CN113941377A - 一种全玻璃微流控芯片及加工方法 - Google Patents

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Abstract

本技术方案公开了一种全玻璃微流控芯片，包括：采用石英玻璃加工的且叠放在一起，并相互密封的透明玻璃顶盖和玻璃底板；透明玻璃顶盖开设鞘液入口、细胞入口、出液孔，玻璃底板具有双凹透镜形状的玻璃微透镜和多个集成光纤通道，还带有对样品进行三维流体聚焦的微流体通道。全玻璃微流控芯片的微结构采用皮秒激光刻蚀装置刻蚀，采用CO2激光回流后处理方法去除毛刺，采用非高温键合实现玻璃之间的良好密封封接。一种用于细胞计数、分类检测的全玻璃微流控芯片系统包括所述全玻璃微流控芯片与激光二极管、光电倍增管、光电二极管、泵、数据采集卡、数据处理设备、废液池、供电模块。本技术方案提有助于高微流控流式细胞术检测的稳定性和准确性。

Description

一种全玻璃微流控芯片及加工方法
技术领域
本发明涉及一种全玻璃微流控芯片，还包括基于该全玻璃微流控芯片的用于细胞计数、分类检测的系统，及其加工和使用方法，可应用于流式细胞仪。
背景技术
在过去的40年里，流式细胞术已经彻底改变了高通量粒子分析，并且在细胞生物学、蛋白质工程、药物发现、医学诊断和生物技术等领域的研究中运用广泛。随着微电子机械系统(MEMS)的发展，以微加工技术为支撑的微流控技术成为了一个新兴的领域，它在重塑下一代流式细胞仪中起着主导作用。
到目前为止，聚二甲基硅氧烷(PDMS)实际上已经成为制作微流控流式细胞仪芯片的主要材料。然而，相对于非晶热塑性塑料、硅和玻璃，PDMS有其自身的缺陷，如表面散射度高，刚性较低(通常<1mpa)，容易变形，不易集成波导等。这些问题无疑造成了PDMS微流控流式细胞仪检测的不稳定和低精度的结果(Iliescu C.,Taylor H.,Avram M.,Miao J.,Franssila S.,"A practical guide for the fabrication of microfluidic devicesusing glass and silicon."Biomicrofluidics Papers 6(1),16505–1650516(2012).)。
目前的前沿生物学研究和临床医学研究，例如血细胞分析和流式细胞检测，准确且稳定的检测血细胞的个数并进行细胞内容物的精确鉴定是飞速发展的生物学和医学研究十分需要的技术。
在对比了现有的用于制作微流控流式细胞仪芯片的材料后，发现玻璃材料以优越的光学透明度、高硬度和热稳定性而使其成为在各种恶劣环境下工作时具有高稳定光学系数的必备光学材料。极低的表面光学散射，高硬度，易于波导集成，使玻璃微流控芯片应用于微流控流式细胞仪，从而获取稳定精确的细胞检测结果成为可能。
所以，本发明的目的在于提高微流控流式细胞术检测的稳定性和准确性，实现方法是利用微流控技术及激光微加工方法，制作全玻璃微流控芯片代替传统的PDMS芯片应用于微流控流式细胞的检测中。
目前，尚无制作流式细胞仪的全玻璃微流控芯片并应用于细胞检测的公开技术。但分别实现流式细胞仪检测和PDMS微流控芯片加工技术都已有公开报道。
关于微流控流式细胞仪的结构制作有以下三类技术：
1.三维聚焦通道：在微流控芯片的微通道中设计三角阻碍平铺板,使细胞液进行首次聚焦,在聚焦通道出口处两边样本缓冲液从鞘液通道流出再次对流出聚焦通道的细胞液进行聚焦,使细胞液中的细胞成单排、均匀地流过采集区域(如中国专利申请号201910181056.4)
2.光谱散射系统：照射源将多波长照射光束引导至可包括纳米标签的微流控靶，检测器从微流控靶接收多波长检测光束并产生检测信号，处理器接收检测信号,并将检测信号的多波长侧向散射强度特征与一种或多种纳米标签类型的预定多波长弹性侧向散射强度分布进行比较,确定微流控靶中纳米标签的存在。(如中国专利申请号201880069066.2)。
3.集成化微流式细胞仪：设计结构是细胞进样单元、激光诱导荧光检测单元和光信号检测和处理单元分别与细胞分选芯片单元连接；细胞分选芯片单元和侧向和前向散射光检测单元连接；激光诱导荧光检测单元和侧向和前向散射光检测单元分别与光信号检测和处理单元连接。(如中国专利申请200910273037.0)。
目前已公开的技术中，都没有涉及到利用玻璃材料加工制作集成化的微流控芯片并应用于微流控流式细胞仪的检测分析中。
