BR112022024743B1 - Método para isolar células trofoblásticas placentárias a partir de células esfoliadas cervicais de mulheres grávidas - Google Patents
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Abstract
método para isolar células trofoblásticas placentárias a partir de células esfoliadas cervicais de mulheres grávidas. a presente invenção divulga um método para isolar células trofoblásticas placentárias a partir de células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida. baseado em um antígeno específico ou combinação expressa na superfície ou dentro das células trofoblásticas específicas, o chip de separação microfluídica designado ou citômetro de fluxo é usado no método para realizar separação celular de uma suspensão celular de uma amostra de trofoblastos placentários, assim, obtendo células trofoblásticas placentárias isoladas e purificadas. comparado aos métodos convencionais, o método da presente invenção possui as vantagens de obter amostras de modo não invasivo e boa especificidade. além disso, o método causa baixo risco de infecção e aborto, permite tempo de amostragem precoce e pode obter a marcação síncrona de uma pluralidade de antígenos, bem como identificação e separação de sinais de fluorescência característica; e o método melhorou muito a precisão e maior confiabilidade e área de cobertura mais ampla dos resultados de detecção. além disso, comparado às tecnologias de esferas imunomagnéticas e outras, o método pode obter as vantagens de quantidade e qualidade de células, e o número de células obtidas é maior do que em outras tecnologias, e bom na especificidade e sensibilidade. portanto, o método possui excelentes valores de aplicação e, com isso, pode ser aplicado em muitas finalidades de detecção e cenários de aplicação.
Description
[0001] A presente invenção pertence ao campo técnico de separação de células. Mais especificamente, a presente invenção diz respeito a um método para isolar células trofoblásticas placentárias a partir de células esfoliadas de uma mulher grávida.
[0002] O sistema de prevenção e controle de três níveis (pré-gestação, pré-natal e recém-nascido) é um dos meios importantes para reduzir defeitos de nascimento e melhorar a qualidade populacional na China, dentro os quais a separação e diagnóstico pré-natal são uma das partes mais complexas e difíceis.
[0003] Atualmente, existem várias desvantagens nas tecnologias diagnósticas de pré-natal clinicamente usadas, tais como amnionocentese ou cordocentese, e métodos de separação pré-natal não invasivos como sequenciamento de ácido nucleicos fetais livres. A amnionocentese e cordocentese possuem riscos altos de infecção durante a amostragem e aborto, período de análise longo, itens de detecção limitados e variação. Além disso, o tempo de diagnóstico é limitado dentro dos estágios médio e avançado de gravidez, mulheres grávidas possuem baixa aceitação a essas tecnologias e o tratamento clínico é difícil. A tecnologia de sequenciamento de ácidos nucleicos fetais livres possui variação de teste extremamente limitada e pode detectar apenas 3-5 aneuploides de cromossomo designados, sendo difícil evitar casos de falso positivo e falso negativo usando esse método. Além disso, a tecnologia possui capacidade insuficiente na detecção de mutações comuns e as diferenças individuais existem no conteúdo dos ácidos nucleicos fetais livres no sangue materno.
[0004] O requerente divulga um método para isolar células de trofoblasto no pedido de patente CN111304153A. Nesse método, determinando um antígeno específico na superfície de células trofoblásticas e usando esferas imunomagnéticas portadoras de anticorpo específico correspondente, as células trofoblásticas placentárias são isoladas a partir de uma suspensão celular de uma amostra trofoblástica placentárias e purificadas. Comparada à amnionocentese convencional e biópsia das vilosidades coriônicas, a tecnologia possui as vantagens de tempo de biópsia mais precoce não invasivo, baixo risco de infecção e aborto e confiabilidade similar dos resultados do teste. Por outro lado, a tecnologia ainda possui espaço para melhoria dos anticorpos aplicáveis cujas combinações divulgadas ainda são limitadas, em precisão e especificidade. A equipe do requerente realizou pesquisa e desenvolvimento contínuos para o projeto.
[0005] O objetivo da presente invenção é fornecer um método para isolar células trofoblásticas placentárias a partir de células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida na separação de citometria de fluxo ou microfluidos. A presente invenção não apenas soluciona os problemas e defeitos dos métodos convencionais, mas também consegue obter a marcação síncrona de uma pluralidade de antígenos, bem como identificação e separação de sinais de fluorescência característicos, simultaneamente; e o método melhorou muito a precisão e especificidade superiores à solução anterior de separação por esferas imunomagnéticas. Além disso, o método possui vantagens na melhoria da quantidade e qualidade de células. O número de células obtidas é maior do que nos métodos convencionais, com boas especificidade e sensibilidade.
[0006] Os objetivos acima da presente invenção são alcançados pelas seguintes soluções técnicas:
[0007] um método para isolar células trofoblásticas, incluindo as seguintes etapas: etapa (1) preparar uma suspensão de células de amostra a partir de uma amostra de suco de células esfoliadas cervicais; etapa (2) adicionar um anticorpo específico à suspensão de células de amostra para incubação;
[0008] o anticorpo específico é uma combinação de anticorpos correspondente ao(s) antígeno(s) específico(s) expressos na superfície ou dentro das células trofoblásticas; preferencialmente, a combinação de anticorpos específicos é uma combinação de HLA-G+CK7, HLA-G+CK18, HLA-G+β-HCG, CD31+HPL, MMP9+CD31, HLA-G+HPL, HLA-G+MMP9, HLA-G+CD31, HLA-G+P, CD31+P, HLA-G+CDH5, CD31+CDH5, CD31+CK7+HLA-G, HLA-G+CK18+CD31, HLA-G+β-HCG+CD31, CD31+HPL+HLA-G, MMP9+CD31+HLA-G, CD31+P+HLA-G ou HLA-G+CDH5+CD31; etapa (3) realizar a separação de uma ressuspensão de células incubadas na etapa (2) por um citômetro de fluxo para obter células trofoblásticas placentárias isoladas e purificadas;
[0009] alternativamente, realizar marcação por fluorescência a separação de células do microfluido de uma ressuspensão de células incubadas na etapa (2) por um chip de separação microfluidica para obter células trofoblásticas placentárias isoladas e purificadas.
