KR20230004915A - 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 태반 영양막 세포를 분리하는 방법 - Google Patents

임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 태반 영양막 세포를 분리하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230004915A
KR20230004915A KR1020227043777A KR20227043777A KR20230004915A KR 20230004915 A KR20230004915 A KR 20230004915A KR 1020227043777 A KR1020227043777 A KR 1020227043777A KR 20227043777 A KR20227043777 A KR 20227043777A KR 20230004915 A KR20230004915 A KR 20230004915A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
hla
flow channel
cell
outlet
Prior art date
Application number
KR1020227043777A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102626620B1 (ko
Inventor
옌 정
지아옌 마
씨아오웨이 펑
멍유 리우
페이쑤안 천
즈셩 구안
롱쉬 씨에
이유안 거
Original Assignee
광저우 하이브리바이오 메디슨 테크놀로지 엘티디.
광동 하이브리바이오 바이오테크 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 광저우 하이브리바이오 메디슨 테크놀로지 엘티디., 광동 하이브리바이오 바이오테크 컴퍼니 리미티드 filed Critical 광저우 하이브리바이오 메디슨 테크놀로지 엘티디.
Publication of KR20230004915A publication Critical patent/KR20230004915A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102626620B1 publication Critical patent/KR102626620B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 태반 영양막 세포를 분리하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 특정된 영양막 세포 표면 또는 세포내에서 발현되는 특이적 항원 및 조합을 기반으로, 설계된 미세유체 선별 칩 또는 유세포 분석기를 이용하여 태반 영양막 샘플의 세포 현탁액에 대해 세포 선별을 수행함으로써, 분리 및 정제된 태반 영양막 세포를 얻는다. 기존의 방법에 비해, 본 발명의 방법은 비침습적으로 검체를 얻을 수 있고 특이도가 좋은 장점이 있으며, 상기 방법은 샘플링 시간이 빠르고, 감염 및 유산의 위험이 낮으며, 다수의 항원에 대해 동시 표지 및 특징 형광 신호의 식별 및 선별을 동시에 수행할 수 있어 정확도가 크게 향상되고, 검출 결과가 또한 더 높은 신뢰성 및 더 넓은 적용 범위를 갖는다. 또한, 상기 방법은 기존의 자기 비드 방법 등 기술에 비해 세포의 수와 품질을 모두 고려할 수 있는 장점을 가지며, 얻은 세포의 수가 많을 뿐만 아니라 세포 손상이 적고, 얻은 세포의 수가 많으며, 특이도가 좋고, 민감도가 좋으며, 다양한 검출 용도 및 응용 장면에 적용할 수 있어 적용 가치가 아주 높다.

Description

임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 태반 영양막 세포를 분리하는 방법
본 발명은 세포 분리 기술분야에 속하는 것으로, 보다 구체적으로, 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 영양막 세포를 분리 및 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
임신 전, 산전, 신생아의 3단계 예방 및 통제 시스템은 중국에서 선천성 결함을 줄이고 인구의 질을 향상시키는 중요한 수단 중 하나이며, 그 중 산전 선별 및 진단은 가장 복잡하고 가장 어려운 단계이다.
현재 임상에서 산전 진단을 위한 양수 천자술 또는 제대혈 천자술, 및 태아 무세포 핵산 시퀀싱 등 비침습적 산전 선별 기술은 모두 다양한 단점을 가지고 있다. 양수 천자술 또는 제대혈 천자술의 샘플링 방법은 수술 감염 및 유산의 위험이 높고, 분석 시간이 길며, 검출 항목과 범위가 제한적이고, 진단 시간이 임신 2기, 3기로 제한되어 있으며, 임산부의 수용도가 낮고 임상 처리에 불리하다. 태아 무세포 핵산 시퀀싱 기술의 검출 범위는 극히 제한적이고, 또한 3 ~ 5개의 지정된 염색체 배수성만 검출할 수 있고, 위양성 및 위음성 상황이 불가피하며, 일반적인 변이체에 대한 검출 능력이 부족하고, 모체 혈액 내 태아 무세포 핵산의 함량에도 개인차가 있는 등 문제가 존재한다.
출원인의 특허 출원 CN111304153A에서는 영양막 세포 표면에서 발현되는 특이적 항원을 결정하고 대응되는 특이적 항체를 갖는 면역자기 비드 기술을 이용하여 태반 영양막 샘플 세포 현탁액으로부터 태반 영양막 세포를 분리 및 정제하는 영양막 세포의 분리 방법을 개시하였다. 해당 기술은 기존의 양수 천자 및 융모막 융모 샘플링에 비해 비침습적인 장점이 있고, 샘플링 시간이 빠르며, 감염 및 유산의 위험이 낮고, 검출 결과가 또한 유사한 신뢰성을 갖는다. 한편, 해당 기술은 아직 개선의 여지가 남아 있으며, 개시된 적용되는 항체의 조합이 제한되어 있고, 정확도와 특이도를 여전히 개선할 필요가 있다. 출원인 팀은 해당 프로젝트에 대해 지속적인 연구 및 개발을 수행하고 있다.
본 발명의 목적은 유세포 분석에 의한 분리 또는 미세유체 기술을 기반으로 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 영양막 세포를 분리 및 스크리닝하는 방법을 제공하는 것으로, 이는 기존의 방법의 문제 및 결함을 극복할 뿐만 아니라 보다 많은 항원에 대해 동시 표지 및 특징 형광 신호의 식별 및 선별을 동시에 수행할 수 있어 정확도가 크게 향상됨과 동시에 특이도도 이전의 면역자기 비드 분리 방법보다 우수하고, 또한 세포의 수와 품질을 모두 고려할 수 있는 장점을 가지며, 얻은 세포의 수가 많고, 특이도가 좋으며, 민감도가 좋다.
본 발명의 상기 목적은 다음과 같은 기술적 해결수단을 통해 구현된다.
영양막 세포의 분리 방법은,
자궁경부 탈락 세포액 샘플을 샘플 세포 현탁액으로 제조하는 단계 (1);
샘플 세포 현탁액에 특이적 항체를 첨가하여 배양하는 단계 (2); 및
유세포 분석기를 이용하여, 단계 (2)에서 배양된 세포 재현탁액에 대해 선별을 수행하여, 분리 및 정제된 태반 영양막 세포를 얻거나; 또는 미세유체 선별 칩을 이용하여, 단계 (2)에서 배양된 세포 재현탁액에 대해 형광 표지 미세유체 세포 선별을 수행하여, 분리 및 정제된 태반 영양막 세포를 얻는 단계 (3)을 포함하되,
상기 특이적 항체는 영양막 세포 표면 또는 세포내에서 발현되는 특이적 항체에 대응되는 항체의 조합이고; 바람직하게는, 특이적 항체의 조합은 HLA-G+CK7, HLA-G+CK18, HLA-G+β-HCG, CD31+HPL, MMP9+CD31, HLA-G+HPL, HLA-G+MMP9, HLA-G+CD31, HLA-G+P, CD31+P, HLA-G+CDH5, CD31+CDH5, CD31+CK7+HLA-G, HLA-G+CK18+CD31, HLA-G+β-HCG+CD31, CD31+HPL+HLA-G, MMP9+CD31+HLA-G, CD31+P+HLA-G 또는 HLA-G+CDH5+CD31의 조합이다.