发明内容
为了克服上述现有微流控流式细胞仪中的不足，本发明的目的之一是提供一种全玻璃微流控芯片，该芯片具有微流体通道，实现三维聚焦，确保单细胞检测；具有集成光纤通道，实现光波导与芯片直接的耦合；设计玻璃微透镜实现对入射激发光线的汇聚，并在检测区域的微流道中心形成一个大小合适的检测光斑。本发明的另一目的是提供一套基于上述芯片的微流控流式细胞仪系统，用于对细胞进行计数，分类等检测，以提高检测结果的稳定性和准确性。
本发明所述一种全玻璃微流控芯片，包括：
采用石英玻璃加工的透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)，其中，
所述透明玻璃顶盖(1)，其上开设有多个贯通孔，这些贯通孔分别贯通于透明玻璃顶盖(1)的上下表面；
所述玻璃底板(5)的上表面，即玻璃底板(5)与透明玻璃顶盖(1)接触的表面，具有与透明玻璃顶盖(1)的各个贯通孔的位置相对应的多个凹槽；凹槽之间开设有微流体通道(11)，用于对样品进行三维流体聚焦；微流体通道(11)的深度与所述凹槽深度相同，微流体通道(11)的宽度应大于待测样品粒子的最大直径；
所述玻璃底板(5)，从侧壁向内开设多个集成光纤通道，包括激发光纤通道(7)、荧光检测光纤通道(8)、侧向散射光检测光纤通道(9)、前向散射光检测光纤通道(10)；所述每个集成光纤通道的前端内端面都加工为平面；
所述玻璃底板(5)上表面，开设具有双凹透镜形状凹槽，称为玻璃微透镜(6)；激发光纤通道(7)的轴向垂直于鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)，且与玻璃微透镜(6)的光轴重合；
透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)叠放在一起，使得透明玻璃顶盖(1)的贯通孔与玻璃底板(5)的相应凹槽对齐，并相互密封。
所述透明玻璃顶盖(1)开设的多个贯通孔分别作为鞘液入口、细胞入口、出液孔，其中：
鞘液入口，用于注入鞘液(如蒸馏水鞘液)，实现三维聚焦；
细胞入口(3)，用于注入细胞样品；
出液孔(4)，用于鞘液和细胞样品的排出；
作为优选，所述细胞入口(3)位于鞘液入口(2b)和鞘液入口(2c)之间；鞘液入口(2a)和出液孔(4)分别位于前三者的两侧；
当透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)叠放在一起，并相互密封，鞘液入口(2b)、细胞入口(3)、鞘液入口(2c)、出液孔(4)依次通过微流体通道(11)连通，鞘液入口(2a)通过左右对称布设的2条微流体通道(11)，与鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)相连通。
本发明所述的一种用于细胞计数、分类检测的全玻璃微流控芯片系统，包括：
所述全玻璃微流控芯片、激光二极管(13)、光电倍增管(14d和14e)、光电二极管(15)、泵(12)、数据采集卡(16)、数据处理设备(17)、废液池(18)、供电模块；
泵(12)通过注射器橡胶管道分别与鞘液入口(2)、细胞入口(3)密封连接；出液孔(4)与废液池(18)通过橡胶管道密封连接；
激光二极管(13)连接单模光纤的末端，并将该单模光纤插入激发光纤通道(7)使得单模光纤的前端置于激发光纤通道(7)的内部顶端；
光电倍增管(14e)和光电倍增管(14d)的输入端，分别连接各自的多模光纤的末端，并将各自的多模光纤分别插入荧光检测光纤通道(8)和侧向散射光检测光纤通道(9)，使得各自的多模光纤的前端分别置于荧光检测光纤通道(8)和侧向散射光检测光纤通道(9)的内部顶端；
光电二极管(15)的输入端连接多模光纤的末端，并将该多模光纤插入前向散射光检测光纤通道(10)使得多模光纤的前端置于前向散射光检测光纤通道(10)的内部顶端；
将所述2个光电倍增管(14d和14e)和光电二极管(15)的输出端，分别与数据采集卡(16)连接，用于采集光学检测信号；数据采集卡(16)所采集的信号输出至数据处理设备(17)，进行分析计算；
供电模块为系统各部分提供电源。
本发明所述的全玻璃微流控芯片，其加工方法包括如下步骤：
S1.激光加工：
所述透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)上的结构，是采用皮秒脉冲激光系统刻写的；