[0010] Preferencialmente, o chip de separação microfluidica na etapa (3) possui a estrutura: incluindo um substrato e uma placa de tampa encaixada; o chip é fabricado pela tecnologia de moldagem por injeção a partir do material de base, incluindo, mas não limitado ao acrílico.
[0011] Um lado do substrato é provido de uma corrediça principal, uma corrediça lateral A e uma corrediça lateral B, e as duas corrediças laterais são fechadas nas porções de extremidade esquerda e direita da corrediça principal, correspondentemente.
[0012] Outro lado do substrato é provido de uma entrada C, uma entrada S, uma saída N e uma saída T; todas as duas entradas e as duas saídas penetram o substrato para comunicarem-se com as corrediças do outro lado; e uma posição da entrada C corresponde à porção de extremidade esquerda da corrediça principal; uma posição da entrada S corresponde à porção de extremidade da corrediça lateral A; uma posição da saída N corresponde à porção de extremidade direita da corrediça principal; e uma posição da saída T corresponde à porção de extremidade da corrediça lateral B.
[0013] Um dispositivo de eletrodo de defleção é adicionalmente disposto na corrediça principal e no local de convergência da saída N e da saída T.
[0014] Preferencialmente, corrediça principal, a corrediça lateral A e a corrediça lateral B possuem uma largura não superior a 1.000 μm e uma profundidade não superior a 500 μm.
[0015] Mais preferencialmente, a corrediça principal, a corrediça lateral A e a corrediça lateral B possuem uma largura de 500-1.000 μm.
[0016] Mais preferencialmente, a corrediça principal, a corrediça lateral A e a corrediça lateral B possuem uma largura de 1.000 μm.
[0017] No chip de separação microfluidica, a entrada C é usada para alimentar a amostra de células misturadas a ser separada; a entrada S é usada para alimentar uma solução de tampão; a saída T é usada para coletar células alvo e a saída N é usada para coletar células não-alvo.
[0018] Durante o processo de separação, a amostra misturada contendo as células alvo flui para a corrediça principal do chip a partir da entrada C, e a solução de tampão flui para a corrediça lateral a partir da entrada S; as duas são misturadas na interseção das corrediças e, em seguida, fluem continuamente ao longo da mesma direção da corrediça principal. Quando as células misturadas fluem através do dispositivo de eletrodo de defleção, a corrediça para a qual as células fluem é controlada pela função liga/desliga do eletrodo; as células alvo são separadas para atingir a saída T, enquanto as células não-alvo continuam a fluir ao longo da corrediça principal para atingir a saída N, concluindo assim a separação.
[0019] Além disso, preferencialmente, o anticorpo primário na etapa (2) é incubado nas seguintes condições: reage por 30 - 90 min a 4°C, (preferencialmente, reage por 60 min a 4°C); e um segundo complexo de marcação fluorescente de anticorpo é incubado nas seguintes condições: reage por 20 min a 2°C - 8°C.
[0020] Preferencialmente, a etapa (2) inclui, especificamente: sucessivamente e especificamente, ligar o anticorpo primário e o segundo complexo de marcação fluorescente de anticorpo a uma etapa de antígeno alvo, etapa por etapa, via incubação, em que uma tecnologia de separação de lavagem e centrífuga é usada para evitar a contaminação cruzada durante o processo de ligação.
[0021] Preferencialmente, a etapa (3) inclui, especificamente: alimentar a ressuspensão de células incubadas na entrada C do chip de separação microfluidica, alimentar a solução de tampão na entrada S, em seguida, colocar o chip de separação microfluidica em um separador de células para realizar o programa de separação, e coletar amostras na saída T na extremidade do programa de separação para obter células trofoblásticas separadas.
[0022] Preferencialmente, um sistema de separação de células de fase líquida na etapa (3) é 0,2% - 0,4% de Triton-X-100, (preferencialmente, 0,3% de Triton-X-100). Mais preferencialmente, PBS é usado para preparação.
[0023] Preferencialmente, as condições de separação do citômetro de fluxo na etapa (3) são as seguintes: uma taxa de carregamento de amostra é ajustada dentro de 1000 - 2000 eventos/s, e uma taxa de coleta é 5,0.
[0024] Preferencialmente, o sistema ideal da suspensão de células na etapa (1) é 1xPBS contendo 0,2% - 0,4% de FBS, (preferencialmente, 1xPBS contendo 0,3% de FBS).
[0025] Além disso, um pedido do método na construção de produtos para autenticação STR humana, detecção ploidal de cromossomos humanos, ensaio de gene da talassemia, ensaio de gene de epicofose, sequenciamento completo do exoma, microdeleção de cromossomo/detecção de duplicatas (um método de sequenciamento de alto rendimento) ou detecção de variação de estrutura cromossômica (um método de chip de alta densidade) também devem ser compatíveis com o escopo de proteção da presente invenção.
[0026] A presente invenção possui os seguintes efeitos benéficos:
[0027] Comparado à amnionocentese convencional e biópsia das vilosidades coriônicas, o método para isolar as células trofoblásticas placentárias baseado na separação de citometria de fluxo ou microfluidos fornecido pela presente invenção possui as vantagens de obter as amostras de modo não invasivo, tempo de amostragem precoce, baixo risco de infecção e aborto e o resultado do teste possui maior confiabilidade e área de abrangência mais ampla. As amostras completas de ácidos nucleicos do genoma do feto podem ser obtidas pelo referido tipo de amostra, que torna possível a detecção e análise de todas as doenças genéticas e, basicamente, obtém a abrangência de detecção de doenças genéticas (ploide cromossômico, CNV - variação da estrutura do cromossomo, mitocondria, microdeleção/duplicata, mutação de gene único, detecção de características genéticas SNP/STR e semelhantes).