바람직하게는, 단계 (3)에서 사용된 미세유체 선별 칩은 기판 및 이와 합착된 커버판을 포함하는 구조이고; 아크릴을 기본 재료로 포함하지만 이에 한정되지 않는 것을 선택하여 사출 성형 기술을 통해 제조하며;
상기 기판의 일측면에는 메인 유동 채널, 사이드 유동 채널 A 및 사이드 유동 채널 B가 구비되고, 2개의 사이드 유동 채널은 각각 메인 유동 채널의 좌측 및 우측의 두 단부에 대응되게 근접하며;
상기 기판의 다른 측면에는 C 입구, S 입구, N 출구 및 T 출구가 구비되고; 4개의 입구 및 출구는 모두 기판의 다른 측면으로 관통하여 유동 채널과 연통되며; C 입구의 위치는 메인 유동 채널의 좌측 단부에 대응되고, S 입구의 위치는 사이드 유동 채널 A의 단부에 대응되며, N 출구의 위치는 메인 유동 채널의 우측 단부에 대응되고, T 출구의 위치는 사이드 유동 채널 B의 단부에 대응되며;
상기 메인 유동 채널 내에서 N 출구와 T 출구의 합류점에는 또한 편향 전극 장치가 구비된다.
바람직하게는, 모든 메인 유동 채널, 사이드 유동 채널 A 및 사이드 유동 채널 B의 유동 채널 폭은 모두 1000 μm 이하이고, 깊이는 모두 500 μm 이하이다.
보다 바람직하게는, 모든 메인 유동 채널, 사이드 유동 채널 A 및 사이드 유동 채널 B의 유동 채널 폭은 모두 500 ~ 1000 μm이다.
보다 바람직하게는, 모든 메인 유동 채널, 사이드 유동 채널 A 및 사이드 유동 채널 B의 유동 채널 폭은 모두 1000 μm이다.
미세유체 선별 칩에서, 선별할 혼합 세포 샘플을 C 입구로 통입시킬 수 있고, 완충액을 S 입구로 통입시킬 수 있으며, T 출구는 표적 세포의 수집에 사용되고, N 출구는 비표적 세포의 수집에 사용된다.
선별 과정에서, 표적 세포를 함유한 혼합 샘플은 C 입구에서 칩의 메인 유동 채널으로 유동하고, 완충액은 S 입구에서 칩의 사이드 유동 채널로 진입하며, 양자는 유동 채널의 합류점에서 혼합된 후 계속하여 메인 유동 채널을 따라 동일한 방향으로 유동된다. 혼합된 세포가 편향 전극 장치를 통과할 경우, 진입하는 파이프라인을 전극의 개폐를 통해 제어함으로써, 표적 세포가 선별되어 T 출구에 도달하고, 비표적 세포가 메인 유동 채널을 따라 계속하여 N 출구에 도달하면, 선별이 완료된다.
이 밖에, 바람직하게는, 단계 (2)에서 1차 항체의 배양 조건은 4 ℃에서 30 ~ 90 min(바람직하게는 4 ℃, 60 min) 동안 반응시키는 것이고, 2차 항체-형광 표지 복합체의 배양 조건은 2 ~ 8 ℃에서 20 min 동안 반응시키는 것이다.
바람직하게는, 단계 (2)의 구체적인 방법은, 배양을 통해 1차 항체 및 2차 항체-형광 표지 복합체를 선후 단계별로 표적 항원에 특이적으로 연결하되, 중간에 세척 및 원심분리 기술을 사용하여 교차 오염을 방지하는 것이다.
바람직하게는, 단계 (3)의 구체적인 방법은, 배양된 세포 재현탁액을 미세유체 선별 칩의 C 입구로 통입시키고, 완충액을 S 입구로 통입시킨 다음, 미세유체 선별 칩을 세포 선별기에 놓고 선별 프로그램을 실행하며, 프로그램이 종료된 후, T 출구의 검체를 수집하여 선별된 영양막 세포를 얻는 것이다.
바람직하게는, 단계 (3)에서 세포 선별 액상 시스템은 0.2 % ~ 0.4 %의 Triton-X-100(바람직하게는 0.3 %의 Triton-X-100)이다. 보다 바람직하게는, PBS를 이용하여 구성한다.
바람직하게는, 단계 (3)에서 유세포 분석기를 이용하여 선별하는 상기 조건은 로딩 속도를 1000 ~ 2000 events/초로 조정하고, 수집 속도를 5.0으로 조정하는 것이다.
바람직하게는, 단계 (1)에서 세포 현탁액의 최적의 시스템은 0.2 % ~ 0.4 %의 FBS를 함유한 1ХPBS(바람직하게는 0.3 %의 FBS를 함유한 1ХPBS)이다.
이 밖에, 인간 STR 검사, 인간 염색체 배수성 검출, 지중해 빈혈 유전자 검출, 난청 유전자 검출, 전장 엑솜 유전자 시퀀싱, 염색체 미세결실/중복 검출(고처리량 시퀀싱 방법), 또는 염색체 구조 변이 검출(고밀도 칩 방법)의 제품을 구성함에 있어서 상기 방법의 응용도 본 발명의 보호범위 내에 속해야 한다.
본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다.
본 발명에 의해 제공되는 유세포 분석에 의한 분리 또는 미세유체 기술을 기반으로 태반 영양막 세포를 분리하는 방법은 기존의 양수 천자 및 융모막 융모 샘플링에 비해 비침습적으로 검체를 얻을 수 있는 장점이 있고, 샘플링 시간이 빠르며, 감염 및 유산의 위험이 낮고, 검출 결과가 또한 더 높은 신뢰성 및 더 넓은 적용 범위를 갖는다. 이러한 종류의 검체를 통해 태아의 완전한 게놈 핵산 샘플을 얻을 수 있어 모든 유전성 질환을 검출 및 분석할 수 있고, 유전성 질환 검출의 적용(염색체 배수성, 염색체 구조 변이(CNV), 미토콘드리아, 미세결실/중복, 단일 유전자 돌연변이, SNP/STR 유전적 특성 검사 등)을 기본적으로 구현한다.
본 발명의 방법은 상당한 수의 세포(수천 개이고, 설계된 품질 관리 최소 기준은 >2000개의 양성 세포임)를 얻을 수 있고, 특별한 조작 없이 통상적인 분자 검사 기술을 사용하여 검체를 검출할 수 있으며, 기술자 및 실험실 장비에 대한 요구가 높지 않아 기술적 조건 및 사용 비용이 감소되고, 더 많은 의료 기관에서 시행할 수 있으며, 널리 홍보할 수 있다.
동시에, 본 발명에 의해 제공되는 방법은 다중 표지 병렬 스크리닝 방법을 기반으로 보다 많은 항원에 대해 동시 표지 및 특징 형광 신호의 식별 및 선별을 동시에 수행할 수 있어 정확도가 크게 향상되고, 기존의 자기 비드 방법 등 기술에 비해 세포의 수와 품질을 모두 고려할 수 있는 장점을 가지며, 얻은 세포의 수가 많을 뿐만 아니라 세포 손상이 적고, 얻은 세포의 품질이 우수하며, 검출 특이도가 좋고, 민감도가 좋다.
도 1은 미세유체 선별 칩의 기판의 구조 모식도이고; (a) 부분 및 (b) 부분은 각각 기판의 2개의 측면이다.
도 2는 유세포 분석에 의한 선별에서 선택된 단일 형광 표지 양성 세포 집단을 도시한다.