该激光器利用1064nm波长的激光，使用扫描狭缝光束轮廓仪在峰值强度的1/e2处测量，1/e2表示光强度已经下降到光强峰值的13.5％，焦点处的激光束半径约为10微米，该激光光斑是通过将输出激光束扩大到直径为10毫米的光斑，然后用安装在振镜扫描仪上的100毫米焦距的F-θ透镜聚焦得到的；激光由Advanced Optowave(AO)软件控制，并由MasterCut软件设定激光加工参数，如脉冲能量、激光束扫描速度和激光通过时间，以生成复杂的微流控结构。该加工在环境空气中进行的，不使用任何额外的气体。透明玻璃顶盖(1)中的贯穿孔是通过多次加工相同面积的玻璃直到形成通孔而加工完成的。
S2.表面后处理：
1)透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)被分别单独放置到充满甲醇的容器中，然后将容器放入超声波清洗机中，在室温下清洗以清除玻璃表面松散的碎片。
2)采用CO2激光回流后处理方法去除激光加工过程中加工区域周围产生的小毛刺：首先将二氧化碳激光束聚焦到直径约100μm的圆形斑点上，通过二氧化碳激光将微流体通道(11)加热到熔化温度约645°左右，从而引起回流。然后二氧化碳激光器以5kHz的重复频率工作，通过调节占空比来控制时均光束强度。当微流体通道(11)在回流过程中热收缩时，由于表面张力，使微流体通道(11)表面的光滑度提升，达到光学检测要求。(所述CO2激光回流后处理方法请参考Lin,J.,Yu,S.,Ma,Y.,Fang,W.,He,F.,Qiao,L.,Tong,L.,Cheng,Y.,&Xu,Z.(2012).On-chip three-dimensional high-Q microcavities fabricatedbyfemtosecond laser direct writing.Optics express,20(9),10212–10217.)
S3.键合
为了获得良好的接触，将透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)再次用甲醇洗涤，用柔软的聚酯组织擦拭，并用电离氮射流处理；清洗后，将透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)对其压紧，使得透明玻璃顶盖(1)的贯通孔与玻璃底板(5)的相应凹槽对齐，在15℃～30℃室温条件下通风并放置一段时间，直至透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)之间的光学条纹消失，完成键合。
所述的一种用于细胞计数、分类检测的全玻璃微流控芯片系统，工作流程包括：
如图4所示，细胞悬浮液从全玻璃微流控芯片的细胞入口(3)通入，当细胞经过三维流体聚焦后进入鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)，激发光通过激发光纤，经玻璃微透镜(6)汇聚，在微流体通道(11)检测区域内形成一个光斑，照射单细胞；使用多模光纤采集相应的前向散射光、侧向散射光和荧光，并分别传递到光电二极管(15)和光电倍增管(14d和14e)上进行放大，放大后的信号通过数据采集卡(16)传递到数据处理设备(17)中进行数据的处理分析，从而进行细胞计数、分类检测；
细胞悬浮液和鞘液通过出液孔(4)流入废液池(18)中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.与PDMS微流控芯片相比，全玻璃微流控芯片的光学性能有以下改善：材料表面的散射雾度由50％降低到1.4％，有效光透过率大大提高；同时玻璃微透镜对光线的汇聚能力更强，较之于PDMS微透镜，在检测区域微流道中心汇聚形成的检测光斑由3.60μm减小到2.64μm。
2.玻璃芯片的刚性远远大于PDMS，其固有性质如折射率，形状不会轻易发生改变，更有利于光波导的集成，并且芯片波导的耦合光损耗降低到1dB以下。
3.本发明设计的芯片及相应系统在细胞检测过程中，最终获得的检测结果较之于基于PDMS芯片的微流控流式细胞仪，其检测的信噪比、稳定性和检测精度都有了显著的提高。在血细胞计数实验中检测到单细胞大小的变异系数显著下降；在对白细胞进行分类检测的过程中，由于到达检测区域的光信号明显加强，实现了对白细胞四分类甚至五分类的结果，更加符合临床医学研究中对白细胞检测的现象。