[0028] O método da presente invenção pode obter células consideráveis (milhares de células, o padrão de controle de qualidade mínimo atribuído é maior do que 2.000 células positivas) e pode obter a detecção de amostra pela técnica de ensaio molecular convencional sem operações especiais. Além disso, o método da presente invenção não possui requisito restrito para técnicos e equipamentos laboratoriais, o que reduz as limitações técnicas e custos de uso e pode ser realizado em mais instituições médicas, capaz de ser popularizado em amplo alcance.
[0029] Entretanto, o método fornecido pela presente invenção é uma solução de separação multimarcação que pode obter a marcação síncrona de mais de uma pluralidade de antígenos, bem como identificação e separação de sinais fluorescentes característicos, simultaneamente, e a precisão tem sido muito melhorada. Comparado às esferas imunomagnéticas e outras tecnologias existentes, o método da presente invenção pode ter as vantagens de quantidade e qualidade de células. As células obtidas não são apenas numerosas, mas também possuem menor dano e as células obtidas possuem boa qualidade, boa especificidade e sensibilidade de detecção.
[0030] A Figura 1 é um diagrama esquemático mostrando uma estrutura de substrato de um chip de separação microfluidica; as figuras (a) e (b) representam, respectivamente, os dois lados do substrato;
[0031] A Figura 2 mostra uma população de células positivas marcadas por monofluorescência selecionada na separação de citometria de fluxo;
[0032] A Figura 3 mostra uma população de células positivas marcadas por bifluorescência selecionada na separação de citometria de fluxo;
[0033] A Figura 4 é um canal 1 marcado por FAM; “822-” representa as amostras restante após separação; “822+” representa as amostras separadas; “822” representa as amostras antes da separação;
[0034] A Figura 5 é um canal 2 marcado por HEX;
[0035] A Figura 6 é um canal 3 marcado por TAMRA;
[0036] A Figura 7 é um canal 4 marcado por ROX;
[0037] A Figura 8 é um diagrama esquemático mostrando um resultado de teste de Y-STR do cromossomo Y contendo a amostra nas células plasmoditrofoblásticas separadas;
[0038] A Figura 9 é um resultado de teste de gene da epicofose da amostra separada;
[0039] A Figura 10 é um resultado de teste de genes da talassemia da amostra separada;
[0040] A Figura 11 mostra um genograma de família portando as mutações patogênicas da família detectada;
[0041] A Figura 12 é um diagrama esquemático mostrando os cromossomos completos;
[0042] A Figura 13 é um diagrama esquemático mostrando os cromossomos anormais;
[0043] A Figura 14 é uma figura mostrando as células positivas separadas pelo método da presente invenção;
[0044] A Figura 15 é uma figura mostrando a comparação de células positivas e células negativas antes e após a separação usando o método da presente invenção.
[0045] A Figura 16 é uma figura mostrando as células positivas separadas pelo método de controle de esferas imunomagnéticas.
[0046] A presente invenção será adicionalmente descrita em combinação com as modalidades detalhadas da descrição, e as modalidades não são usadas para limitar a presente invenção de qualquer forma. Exceto se especificado de outra forma, o reagente, o método e o equipamento usado na presente invenção são reagentes, método e equipamento convencionais na técnica.
[0047] Exceto se especificado de outra forma, o reagente e material usados nos exemplos abaixo estão disponíveis no mercado.
[0048] Exemplo 1 Projeto de um chip de separação microfluidica
[0049] O diagrama esquemático do chip de separação microfluidica para isolar células trofoblásticas de células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida é mostrado na Figura 1.
[0050] A estrutura do chip de separação microfluidica é projetado e descrito abaixo: o chip é preparado pela inclusão, mas não limitado a um acrílico como um material de base; uma forma de tubo da Figura 1 foi formado de um lado do material de base através da tecnologia de moldagem por injeção, com a largura do tubo não superior a 1000 μm, e profundidade não superior a 500 μm, e outro lado do material de base é usado para colocação para formar um chip completo.
[0051] Especificamente, o chip de separação microfluidica inclui um substrato e uma placa de tampa encaixada.
[0052] Como mostrado na Figura 1, um lado do substrato é provido de uma corrediça principal, uma corrediça lateral A e uma corrediça lateral B, e as duas corrediças laterais são fechadas, respectivamente, nas porções de extremidade esquerda e direita da corrediça principal; e todas as corrediças possuem uma largura de 1.000 μm.
[0053] Outro lado do substrato é provido de uma entrada C (uma entrada de líquido para amostras de células), uma entrada S (uma entrada de líquido para solução de tampão), uma saída N (um orifício de armazenagem de líquido para células não-alvo) e uma saída T (um orifício de armazenagem de líquido para células alvo); todas as duas entradas e as duas saídas penetram o substrato para comunicarem-se com as corrediças; e uma posição da entrada C corresponde à porção de extremidade esquerda da corrediça principal; uma posição da entrada S corresponde à porção de extremidade da corrediça lateral A; uma posição da saída N corresponde à porção de extremidade direita da corrediça principal; e uma posição da saída T corresponde à porção de extremidade da corrediça lateral B.
[0054] A entrada C é usada para alimentar as amostras de células misturadas a serem separadas; a entrada S é usada para alimentar uma solução de tampão; a saída T é usada para coletar células alvo e a saída N é usada para coletar células não-alvo.
[0055] Além disso, a corrediça principal é provida adicionalmente de um dispositivo de eletrodo de defleção para separação de células; o dispositivo de eletrodo de defleção está localizado, especificamente, na interseção entre a saída N e a saída T; a função liga/desliga do eletrodo pode ser controlada de acordo com a presença de um sinal de célula de fluxo. Células carregadas negativamente são submetidas à defleção no campo eletromagnético formado pelos eletrodos para fluir até o tubo designado e chegando até a saída N ou saída T.
[0056] Durante o processo de separação, a amostra misturada contendo as células alvo flui para a corrediça principal do chip a partir da entrada C, e a solução de tampão flui para a corrediça lateral a partir da entrada S; as duas são misturadas na interseção das corrediças e, em seguida, fluem continuamente ao longo da mesma direção da corrediça principal. Quando as células misturadas fluem através do dispositivo de eletrodo de defleção, a corrediça para a qual as células fluem é controlada pela função liga/desliga do eletrodo; as células alvo são separadas para atingir a saída T, enquanto as células não-alvo continuam a atingir a saída N, concluindo assim a separação.
