大，结构复杂，功能齐全，分选手段单一，鉴于此以及微流控芯片技术所表现出来的优势，希望能有一种微型化的基于微流控芯片技术的新型流式细胞仪，甚至是针对某一生化分析功能的专用微流控芯片流式细胞仪。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供了一种基于微流控芯片的流式细胞仪。
本发明的目的是这样实现的：
本发明包括细胞进样单元、细胞分选芯片单元、激光诱导荧光检测单元、侧向和前向散射光检测单元和光信号检测和处理单元；
细胞进样单元、激光诱导荧光检测单元和光信号检测和处理单元分别与细胞分选芯片单元连接；
细胞分选芯片单元和侧向和前向散射光检测单元连接；
激光诱导荧光检测单元和侧向和前向散射光检测单元分别与光信号检测和处理单元连接。
本发明的工作原理：
连续相液体和含有细胞的分散相液体均通过注射泵推动注射器进入到细胞分选芯片单元中的微流控细胞分选芯片中，在连续相液体的剪切力作用下，分散相液体分散成均匀含有细胞的液滴，每个液滴里面至多有一个细胞；液滴经过激光激发区后，细胞里的荧光标记物受到激光的激发而发射出荧光，同时由于细胞的几何大小、形状不同以及细胞膜、胞质、核膜折射率的分布而对激光散射，散射光包含有细胞的几何大小、形状以及细胞膜、胞质、核膜折射率的信息；荧光被激光诱导荧光检测单元中的光电倍增管检测，散射光被侧向和前向散射光检测单元中的侧向散射光光电二极管和前向散射光光电二极管光电器件检测，经过信号检测、滤波、放大、模数转换电路传输到计算机进行显示和处理；然后计算机向细胞分选芯片单元发送一个分选信号，在压电材料LiNbO3表面上产生声表面波，当含有细胞的微量液滴经过细胞分选芯片单元的叉子电极时，在声表面波的作用下发生偏转，进入到细胞分选芯片单元相应的收集池中，达到分选细胞的目的。
本发明可以只具有一路荧光检测，适合于只需要分析细胞或生物颗粒的荧光特性；也可以是多路荧光检测，更详细地分析其荧光特性；还可以是单独的散射光检测，适合于分析细胞大小以及细胞膜、胞质、核膜性质；还可以是多种检测光路的结合。另外，本发明的细胞分选是通过声表面波完成的，也可以和其它的电场分选、磁场分选、超声波分选、介电泳分选相结合。由于这种专用化、个性化的新型流式细胞仪，整体体积得到了大大缩小，也方便了操作。
本发明与商用的流式细胞仪相比，具有以下优点和积极效果：
集成度高、操作方便、体积小、高通量、灵敏度高、速度快、微型化、专用化、分选力多样化，适合个性化流式细胞分析。
附图说明
图1为本发明的结构框图；
图2为本发明的结构示意图；
图3为本发明利用声表面波进行细胞分选的原理图。
其中：
10-细胞进样单元，
11-注射泵，                12-注射器；
20-细胞分选芯片单元，
21-微流控细胞分选芯片，    22-叉子电极，    23-高频信号发生器；
30-激光诱导荧光检测单元，
31-半导体固体激光器，      32-半反半透镜，  33-物镜，
34-凸透镜，                35-针孔，        36-滤波片，
37-光电倍增管；
40-侧向和前向散射光检测单元，
41-侧向散射光滤波片，      42-侧向散射光光电二极管，
43-前向散射光滤波片，      44-前向散射光光电二极管；
50-光信号检测和处理单元，
51-光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路，
52-光电倍增管信号检测、滤波、放大、模数转换电路，
53-计算机；
A-连续相液体，
B-分散相液体，
C-细胞的液滴。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明详细说明：
一、总体
如图1，本发明包括细胞进样单元10、细胞分选芯片单元20、激光诱导荧光检测单元30、侧向和前向散射光检测单元40和光信号检测和处理单元50；
细胞进样单元10、激光诱导荧光检测单元30和光信号检测和处理单元50分别与细胞分选芯片单元20连接；
细胞分选芯片单元20和侧向和前向散射光检测单元40连接；
激光诱导荧光检测单元30和侧向和前向散射光检测单元40分别与光信号检测和处理单元50连接。
二、功能块
1、细胞进样单元10
如图2，细胞进样单元10包括相互连接的注射泵11和注射器12，注射泵11以一定的速度推动注射器12；