综上所述，本发明通过加工制作全玻璃微流控芯片，与其他光学系统，电路系统耦合连接，搭建了全玻璃微流控流式细胞仪，实现了对溶液中细胞的血细胞计数、分类检测。为微流式细胞仪中微流控芯片的制作提供了一种创新性的材料设计加工，能够更稳定，更准确，更高效的对血细胞进行计数、分类等检测。
附图说明
图1是全玻璃微流控芯片整体结构结构分解示意图，该图为示意图，未按实际比例绘制；
图2是全玻璃微流控芯片整体结构结构分解实物图；
图3是全玻璃微流控芯片玻璃底板结构示意图及各微流体结构尺寸细节标注，该图为示意图，未按实际比例绘制，尺寸参数以注释内容为主；
图4是全玻璃微流控流式细胞仪工作的过程示意图，该图为示意图，未按实际比例绘制；
图中，1-透明玻璃顶盖；2a、2b、2c-鞘液入口；3-细胞入口；4-出液孔；5-玻璃底板；6-玻璃微透镜；7-激发光纤通道；8-荧光检测光纤通道；9-侧向散射光检测光纤通道；10-前向散射光检测光纤通道；11-微流体通道；12-泵；13-激光二极管；14d、14e-光电倍增管；15-光电二极管；16-数据采集卡；17-数据处理设备；18-废液池。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述，同时也叙述了本发明技术方案解决的技术问题及有益效果，需要指出的是，所描述的实例仅旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
(一)透明玻璃顶盖(1)：
全玻璃微流控芯片要求使用透明玻璃顶盖(1)，用作与玻璃底板(5)的封接，实现完整的芯片构成。同时，透明玻璃顶盖()1需要制作流体进入和流出的接口，所以需开贯通孔。
所述透明玻璃顶盖(1)开设的多个贯通孔分别作为鞘液入口、细胞入口、出液孔，其中：
鞘液入口，用于注入鞘液(例如蒸馏水鞘液)，实现三维聚焦；
细胞入口(3)，用于注入细胞样品；
出液孔(4)，用于鞘液和细胞样品的排出；
在本实施例中，所述细胞入口(3)位于鞘液入口(2b)和鞘液入口(2c)之间；鞘液入口(2a)和出液孔(4)分别位于前三者的两侧；
当透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)叠放在一起，并相互密封，鞘液入口(2b)、细胞入口(3)、鞘液入口(2c)、出液孔(4)依次通过微流体通道(11)连通，鞘液入口(2a)通过左右对称布设的2条微流体通道(11)，与鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)相连通。
所述透明玻璃顶盖(1)的贯通孔的半径为0.75毫米。贯通孔的大小设置与注射器针管及导管大小匹配，和细胞类型无关。
(二)微流体通道(11)：
微流体通道(11)起到约束细胞流动的作用，其特征尺寸需要和细胞相匹配，所以需要设计合适的通道深宽比。
在图1和图2所示的优选实施例中，透明玻璃顶盖(1)与玻璃底板(5)采用非高温键合的方式密封连接。
在图1和图2所示的优选实施例中，微流体通道(11)的宽度为100微米，深度为180微米，这保证了鞘液对细胞的三维聚焦作用。当需要处理其它细胞时，可由本领域技术人员自行选择合适的微流体通道尺寸。
(三)玻璃微透镜(6)：
在本发明中，玻璃微透镜(6)是用来聚焦光线形成大小合适的检测光斑的关键部件。为了适应细胞的尺寸，必须选择合适的参数进行设计。在图2所示的优选实施例中，使用皮秒激光刻蚀装置进行玻璃表面微结构的直接刻蚀。
在图3所示的优选实施例中，所述具有双凹透镜形状的玻璃微透镜(6)，其曲率半径分别为0.3毫米正曲率凹面(t)和-0.3毫米负曲率凹面(s)，整个玻璃微透镜(6)宽度为1.2毫米(u)，深度0.18毫米，负曲率凹面距离鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)最近的侧壁距离0.76毫米(v)，正曲率凹面距离激发光纤通道(7)的前端端面0.5毫米(w)，用于将光纤发出的光聚焦到微流体通道(11)的径向中心位置。在对由激发光纤发出的激发光进行汇聚时，会在检测区域微流道中心(x)形成一个大小为2μm的蝶形光斑，与细胞大小相符，保证了单细胞测量。当需要处理其它细胞时，可由本领域技术人员自行选择合适的微透镜设计参数。
(四)集成光纤通道：