도 3은 유세포 분석에 의한 선별에서 선택된 이중 형광 표지 양성 세포 집단을 도시한다.
도 4는 FAM으로 표지된 채널 1을 도시하고, "822-"는 선별 후 남은 검체이며, "822+"는 선별된 검체이고, "822"는 선별 전의 검체이다.
도 5는 HEX로 표지된 채널 2를 도시한다.
도 6은 TAMRA로 표지된 채널 3을 도시한다.
도 7은 ROX로 표지된 채널 4를 도시한다.
도 8은 선별 후 합포체영양막 세포에 Y 염색체를 포함하는 검체에 대한 Y-STR 검출 결과의 모식도이다.
도 9는 선별된 검체에 대한 난청 유전자 검출의 결과를 도시한다.
도 10은 선별된 검체에 대한 지중해 빈혈 유전자 검출의 결과를 도시한다.
도 11은 가계 병원성 돌연변이 보유 검출 가계도이다.
도 12는 전체 염색체의 모식도이다.
도 13은 이상 염색체의 모식도이다.
도 14는 본 발명의 방법에 의해 선별하여 얻은 양성 세포의 사진이다.
도 15는 본 발명의 방법에 따른 선별 전과 후의 양성 세포와 음성 세포의 비교 사진이다.
도 16은 대조를 위한 자기 비드 방법에 의해 선별하여 얻은 양성 세포의 사진이다.
아래, 구체적인 실시예와 결부하여 본 발명을 더 설명하지만 실시예는 본 발명을 어떠한 형태로도 한정하지 않는다. 특별히 달리 설명되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 시약, 방법 및 장비는 당업계에서 통상적인 시약, 방법 및 장비이다.
특별히 달리 설명되지 않는 한, 아래의 실시예에서 사용되는 시약 및 재료는 모두 시중에서 구입 가능하다.
실시예 1: 미세유체 선별 칩의 설계
임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 영양막 세포를 분리 및 스크리닝하기 위한 미세유체 선별 칩의 모식도는 도 1에 도시된 바와 같다.
미세유체 선별 칩의 구조 설계에 대한 설명은 다음과 같은 바, 칩은 아크릴을 기본 재료로 포함하지만 이에 한정되지 않는 것을 선택하여 제조하며, 사출 성형 기술을 통해 일측면의 기재에 도 1에 도시된 바와 같이 파이프라인 형상으로 형성하되, 파이프라인의 폭은 1000 μm 이하이며, 깊이는 500 μm 이하이고, 다른 측면의 기재를 사용하여 합착함으로써 완전한 칩을 형성한다.
구체적으로, 미세유체 선별 칩은 기판 및 이와 합착된 커버판을 포함하고;
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 기판의 일측면에는 메인 유동 채널, 사이드 유동 채널 A 및 사이드 유동 채널 B가 구비되며, 2개의 사이드 유동 채널은 각각 메인 유동 채널의 좌측 및 우측의 두 단부에 근접하고; 모든 유동 채널 폭은 모두 1000 μm이며;
상기 기판의 다른 측면에는 C 입구(세포 샘플 유입홀), S 입구(완충액 유입홀), N 출구(비표적 세포 저장홀) 및 T 출구(표적 세포 저장홀)가 구비되고; 4개의 입구 및 출구는 모두 기판의 다른 측면으로 관통하여 유동 채널과 연통되며; C 입구의 위치는 메인 유동 채널의 좌측 단부에 대응되고, S 입구의 위치는 사이드 유동 채널 A의 단부에 대응되며, N 출구의 위치는 메인 유동 채널의 우측 단부에 대응되고, T 출구의 위치는 사이드 유동 채널 B의 단부에 대응되며;
선별할 혼합 세포 샘플을 C 입구로 통입시킬 수 있고, 완충액을 S 입구로 통입시킬 수 있으며, T 출구는 표적 세포의 수집에 사용되고, N 출구는 비표적 세포의 수집에 사용된다.
이 밖에, 상기 메인 유동 채널 내에는 또한 세포 선별을 위한 편향 전극 장치가 구비되고, 편향 전극 장치의 구체적인 위치는 N 출구와 T 출구의 합류점에 위치하며; 유동 세포 신호의 유무에 따라 전극의 개방/폐쇄를 제어할 수 있다. 음전하를 띠는 세포는 전극에 의해 형성된 전자기장에서 편향되어 N 출구 또는 T 출구로 통하는 지정된 파이프라인으로 진입한다.
선별 과정에서, 표적 세포를 함유한 혼합 샘플은 C 입구에서 칩의 메인 유동 채널으로 유동하고, 완충액은 S 입구에서 칩의 사이드 유동 채널로 진입하며, 양자는 유동 채널의 합류점에서 혼합된 후 계속하여 메인 유동 채널을 따라 동일한 방향으로 유동된다. 혼합된 세포가 편향 전극 장치를 통과할 경우, 진입하는 파이프라인을 전극의 개폐를 통해 제어함으로써, 표적 세포가 선별되어 T 출구에 도달하고, 비표적 세포가 메인 유동 채널을 따라 계속하여 N 출구에 도달하면, 선별이 완료된다.
선별이 완료된 후, 칩은 즉시 폐기되며, 선별 환경이 깨끗하고 제어 가능하며 교차 오염이 없도록 보장하기 위해 매번 선별 전에 칩을 새로 교체해야 한다.
실시예 2: 미세유체 선별 칩을 기반으로 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 영양막 세포를 분리 및 스크리닝
가. 영양막 세포의 선별 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
1. 자궁경부 탈락 세포액 샘플을 샘플 세포 현탁액으로 제조하되, 구체적인 방법은 아래의 (1) 내지 (5)를 포함한다.
2. 샘플 세포 현탁액에 특이적 항체를 첨가하여 배양하되, 구체적인 방법은 아래의 (6) 내지 (14)를 포함한다.
3. 실시예 1의 미세유체 선별 칩을 이용하여, 단계 2에서 배양된 세포 재현탁액에 대해 형광 표지 미세유체 세포 선별을 수행하되, 구체적인 방법은 아래의 (15) 내지 (18)를 포함한다.
여기서, 특이적 항체의 조합은 표 1에 나타낸 바와 같다.
[표 1]
영양막 세포에서 발현되는 항원 및 항체의 조합
Figure pct00001
나. 구체적으로, 영양막 세포의 선별 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
(1) 세포 보존액(자궁경부 탈락 세포)을 셰이커에서 5 min 동안 균일하게 혼합하였다.
(2) 보존액을 꺼내 15 ml의 원심분리 튜브에 넣고, 보존액의 병에 3 ml의 1ХPBS를 넣고 흔들어 균일하게 혼합한 후 꺼내 15 ml의 원심분리 튜브에 넣었다.
(3) 3000 rpm에서 10 min 동안 원심분리하고, 상층액을 버렸다.
(4) 1 ml의 1ХPBST를 넣고, 균일하게 혼합한 후 1.5 ml의 EP 튜브로 옮기며, 3000 rpm에서 5 min 동안 원심분리한 후 상층액을 버렸다.
(5) 단계 4를 두 번 반복하여 세포 현탁액을 제조하였다.
(6) 200 μl의 0.3 %의 Triton X-100을 넣고, 균일하게 혼합한 후 실온에서 20 min 동안 투과시켰다.
(7) 단계 4를 세 번 반복하였다.