所述的注射泵11是一种常用的产品，内置有控制电路；注射器12是一种常用的产品。
细胞进样单元10的工作原理是：
注射泵11将注射器12中的连续相和分散相液体注入到细胞分选芯片单元20内；
注射泵11通过内置的控制电路控制泵来推动注射器12的速度，进而控制细胞分选芯片单元20中连续相和分散相液体的流速。
2、细胞分选芯片单元20
如图3，细胞分选芯片单元20包括微流控细胞分选芯片21、叉子电极22和高频信号发生器23；
叉子电极22置于微流控细胞分选芯片21通道旁边，叉子电极22和外置的高频信号发生器23连接。
细胞分选芯片单元20的工作原理是：
在微流控细胞分选芯片21的微米级通道中，由注射器12注入的连续相液体A和分散相液体B相遇时，由于连续相液体A对分散相液体B施加剪切力而产生含有细胞的液滴C；高频信号发生器23输出的正弦交流电信号施加在叉子电极22上从而使得微流控细胞分选芯片21在微米级通道的表面产生声表面波，对含有细胞的液滴C进行操控，从而达到细胞分选的作用。
(1)微流控细胞分选芯片21由压电材料LiNbO3和有机高聚物聚二甲基硅氧烷封接而成；在压电材料LiNbO3表面上利用光刻显影技术和磁控溅射技术制作出叉子电极22；同时利用光刻显影技术在硅片上做出微流控细胞分选芯片的阴模或阳模，加入有机高聚物聚二甲基硅氧烷的预聚物和黏合剂，待其固化后就得到了含有微米级通道的有机高聚物聚二甲基硅氧烷微流控芯片；利用阳极键合技术，将微米级通道的有机高聚物聚二甲基硅氧烷微流控芯片和含有叉子电极22的压电材料LiNbO3键合在一起，制备出微流控细胞分选芯片21。
本发明中所使用的微流控芯片，其材料可以是玻璃、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯与压电材料LiNbO3键合制成的；以玻璃为微流控芯片材料的，可以通过湿法刻蚀、干法刻蚀来实现；以聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等有机高分子聚合物做为微流控芯片材料的，可以通过软光刻方法、热压法、激光消融刻蚀法、微复制注塑法等制备。
本发明中的细胞分选芯片单元中，含有细胞的分散相液体形成分散的微量液滴的制备方法有很多种，主要包括T型沟道法、双T型沟道法、流聚焦沟道法、数字微流电浸润法、微泵微阀法、超声波法等；利用电场、介电场来实现分选的微电极的材料有多种，比如：铂钛电极、银电极、碳电极等等；制作电极的方法也有多种，比如磁控溅射法、丝网印刷碳电极法、化学电镀法；也可采用在微流控芯片中制备电极沟道，然后通入导电银浆，或者其它可以导电的浆状物质，干燥后就可以充当电极。
(2)叉子电极22
叉子电极22是一种利用成熟的光刻显影技术和磁控溅射技术在压电材料LiNbO3表面上镀铂的两个呈交叉排列的梳状电极。
(3)高频信号发生器23
高频信号发生器23是一种上市产品，可以输出各种波形及多种频率的电信号。
3、激光诱导荧光检测单元30
如图2，激光诱导荧光检测单元30包括半导体固体激光器31、半反半透镜32、物镜33、凸透镜34、针孔35、滤波片36和光电倍增管37；
其光路是：固体激光器31产生的激光经半反半透镜32反射后通过物镜33聚焦到微流控细胞分选芯片21后，当有细胞通过时，细胞里的荧光标记物在激光的激发下产生荧光，荧光又依次通过物镜33、半反半透镜32、凸透镜34、针孔35和滤光片36后进入光电倍增管37，检测荧光信号(模拟信号)。
为了把本发明市场化，激光诱导荧光检测单元30所包括的各个组件都是市场上可以买到的商品。
4、侧向和前向散射光检测单元40
如图2，侧向和前向散射光检测单元40包括侧向散射光滤波片41、侧向散射光光电二极管42、前向散射光滤波片43和前向散射光光电二极管44；
微流控细胞分选芯片21的侧向散射光通过侧向散射光滤波片41和侧向散射光光电二极管42后进入光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路51；
微流控细胞分选芯片21的前向散射光通过前向散射光滤波片43和前向散射光光电二极管44后进入光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路51。
侧向散射光滤波片41、侧向散射光光电二极管42、前向散射光滤波片43和前向散射光光电二极管44均有上市产品。