本发明中，玻璃底板(5)上设计集成光纤通道。光纤插入集成光纤通道中，实现外界光纤与芯片之间的耦合。图3所示的优选实施例中，玻璃底板(5)上激发光纤通道(7)耦合激发光纤垂直入射，经过玻璃微透镜(6)进行汇聚，通过不同位置的检测光纤对相应的前向散射光、侧向散射光及荧光进行检测。
图3所示的优选实施例中，所述集成光纤通道，宽度0.16～0.6毫米，其中：
前向散射光检测光纤通道(10)与激发光纤通道(7)的轴向呈13°(m)，距离鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)外壁0.25毫米(n)放置；
侧向散射光检测光纤通道(9)与激发光纤通道(7)的轴向呈-60°(o)，距离鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)外壁0.12毫米(p)放置；
荧光检测光纤通道(8)与激发光纤通道(7)的轴向呈-120°(q)，距离鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)外壁0.12毫米(r)放置。
(五)封接方法：
在图2所示的优选实施例中，透明玻璃顶盖和玻璃底板的材料均是熔融石英玻璃。采用非高温键合的方法可以很好的实现玻璃之间的良好密封封接。
(六)芯片配套系统：
除了全玻璃微流控芯片之外，本发明还需要激光二极管(13)，光电倍增管(14d和14e)，光电二极管(15)，泵(12)，数据采集卡(16)，数据处理设备(17)，废液池(18)来构成完整的系统，完成对细胞的检测。
激光二极管(13)用于发射激光对细胞进行照射，在图4所示的优选实施例中，采用633nm的激光对血细胞进行照射。
光电倍增管(14d和14e)，光电二极管(15)用于将采集到的光信号进行放大；数据采集卡(16)用于将采集到的信号进行模数转换，传递到数据处理设备(17)上进行数据的处理；泵(12)用于驱动微流体。
(七)芯片的具体制造步骤：
由如下的制作工艺已经成功制造出了本发明所述芯片及系统。给出具体制作方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的制造方法，而并不是对本发明所述器件的材料，尺寸和制造方法做出限定。
制作方法：
透明玻璃顶盖：采用75*25*1.5毫米的HPFS 7980玻璃片(康宁公司)，用激光在每个特定位置打孔。
底板：采用75*25*1.5毫米的HPFS 7980玻璃片，采用皮秒脉冲激光刻蚀装置在玻璃片表面刻蚀所需要的微结构。该激光器是利用1064nm波长的激光进行的。使用扫描狭缝光束轮廓仪在峰值强度的1/e2处测量，焦点处的激光束半径(ω0)约为10微米。这样一个小的激光光斑是通过将输出激光束扩大到直径为10毫米的光斑，然后用安装在振镜扫描仪上的100毫米焦距的F-θ透镜聚焦得到的。激光由Advanced Optowave(AO)软件控制，并由Master Cut软件设定激光加工参数，如脉冲能量、激光束扫描速度和激光通过时间，以生成复杂的微流控结构。该加工在环境空气中进行的，不使用任何额外的气体。透明玻璃顶盖(1)中的贯穿孔是通过多次加工相同面积的玻璃直到形成通孔而加工完成的。激光加工过程之后，透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)被单独放置到一个充满甲醇的烧杯中。然后将烧杯放入超声波清洗机中，在室温下清洗几分钟，以清除玻璃表面松散的碎片。除去除碎片外，采用CO2激光回流后处理方法去除激光加工过程中加工区域周围产生的小毛刺。首先将二氧化碳激光束通过透镜聚焦到直径约100μm的圆形斑点上，通过激光将微通道加热到熔化温度约645°左右，从而引起回流。然后激光器以5kHz的重复频率工作，通过调节占空比来控制时均光束强度。当微流体通道(11)在回流过程中热收缩时，由于表面张力，导致微通道表面的光滑度非常好，表面品质因数可以达到10^6级别。(所述CO2激光回流后处理方法请参考Lin,J.,Yu,S.,Ma,Y.,Fang,W.,He,F.,Qiao,L.,Tong,L.,Cheng,Y.,&Xu,Z.(2012).On-chip three-dimensional high-Q microcavities fabricated by femtosecondlaser direct writing.Optics express,20(9),10212–10217.)