[0057] No final da separação, o chip é imediatamente descartado, e um novo chip deve ser trocado antes de cada separação para garantir um ambiente de separação limpo, controlável e livre de contaminação cruzada.
[0058] Exemplo 2 Isolamento entre células trofoblásticas e células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida baseado no chip de separação microfluidica
[0059] Um método para isolar células trofoblásticas incluindo as seguintes etapas:
[0060] etapa 1, uma suspensão de células da amostra a partir de uma amostra de suco de células cervicais esfoliadas; o método específico incluiu o seguinte, como mostrado na etapa (1) - etapa (5);
[0061] etapa 2, um anticorpo específico foi adicionado à suspensão de células da amostra para incubação; e o método específico incluiu o seguinte, como mostrado na etapa (6) - etapa (14);
[0062] etapa 3, marcação por fluorescência e separação de células por microfluidos foi realizada em uma ressuspensão incubada na etapa 2 pelo chip de separação microfluidica no Exemplo 1; o método específico incluiu o seguinte, como mostrado na etapa (15) - etapa (18).
[0063] As combinações dos anticorpos específicos são mostradas na Tabela 1: Tabela 1: Combinações de antígenos e anticorpos expressos nas células trofoblásticas
[0064] II. Especificamente, o método de classificação das células trofoblásticas inclui a seguintes etapas de:
[0065] etapa (1), uma solução de preservação de células (contendo as células esfoliadas cervicais) foi misturada em um misturador oscilante, uniformemente, por 5 min;
[0066] etapa (2), a solução de preservação foi transferida para um tubo centrífugo de 15 mL, e 3 mL de 1 xPBS foi adicionado ao frasco da solução de preservação, e misturado uniformemente por oscilação, em seguida, a solução foi transferida para o mesmo tubo centrífugo de 15 mL;
[0067] etapa (3), a solução foi centrifugada por 10 min a 3000 rpm, e o sobrenadante foi descartada;
[0068] etapa (4), 1 mL de 1 xPBST foi adicionado e bem misturado e transferido para um tubo EP de 1,5 mL, e centrifugado por 5 min a 3.000 rpm, e o sobrenadante foi descartado;
[0069] etapa (5), a etapa (4) foi repetida duas vezes para preparar uma suspensão de células;
[0070] etapa (6), 200 μL de Triton X-100 a 0,3% foi adicionado e bem misturado, em seguida, permeabilizado a temperatura ambiente por 20 min;
[0071] etapa (7), a etapa (4) foi repetida por três vezes;
[0072] etapa (8), adição de um anticorpo primário: 200 μL anticorpo monoclonal CK7 anti-humano de camundongo, anticorpo monoclonal CK18 anti-humano de camundongo, anticorpo monoclonal β-HCG anti-humano de camundongo, anticorpo monoclonal MMP9 anti-humano de camundongo, anticorpo monoclonal CDH5 anti-humano de camundongo, anticorpo monoclonal P anti-humano de camundongo, anticorpo monoclonal hPL anti-humano de camundongo, anticorpo monoclonal HLA-G anti-humano de coelho, e anticorpo monoclonal CD31 anti-humano de coelho (Abcam company) que foram diluídos em proporções foram, respectivamente, adicionados, e bem misturados, 60 min a 4°C;
[0073] etapa (9), a etapa (4) foi repetida por três vezes;
[0074] etapa (10), adição de um complexo de marcação fluorescente de anticorpo secundário: 200 μL de anticorpos anti-coelho de cabra e anti-camundongo de cabra que foram diluídos em proporções foram bem misturados, 60 min a 37°C;
[0075] etapa (11), a etapa (4) foi repetida por três vezes, e 200 μL de tampão (DPBS+0,1% de BSA+2 mM de EDTA) foi usado para ressuspensão;
[0076] etapa (12), a reação foi realizada por 20 min a 2°C - 8°C;
[0077] etapa (13), 1 mL de 1xPBST foi adicionado e bem misturado e transferido para um tubo EP de 1,5 mL, e centrifugado por 5 min a 3.000 rpm e o sobrenadante foi descartado;
[0078] etapa (14), a etapa (13) foi repetida por duas a três vezes, e 200 μL de IxPBST foi adicionado para ressuspensão para obter uma ressuspensão de células;
[0079] etapa (15), a ressuspensão de células obtida foi alimentada na entrada C do chip de separação microfluidica no Exemplo 1, e IxPBST foi alimentado na entrada S;
[0080] etapa (16), o chip de separação microfluidica foi colocado e fixado em uma mesa objetiva de um separador de células, e o separador de células foi ligado para ajustar o programa designado para operação;
[0081] etapa (17), no fim do programa, as amostras na saída T foram coletadas para obter as células trofoblásticas separadas;
[0082] etapa (18), as amostras na saída N foram coletadas para obter as células restantes obtidos após as células trofoblásticas serem removidas das células esfoliadas cervicais.