(8) 1차 항체의 첨가: 비율로 희석된 마우스 항-인간 CK7 단클론 항체, 마우스 항-인간 CK18 단클론 항체, 마우스 항-인간 β-HCG 단클론 항체, 마우스 항-인간 MMP9 단클론 항체, 마우스 항-인간 CDH5 단클론 항체, 마우스 항-인간 P 단클론 항체, 마우스 항-인간 hPL 단클론 항체, 토끼 항-인간 HLA-G 단클론 항체, 토끼 항-인간 CD31 단클론 항체(abcam사)를 각각 200 μl씩 첨가하고, 균일하게 혼합한 후, 4 ℃, 60 min.
(9) 단계 4를 세 번 반복하였다.
(10) 2차 항체-형광 표지 복합체의 첨가: 비율로 희석된 200 μl의 양 항-토끼 및 양 항-마우스 항체를 균일하게 혼합한 후, 37 ℃, 60 min.
(11) 단계 4를 세 번 반복한 후 200 μl의 완충액(buffer)(DPBS+0.1%BSA+2mM EDTA)으로 재현탁하였다.
(12) 2 ℃ ~ 8 ℃에서 20 min 분 동안 반응시켰다.
(13) 1 ml의 1ХPBST를 넣고, 균일하게 혼합한 후 1.5 ml의 EP 튜브로 옮기며, 3000 rpm에서 5 min 동안 원심분리한 후 상층액을 버렸다.
(14) 단계 (13)을 두 번 내지 세 번 반복하고, 200 μl의 1ХPBST를 넣어 재현탁하여 세포 재현탁액을 얻었다.
(15) 얻은 세포 재현탁액을 실시예 1의 미세유체 선별 칩의 C 입구로 통입시키고, 1ХPBST를 S 입구로 통입시켰다.
(16) 미세유체 칩을 세포 선별기의 스테이지에 놓아 고정하고, 전원을 켜 지정된 프로그램을 설정하여 실행하였다.
(17) 프로그램이 종료된 후, T 출구의 검체를 수집하여 선별된 영양막 세포를 얻었다.
(18) 자궁경부 탈락 세포에서 영양막 세포가 제거된 나머지 세포인 N 출구의 검체를 수집하였다.
실시예 3: 유세포 분석기를 기반으로 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 영양막 세포를 분리 및 스크리닝하는 방법
영양막 세포의 선별 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
1. 자궁경부 탈락 세포액 샘플을 샘플 세포 현탁액으로 제조하되, 구체적인 방법은 실시예 2의 (1) 내지 (5)와 동일하다.
2. 샘플 세포 현탁액에 특이적 항체를 첨가하여 배양하되, 구체적인 방법은 실시예 2의 (6) 내지 (14)와 동일하며; 여기서, 특이적 항체의 조합은 상기 표 1에 나타낸 바와 같다.
3. 유세포 분석에 의한 선별기(BDFACSAria II형, 미국)를 이용하여, 단계 2배양된 세포 재현탁액에 대해 형광 표지 선별을 수행하는 단계는 다음과 같은 단계를 포함한다.
1) 유세포 분석기를 작동시키고, 조작 설명서에 따라 매일 가동시켜 조작하였다.
2) 기기에 대해 액체 유동 조정을 수행하여 액체 유동 중단점 위치가 윈도우의 상단 중간에 위치하도록 하였다.
3) 선별 액체 경로를 조정하여 액적 지연을 결정하고, 로딩 속도를 1000 ~ 2000 events/초로 조정하였다.
4) 5 ml의 유세포 분석 튜브를 수집 장치로 선택하고, 선별된 세포의 수를 3000개로 선택하며, 방향을 왼쪽으로 하고, 선별할 세포 집단을 추가하며, 순차적으로 게이팅하여 수집 튜브에 넣었다.
5) 배양된 세포 현탁액을 주입 챔버에 넣고, 수집 속도를 5.0으로 설정하여 로딩하였다.
6) 300 ~ 500 V 범위 내에서 전압을 조정하여 형광 염료 간의 보상을 가능한 작게 하고, 게이팅 위치를 조정하며, 양성 세포를 중앙에 위치시키고, 게이트 내 세포를 수집하면, 수집 튜브 중의 세포는 선택된 표적 세포이다.
주어진 표지 조합에 따라 도 2 및 도 3과 같이 표적 세포 집단을 얻었다. 여기서, 도 2는 단일 형광 표지 선별 결과이고, 도 3은 이중 형광 표지 선별 결과이다.
실시예 4: 방법의 응용 사례---인간 STR 검사
1. 상기 실시예 2의 방법에 따라 샘플(자궁경부 탈락 세포)로부터 영양막 세포를 선별 및 분리하였다.
2. 분리된 영양막 세포와 임산부의 자궁경부 탈락 세포에 대해 DNA 추출을 수행하였다.
1) 선별된 영양막 세포(실시예 2의 방법에 따라 세포 선별의 17번째 단계를 수행하여 얻은 영양막 세포), 및 실시예 2의 방법에 따라 세포 선별의 18번째 단계를 수행하여 얻은 세포(자궁경부 탈락 세포에서 영양막 세포가 제거된 나머지 세포)를 각각 12000 rpm에서 3 min 동안 원심분리하였다.
2) 상층액을 제거하고, 200 μl의 용액 P를 첨가하여 재현탁 및 침전시켰다.
3) 20 μl의 프로테아제 K 및 200 μl의 용액 L을 첨가하여 균일하게 혼합하였다.
4) 56 ℃에서 20 min 동안 온욕하고, 뒤집어 균일하게 혼합하였다.
5) 200 μl의 무수 에탄올을 첨가하여 충분히 균일하게 혼합한 후, 흡착 칼럼으로 옮기고, 10000 rpm에서 1 min 동안 원심분리하며, 수집 튜브 중의 폐액을 버렸다.
6) 500 μl의 W1을 첨가하고,10000 rpm에서 1 min 동안 원심분리하며, 수집 튜브 중의 폐액을 버렸다.
7) 500 μl의 W2를 첨가하고,10000 rpm에서 1 min 동안 원심분리하며, 수집 튜브 중의 폐액을 버렸다.
8) 500 μl의 W2를 첨가하고,10000 rpm에서 1 min 동안 원심분리하며, 수집 튜브 중의 폐액을 버렸다.
9) 빈 튜브를 12000 rpm에서 3 min 동안 원심분리하며, 수집 튜브를 버렸다.
10) 흡착 칼럼을 새로운 1.5 ml의 원심분리 튜브에 넣고, 두껑을 열어 2 min 동안 정치하며, 50 μl의 TE를 넣고 5 min 동안 정치한 후, 12000 rpm에서 2 min 동안 원심분리하고, 칼럼을 버렸다.
11) 추출된 DNA 농도 및 순도를 측정하였다.
3. 분리된 영양막 세포와 임산부의 자궁경부 탈락 세포에서 DNA를 추출한 후, Microreader D-21 인간 STR 검사 키트를 사용하여 PCR 증폭을 수행하고, 3500xL 시퀀서를 사용하여 PCR 산물에 대해 모세관 전기영동 분석을 수행하며, G5-Matrix Standard를 사용하여 기기에 대해 형광 보정을 수행하고, 동시에 상응한 Panels 및 bins 파일을 작성하며, 소프트웨어 GeneMapper ID version 3.0을 사용하여 결과를 분석하였다.