封接(键合)：为了获得良好的接触，将透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)再次用甲醇洗涤，用柔软的聚酯组织擦拭，并用电离氮射流处理；清洗后，将透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)对其压紧，使得透明玻璃顶盖(1)的贯通孔与玻璃底板(5)的相应凹槽对齐，在15℃～30℃室温条件下通风并放置一段时间，直至透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)之间的光学条纹消失，完成键合。
(八)一种用于细胞计数、分类检测的全玻璃微流控芯片系统：
包括所述全玻璃微流控芯片、激光二极管(13)、光电倍增管(14d和14e)、光电二极管(15)、泵(12)、数据采集卡(16)、数据处理设备(17)、废液池(18)、供电模块；
泵(12)通过注射器橡胶管道分别与鞘液入口(2)、细胞入口(3)密封连接；出液孔(4)与废液池(18)通过橡胶管道密封连接；
激光二极管(13)连接单模光纤的末端，并将该单模光纤插入激发光纤通道(7)使得单模光纤的前端置于激发光纤通道(7)的内部顶端；
光电倍增管(14e)和光电倍增管(14d)的输入端，分别连接各自的多模光纤的末端，并将各自的多模光纤分别插入荧光检测光纤通道(8)和侧向散射光检测光纤通道(9)，使得各自的多模光纤的前端分别置于荧光检测光纤通道(8)和侧向散射光检测光纤通道(9)的内部顶端；
光电二极管(15)的输入端连接多模光纤的末端，并将该多模光纤插入前向散射光检测光纤通道(10)使得多模光纤的前端置于前向散射光检测光纤通道(10)的内部顶端；
将所述2个光电倍增管(14d和14e)和光电二极管(15)的输出端，分别与数据采集卡(16)连接，用于采集光学检测信号；数据采集卡(16)所采集的信号输出至数据处理设备(17)，进行分析计算；
供电模块为系统各部分提供电源。
(九)具体应用方法：
由如下的方法已经将本发明所述微流控芯片及相应系统成功应用于血细胞检测。给出具体方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的功能及应用方法，而并不是对本发明所述装置的适用范围做出限定。
工作流程包括：
如图4所示，从全玻璃微流控芯片的细胞入口(3)通入细胞悬浮液，当细胞经过三维流体聚焦后进入鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)，激发光通过激发光纤，经玻璃微透镜(6)汇聚，在微流体通道(11)检测区域内形成一个光斑，照射单细胞；使用多模光纤采集相应的前向散射光、侧向散射光和荧光，并分别传递到光电二极管(15)和光电倍增管(14d和14e)上进行放大，放大后的信号通过数据采集卡(16)传递到数据处理设备(17)中进行数据的处理分析，从而进行细胞计数，分类检测；
细胞悬浮液和鞘液通过出液孔(4)流入废液池(18)中。
例如取用全血细胞稀释后，与鞘液一起通入微流控芯片中。待细胞到达检测区域后，在激发光照射下，通过检测光纤采集不同的检测信号。采集到的光信号通过外部光学检测器件放大后，通过数据采集卡(16)传导到上数据处理设备(17)中，对数据进行处理分析后，得到许多个均匀连续的信号峰，峰的个数代表检测到的细胞个数，峰值的大小代表检测到不同大小的细胞。所述细胞悬浮液可以来自于活体组织，血液或者体外培养的细胞悬浮液。所述激发光波长为633nm。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换和替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种全玻璃微流控芯片，其特征在于，包括：
采用石英玻璃加工的透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)，其中，
所述透明玻璃顶盖(1)，其上开设有多个贯通孔，这些贯通孔分别贯通于透明玻璃顶盖(1)的上下表面；
所述玻璃底板(5)的上表面，即玻璃底板(5)与透明玻璃顶盖(1)接触的表面，具有与透明玻璃顶盖(1)的各个贯通孔的位置相对应的多个凹槽；凹槽之间开设有微流体通道(11)，用于对样品进行三维流体聚焦；微流体通道(11)的深度与所述凹槽深度相同，微流体通道(11)的宽度应大于待测样品粒子的最大直径；
所述玻璃底板(5)，从侧壁向内开设多个集成光纤通道，包括激发光纤通道(7)、荧光检测光纤通道(8)、侧向散射光检测光纤通道(9)、前向散射光检测光纤通道(10)；所述每个集成光纤通道的前端内端面都加工为平面；
所述玻璃底板(5)上表面，开设具有双凹透镜形状凹槽，称为玻璃微透镜(6)；激发光纤通道(7)的轴向垂直于鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)，且与玻璃微透镜(6)的光轴重合；
透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)叠放在一起，使得透明玻璃顶盖(1)的贯通孔与玻璃底板(5)的相应凹槽对齐，并相互密封。
2.如权利要求1所述的全玻璃微流控芯片，其特征在于，所述透明玻璃顶盖(1)开设的多个贯通孔分别作为鞘液入口、细胞入口、出液孔，其中：
鞘液入口，用于注入鞘液，实现三维聚焦；
细胞入口(3)，用于注入细胞样品；
出液孔(4)，用于鞘液和细胞样品的排出。
3.如权利要求2所述的全玻璃微流控芯片，其特征在于，所述细胞入口(3)位于鞘液入口(2b)和鞘液入口(2c)之间；鞘液入口(2a)和出液孔(4)分别位于前三者的两侧；
当透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)叠放在一起，并相互密封，鞘液入口(2b)、细胞入口(3)、鞘液入口(2c)、出液孔(4)依次通过微流体通道(11)连通，鞘液入口(2a)通过左右对称布设的2条微流体通道(11)，与鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)相连通。
4.如权利要求1-3所述的全玻璃微流控芯片，其特征在于，所述集成光纤通道，宽度0.16～0.6毫米，其中：
前向散射光检测光纤通道(10)与激发光纤通道(7)的轴向呈13°(m)，距离鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)外壁0.25毫米(n)放置；
侧向散射光检测光纤通道(9)与激发光纤通道(7)的轴向呈-60°(o)，距离鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)外壁0.12(p)毫米放置；
荧光检测光纤通道(8)与激发光纤通道(7)的轴向呈-120°(q)，距离鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)外壁0.12毫米(r)放置。
5.如权利要求1-4所述的全玻璃微流控芯片，其特征在于，所述具有双凹透镜形状的玻璃微透镜(6)，其曲率半径分别为0.3毫米(t)和-0.3毫米(s)，整个玻璃微透镜(6)宽度为1.2毫米(u)，深度0.18毫米，负曲率凹面距离鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)最近的侧壁距离0.76毫米(v)，正曲率凹面距离激发光纤通道(7)的前端端面0.5毫米(w)，用于将光纤发出的光聚焦到微流体通道(11)的径向中心位置。
6.一种用于细胞计数、分类检测的全玻璃微流控芯片系统，其特征在于，包括：
所述全玻璃微流控芯片、激光二极管(13)、光电倍增管(14d和14e)、光电二极管(15)、泵(12)、数据采集卡(16)、数据处理设备(17)、废液池(18)、供电模块；
泵(12)通过注射器橡胶管道分别与鞘液入口(2)、细胞入口(3)密封连接；出液孔(4)与废液池(18)通过橡胶管道密封连接；
激光二极管(13)连接单模光纤的末端，并将该单模光纤插入激发光纤通道(7)使得单模光纤的前端置于激发光纤通道(7)的内部顶端；