[0083] Exemplo 3 Método para isolar células trofoblásticas e células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida baseado em citometria de fluxo
[0084] Um método para separar células trofoblásticas incluindo as seguintes etapas:
[0085] etapa 1, uma suspensão de células da amostra a partir de uma amostra de suco de células cervicais esfoliadas; e o método específico foi o mesmo da etapa (1) - etapa (5) do Exemplo 2;
[0086] etapa 2, um anticorpo específico foi adicionado à suspensão de células da amostra para incubação; e o método específico foi o mesmo da etapa (6) - etapa (14) do Exemplo 2; combinações dos anticorpos específicos são as mesmas da Tabela 1 acima;
[0087] etapa 3, uma ressuspensão de células incubadas na etapa 2 foi submetida a marcação por fluorescência e separação por um citômetro de fluxo (BDFACSAria tipo II, USA), incluindo as etapas seguintes:
[0088] etapa 1), o citômetro de fluxo foi ligado para operação de inicialização diária de acordo com as instruções;
[0089] etapa 2), o instrumento foi submetido a ajuste de fluxo de líquido de modo que a posição do ponto de quebra do fluxo do líquido estivesse localizada na parte do meio-superior da janela;
[0090] etapa 3), o caminho do líquido de separação foi ajustado para confirmar o atraso das gotas de líquido, e a taxa de carregamento da amostra foi ajustada dentro de 1.000-2.000 eventos/s;
[0091] etapa 4), 5 mL de tubos de fluxo foram escolhidos como dispositivos de coleta; o número das células separadas foi 3.000, e a direção foi a esquerda, e a população de células a ser separada foi adicionada, e submetida a controle por portas, sucessivamente, em seguida, carregada nos tubos de coleta;
[0092] etapa 5), a suspensão de células incubadas foi colocada em um depósito de amostras, e uma taxa de coleta foi ajustada em 5,0 e o carregamento da amostra foi realizado;
[0093] etapa 6), a tensão foi ajustada dentro do escopo de 300 - 500 V de modo que a compensação entre os corantes fluorescentes foi mantida tão pequena quanto possível; a posição da porta foi ajustada de modo que as células positivas estivessem localizadas no centro, e as células dentro da porta foram coletadas; e as células no tubo de coleta foram as células alvo selecionadas.
[0094] A população de células alvo foi obtida de acordo com as combinações de marcação dadas, como mostrado nas Figuras 2-3. A Figura 2 mostra um resultado de separação de marcação por monofluorescência, e a Figura 3 mostra um resultado de separação de marcação por bifluorescência.
[0095] Exemplo 4 Caso de aplicação do método --- autenticação STR humana
[0096] 1. As células trofoblásticas foram separadas e isoladas de uma amostra (células esfoliadas cervicais) de acordo com o método do Exemplo 2 acima.
[0097] 2. As células trofoblásticas isoladas e células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida foram submetidas a extração de DNA:
[0098] 1) as células trofoblásticas separadas (as células trofoblásticas obtidas na etapa (17) do método de separação de células no Exemplo 2), e as células obtidas na etapa (18) do método de separação de células no Exemplo 2 (as células restantes obtidas após as células trofoblásticas foram removidas das células esfoliadas cervicais) foram, respectivamente, centrifugadas por 3 min a 12.000 rpm;
[0099] 2) o sobrenadante foi descartado, e 200 μL de solução P foram adicionados para ressuspender os precipitados;
[0100] 3) 20 μL de protease K e 200 μL de solução L foram adicionados e bem misturados;
[0101] 4) a solução misturada foi tratada em um banho quente a 56°C por 20 min e, virada e bem misturada;
[0102] 5) 200 μL de álcool etílico absoluto foram adicionados e bem misturados e, em seguida, a solução misturada foi transferida para uma coluna de absorção, e centrifugada a 10.000 rpm por 1 min, em seguida, a solução do resíduo no tubo de coleta foi descartada;
[0103] 6) 500 μL de W1 foram adicionados e centrifugados a 10.000 rpm por 1 min, em seguida, a solução do resíduo no tubo de coleta foi descartada;
[0104] 7) 500 μL de W2 foram adicionados e centrifugados a 10.000 rpm por 1 min, em seguida, a solução do resíduo no tubo de coleta foi descartada;
[0105] 8) 500 μL de W2 foram adicionados e centrifugados a 10.000 rpm por 1 min, em seguida, a solução do resíduo no tubo de coleta foi descartada;
[0106] 9) o tubo do branco foi centrifugado a 12000 rpm por 3 min, em seguida, o tubo de coleta foi descartado;
[0107] 10) a coluna de absorção foi colocada em um novo tubo centrífugo de 1,5 mL, descoberta e colocada em repouso por 2 min, em seguida, 50 μL de TE foi adicionado e centrifugado a 12.000 rpm por 2 min após repouso de 5 min, e a coluna de absorção foi descartada;
[0108] 11) a concentração e pureza do DNA extraído foi determinada.
[0109] 3. As células trofoblásticas isoladas e células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida foram submetidas a extração de DNA e, em seguida, submetidas à amplificação por PCR com kit de autenticação STR humana Microread D-21; os produtos do PCR foram submetidos a eletroforese capilar com um sequenciador de 3500xL, e o instrumento foi submetido a calibração fluorescente com Padrão G5-Matrix, e os Painéis e arquivos da lixeira correspondentes foram complicados, e o software GeneMapper ID versão 3.0 foi usado para análise dos resultados.
[0110] 4. Detecção STR
[0111] 1) amplificação por PCR, e o sistema de amplificação é mostrado na Tabela 2: Tabela 2: Sistema de amplificação por PCR
[0112] Procedimento de reação de PCR: A reação de PCR foi realizada por 10 min a 50°C e por 4 min a 96°C (5 seg a 94°C e 1 min + 10 seg a 60°C) x 27 ciclos, por 30 min a 60°C, e preservada a 15°C.
[0113] 2) Resultado do teste de STR
[0114] 8,7 μL de Hidi e 0,3 μL de referência interna foram bem misturados de acordo com as instruções, e adicionados com 1 mL de produto amplificado, em seguida, o produto de PCR foi submetido a eletroforese capilar com um sequenciador de 3500xL, e o instrumento foi submetido a calibração fluorescente com Padrão G5-Matrix, e os Painéis correspondentes e arquivos da lixeira foram compilados, e o software GeneMapper ID versão 3.0 foi usado para a análise dos resultados. Os resultados são mostrados nas Figuras 4-7. Os resultados mostram que além do DNA da mulher grávida, havia exatamente outras informações individuais do DNA, e as informações do DNA tinham uma forte relação com a mulher grávida.
[0115] 3) Detecção Y-STR
[0116] A amostra do cromossomo Y detectada no STR foi submetida a detecção Y-STR com um kit Microread 40Y. Os resultados são mostrados na Figura 8, e os resultados mostram que existe DNA masculino na amostra.