4. STR 검출 수행
1) PCR 증폭을 수행하되, 증폭 시스템은 표 2에 나타낸 바와 같다.
[표 2]
PCR 증폭 시스템
Figure pct00002
PCR 반응 프로그램: 50 ℃, 10 min; 96 ℃, 4 min; (94 ℃, 5 sec; 60 ℃, 1 min 10 sec)Х27 cycles; 60 ℃, 30 min; 15 ℃, 보존.
2) STR 검출 결과
설명서에 따라 8.7 μl의 Hidi 및 0.3 μl의 내부 기준을 균일하게 혼합하고, 1 ml의 증폭된 산물을 첨가하며, 3500xL시퀀서를 사용하여 PCR 산물에 대해 모세관 전기영동 분석을 수행하고, G5-Matrix Standard를 사용하여 기기에 대해 형광 보정을 수행하고, 동시에 상응한 Panels 및 bins 파일을 작성하며, 소프트웨어 GeneMapper ID version 3.0을 사용하여 결과를 분석하였는 바, 그 결과는 도 4 내지 도 7에 도시된 바와 같으며, 결과는 검체에서 임산부 자신의 DNA 외에도 또 다른 독립적인 개체의 DNA 정보가 확실하게 존재하고 임산부 자신과 강한 혈연 관계가 있음을 보여준다.
3) Y-STR 검출
STR에서 Y 염색체가 검출된 검체에 대해 Microreader 40Y 키트를 사용하여 Y-STR 검출을 수행하였는 바, 그 결과는 도 8에 도시된 바와 같으며, 결과는 상기 검체에 남성 DNA가 존재함을 보여준다.
실시예 5: 방법의 응용 사례---난청 감수성 유전자 검출
실시예 2에 따른 방법 및 상품화된 키트(난청 감수성 유전자 검출 키트(PCR+플로우-쓰루 혼성화(flow-through hybridization) 방법), Chaozhou Kaipu Chaozhou Kaipu Biochemical Co., Ltd., 중국 의료기기 등록 번호: 20153401698)를 사용하여 임산부의 자궁경부 탈락 세포(샘플 출처: Guangzhou Kaipu Medical Laboratory)에 대해 난청 감수성 유전자 검출을 수행하되, 구체적으로 난청 관련 유전자(GJB2, GJB3, SLC26A4 및 mtDNA)의 9개의 돌연변이 부위(mtDNA1494, mtDNA1555, SLC26A4-IVS7(-2), SLC26A4-2168, GJB2-35, GJB2-176, GJB2-235, GJB2-299, GJB3-538)를 검출하였다.
실시예 4의 임산부의 자궁경부 탈락 세포에서 DNA를 추출하는 상기 방법으로 추출한 후, 상품화된 키트(난청 감수성 유전자 검출 키트(PCR+플로우-쓰루 혼성화 방법), Chaozhou Kaipu Chaozhou Kaipu Biochemical Co., Ltd., 중국 의료기기 등록 번호: 20153401698)를 사용하여 후속 검출을 수행하되, 구체적인 조작은 설명서를 참조한다. 원래의 결과는 도 9에 도시된 바와 같으며, 결과 분석은 표 3에 나타낸 바와 같다.
[표 3]
난청 결과 분석
Figure pct00003
결과는 상기 시험 검출 결과가 임상 검출 결과와 일치함을 보여준다.
실시예 6: 방법의 응용 사례---지중해 빈혈 관련 유전자 검출
실시예 2상기 방법 및 상품화된 키트(α- 및 β-지중해 빈혈 유전자 검출 키트(PCR+막 혼성화 방법), Chaozhou Kaipu Chaozhou Kaipu Biochemical Co., Ltd., 중국 식품 의약품 감독 의료기기(준)자 2012 제3400399호)를 사용하여 임산부의 자궁경부 탈락 세포(샘플 출처: Kaipu Medical Laboratory에서 검출한 인간 유래 검체의 나머지 핵산 샘플)에 대해 난청 감수성 유전자 검출 검출을 수행하되, 구체적으로 일반적인 3가지 α-지중해 빈혈 결실형(--SEA, -α3 .7, -α4 .2), 2가지 α-지중해 빈혈 돌연변이형(CS, QS) 및 11가지 β-지중해 빈혈 돌연변이형(CD14-15, CD17, CD27-28, CD41-42, CD43, CD71-72, -28, -29, IVS-I-1, IVS-II-654, β EN)을 검출하였다.
실시예 4의 임산부의 자궁경부 탈락 세포에서 DNA를 추출하는 상기 방법으로 추출한 후, 상품화된 키트(α- 및 β-지중해 빈혈 유전자 검출 키트(PCR+막 혼성화 방법), Chaozhou Kaipu Chaozhou Kaipu Biochemical Co., Ltd., 중국 식품 의약품 감독 의료기기(준)자 2012 제3400399호)를 사용하여 후속 검출을 수행하되, 구체적인 조작은 설명서를 참조한다. 원래의 결과는 도 10에 도시된 바와 같으며, 결과 분석은 표 4에 나타낸 바와 같다.
[표 4]
지중해 빈혈 결과 분석
Figure pct00004
결과는 상기 시험 검출 결과가 임상 검출 결과와 일치함을 보여준다.
실시예 7: 방법의 응용 사례---전장 엑솜 유전자 시퀀싱
1. 알려진 난청 가계(부친, 모친(임신 16주), 큰 아들(농아), 작은 아들(농아))에서, 실시예 2에 따른 방법에 따라 임산부의 자궁경부 탈락 세포 검체 및 양수 검체를 얻고, 임산부 자신 및 다른 가계 구성원에서 전혈 검체를 수집하며, DNA(임산부 자궁경부 탈락 세포)를 추출하여 선별한 후, 검체는 실시예 4에 따른 추출 방법에 따라 얻고, 양수 및 전혈 검체는 인간 전혈 게놈 DNA 추출 키트(Kaipu Biotechnology, 중국)를 사용하여 추출하며(샘플 출처: Kaipu Medical Laboratory에서 검출한 인간 유래 검체), 얻은 인간 게놈 DNA에 대해 인간 전장 엑솜 검출 키트(Beijing iGeneTech Bioscience Co., Ltd., 상품 번호: T086V4)를 사용하여 전장 엑솜 시퀀싱(WES)을 수행하였다.
게놈 DNA를 트랜스포사제 Tn5로 처리하여 300bp 단편을 생성하여 DNA 라이브러리를 구축하고; 두 말단에 링커 P5, P7, index1, 2를 추가하며; 적절한 길이의 DNA 단편을 선택하고, 증폭 및 정제하며; 비오틴을 갖는 엑손 프로브 라이브러리와 혼성화하고; 비오틴(biotin)과 스트렙타비딘의 강력한 결합 능력을 이용하여 스트렙타비딘을 갖는 자기 비드를 표적 라이브러리가 결합되어 있는 프로브와 결합하며; 자기 비드를 흡착하고; 상층액을 제거하며; 자기 비드 상의 DNA를 용출하고; PCR로 라이브러리를 증폭하며; 라이브러리 품질을 검정하고; 컴퓨터로 시퀀싱하였다.