5、光信号检测和处理单元50
如图2，光信号检测和处理单元50包括光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路51，光电倍增管信号检测、滤波、放大、模数转换电路52和计算机53；
光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路51和光电倍增管信号检测、滤波、放大、模数转换电路52分别与计算机53连接。
光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路51，光电倍增管信号检测、滤波、放大、模数转换电路52，和计算机53均有上市产品。

Claims (6)

1.一种基于微流控芯片的流式细胞仪，其特征在于：
包括细胞进样单元(10)、细胞分选芯片单元(20)、激光诱导荧光检测单元(30)、侧向和前向散射光检测单元(40)和光信号检测和处理单元(50)；
细胞进样单元(10)、激光诱导荧光检测单元(30)和光信号检测和处理单元(50)分别与细胞分选芯片单元(20)连接；
细胞分选芯片单元(20)和侧向和前向散射光检测单元(40)连接；
激光诱导荧光检测单元(30)和侧向和前向散射光检测单元(40)分别与光信号检测和处理单元(50)连接。
2.按权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于：
细胞进样单元(10)包括相互连接的注射泵(11)和注射器(12)。
3.按权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于：
细胞分选芯片单元(20)包括微流控细胞分选芯片(21)、叉子电极(22)和高频信号发生器(23)；
叉子电极(22)置于微流控细胞分选芯片(21)通道旁边，叉子电极(22)和外置的高频信号发生器(23)连接；
所述微流控细胞分选芯片(21)由压电材料LiNbO3和有机高聚物聚二甲基硅氧烷封接而成；
所述叉子电极(22)是一种利用成熟的光刻显影技术和磁控溅射技术在压电材料LiNbO3表面上镀铂的两个呈交叉排列的梳状电极。
4.按权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于：
激光诱导荧光检测单元(30)包括半导体固体激光器(31)、半反半透镜(32)、物镜(33)、凸透镜(34)、针孔(35)、滤波片(36)和光电倍增管(37)；
其光路是：固体激光器(31)产生的激光经半反半透镜(32)反射后通过物镜(33)聚焦到微流控细胞分选芯片(21)后，当有细胞通过时，细胞里的荧光标记物在激光的激发下产生荧光，荧光又依次通过物镜(33)、半反半透镜(32)、凸透镜(34)、针孔(35)和滤光片(36)后进入光电倍增管(37)，检测荧光信号。
5.按权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于：
侧向和前向散射光检测单元(40)包括侧向散射光滤波片(41)、侧向散射光光电二极管(42)、前向散射光滤波片(43)和前向散射光光电二极管(44)；
微流控细胞分选芯片(21)的侧向散射光通过侧向散射光滤波片(41)和侧向散射光光电二极管(42)后进入光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路(51)；
微流控细胞分选芯片(21)的前向散射光通过前向散射光滤波片(43)和前向散射光光电二极管(44)后进入光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路(51)。
6.按权利要求1所述的流式细胞仪，其特征在于：
光信号检测和处理单元(50)包括光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路(51)，光电倍增管信号检测、滤波、放大、模数转换电路(52)和计算机(53)；
光电二极管信号检测、滤波、放大、模数转换电路(51)和光电倍增管信号检测、滤波、放大、模数转换电路(52)分别与计算机(53)连接。
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