[0117] Exemplo 5 Caso de aplicação do método---detecção de genes suscetíveis a epicofose
[0118] Células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida (fonte da amostra: Guangzhou Hybribio Medical Laboratory) foram submetidas a ensaio de gene suscetível a epicofose com um kit comercial (um kit de gene suscetível a epicofose (PCR+fluxo-através de hibridização), Chaozhou Hybribio Biochemistry Co., Ltd., n° do certificado de registro de dispositivo médico da República Popular da China: 20153401698) de acordo com o método do Exemplo 2; especificamente, 9 sítios de mutação (mtDNA1494, mtDNA1555, SLC26A4-IVS7(-2), SLC26A4-2168, GJB2-35, GJB2-176, GJB2-235, GJB2-299 e GJB3-538) dos genes relacionados a epicofose (GJB2, GJB3, SLC26A4 e mtDNA) foram submetidos a testes.
[0119] O método de extração de DNA das células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida no Exemplo 4 foi usado e, em seguida, um kit comercial (kit de gene suscetível a epicofose (PCR+fluxo-através de hibridização), Chaozhou Hybribio Biochemistry Co., Ltd., certificado de registro de dispositivo médico da República Popular da China: 20153401698) foi usado para testes subsequentes. Operações específicas são mostradas especificamente nas instruções. Os dados brutos são mostrados na Figura 9; e a análise dos resultados é mostrada na Tabela 3. Tabela 3 Análise dos resultados de epicofose
[0120] Os resultados indicam que os resultados do teste são consistentes com os resultados do ensaio clínico.
[0121] Exemplo 6 Caso de aplicação do método---detecção de genes relacionados a talassemia
[0122] Células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida (fonte da amostra: amostras de ácidos nucleicos restantes da amostra humanizada detectada pela Hybribio Medical Laboratory) foram submetidas a ensaio de genes suscetíveis a epicofose com um kit comercial (kit de gene de α-talassemia e β-talassemia (PCR+ método de hibridização de membranas), Chaozhou Hybribio Biochemistry Co., Ltd., SFDA n° do certificado.: 3400399, 2012) de acordo com o método do Exemplo 2; especificamente, 3 tipos comuns de deleção de α-talassemia (--SEA, -α3.7, -α4.2), 2 tipos mutantes de α-talassemia (CS e QS) e 11 tipos mutantes de β-talassemia (CD14-15, CD17, CD27-28, CD41-42, CD43, CD71-72, -28, -29, IVS-I-1, IVS-II-654 e β EN) foram submetidos a testes.
[0123] O método de extração de DNA das células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida no Exemplo 4 foi usado e, em seguida, um kit comercial (kit de gene de α-talassemia e β-talassemia (PCR+ método de hibridização de membranas), Chaozhou Hybribio Biochemistry Co., Ltd., SFDA n° do certificado.: 3400399, 2012) foi usado para testes subsequentes. Operações específicas são mostradas especificamente nas instruções. Os dados brutos são mostrados na Figura 10; e a análise dos resultados é mostrada na Tabela 4. Tabela 4 Análise dos resultados de thalassemia
[0124] Os resultados indicam que os resultados do teste são consistentes com os resultados do ensaio clínico.
[0125] Exemplo 7 Caso de aplicação do método --- sequenciamento completo do exoma
[0126] 1. Amostra de células esfoliadas cervicais e amostra de fluido amniótico de uma mulher grávida foram obtidas em uma família com epicofose conhecida (pai, mãe (gravidez de 16 semanas), filho mais velho (filho surdo) e filho mais novo (filho surdo)) de acordo com o método no Exemplo 2. A mulher grávida e outros membros da família foram submetidos a coleta de amostra de sangue total e extração de DNA (depois que as células esfoliadas cervicais da mulher grávida foram separadas, a amostra foi obtida pelo método de extração do Exemplo 4; o fluido amniótico e as amostras de sangue total foram extraída por um kit de extração de DNA do genoma humano do sangue total (Hybribio, China) (fonte da amostra: amostra humanizada detectada pela Hybribio Medical Laboratory)); e o DNA do genoma humano obtido foi submetido a sequenciamento completo de genoma (WES) com um kit de exoma completo (iGeneTech Biotechnology (Pequim) Co., Ltd., n° do art.: T086V4):
[0127] O DNA do genoma foi processado em fragmentos de 300bp com uma transposase Tn5 para construir uma biblioteca do DNA; adaptadores P5, P7, índice 1, 2 foram adicionados em ambos os terminais; um comprimento adequado dos fragmentos de DNA foi escolhido, amplificado e purificado, em seguida, hibridizado com a biblioteca de sonda de éxon com biotina; a força de ligação forte da biotina com estreptavidina foi usada para ligar as esferas magnéticas portadores de estreptavidina com a sonda que foi ligada à biblioteca alvo; as esferas magnéticas foram absorvidas e as esferas magnéticas foram eluidas, e a biblioteca foi submetida à amplificação por PCR e avaliação de qualidade; e o sequenciamento em uma máquina foi realizado.
[0128] 2. Resultado do sequenciamento completo do exoma
[0129] O sequenciamento completo do exoma foi realizado com uma tecnologia de sequenciamento de alto rendimento, e o sítio patogênico detectado e sítio patogênico suspeito foi verificado com sequenciamento de Sanger. A amostra de teste foi uma amostra de fluido amniótico (gravidez de 16 semanas); dois irmãos eram surdos e os pais eram normais. Mutação heterozigoto CDH23 gene c.8363T>C (p.Leu2788Pro) e mutação heterozigoto GJB2 gene c.109G>A (p.Val27Ile) foram detectadas na amostra. O genograma familiar é mostrado na Figura 11.
[0130] Os resultados indicam que a mutação patogênica foi efetivamente detectada a partir da amostra de células esfoliadas separadas, que é completamente consistente com a amostra de fluido amniótico. Situações de patogênese e de portadores de mutação patogênica podem ser encontradas nos resultados dos testes.
[0131] Exemplo 8 Caso de aplicação do método---detecção de variação de número de cópias de DNA do genoma completo (CNV)
[0132] 1. A variação do número de cópias de DNA do genoma completo foi detectada com um chip de cromossomo CytoOneArray e um kit de suporte da Phalanx Biotech de acordo com a teoria (aCGH) de hibridização genômica comparativa:
[0133] as células trofoblásticas separadas pelo método do Exemplo 2 foram extraídas pelo método de extração de DNA das células esfoliadas cervicais da mulher grávida no Exemplo 4; o DNA do genoma humano obtido foi submetido à fragmentação, pré-tratamento de amplificação, amplificação e purificação do produto do PCR, em seguida, marcado por dois corantes fluorescentes diferentes (amostra normal foi marcada por Cy3, mostrando verde, e a amostra do paciente foi marcada por Cy5, mostrando vermelho);
[0134] o produto fluorescente foi vertido no chip após ser purificado, e o chip foi lavado e digitalizado para obter os resultados.
[0135] 2. Resultados do teste de variação de número de cópias de DNA do genoma completo (CNV)
[0136] O diagrama esquemático dos cromossomos completos é mostrado na Figura 12 e o diagrama esquemático dos cromossomos anormais é mostrado na Figura 13. Na Figura 13, o eixo horizontal representa o diagrama esquemático de uma zona de cromossomos, e o eixo longitudinal mostra uma razão de sinal da amostra para a amostra padrão (representada por uma razão log2). Quando o CNV do cromossomo possui uma diferença significativa, é representado por cores diferentes. A região (Ganho) onde o cromossomo é amplificado é representada por azul, e a região (Perda) onde o cromossomo é deletado é representada por vermelho. O comprimento e valor da linha preta representa, respectivamente, o tamanho da média e sinal de cada segmento.
[0137] Uma anormalidade é detectada na amostra, ou seja, deleção 22q11.21; e as posições início-fim [UCSC hg19] do fragmento anormal são arr22q11.21 (19006943_21461068)x1 com um tamanho de 2,454 Mb. A área da doença relacionada é patogênica (patogenicidade, classificação ACMG); e o referido fragmento anormal abrange os genes 106 ISCA, tais como TBX1, CRKL, GP1BB, SLC25A1, DGCR10, TSSK1A, GSC2 e CLTCL1. A anomalia regional está localizada na região (inclui TBX1) recorrente 22q11.2 (DGS/VCFS). A deleção da região proximal 22q11.2 (A-D) está relacionada à síndrome de DiGeorge / Velocardiofacial (DGS/VCFS) que é geralmente e clinicamente caracterizada por doença cardíaca congênita, anormalidade cardíaca, características faciais características, DD/ID, distúrbios do comportamento, imunodeficiência e hipocalcemia (PMID 25217958). A anomalia regional está localizada na região recorrente 22q11.2 (central, B/C-D) (inclui CRKL). Os fenótipos clínicos possivelmente causados pela deleção da região incluem: características faciais deformadas, restrição no crescimento/baixa estatura, anormalidade/ataque do sistema nervoso central, retardo no desenvolvimento, disgnosia, anomalias esqueléticas, defeitos cardiovasculares, anomalias do sistema urogenital, imunodeficiência/infeção repetida (PMID 25123976).
[0138] Os resultados indicam que a amostra de células separadas pode ser efetivamente submetida à detecção de variação de estruturam cromossômica e mutações correspondentes podem ser detectadas.
[0139] Exemplo 8 Comparação entre o método para isolar células trofoblásticas de células esfoliadas cervicais de uma mulher grávida baseado no chip de separação microfluidica e no método de esferas imunomagnéticas
[0140] (I) Amostra experimental:
[0141] Duas amostras de suco de células esfoliadas cervicais de uma amostra humanizada detectada pela Hybribio Medical Laboratory.
[0142] (II) A separação por esferas imunomagnéticas serviu como um experimento de controle para comparar as diferenças dos efeitos dos dois métodos.
[0143] O método da presente invenção foi o mesmo do Exemplo 2.
[0144] O processo para separar as células trofoblásticas por esferas imunomagnéticas inclui as seguintes etapas:
[0145] etapa (1) a amostra da célula esfoliada cervical coletada da mulher grávida foi bem misturada via oscilação por 5 min;
[0146] etapa (2), a solução de preservação foi transferida para um tubo centrífugo de 15 mL, e 3 mL de solução de separação de células foram adicionados ao frasco da solução de preservação, e misturado uniformemente por oscilação, em seguida, a solução restante foi transferida para o mesmo tubo centrífugo de 15 mL;
[0147] etapa (3), a solução foi centrifugada por 10 min a 3.000 rpm, e o sobrenadante foi descartado;
[0148] etapa (4) 1 mL de 1 xPBST foi adicionado e bem misturado e transferido para um tubo EP de 1,5 mL, e centrifugado por 5 min a 3.000 rpm, e o sobrenadante foi descartado;
[0149] etapa (5) a etapa (4) foi repetida duas vezes;
[0150] etapa (6), 200 μL de Triton X-100 a 0,5% foi adicionado e bem misturado, em seguida, permeabilizado a temperatura ambiente por 20 min;
[0151] etapa (7) etapa (4) foi repetida por três vezes;
[0152] etapa (8) 200 μl de anticorpo primário foi adicionado e bem misturado, incubando durante à noite a 4°C;
[0153] etapa (9) etapa (4) foi repetida por três vezes;
[0154] etapa (10) 200 μl de anticorpo secundário foi adicionado e bem misturado para reação por 1 h a 37°C;
[0155] etapa (11) a etapa (4) foi repetida por três vezes, e 200 μL de tampão (DPBS+0,1% de BSA+2 mM de EDTA) foi usado para ressuspensão;
[0156] etapa (12) 25 μl de esferas foram completamente misturados com 50 μl de poço de tampão, e 600 g foram centrifugados por 10 min, e o sobrenadante foi descartado, a solução restante foi ressuspensa com 25 μl de tampão, em seguida, adicionado à solução misturada na etapa (11);
[0157] etapa (13) a reação foi realizada por 20 min a 2°C-8°C;
[0158] etapa (14) 1 mL de tampão foi adicionado e bem misturado, em repouso em uma estrutura magnética por 2 min, em seguida, o sobrenadante foi descartado (200 μl foram preservados para comparação);
[0159] etapa (15) etapa (14) foi repetida por duas a três vezes;
[0160] etapa (16) 200 μl de tampão pré-aquecido a 37°C foi adicionado para ressuspensão, e 4 μl de Tampão de Liberação foi adicionado e bem misturado;
[0161] etapa (17) 15 min depois a temperatura ambiente, a solução foi pipetada por 5-10 vezes com uma pipeta de carregamento de amostra, repousando na estrutura magnética por 2 min, e o sobrenadante foi coletado;
[0162] etapa (18) 200 μl de tampão foi adicionado e pipetado por 5-10 vezes, repousando na estrutura magnética por 2 min, em seguida, o sobrenadante foi coletado;
[0163] etapa (19) a etapa (18) foi repetida três vezes para finalmente obter as células trofoblásticas.
[0164] (III) Resultado
[0165] As células positivas separadas foram submetidas à sessão fotográfica com um microscópio de fluorescência SUNNY RX50, como mostrado nas Figuras 14-16. A Figura 14 é uma figura mostrando as células positivas separadas pelo método da presente invenção; a Figura 15 é uma figura mostrando a comparação de células positivas e células negativas antes e após a separação pelo método da presente invenção; a Figura 16 é uma figura mostrando as células positivas separadas pelas esferas imunomagnéticas. Pode-se ver com clareza pela comparação que existe uma diferença óbvia na ordem de magnitudes da população de células após serem separadas pelos dois métodos; o método da presente invenção é significativamente superior às esferas imunomagnéticas. As estatísticas mostram que o número das células positivas separadas pelo método da presente invenção pode ser até cerca de 3.000-13.000.
[0166] Os exemplos descritos acima são apenas várias modalidades da presente invenção e, descritos mais especificamente, mas não podem ser interpretados como limitando o escopo da patente de invenção. Deve ser indicado que um versado na técnica pode realizar várias deformações e melhorias adicionais sem se afastar do conceito da presente invenção. Além disso, essas deformações e melhorias devem ser compatíveis com o escopo de proteção da presente invenção. Portanto, o escopo de proteção da presente invenção deve ser submetido às reivindicações anexas.
Claims (3)
1. Método para isolar células trofoblásticas, caracterizado pelo fato de que o método compreende as seguintes etapas: etapa (1) preparar uma suspensão de células de amostra a partir de uma solução que compreende células esfoliadas cervicais em tampão fosfato salino (PBS 1x) em que dito tampão fosfato salino contém 0,2%-0,4% de soro bovino fetal (FBS); etapa (2) adicionar um anticorpo específico que é uma combinação de anticorpos correspondente ao antígeno específico expressos na superfície ou dentro das células trofoblásticas, ou seja, uma combinação de anticorpos específicos é HLA-G+CK7, HLA-G+CK18, HLA-G+β-HCG, CD31+HPL, MMP9+CD31, HLA-G+HPL, HLA-G+MMP9, HLA-G+CD31, HLA-G+P, CD31+P, HLA-G+CDH5, CD31+CDH5, CD31+CK7+HLA-G, HLA- G+CK18+CD31, HLA-G+β-HCG+CD31, CD31+HPL+HLA-G, MMP9+CD31+HLA-G, CD31+P+HLA-G ou HLA-G+CDH5+CD31 à suspensão de células de amostra da etapa (1) para incubação, ; e em que as condições de incubação do anticorpos primários que são selecionados dentre anticorpo anti-CK7, anticorpo anti-CK18, anticorpo anti-β-HCG, anticorpo anti-MMP9, anticorpo anti-CDH5, anticorpo anti-P, anticorpo anti-hPL, anticorpo anti-HLA-G; e anticorpo anti-CD31, são: reação por 30-90 min a 4 °C; e as condições de incubação para a ligação do complexo anticorpo secundário-marcado fluorescentemente aos ditos anticorpos primários,: reação por 20 min a 2 °C - 8 °C; e etapa (3) realizar marcação por fluorescência e separação celular microfluídica de a ressuspensão de células incubadas na etapa (2) por um chip de separação celular microfluídica para obter células trofoblásticas placentárias isoladas e purificadas; em que a separação celular microfluídica é um sistema de separação de células em fase líquida que compreende 0,2%- 0,4% de Triton-X-100; em que o chip de separação celular microfluídica compreende um substrato e uma placa de tampa encaixada; em que um lado do substrato é provido de um canal principal, um canal lateral A e um canal lateral B, e os dois canais laterais estão, respectivamente, próximas às porções das extremidades esquerda e direita do canal principal; em que outro lado do substrato é provido de uma entrada C, uma entrada S, uma saída N e uma saída T; todas as duas entradas e as duas saídas penetram o substrato para comunicarem-se com os canais do outro lado; e uma posição da entrada C corresponde à porção de extremidade esquerda do canal principal; uma posição da entrada S corresponde à porção de extremidade do canal lateral A; uma posição da saída N corresponde à porção de extremidade direita do canal principal; e uma posição da saída T corresponde à porção de extremidade do canal lateral B; e em que o chip de separação celular microfluídica adicionalmente compreende um dispositivo de eletrodo de deflexão que está disposto no canal principal especificamente, na interseção entre a saída N e da saída T;e em que o canal principal, o canal lateral A e o canal lateral B possuem, cada um, respectivamente, uma largura não superior a 1.000 μm e uma profundidade não superior a 500 μm.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (2) compreende: sucessivamente e especificamente, ligar o anticorpo primário e o do complexo anticorpo secundário-marcado fluorescentemente a um antígeno específico expressado na superfície ou dentro das células trofoblásticas, etapa por etapa, via incubação, em que uma tecnologia lavagem e separação centrífuga é usada para evitar a contaminação cruzada durante o processo de ligação.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (3) compreende, especificamente: alimentar a ressuspensão de células incubadas na entrada C do chip de separação de células microfluídica, alimentar uma solução de tampão na entrada S, em seguida, colocar o chip de separação de células microfluídica em um separador de células para realizar o programa de separação, e coletar amostras na saída T no final do programa de separação para obter células trofoblásticas separadas.
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