2. 전장 엑솜 시퀀싱 결과
고처리량 시퀀싱 기술을 사용하여 전장 엑솜 검출을 수행하고, 검출된 병원성 또는 의심되는 병원성 부위를 Sanger 시퀀싱을 사용하여 검증하였다. 검사용 샘플은 임신 16주의 양수 검체이고, 두 명의 형은 농아이며, 부모는 모두 정상이다. 샘플에서 CDH23 유전자 c.8363T>C (p.Leu2788Pro) 이형 접합성 돌연변이, GJB2 유전자c.109G>A (p.Val27Ile) 이형 접합성 돌연변이가 검출되었다. 가계도는 도 11에 도시된 바와 같다.
결과는 선별된 탈락 세포 검체가 병원성 돌연변이를 효과적으로 검출할 수 있고 양수 검체와 완전히 일치함을 보여준다. 검출 결과로부터 상기 가계의 병원성 원인과 병원성 돌연변이의 보유 상황을 발견할 수 있다.
실시예 8: 방법의 응용 사례---전체 게놈 DNA 복제 수 변이( CNV ) 검출
1. Phalanx Biotech사의 CytoOneArray 염색체 칩 및 이와 세트로 된 검출 키트를 사용하고, 비교 게놈 혼성화 기술의 원리(aCGH)에 따라 전체 게놈 DNA 복제 수 변이를 검출하였다.
실시예 2의 방법으로 선별된 영양막 세포를 실시예 4의 임산부의 자궁경부 탈락 세포에서 DNA를 추출하는 상기 방법으로 추출하고, 얻은 인간 게놈 DNA에 대해 단편화, 증폭 전처리를 수행하며, 증폭 및 PCR 산물 정제 후, 2가지 상이한 형광 염료로 표지하였다(정상 샘플은 Cy3으로 표지되어 녹색으로 나타나고, 환자 샘플은 Cy5로 표지되어 빨간색으로 나타남).
형광 산물을 정제한 후 칩에 주입하고, 칩을 세척한 후 스캐닝하여 결과를 얻었다.
2. 전체 게놈 DNA 복제 수 변이(CNV) 검출 결과
전체 염색체의 모식도는 도 12에 도시되고, 이상 염색체의 모식도는 도 13에 도시된다. 도 13에서 횡축은 염색체 영역의 모식도이고, 종축은 샘플과 표준 샘플 사이의 신호 비율(log2 ratio로 표시됨)이다. 염색체 복제 수에 현저한 차이가 있는 경우 상이한 색상으로 표시된다. 염색체가 증폭된 영역(Gain)은 파란색으로 표시되고, 염색체가 결실된 영역(Loss)은 빨간색으로 표시된다. 도면에서 검은색 선의 길이와 값은 각각 각 세그먼트(Segment)의 크기와 신호의 평균값을 나타낸다.
샘플에 이상이 하나가 검출되면, 22q11.21 결실이고, 이상 단편의 시작-종료 위치[UCSC hg19]는 arr22q11.21 (19006943_21461068)x1이며, 이상 단편의 크기는 2.454 Mb이다. 관련 질환 영역은 Pathogenic(병원성, ACMG 분류)이고, 이 영역의 이상은 TBX1, CRKL, GP1BB, SLC25A1, DGCR10, TSSK1A, GSC2, CLTCL1 등 106개의 ISCA 유전자를 포함한다. 이 영역의 이상은 22q11.2 recurrent (DGS/VCFS) region (includes TBX1)에 위치한다. 22q11.2 근위(A-D) 영역의 결실은 DiGeorge/Velocardioffacial (DGS/VCFS) 증후군과 관련이 있고, 임상 표현은 일반적으로 선천성 심장 질환, 심장 이상, 특징적인 얼굴 특징, DD/ID, 행동 문제, 면역 결핍 및 저칼슘혈증(PMID 25217958)이다. 이 영역의 이상은 22q11.2 recurrent region (central, B/C-D) (includes CRKL)에 위치하고, 이 영역의 결실로 인해 발생될 수 있는 임상 표현형은 기형 얼굴 특징, 성장 제한/저신장, 중추신경계 이상/발작, 발달 지연, 지적 장애, 골격 이상, 심혈관 결함, 비뇨생식계 이상 및 면역 결핍/재발 감염(PMID 25123976)을 포함한다.
결과는 상기 선별 세포 검체가염색체 구조 변이를 효과적으로 검출하고 상응한 돌연변이를 검출할 수 있음을 보여준다.
실시예 9: 미세유체 선별 칩을 기반으로 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 영양막 세포를 분리 및 스크리닝하는 방법과 자기 비드 방법의 비교
(가) 실험 샘플:
Kaipu Medical Laboratory에서 검출한 인간 유래 검체로부터 2개의 자궁경부 탈락 세포액 샘플을 얻었다.
(나) 자기 비드 방법에 의한 선별을 대조 실험으로 사용하고, 2가지 방법의 효과의 차이를 비교하였다.
본 발명의 방법은 실시예 2와 동일하다.
자기 비드 방법으로 영양막 세포를 선별하는 과정은 다음과 같다.
(1) 수집된 임산부 자궁경부 탈락 세포 보존액 검체를 5 min 동안 흔들어 균일하게 혼합하였다.
(2) 보존액을 꺼내 15 ml의 원심분리 튜브에 넣고, 보존액의 병에 3 ml의 세포 분리액을 넣고 흔들어 균일하게 혼합한 후 꺼내 15 ml의 원심분리 튜브에 넣었다.
(3) 3000 rpm에서 10 min 동안 원심분리하고, 상층액을 버렸다.
(4) 1 ml의 1ХPBST를 넣고, 균일하게 혼합한 후 1.5 ml의 EP 튜브로 옮기며, 3000 rpm에서 5 min 동안 원심분리한 후 상층액을 버렸다.
(5) 단계 4를 두 번 반복하였다.
(6) 200 μl의 0.5 %의 Triton X-100을 넣고, 균일하게 혼합한 후 실온에서 20 min 동안 투과시켰다.
(7) 단계 4를 세 번 반복하였다.
(8) 200 μl의 1차 항체를 넣고, 균일하게 혼합한 후, 4 ℃에서 밤새 두었다.
(9) 단계 4를 세 번 반복하였다.
(10) 200 μl의 2차 항체를 넣고, 균일하게 혼합한 후, 37 ℃에서 1 h 동안 반응시켰다.
(11) 단계 4를 세 번 반복한 후 200 μl의 완충액(DPBS+0.1%BSA+2mM EDTA)으로 재현탁하였다.
(12) 25 μl의 beads와 50 μl의 완충액을 충분히 균일하게 혼합한 후 600 g에서 10 min 동안 원심분리하여 상층액을 버리고, 25 μl의 완충액으로 재현탁한 후 (11)번째 단계의 혼합 용액에 넣었다.
(13) 2 ℃ ~ 8 ℃에서 20 min 분 동안 반응시켰다.
(14) 1 ml의 완충액을 넣고 균일하게 혼합하고, 마그네틱 프레임에서 2 min 동안 정치한 후, 상층액을 버렸다(비교를 위해 200 μl를 남김).
(15) 단계 (14)를 두 번 내지 세 번 반복하였다.
(16) 37 ℃에서 예열된 200 μl의 완충액을 넣고 재현탁한 후, 4 μl의 Release Buffer를 넣고 균일하게 혼합하였다.
(17) 실온에서 15 min 동안 피펫으로 5 ~ 10회 피펫팅하고, 마그네틱 프레임에서 2 min 동안 정치하여 상층액을 수집하였다.