光电倍增管(14e)和光电倍增管(14d)的输入端，分别连接各自的多模光纤的末端，并将各自的多模光纤分别插入荧光检测光纤通道(8)和侧向散射光检测光纤通道(9)，使得各自的多模光纤的前端分别置于荧光检测光纤通道(8)和侧向散射光检测光纤通道(9)的内部顶端；
光电二极管(15)的输入端连接多模光纤的末端，并将该多模光纤插入前向散射光检测光纤通道(10)使得多模光纤的前端置于前向散射光检测光纤通道(10)的内部顶端；
将所述2个光电倍增管(14d和14e)和光电二极管(15)的输出端，分别与数据采集卡(16)连接，用于采集光学检测信号；数据采集卡(16)所采集的信号输出至数据处理设备(17)，进行分析计算；
供电模块为系统各部分提供电源。
7.如权利要求1所述的全玻璃微流控芯片，其加工方法特征在于，包括如下步骤：
S1.激光加工：
所述透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)表面上的微结构，是采用皮秒激光刻蚀装置刻蚀的；
该激光器利用1064nm波长的激光，使用扫描狭缝光束轮廓仪在峰值强度的1/e2处测量，1/e2表示光强度已经下降到光强峰值的13.5％，焦点处的激光束半径约为10微米，该激光光斑是通过将输出激光束扩大到直径为10毫米的光斑，然后用安装在振镜扫描仪上的100毫米焦距的F-θ透镜聚焦得到的；激光由Advanced Optowave(AO)软件控制，并由MasterCut软件设定激光加工参数，如脉冲能量、激光束扫描速度和激光通过时间，以生成复杂的微流控结构；该加工在环境空气中进行的，不使用任何额外的气体；透明玻璃顶盖(1)中的贯穿孔是通过多次加工相同面积的玻璃直到形成通孔而加工完成的；
S2.表面后处理：
1)透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)被分别单独放置到充满甲醇的容器中，然后将容器放入超声波清洗机中，在室温下清洗以清除玻璃表面松散的碎片；
2)采用CO2激光回流后处理方法去除激光加工过程中加工区域周围产生的小毛刺：首先将二氧化碳激光束聚焦到直径约100μm的圆形斑点上，通过二氧化碳激光将微流体通道(11)加热到熔化温度约645°左右，从而引起回流；然后二氧化碳激光器以5kHz的重复频率工作，通过调节占空比来控制时均光束强度；当微流体通道(11)在回流过程中热收缩时，由于表面张力，使微流体通道(11)表面的光滑度提升，达到光学检测要求；
S3.键合
为了获得良好的接触，将透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)再次用甲醇洗涤，用柔软的聚酯组织擦拭，并用电离氮射流处理；清洗后，将透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)对其压紧，使得透明玻璃顶盖(1)的贯通孔与玻璃底板(5)的相应凹槽对齐，在15℃～30℃室温条件下通风并放置一段时间，直至透明玻璃顶盖(1)和玻璃底板(5)之间的光学条纹消失，完成键合。
8.如权利要求6所述的一种用于细胞计数、分类检测的全玻璃微流控芯片系统，其特征在于，工作流程包括：
从全玻璃微流控芯片的细胞入口(3)通入细胞悬浮液，当细胞经过三维流体聚焦后进入鞘液入口(2c)和出液孔(4)之间的微流体通道(11)，激发光通过激发光纤，经玻璃微透镜(6)汇聚，在微流体通道(11)检测区域(x)内形成一个光斑，照射单细胞；使用多模光纤采集相应的前向散射光、侧向散射光和荧光，并分别传递到光电二极管(15)和光电倍增管(14d和14e)上进行放大，放大后的信号通过数据采集卡(16)传递到数据处理设备(17)中进行数据的处理分析，从而进行细胞计数，分类检测；
细胞悬浮液和鞘液通过出液孔(4)流入废液池(18)中。
9.如权利要求9所述的一种用于细胞计数、分类检测的全玻璃微流控芯片系统，其特征在于，所述细胞悬浮液可以来自于活体组织，血液或者体外培养的细胞悬浮液。
10.如权利要求1或4所述的全玻璃微流控芯片，其特征在于，
所述微流体通道(11)的宽度为100微米，深度为180微米。
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