(18) 200 μl의 완충액을 넣고, 5 ~ 10회 피펫팅하며, 마그네틱 프레임에서 2 min 동안 정치하여 상층액을 수집하였다.
(19) 단계 (18)을 세 번 반복하여 최종적으로 영양막 세포를 얻었다.
(다) 결과
선별하여 얻은 양성 세포를 Sunny RX50 형광 현미경으로 촬영하였으며, 도 14 내지 도 16에 도시된 바와 같이, 도 14는 본 발명의 방법에 의해 선별하여 얻은 양성 세포의 사진이고, 도 15는 본 발명의 방법에 따른 선별 전과 후의 양성 세포와 음성 세포의 비교 사진이며, 도 16은 자기 비드 방법으로 선별하여 얻은 양성 세포의 사진이고, 이들을 비교하여 알 수 있는 바, 2가지 방법으로 스크리닝된 세포 수의 크기는 현저한 차이가 있으므로, 본 발명의 방법은 자기 비드 방법보다 현저히 우수하며, 통계에 따르면 본 발명의 방법에 의해 선별하여 얻은 양성 세포의 수는 약 3000 ~ 13000개에 도달할 수 있다.
상술한 실시예는 본 발명의 몇 가지 실시형태를 나타낼 뿐이며, 그 설명은 구체적이고 상세하지만, 본 발명 특허의 범위에 대한 한정으로 이해해서는 아니된다. 당업자는 본 발명의 구상을 벗어나지 않고 다양한 변형 및 개선을 진행할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 보호범위에 속함에 유의해야 한다. 따라서, 본 발명 특허의 보호범위는 첨부된 특허청구범위를 기준으로 해야 한다.

Claims (9)

  1. 영양막 세포의 분리 방법으로서,
    자궁경부 탈락 세포액 샘플을 샘플 세포 현탁액으로 제조하는 단계 (1);
    샘플 세포 현탁액에 특이적 항체를 첨가하여 배양하는 단계 (2); 및
    유세포 분석기를 이용하여, 단계 (2)에서 배양된 세포 재현탁액에 대해 형광 표지 선별을 수행하여, 분리 및 정제된 태반 영양막 세포를 얻거나; 또는 미세유체 선별 칩을 이용하여, 단계 (2)에서 배양된 세포 재현탁액에 대해 형광 표지 미세유체 세포 선별을 수행하여, 분리 및 정제된 태반 영양막 세포를 얻는 단계 (3);
    을 포함하되,
    상기 특이적 항체는 영양막 세포 표면 또는 세포내에서 발현되는 특이적 항체에 대응되는 항체의 조합, 즉 HLA-G+CK7, HLA-G+CK18, HLA-G+β-HCG, CD31+HPL, MMP9+CD31, HLA-G+HPL, HLA-G+MMP9, HLA-G+CD31, HLA-G+P, CD31+P, HLA-G+CDH5, CD31+CDH5, CD31+CK7+HLA-G, HLA-G+CK18+CD31, HLA-G+β-HCG+CD31, CD31+HPL+HLA-G, MMP9+CD31+HLA-G, CD31+P+HLA-G 또는 HLA-G+CDH5+CD31의 특이적 항체의 조합인 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세유체 선별 칩은 기판 및 이와 합착된 커버판을 포함하고;
    상기 기판의 일측면에는 메인 유동 채널, 사이드 유동 채널 A 및 사이드 유동 채널 B가 구비되며, 2개의 사이드 유동 채널은 각각 메인 유동 채널의 좌측 및 우측의 두 단부에 근접하고;
    상기 기판의 다른 측면에는 C 입구, S 입구, N 출구 및 T 출구가 구비되며; 4개의 입구 및 출구는 모두 기판의 다른 측면으로 관통하여 유동 채널과 연통되고; C 입구의 위치는 메인 유동 채널의 좌측 단부에 대응되며, S 입구의 위치는 사이드 유동 채널 A의 단부에 대응되고, N 출구의 위치는 메인 유동 채널의 우측 단부에 대응되며, T 출구의 위치는 사이드 유동 채널 B의 단부에 대응되고;
    상기 메인 유동 채널 내에서 N 출구와 T 출구의 합류점에는 또한 편향 전극 장치가 구비되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    모든 메인 유동 채널, 사이드 유동 채널 A 및 사이드 유동 채널 B의 유동 채널 폭은 모두 1000 μm 이하이고, 깊이는 모두 500 μm 이하인 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    단계 (2)에서 1차 항체의 배양 조건은 4 ℃에서 30 ~ 90 min 동안 반응시키는 것이고; 2차 항체-형광 표지 복합체의 배양 조건은 2 ~ 8 ℃에서 20 min 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    단계 (2)의 구체적인 방법은,
    배양을 통해 1차 항체 및 2차 항체-형광 표지 복합체를 선후 단계별로 표적 항원에 특이적으로 연결하되, 중간에 세척 및 원심분리 기술을 사용하여 교차 오염을 방지하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    단계 (3)의 구체적인 방법은,
    배양된 세포 재현탁액을 미세유체 선별 칩의 C 입구로 통입시키고, 완충액을 S 입구로 통입시킨 다음, 미세유체 선별 칩을 세포 선별기에 놓고 선별 프로그램을 실행하며, 프로그램이 종료된 후, T 출구의 검체를 수집하여 선별된 영양막 세포를 얻는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    단계 (3)에서 세포 선별 액상 시스템은 0.2 % ~ 0.4 %의 Triton-X-100인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    단계 (1)에서 세포 현탁액의 최적의 시스템은 0.2 % ~ 0.4 %의 FBS를 함유한 1ХPBS인 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 인간 STR 검사, 인간 염색체 배수성 검출, 지중해 빈혈 유전자 검출, 난청 유전자 검출, 전장 엑솜 유전자 시퀀싱, 염색체 미세결실/중복 검출, 또는 염색체 구조 변이 검출의 제품을 구성함에 있어서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법의 응용.
KR1020227043777A 2021-05-20 2022-03-16 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 태반 영양막 세포를 분리하는 방법 KR102626620B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110549947.8A CN112980779B (zh) 2021-05-20 2021-05-20 一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法
CN202110549947.8 2021-05-20
PCT/CN2022/081234 WO2022242285A1 (zh) 2021-05-20 2022-03-16 一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230004915A true KR20230004915A (ko) 2023-01-06
KR102626620B1 KR102626620B1 (ko) 2024-01-17

Family

ID=76337075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227043777A KR102626620B1 (ko) 2021-05-20 2022-03-16 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 태반 영양막 세포를 분리하는 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11796443B2 (ko)
EP (1) EP4144834A4 (ko)
JP (1) JP7368642B2 (ko)
KR (1) KR102626620B1 (ko)
CN (1) CN112980779B (ko)
AU (1) AU2022277079A1 (ko)
BR (1) BR112022024743B1 (ko)
WO (1) WO2022242285A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112980779B (zh) 2021-05-20 2021-08-24 广州凯普医药科技有限公司 一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101726585A (zh) * 2009-11-30 2010-06-09 宁波普赛微流科技有限公司 一种基于微流控芯片的流式细胞仪
US20160090631A1 (en) * 2013-06-11 2016-03-31 James R. STELLING Method for detection of fetal abnormalities
CN111304153A (zh) * 2019-12-17 2020-06-19 广东凯普生物科技股份有限公司 一种分离滋养层细胞的方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0447424B1 (en) * 1988-12-06 1998-01-07 Flinders Technologies Pty. Ltd. Isolation of fetal cells from maternal blood to enable prenatal diagnosis
JPH07509136A (ja) * 1992-07-17 1995-10-12 バイシス，インク． インサイチュ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）・ハイブリダイゼーションのための母体血液中の胎児細胞の富化と同定
US5714325A (en) * 1993-09-24 1998-02-03 New England Medical Center Hospitals Prenatal diagnosis by isolation of fetal granulocytes from maternal blood
WO1996031604A1 (en) * 1995-04-07 1996-10-10 The Regents Of The University Of California Antibodies for the detection of hla-g
US20020045196A1 (en) * 2000-05-12 2002-04-18 Walt Mahoney Methods of isolating trophoblast cells from maternal blood
AUPR749901A0 (en) * 2001-09-06 2001-09-27 Monash University Method of identifying chromosomal abnormalities and prenatal diagnosis
US20050181429A1 (en) * 2003-04-03 2005-08-18 Monaliza Medical Ltd. Non-invasive prenatal genetic diagnosis using transcervical cells
US20040197832A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-07 Mor Research Applications Ltd. Non-invasive prenatal genetic diagnosis using transcervical cells
WO2005047532A1 (en) * 2003-11-17 2005-05-26 Gribbles Molecular Science Pty Ltd Improved method of performing genetic analyses on reproductive tract cell samples
US20070224597A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Biocept, Inc. Isolating fetal trophoblasts
DE102007019017A1 (de) * 2007-04-19 2009-01-22 Ldt Laser Display Technology Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Projizieren eines Bildes auf eine Projektionsfläche
ITTO20070307A1 (it) * 2007-05-04 2008-11-05 Silicon Biosystems Spa Metodo e dispositivo per la diagnosi prenatale non-invasiva
WO2010119001A1 (en) * 2009-04-14 2010-10-21 Institut Gustave Roussy Prostate cancer cell lines and their use in screening method
AU2010239131A1 (en) * 2009-04-21 2011-11-17 Genetic Technologies Limited Methods for obtaining fetal genetic material
RU2641595C2 (ru) * 2012-05-24 2018-01-18 Рарсель Способ проведения мульти-анализов редких клеток, экстрагированных или выделенных из биологических образцов фильтрацией
EP2909315B1 (en) * 2012-10-19 2019-05-01 Wayne State University Identification and analysis of fetal trophoblast cells in cervical mucus for prenatal diagnosis
CN103983794B (zh) * 2013-02-12 2016-06-15 李木 一种微流控芯片及一种微流控方法
CA3019953A1 (en) * 2016-04-06 2017-10-12 Wayne State University Isolation and analysis of fetal dna from extravillous trophoblast cells retrieved from the endocervical canal
CN107312747A (zh) * 2016-12-20 2017-11-03 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种免疫磁珠法分离胎盘滋养层细胞的方法
CN108265051B (zh) * 2016-12-30 2020-08-25 张婧 用于从母体捕获和分离胎儿细胞的无创方法和试剂盒
WO2019153032A1 (en) * 2018-02-07 2019-08-15 University Of South Australia Pre-natal cell isolation
CN108535228B (zh) * 2018-04-03 2020-12-25 德运康明(厦门)生物科技有限公司 一种从孕妇外周血中分离游离胎儿细胞的方法
TWI668423B (zh) * 2018-10-02 2019-08-11 吳宏偉 細胞分選方法及系統
CN110117571B (zh) * 2019-05-08 2023-01-31 南方医科大学南方医院 无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法
KR20220047929A (ko) * 2019-06-07 2022-04-19 아크에디 바이오테크 에이피에스 Facs를 사용하는 태아 세포의 분리
JP2022541031A (ja) * 2019-07-15 2022-09-21 メナリニ バイオマーカーズ シンガポール プライベート リミテッド 胎児細胞を単離、検出及び解析する組成物及び方法
CN111440696B (zh) * 2020-02-26 2023-02-24 德运康明(厦门)生物科技有限公司 胎儿细胞捕获模块、用于胎儿细胞捕获的微流控芯片，及它们的使用方法
CN112980779B (zh) 2021-05-20 2021-08-24 广州凯普医药科技有限公司 一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101726585A (zh) * 2009-11-30 2010-06-09 宁波普赛微流科技有限公司 一种基于微流控芯片的流式细胞仪
US20160090631A1 (en) * 2013-06-11 2016-03-31 James R. STELLING Method for detection of fetal abnormalities
CN111304153A (zh) * 2019-12-17 2020-06-19 广东凯普生物科技股份有限公司 一种分离滋养层细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP7368642B2 (ja) 2023-10-24
US20230228667A1 (en) 2023-07-20
US11796443B2 (en) 2023-10-24
WO2022242285A1 (zh) 2022-11-24
BR112022024743B1 (pt) 2024-03-05
EP4144834A4 (en) 2023-09-27
EP4144834A1 (en) 2023-03-08
KR102626620B1 (ko) 2024-01-17
CN112980779B (zh) 2021-08-24
AU2022277079A1 (en) 2023-01-19
BR112022024743A2 (ko) 2023-06-27
CN112980779A (zh) 2021-06-18
JP2023527246A (ja) 2023-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cheung et al. Prenatal diagnosis of sickle cell anaemia and thalassaemia by analysis of fetal cells in maternal blood
Hahn* et al. Current applications of single-cell PCR
Bianchi Fetal cells in the maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis.
KR101781147B1 (ko) 대립유전자, 게놈 및 전사체 검출을 위한 방법 및 유전자형 분석 패널
CN104745718B (zh) 一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法
US20230092810A1 (en) Fetal cell capture module and microfluidic chip for fetal cell capture and methods for using the same
JPH05501612A (ja) 胎児ｄｎａ単離および検出のための非侵入性方法
US20080254460A1 (en) Method of Fetal Cell Enrichment
Borgatti et al. New trends in non-invasive prenatal diagnosis: applications of dielectrophoresis-based Lab-on-a-chip platforms to the identification and manipulation of rare cells
KR102626620B1 (ko) 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 태반 영양막 세포를 분리하는 방법
CN106544411A (zh) 一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物y精子分型的方法
CN109371121A (zh) 一种用于产前诊断染色体异常的试剂盒
WO2005047532A1 (en) Improved method of performing genetic analyses on reproductive tract cell samples
Holzgreve et al. Fetal cells in cervical mucus and maternal blood
RU2808260C1 (ru) Способ отделения клеток плацентарного трофобласта от отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин
Al-Mufti et al. Distribution of fetal and embryonic hemoglobins in fetal erythroblasts enriched from maternal blood
Bianchi Progress in the genetic analysis of fetal cells circulating in maternal blood
CN110117571A (zh) 无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法
Chiu et al. Non-invasive prenatal diagnosis: on the horizon?
CN112662747A (zh) 检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型方法及引物
US9506936B2 (en) Non invasive method for prenatal diagnosis
US20170206310A1 (en) Noninvasive discrimination method and discrimination system of chromosomal heteroploidy of fetus
CN115807103B (zh) 36个红细胞血型系统基因全编码区序列同步检测基因分型方法、探针集及试剂盒
Yang et al. Prenatal diagnosis of trisomy 21 with fetal cells in maternal blood using comparative genomic hybridization
Di Renzo et al. Prenatal diagnosis of fetal abnormality using fetal cells in maternal circulation

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant