RU2808260C1 - Способ отделения клеток плацентарного трофобласта от отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин - Google Patents
Способ отделения клеток плацентарного трофобласта от отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808260C1 RU2808260C1 RU2022132646A RU2022132646A RU2808260C1 RU 2808260 C1 RU2808260 C1 RU 2808260C1 RU 2022132646 A RU2022132646 A RU 2022132646A RU 2022132646 A RU2022132646 A RU 2022132646A RU 2808260 C1 RU2808260 C1 RU 2808260C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hla
- cells
- cell
- sorting
- sample
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 110
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 15
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 claims description 14
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 14
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 13
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 12
- 102100029761 Cadherin-5 Human genes 0.000 claims description 11
- 101000794587 Homo sapiens Cadherin-5 Proteins 0.000 claims description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 11
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 claims description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 10
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 6
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 claims description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims 13
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims 13
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 claims 3
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 claims 3
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims 2
- 208000036086 Chromosome Duplication Diseases 0.000 claims 1
- -1 HLA- G+CD31 Proteins 0.000 claims 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract description 4
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 102100023974 Keratin, type II cytoskeletal 7 Human genes 0.000 description 9
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 description 8
- 102000004576 Placental Lactogen Human genes 0.000 description 8
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 7
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 101000975502 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 7 Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108010070507 Keratin-7 Proteins 0.000 description 4
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 4
- 201000006288 alpha thalassemia Diseases 0.000 description 4
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 4
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 208000000398 DiGeorge Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 102100033421 Keratin, type I cytoskeletal 18 Human genes 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000007482 whole exome sequencing Methods 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010543 22q11.2 deletion syndrome Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100029375 Crk-like protein Human genes 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000919315 Homo sapiens Crk-like protein Proteins 0.000 description 2
- 101000984189 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000713590 Homo sapiens T-box transcription factor TBX1 Proteins 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 2
- 108010011942 LH Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000023108 LH Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100025584 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100025583 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102100036771 T-box transcription factor TBX1 Human genes 0.000 description 2
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000009609 prenatal screening Methods 0.000 description 2
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 2
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 description 1
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 1
- 102100034665 Clathrin heavy chain 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000002330 Congenital Heart Defects Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037156 Gap junction beta-2 protein Human genes 0.000 description 1
- 102100039397 Gap junction beta-3 protein Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101150034593 Gjb2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 102100038145 Homeobox protein goosecoid-2 Human genes 0.000 description 1
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000899442 Homo sapiens Cadherin-23 Proteins 0.000 description 1
- 101000946482 Homo sapiens Clathrin heavy chain 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000954092 Homo sapiens Gap junction beta-2 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000889136 Homo sapiens Gap junction beta-3 protein Proteins 0.000 description 1
- 101001032616 Homo sapiens Homeobox protein goosecoid-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000945331 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL4 Proteins 0.000 description 1
- 101000984190 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 1
- 101001116302 Homo sapiens Platelet endothelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 101001070786 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib beta chain Proteins 0.000 description 1
- 208000013038 Hypocalcemia Diseases 0.000 description 1
- 241000665848 Isca Species 0.000 description 1
- 102100033633 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL4 Human genes 0.000 description 1
- 108010017736 Leukocyte Immunoglobulin-like Receptor B1 Proteins 0.000 description 1
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005736 Nervous System Malformations Diseases 0.000 description 1
- 102100035278 Pendrin Human genes 0.000 description 1
- 101710204736 Platelet endothelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 102100034168 Platelet glycoprotein Ib beta chain Human genes 0.000 description 1
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 108091006703 SLC25A1 Proteins 0.000 description 1
- 108091006507 SLC26A4 Proteins 0.000 description 1
- 208000020221 Short stature Diseases 0.000 description 1
- 108010012306 Tn5 transposase Proteins 0.000 description 1
- 102100036216 Tricarboxylate transport protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 208000006038 Urogenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 102000008790 VE-cadherin Human genes 0.000 description 1
- 231100000871 behavioral problem Toxicity 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 108010018828 cadherin 5 Proteins 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000007555 cardiovascular defect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000004177 elastic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000000705 hypocalcaemia Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102220263438 rs1554454234 Human genes 0.000 description 1
- 102200145334 rs2274084 Human genes 0.000 description 1
- 102200145330 rs72474224 Human genes 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 231100001055 skeletal defect Toxicity 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000866 velocardiofacial syndrome Diseases 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, медицине и диагностике. Предложен способ отделения клеток плацентарного трофобласта от отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин с помощью микрожидкостного сортировочного чипа для получения отделенных и очищенных клеток плацентарного трофобласта. Способ имеет преимущества неинвазивного получения образцов и хорошей специфичности, позволяет брать образцы в ранние сроки, что приводит к низкому риску инфицирования и выкидыша, позволяет одновременно синхронно маркировать несколько антигенов, а также распознавать и сортировать характерные флуоресцентные сигналы, что значительно повышает точность, а результаты обнаружения имеют более высокую надежность и более широкий охват. Кроме того, данный способ имеет преимущество, заключающееся в учете количества и качества клеток. Способ можно применять для различных целей обнаружения и сценариев применения. 9 н. и 2 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 9 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области техники отделения клеток. Более конкретно, оно относится к способу отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин.
Уровень техники
Трехуровневая система предбеременной, пренатальной и неонатальной профилактики и контроля является одним из важных средств снижения врожденных дефектов и улучшения качества населения, среди которых наиболее сложным и трудным звеном является пренатальный скрининг и диагностика.
На данный момент амниоцентез или пункция пупочной вены, используемые для пренатальной диагностики, а также неинвазивные способы пренатального скрининга, такие как бесклеточное секвенирование нуклеиновых кислот плода, имеют различные недостатки; амниоцентез или пункция пупочной вены создают высокий риск инфекции и выкидыша, время анализа длительное, элементы и объем обнаружения ограничены, а время диагностики ограничивается вторым и третьим триместром беременности, приемлемость у беременных женщин низкая, что не способствует клиническому лечению. Диапазон обнаружения технологии бесклеточного секвенирования нуклеиновых кислот плода является чрезвычайно ограниченным, и можно обнаружить только 3-5 определенных хромосомных плоидий. Неизбежны ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Возможности выявления распространенных мутаций недостаточны, а также существуют такие проблемы, как индивидуальные различия в содержании свободных нуклеиновых кислот плода в материнской крови.
Патентная заявка заявителя CN111304153A раскрывает способ отделения клеток трофобласта. В этом способе клетки плацентарного трофобласта отделяют и очищают из клеточной суспензии образца плацентарного трофобласта путем определения специфических антигенов, экспрессируемых на поверхности клеток трофобласта, и с использованием технологии иммуномагнитных шариков с соответствующими специфическими антителами. По сравнению с традиционным амниоцентезом и пункцией ворсин хориона данный способ имеет преимущества неинвазивности, более раннего времени взятия пробы, более низкого риска инфекции и выкидыша, а результаты теста имеют аналогичную надежность. С другой стороны, есть еще возможности для совершенствования этой технологии. Описанные применимые комбинации антител ограничены, и необходимо улучшить точность и специфичность. Группа заявителей постоянно проводит исследования и разработки в рамках данного проекта.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является создание способа отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин, основанного на разделении проточной цитометрией или микрофлюидной технологии, который не только преодолевает проблемы и недостатки традиционных способов, но также одновременно реализует мечение, идентификацию и сортировку большего количества антигенов и характерных флуоресцентных сигналов, что значительно повышает точность, а специфичность лучше, чем у предыдущего способа иммуномагнитных шариков. Кроме того, способ имеет преимущество, заключающееся в том, что учитывается количество и качество клеток. Можно получить большое количество клеток с хорошей специфичностью и чувствительностью.
Вышеупомянутая цель настоящего изобретения достигается за счет следующих технических решений:
Способ отделения клеток трофобласта, включающий следующие этапы:
(1) Приготовить образец жидкости отслоившихся клеток шейки матки в виде клеточной суспензии образца;
(2) Добавить специфические антитела к клеточной суспензии образца для выполнения инкубации;
Специфическое антитело представляет собой комбинацию антител, соответствующую специфическим антигенам, экспрессированным на поверхности клеток трофобласта или внутриклеточно; предпочтительно комбинация специфических антител представляет собой HLA-G+CK7, HLA-G+CK18, HLA-G+β-HCG, CD31+HPL, MMP9+CD31, HLA-G+HPL, HLA-G+MMP9, HLA-G+CD31, HLA-G+P, CD31+P, HLA-G+CDH5, CD31+CDH5, CD31+CK7+HLA-G, HLA-G+CK18+CD31, HLA-G+β-HCG+CD31, CD31+HPL+HLA-G, MMP9+CD31+HLA-G, CD31+P+HLA-G или HLA-G+CDH5+CD31;
(3) Использовать проточный цитометр для сортировки клеточной ресуспендированной жидкости, инкубированной на этапе (2), для получения отделенных и очищенных клеток плацентарного трофобласта;
либо с помощью микрожидкостного сортировочного чипа клеточную ресуспендированную жидкость, инкубированную на этапе (2), подвергнуть сортировке микрожидкостных клеток с флуоресцентным мечением, чтобы получить отделенные и очищенные клетки плацентарного трофобласта.
Предпочтительно структура микрожидкостного сортировочного чипа, используемого на этапе (3), является следующей: включает подложку и прикрепленную к ней крышку; выбран, помимо прочего, акрил, в качестве основного материала, изготавливаемого по технологии литья под давлением;
Одна сторона подложки снабжена основным каналом, боковым каналом А и боковым каналом В, при этом два боковых канала соответствуют левому и правому концам вблизи основного канала соответственно;
Другая сторона подложки снабжена входом C, входом S, выходом N и выходом T; все четыре отверстия проходят через другую сторону подложки и соединяются с каналами; при этом положение входа C соответствует левому концу основного канала, положение входа S соответствует концу бокового канала A, положение выхода N соответствует правому концу основного канала, а положение выхода T соответствует концу бокового канала B;
В основном канале, в месте стыка выхода Н и выхода Т, также расположено устройство отклоняющего электрода.
Предпочтительно ширина всех основных каналов, боковых каналов А и боковых каналов В составляет не более 1000 мкм, а глубина – не более чем 500 мкм.
Более предпочтительно, чтобы ширина всех основных каналов, бокового канала А и бокового канала В составляла 500-1000 мкм.
Более предпочтительно, чтобы ширина всех основных каналов, боковых каналов А и боковых каналов В составляла 1000 мкм.
В микрожидкостном сортировочном чипе вход C может быть направлен к образцу смешанных клеток для сортировки, вход S может быть направлен к буферному раствору, выход T предназначен для сбора целевых клеток, а выход N — для сбора нецелевых клеток.
В процессе сортировки смешанный образец, содержащий целевые клетки, поступает в основной канал чипа от входа C, а буферный раствор поступает в канал со стороны чипа на входе S. После смешивания на пересечении каналов оба продолжают течь в одном направлении вдоль основного канала. Когда смешанные клетки проходят через устройство отклоняющего электрода, канал, в который собираются поступать клетки, выбирается путем контролирования открытия и закрытия электродов; целевые клетки сортируются и достигают выхода T, в то время как нецелевые клетки продолжают достигать выхода N по основному каналу, и сортировка завершается.
Кроме того, предпочтительные условия инкубации первичных антител на этапе (2): реакция при 4°C в течение 30-90 мин, предпочтительно 4°C, 60 мин, а условия инкубации комплекса вторичных антител-флуоресцентных меток: реакция при 2°С-8°С в течение 20 мин.
Предпочтительно конкретный способ этапа (2) заключается в следующем: посредством инкубации комплекс первичных антител, вторичных антител-флуоресцентных меток последовательно специфически связывается с целевым антигеном, во избежание перекрестного загрязнения используются промежуточные способы промывки и центрифугирования.
Предпочтительно конкретный способ этапа (3) заключается в следующем: инкубированную клеточную ресуспендированную жидкость пропускают через вход С микрожидкостного сортировочного чипа и пропускают в буферный раствор через вход S; затем помещают микрожидкостный сортировочный чип в сортировщик клеток и запускают программу сортировки. После завершения программы собирают образцы из выхода Т для получения отсортированных клеток трофобласта.
Предпочтительно жидкофазная система для сортировки клеток на этапе (3) представляет собой 0,2%-0,4% Triton-X-100, предпочтительно 0,3% Triton-X-100. Более предпочтительно с использованием PBS.
Предпочтительно условия для сортировки с помощью проточного цитометра на этапе (3): регулирование скорости загрузки образца на уровне 1000-2000 событий/секунда и коэффициента сбора – 5,0.
Предпочтительно оптимальной системой клеточной суспензии на этапе (1) является 1xPBS, содержащий 0,2%-0,4% FBS, предпочтительно 1xPBS, содержащий 0,3% FBS.
Кроме того, способ используется в конструировании продуктов для идентификации STR человека, обнаружения плоидности хромосом человека, обнаружения гена талассемии, обнаружения гена глухоты, секвенирования всего экзомного гена, обнаружения микроделеций/дупликаций хромосом (способ высокопроизводительного секвенирования) или обнаружения структурных вариаций хромосом (способ чипов высокой плотности), а также должен подпадать под объем защиты настоящего изобретения.
Настоящее изобретение имеет следующие положительные эффекты:
По сравнению с традиционным амниоцентезом и пункцией ворсин хориона способ отделения клеток плацентарного трофобласта, основанный на проточной цитометрии или микрофлюидной технологии, предлагаемый настоящим изобретением, имеет преимущества неинвазивного сбора образцов, более раннего времени взятия пробы, низкого риска инфицирования и выкидыша, а результаты тестирования, в свою очередь, имеют более высокую надежность и более широкий охват. С помощью данного типа образцов можно получить полный образец нуклеиновой кислоты генома плода, что позволяет обнаруживать и анализировать все наследственные заболевания и, в основном, реализовать охват обнаружения генетических заболеваний (от хромосомной плоидности, структурных вариаций хромосом CNV, митохондрий, микроделеций/дупликаций, мутаций одного гена, теста генетических характеристик SNP/STR и т. д.).
Способ по настоящему изобретению позволяет получить значительное количество клеток (тысячи клеток, а минимальный стандарт контроля качества составляет >2000 положительных клеток) и реализовать использование обычной технологии молекулярного тестирования для контроля образцов без специальных операций. Требования к техническим специалистам и лабораторному оборудованию не высоки, что снижает технический порог и стоимость использования, его можно проводить в большем количестве медицинских учреждений и широко распространять.
В то же время способ, предлагаемый изобретением, представляет собой схему скрининга, которая может быть основана на параллельном использовании нескольких меток, что позволяет реализовать синхронное мечение большего количества антигенов, а также распознавание и сортировку характерных флуоресцентных сигналов одновременно, при этом точность значительно повышается. По сравнению с существующим методом магнитных шариков и другими технологиями способ имеет преимущество, заключающееся в том, что учитывается количество и качество клеток. Полученные клетки не только многочисленны, но также имеют мало клеточных повреждений. Полученные клетки имеют отличное качество, хорошую специфичность обнаружения и чувствительность.
Описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой схематическую диаграмму структуры подложки микрожидкостного сортировочного чипа, на фиг.(a) и (b) показаны две стороны подложки соответственно.
На фиг. 2 показана популяция клеток с положительной флуоресцентной меткой, выбранная при сортировке с помощью проточной цитометрии.
На фиг. 3 показана популяция клеток с двойной флуоресцентной меткой, выбранная при сортировке с помощью проточной цитометрии.
На фиг. 4 показан канал 1, отмеченный FAM, «822-» – оставшиеся образцы после сортировки, «822+» – отсортированные образцы, а «822» – образцы до сортировки.
На фиг. 5 показан канал 2 с маркировкой HEX.
На рис. 6 показан канал 3 с маркировкой TAMRA.
На рис. 7 показан канал 4 с маркировкой ROX.
Фиг. 8 представляет собой схематическую диаграмму результатов обнаружения Y-STR на образцах, содержащих Y-хромосомы в отсортированных клетках синцитиотрофобласта.
На фиг. 9 представлены результаты обнаружения гена глухоты отсортированных образцов.
На фиг. 10 представлены результаты обнаружения гена талассемии отсортированных образцов.
На фиг. 11 представлена родословная карта выявления носителей патогенных мутаций в семьях.
Фиг. 12 представляет собой схематическую диаграмму всех хромосом.
Фиг. 13 представляет собой схематическую диаграмму аномальных хромосом.
Фиг.14 представляет собой фотографию положительных клеток, отсортированных по способу настоящего изобретения.
Фиг.15 представляет собой сравнительную фотографию положительных и отрицательных клеток до и после сортировки по способу настоящего изобретения.
Фиг. 16 представляет собой фотографию положительных клеток, отсортированных способом контрольных магнитных шариков.
Конкретные способы осуществления
Изобретение дополнительно описано ниже в сочетании с конкретными вариантами осуществления, однако варианты осуществления ни в какой форме не ограничивают настоящее изобретение. Если не указано иное, реагенты, способы и оборудование, используемые в настоящем изобретении, являются обычными реагентами, способами и оборудованием в области техники.
Если не указано иное, реагенты и материалы, используемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными.
Пример осуществления 1. Конструкция микрожидкостного сортировочного чипа.
Схематическая диаграмма микрожидкостного сортировочного чипа, используемого для отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин, показана на фиг. 1.
Конструктивный дизайн микрожидкостного сортировочного чипа описывается следующим образом: в качестве основного материала чипа, помимо прочего, выбран акрил, а форма трубы, представленная на фиг. 1, формируется на одной стороне подложки с помощью технологии литья под давлением. Ширина трубы не должна превышать 1000 мкм, а глубина не должна быть более 500 мкм, при этом другая сторона подложки должна использоваться для склеивания, чтобы сформировать цельный чип.
В частности, микрожидкостный сортировочный чип включает в себя подложку и прикрепленную к ней крышку;
Как показано на фиг. 1, одна сторона подложки снабжена основным каналом, боковым каналом А и боковым каналом В, при этом два боковых канала расположены вблизи левого и правого конца основного канала соответственно; ширина всех каналов составляет 1000 мкм;
Другая сторона подложки снабжена входом C (входное отверстие для образца клеток), входом S (входное отверстие буферного раствора), выходом N (отверстие для хранения нецелевых клеток) и выходом T (отверстие для хранения целевых клеток). Все четыре отверстия проходят через другую сторону подложки и соединяются с каналами, при этом положение входа С соответствует левому концу основного канала, положение входа S соответствует концу А бокового канала, положение выхода N соответствует правому концу основного канала, а положение выхода T соответствует концу бокового канала B;
Вход C может быть направлен к образцу смешанных клеток для сортировки, вход S может быть направлен к буферному раствору, выход T предназначен для сбора целевых клеток, а выход N — для сбора нецелевых клеток.
Кроме того, основной канал также снабжен устройством отклоняющего электрода для сортировки клеток, а конкретное положение устройства отклоняющего электрода находится в месте стыка выхода N и выхода T; электроды можно включать и выключать в зависимости от наличия или отсутствия сигналов проточной кюветы. Отрицательно заряженные клетки отклоняются в электромагнитном поле, создаваемом электродами, и попадают в обозначенные каналы, ведущие либо к выходу N, либо к выходу T.
В процессе сортировки смешанный образец, содержащий целевые клетки, поступает в основной канал чипа от входа C, а буферный раствор поступает в канал со стороны чипа на входе S. После смешивания на пересечении каналов оба продолжают течь в одном направлении вдоль основного канала. Когда смешанные клетки проходят через устройство отклоняющего электрода, канал, в который собираются поступать клетки, выбирается путем контролирования открытия и закрытия электродов; целевые клетки сортируются и достигают выхода T, в то время как нецелевые клетки продолжают достигать выхода N по основному каналу, и сортировка завершается.
После сортировки чип сразу выбрасывается. Перед каждой сортировкой чип необходимо заменять, чтобы убедиться, что среда сортировки чистая, контролируемая и свободная от перекрестного загрязнения.
Пример осуществления 2. Отделение и скрининг клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин на основе микрожидкостных сортирующих чипов.
1. Способ сортировки клеток трофобласта включает следующие этапы:
1. Приготовить образец жидкости отслоившихся клеток шейки матки в виде клеточной суспензии образца, конкретные способы включают (1)-(5) ниже;
2. Добавить специфические антитела к клеточной суспензии образца для выполнения инкубации; конкретные способы включают (6)-(14) ниже;
3. С помощью микрожидкостного сортировочного чипа из примера осуществления 1, клеточную ресуспендированную жидкость, инкубированную на этапе 2, подвергнуть сортировке микрожидкостных клеток с флуоресцентным мечением, конкретные способы включают (15)-(18) ниже.
Среди них комбинация специфических антител представлена в таблице 1:
Таблица 1: Комбинации антигенов и антител, экспрессированных на клетках трофобласта
Комбинация антител | HLA-G+CK7, HLA-G+CK18, HLA-G+β-HCG, CD31+HPL, MMP9+CD31, HLA-G+HPL, HLA-G+MMP9, HLA-G+CD31, HLA-G+P, CD31+P, HLA-G+CDH5, CD31+CDH5, CD31+CK7+HLA-G, HLA-G+CK18+CD31, HLA-G+β-HCG+CD31, CD31+HPL+HLA-G, MMP9+CD31+HLA-G, CD31+P+HLA-G, HLA-G+CDH5+CD31 | |
Информация о соответствующем антигене представлена ниже: | ||
Специфический антиген поверхности клеток трофобласта | Соответствующий рецептор | Доступные моноклональные антитела |
HLA-G (человеческий лейкоцитарный антиген G) | LIR1/ILT2, LIR2/ILT4, p49/KIR2DL4, BY55 |
4H84(BD Biosciences) |
β-HCG (хорионический гонадотропин человека) | Рецептор LH/HCG | 5H4-E2 (Thermo Scientific) |
Cytokeratin7 (Цитокератин 7, СК-7) | OV-TL 12/30 (DAKO), Мышиное моноклональное антитело против человеческого цитокератина 7 (CK-7) | |
Cytokeratin18 (Цитокератин 18, СК-18) | Мышиное моноклональное антитело против человеческого CK18 (ab181597) (компания abcam) | |
Матриксные металлопротеиназы 9 (MMP9) | Коллагеновые, желатиновые и эластические волокна типа IV, V, VII, X | 4H3 (системы НИОКР) |
VE-кадгерин VE-Cadherin (CDH5) | 2158 (технология сотовой сигнализации) | |
Предшественник молекул адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов PECAM1 (CD31) | 89C2 (технология сотовой сигнализации) | |
Плацентарный лактоген человека (HPL) | Рецептор пролактина | |
Прогестерон (P) | Рецептор прогестерона (Progesterone receptor, PGR) |
2. В частности, способ сортировки клеток трофобласта включает следующие этапы:
(1) Смешать клеточный консервационный раствор (отслоившиеся клетки шейки матки) в шейкере в течение 5 минут;
(2) Извлечь консервационный раствор и поместить его в центрифужную пробирку на 15 мл, добавить 3 мл 1×PBS во флакон с консервационным раствором, встряхнуть и хорошо перемешать, извлечь и поместить в центрифужную пробирку на 15 мл;
(3) Центрифугировать при 3000 об/мин в течение 10 мин, удалить супернатант;
(4) Добавить 1 мл 1×PBST, хорошо перемешать и перенести в пробирку на 1,5 мл EP, центрифугировать при 3000 об/мин в течение 5 минут и удалить супернатант;
(5) Повторить этап 4 дважды, чтобы приготовить клеточную суспензию;
(6) Добавить 200 мкл 0,3% Triton X-100, хорошо перемешать и дать пермеабилизироваться при комнатной температуре в течение 20 минут;
(7) Повторить этап 4 три раза;
(8) Добавить первичные антитела: добавить мышиное моноклональное антитело против человеческого CK7, мышиное моноклональное антитело против человеческого CK18, мышиное моноклональное антитело против человеческого β-HCG, мышиное моноклональное антитело против человеческого MMP9, мышиное моноклональное антитело против человеческого CDH5, мышиное моноклональное антитело против человеческого P, мышиное моноклональное антитело против человеческого hPL, кроличье моноклональное антитело против человеческого HLA-G, кроличье моноклональное антитело против человеческого CD31 (компания abcam) 200 мкл, разведенные в соответствии с пропорцией, хорошо перемешать, инкубация 60 мин при 4°С;
(9) Повторить этап 4 три раза;
(10) Добавить комплекс вторичное антитело-флуоресцентная метка: добавить 200 мкл козьих антикроличьих и козьих антимышиных антител, разведенных в пропорции, после смешивания, инкубация 60 мин при 37°С;
(11) Повторить этап 4 три раза и ресуспендировать с 200 мкл буферного раствора (DPBS + 0,1% BSA + 2 мМ EDTA);
(12) 20-минутная реакция при 2°C-8°C;
(13) Добавить 1 мл 1×PBST, хорошо перемешать и перенести в пробирку на 1,5 мл EP, центрифугировать при 3000 об/мин в течение 5 минут и удалить супернатант;
(14) Повторить этап (13) два-три раза, добавить 200 мкл 1×PBST для ресуспендирования и получить клеточную ресуспендированную жидкость;
(15) Пропустить полученную клеточную ресуспендированную жидкость через вход C микрожидкостного сортировочного чипа из Примера 1 и пропустить 1×PBST через вход S;
(16) Поместить микрожидкостный чип на платформу сортировщика клеток, чтобы зафиксировать его, включить питание, установить указанную программу и запустить;
(17) После процедуры собрать образцы из выхода Т для получения отсортированных клеток трофобласта.
(18) Собрать образцы из выхода N, которые представляют собой оставшиеся клетки отслоившихся клеток шейки матки после удаления клеток трофобласта.
Пример осуществления 3 Способ отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин на основе проточной цитометрии
Способ сортировки клеток трофобласта включает следующие этапы:
1. Приготовить образец жидкости отслоившихся клеток шейки матки в виде клеточной суспензии образца, конкретный способ показан в (1)-(5) примера осуществления 2;
2. Добавить специфические антитела к клеточной суспензии образца для выполнения инкубации, конкретный способ показан в (6)-(14) примера осуществления 2; комбинация специфических антител представлена в Таблице 1 выше;
3. С помощью проточного цитометрического сортировщика (BDFACSAria II, США) выполнить сортировку клеток, ресуспендированных после инкубации на этапе 2, путем флуоресцентного мечения, включая следующие этапы:
1) Включить проточный цитометр и следовать инструкциям по ежедневному запуску;
2) Отрегулировать поток жидкости прибора так, чтобы точка излома потока жидкости находилась в средней и верхней части окна;
3) Отрегулировать путь сортировочной жидкости, подтвердить задержку капель и отрегулировать скорость загрузки образца до 1000-2000 событий/сек;
4) Выбрать проточную трубку объемом 5 мл в качестве устройства для сбора, выбрать 3000 для количества отсортированных клеток, направление слева, добавить популяцию клеток для сортировки, по очереди установить затворы и поместить в пробирку для сбора;
5) Поместить инкубированную клеточную суспензию в камеру для образцов, установить скорость сбора на 5,0 и загрузить образец;
6) Отрегулировать напряжение в диапазоне 300-500В, чтобы минимизировать компенсацию между флуоресцентными красителями, отрегулировать положение затворов так, чтобы положительные ячейки находились в центре, собрать ячейки в затворах; клетки в пробирке для сбора являются выбранными целевыми клетками.
Популяции целевых клеток получают в соответствии с заданной комбинацией маркеров, как показано на фиг. 2 и фиг. 3. Фиг. 2 представляет собой результат сортировки одинарных флуоресцентных меток, а фиг. 3 — результат сортировки двойных флуоресцентных меток.
Пример осуществления 4. Пример применения способа: идентификация STR человека.
1. В соответствии со способом примера 2 выше клетки трофобласта сортируют и отделяют для образца (отслоившиеся клетки шейки матки).
2. ДНК извлекают из отделенных клеток трофобласта и отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин:
1) Отсортированные клетки трофобласта (клетки трофобласта, полученные на этапе 17 сортировки клеток по способу примера осуществления 2) и клетки, полученные на этапе 18 сортировки клеток по способу примера осуществления 2 (оставшиеся клетки трофобласта, удаленные из отслоившихся клеток шейки матки) отделяют и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 3 мин.
2) Удалить супернатант и добавить 200 мкл раствора P, чтобы ресуспендировать осадок.
3) Добавить 20 мкл протеиназы К и 200 мкл раствора L и хорошо перемешать.
4) Инкубировать при 56°С в течение 20 мин, перевернуть и перемешать.
5) Добавить 200 мкл абсолютного этанола, хорошо перемешать, перенести на адсорбционную колонну, центрифугировать при 10 000 об/мин в течение 1 мин и слить отработанную жидкость в пробирку для сбора.
6) Добавить 500 мкл W1, центрифугировать при 10000 об/мин в течение 1 мин и слить отработанную жидкость в пробирку для сбора.
7) Добавить 500 мкл W2, центрифугировать при 10000 об/мин в течение 1 мин и слить отработанную жидкость в пробирку для сбора.
8) Добавить 500 мкл W2, центрифугировать при 10000 об/мин в течение 1 мин и удалить отработанную жидкость в пробирку для сбора.
9) Центрифугировать пустую пробирку при 12000 об/мин в течение 3 минут и выбросить пробирку для сбора.
10) Поместить адсорбционную колонну в новую центрифужную пробирку на 1,5 мл, откыть крышку и дать постоять 2 минуты, добавить 50 мкл ТЕ и после отстаивания в течение 5 минут центрифугировать при 12000 об/мин в течение 2 минут и выбросить колонну.
11) Определить концентрацию и чистоту извлеченной ДНК.
3. После извлечения ДНК из отделенных клеток трофобласта и отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин проводят ПЦР-амплификацию с помощью набора для идентификации человека STR Юэвэй D-21, продукты ПЦР анализируют методом капиллярного электрофореза с использованием секвенатора 3500xL, а для выполнения калибровки флуоресценции на приборе используют G5-Matrix Standard, в то же время были скомпилированы соответствующие файлы Panels и bins, а для анализа результатов используется программное обеспечение GeneMapper ID версии 3.0.
4. Выполнить обнаружение STR
1) ПЦР-амплификация, система амплификации, как показано в таблице 2:
Таблица 2: Система амплификации ПЦР
Реагент | Объем (мкл) |
2,5× Буферный раствор D | 10 |
5× СМЕСЬ праймеров | 5 |
Полимераза СМЕСЬ I | 0,55 |
ДНК | 1 |
H2O | до 25 |
Программа реакции ПЦР: 50°С, 10 мин, 96°С, 4 мин, (94°С, 5 с, 60°С, 1 мин 10 с)×27 циклов, 60°С, 30 мин, 15°С, хранение.
2) Результаты теста STR
В соответствии с инструкциями смешивали 8,7 мкл Hidi и 0,3 мкл внутреннего стандарта, добавили 1 мл амплифицированного продукта, с помощью секвенатора 3500xL провели анализ продукта ПЦР методом капиллярного электрофореза и с помощью G5-Matrix Standard выполнили калибровку флуоресценции на приборе, записали соответствующие файлы Panels и bins и использовали программное обеспечение GeneMapper ID версии 3.0 для анализа результатов. Результаты представлены на фиг. 4-7. Результаты показывают, что в дополнение к ДНК беременной женщины в образце действительно присутствует другая независимая индивидуальная информация о ДНК, и она имеет сильное родство с самой беременной женщиной.
3) Обнаружение Y-STR
Y-хромосома была обнаружена в образце STR с использованием набора Read Micro 40Y для обнаружения Y-STR. Результаты показаны на фиг. 8. Результаты показали, что в образце присутствует мужская ДНК.
Пример осуществления 5. Пример применения способа --- обнаружение гена предрасположенности к глухоте
Отслоившиеся клетки шейки матки беременных женщин с использованием способа, описанного в примере осуществления 2, и коммерческого набора реактивов (набор для обнаружения гена предрасположенности к глухоте (ПЦР + метод проточной гибридизации), Чаочжоу Кайпу Биокемикал Ко., Лтд., одобрение государственной аппаратуры 20153401698) подвергались тестированию на гены предрасположенности к глухоте, (источник образцов: Медицинская лаборатория Гуанчжоу Кайпу), в частности, было проведено обнаружение для 9 мутационных участков (GJB2, GJB3, SLC26A4 и mtDNA) генов, связанных с глухотой (mtDNA1494, mtDNA1555, SLC26A4-IVS7(-2), SLC26A4-2168, GJB2-35, GJB2-176, GJB2-235, GJB2-299, GJB3-538).
ДНК из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин в примере осуществления 4 экстрагировали способом, описанным выше, после чего проводили последующие испытания с помощью коммерческого набора реактивов (набор для обнаружения генов предрасположенности к глухоте (ПЦР + метод управляемой гибридизации), Чаочжоу Кайпу Биокемикал Ко., Лтд., одобрение государственной аппаратуры 20153401698). См. инструкции для конкретных операций. Исходные результаты представлены на фиг. 9, а анализ результатов приведен в таблице 3.
Таблица 3 Анализ результатов глухоты
155 M гомозиготные | 176 M гомозиготные | 235 М гомозиготные |
299 М гомозиготные | 1494 М гомозиготные | 1555 М гомозиготные |
7445 M гомозиготные | 538 М гомозиготные | 2168 М гомозиготные |
IVS- M гомозиготные | 1229 М гомозиготные | Нормальный образец |
Контрольный для сравнения | Контрольный для сравнения | Контрольный для сравнения |
Результаты показали, что результаты испытаний соответствовали результатам клинических испытаний.
Пример осуществления 6. Пример применения способа --- обнаружение генов, связанных с талассемией.
Используя метод, описанный в примере 2, и коммерческий набор (набор для обнаружения генов α- и β-талассемии (ПЦР+мембранная гибридизация), Чаочжоу Кайпу Биокемикал Ко., Лтд., государственное управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (стандарт) 2012 г. №3400399) проводилось выявление гена предрасположенности к глухоте на отслоившихся клетках шейки матки беременных женщин (источник образцов: оставшиеся образцы нуклеиновых кислот образцов человеческого происхождения, обнаруженные медицинской лабораторией Кайпу), в частности, было проведено обнаружение для 3 распространенных типов делеции α-талассемии (--SEA, -α3.7, -α4.2), 2 типов мутации α-талассемии (CS, QS) и 11 типов мутации β-талассемии (CD14-15, CD17, CD27-28, CD41-42, CD43, CD71-72, -28, -29, IVS-I-1, IVS-II-654, β EN)
ДНК из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин в примере осуществления 4 экстрагировали способом, описанным выше, после чего проводили последующие испытания с помощью коммерческого набора реактивов (набор для обнаружения генов α- и β-талассемии (метод ПЦР+мембранная гибридизация), Чаочжоу Кайпу Биокемикал Ко., Лтд., государственное управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (стандарт) 2012 г. №3400399). См. инструкции для конкретных операций. Исходные результаты представлены на фиг. 10, а анализ результатов приведен в таблице 4.
Таблица 4 Анализ результатов талассемии
Тип делеции Юго-Восточной Азии (--SEA/--SEA) | Правый тип делеции (-α4.2/αα) | QS мутантные гетерозиготные |
Левый тип делеции (-α4.2/αα) | 41-42М гетерозиготные | 17M гетерозиготные |
Нормальный образец | Нормальный образец | Правый тип делеции (-α3.7/-α3.7) |
Правый тип делеции (-α3.7/-α3.7) | Нормальный образец | Левый тип делеции (-α4.2/αα) |
Нормальный образец | Нормальный образец | 654M гетерозиготные |
Результаты показали, что результаты испытаний соответствовали результатам клинических испытаний.
Пример осуществления 7. Пример применения способа --- полное генетическое секвенирование экзома
1. В глухой семье (отец, мать (16 недель беременности)), старший сын (глухой ребенок), младший сын (глухой ребенок), согласно способу, описанному в примере осуществления 2, получают образцы отслоившихся клеток шейки матки и образцы амниотической жидкости у беременных женщин, а также образцы цельной крови, взятые у самих беременных женщин и других членов семьи, и экстрагируют ДНК (образцы отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин получают согласно способу экстракции, описанному в примере осуществления 4, а образцы амниотической жидкости и цельной крови извлекают с использованием набора для выделения геномной ДНК цельной крови человека (Кайпу Биокемикал, Китай) (источник образцов: образцы человеческого происхождения, обнаруженные медицинской лабораторией Кайпу), полученную геномную ДНК человека подвергают полному секвенированию экзома (WES) с помощью набора для полного обнаружения экзома человека (Айцзи Тайкан Биотекнолоджи (Пекин) Ко., Лтд., артикул № T086V4).
Геномную ДНК обрабатывают транспозазой Tn5 с получением фрагмента размером 300 п.н. для создания библиотеки ДНК, добавляют линкеры P5, P7, index1, 2 с обоих концов, фрагменты ДНК подходящей длины отбирают, амплифицируют и очищают, проводят гибридизацию с библиотекой экзоновых зондов с биотином; используя сильную связывающую способность биотина и стрептавидина, магнитные шарики со стрептавидином объединяют с зондами, которые связаны с целевой библиотекой; адсорбируют магнитные шарики, удаляют супернатант, элюируют ДНК на магнитных шариках и амплифицируют библиотеку с помощью ПЦР, после чего определяется качество библиотеки и выполняется секвенирование на компьютере.
2. Результаты полного секвенирования экзома
Технология высокопроизводительного секвенирования использовалась для полного обнаружения экзома, а секвенирование по Сэнгеру использовалось для проверки обнаруженных патогенных или подозреваемых патогенных участков. Образцы, представленные для исследования, представляли собой образцы амниотической жидкости на 16-й неделе беременности. Два брата были глухими и немыми, а их родители были без особенностей. В образце обнаружена гетерозиготная мутация гена CDH23 c.8363T>C (p.Leu2788Pro) и гетерозиготная мутация гена GJB2 c.109G>A (p.Val27Ile). Карта семьи представлена на фиг. 11.
Результаты показали, что с помощью отобранных образцов отслоившихся клеток можно эффективно выявлять патогенные мутации, что полностью соответствует образцам амниотической жидкости. По результатам анализов можно выяснить патогенную причину и носительство патогенной мутации в семье.
Пример осуществления 8. Пример применения способа --- обнаружение полногеномной вариации числа копий ДНК (CNV)
1. Полногеномная вариация числа копий ДНК была обнаружена в соответствии с принципом сравнительной геномной гибридизации (aCGH) с использованием хромосомного чипа CytoOneArray и вспомогательного набора для обнаружения Phalanx Biotech:
Клетки трофобласта, отсортированные по способу в примере осуществления 2, экстрагировали способом отделения ДНК в отслоившихся клетках шейки матки беременных женщин по примеру осуществления 4. Полученную геномную ДНК человека подвергали фрагментации, преамплификационной обработке, амплификации и очищали продуктами ПЦР, после чего метили двумя разными флуоресцентными красителями (нормальные образцы отмечены Cy3 зеленым цветом, а образцы пациентов отмечены Cy5 красным цветом);
Флуоресцентный продукт очищают и вводят в чип, после чего чип очищают и сканируют для получения результатов.
2. Результаты обнаружения полногеномной вариации числа копий ДНК (CNV)
Схематическая диаграмма всей хромосомы показана на фиг. 12, а схематическая диаграмма аномальной хромосомы показана на фиг. 13. На фиг. 13 горизонтальная ось представляет собой схематическую диаграмму хромосомной полосы, а вертикальная ось представляет собой отношение сигналов (выраженное log2 ratio) между образцом и стандартным образцом. Когда есть существенные различия в количестве копий хромосом, они выражаются разными цветами. Область хромосомной амплификации (Достижение) показана синим цветом, а область хромосомной делеции (Потеря) показана красным. Длина и значение черной линии на рисунке представляют размер каждого сегмента (Сегмент) и среднее значение сигнала соответственно.
В образце была обнаружена одна аномалия, представляющая собой делецию 22q11.21, начально-конечное положение аномального фрагмента [UCSC hg19] – arr22q11.21 (19006943 21461068)x1, а размер аномального фрагмента – 2,454 Mb. Соответствующая область заболевания является патогенной (патогенность, классификация ACMG), и эта аномалия охватывает 106 генов ISCA, таких как TBX1, CRKL, GP1BB, SLC25A1, DGCR10, TSSK1A, GSC2 и CLTCL1. Аномалия в этой области расположена в рекуррентной области 22q11.2 (DGS/VCFS) (включает TBX1). Делеция проксимальной (AD) области 22q11.2 связана с синдромом Ди Джорджи/велокардиофациального синдрома (DGS/VCFS), обычно с врожденным пороком сердца, сердечными аномалиями, характерными чертами лица, DD/ID, поведенческими проблемами, иммунодефицитом и гипокальциемией (PMID 25217958). Аномалия этой области находится в рекуррентной области 22q11.2 (центральная, B/C-D) (включает CRKL). К клиническим фенотипам, которые могут быть вызваны делецией этой области, относятся: аномальные черты лица, ограничение роста/низкий рост, аномалии центральной нервной системы/судороги, задержка роста, умственная отсталость, аномалии скелета, сердечно-сосудистые дефекты, аномалии мочеполовой системы и иммунодефицит/рецидивирующие инфекции (PMID 25123976).
Результаты показали, что отобранные образцы клеток могут эффективно обнаруживать структурные вариации хромосом и выявлять соответствующие мутации.
Пример осуществления 9. Сравнение способа отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин на основе микрожидкостного сортировочного чипа и способа магнитных шариков
(1) Экспериментальные образцы:
Были взяты два образца цервикальной отслоившейся клеточной жидкости из образцов человека, протестированных в медицинской лаборатории Кайпу.
(2) В качестве контрольного эксперимента для сравнения различий в эффектах двух способов использовался способ магнитных шариков.
Способ по настоящему изобретению такой же, как в примере осуществления 2.
Процесс сортировки клеток трофобласта способом магнитных шариков выглядит следующим образом:
(1) Встряхнуть и перемешать собранные образцы раствора для консервации отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин в течение 5 минут.
(2) Извлечь раствор для консервации и поместить его в центрифужную пробирку на 15 мл, добавить 3 мл раствора для разделения клеток во флакон с раствором для консервации, встряхнуть и хорошо перемешать, затем извлечь и поместить в центрифужную пробирку на 15 мл.
(3) Центрифугировать при 3000 об/мин в течение 10 мин и удалить супернатант.
(4) Добавить 1 мл 1×PBST, хорошо перемешать, перенести в 1,5-мл пробирку EP, центрифугировать при 3000 об/мин в течение 5 минут и удалить супернатант.
(5) Повторить этап 4 дважды.
(6) Добавить 200 мкл 0,5% Triton X-100, хорошо перемешать и дать пермеабилизироваться при комнатной температуре в течение 20 минут.
(7) Повторить этап 4 три раза.
(8) Добавить 200 мкл первичных антител, хорошо перемешать и оставить на ночь при 4°C.
(9) Повторить этап 4 три раза.
(10) Добавить 200 мкл вторичных антител, хорошо перемешать и провести реакцию при 37°C в течение 1 часа.
(11) Повторить шаг 4 три раза и ресуспендировать с 200 мкл буферного раствора (DPBS+0,1%BSA+2 мМ EDTA).
(12) Тщательно перемешать 25 мкл гранул и 50 мкл буферного раствора, отцентрифугировать при 600 g в течение 10 минут, удалить супернатант, ресуспендировать с 25 мкл буферного раствора и добавить его к смеси на этапе (11).
(13) 20-минутная реакция при 2°C-8°C.
(14) Добавить 1 мл буферного раствора и хорошо перемешать. После стояния на магнитной подставке в течение 2 минут удалить супернатант (оставить 200 мкл для сравнения).
(15) Повторить этап (14) два-три раза.
(16) Добавить 200 мкл предварительно нагретого до 37°C буферного раствора для ресуспендирования, добавить 4 мкл высвобождающего буферного раствора и хорошо перемешать.
(17) Через 15 минут при комнатной температуре пипетировать 5-10 раз с помощью пистолета для образцов, дать ему постоять на магнитной подставке в течение 2 минут и собрать супернатант.
(18) Добавить 200 мкл буферного раствора, пипетировать 5-10 раз, дать ему постоять на магнитной подставке в течение 2 минут и собрать супернатант.
(19) Повторить шаг (18) три раза, чтобы окончательно получить клетки трофобласта.
(3) Результаты
Положительные клетки, полученные в результате сортировки, были сфотографированы с помощью флуоресцентного микроскопа Sunny RX50, как показано на фиг. 14-16: фиг. 14 представляет собой фотографию положительных клеток, отсортированных по способу настоящего изобретения, а фиг. 15 представляет собой положительные клетки до и после сортировки по способу настоящего изобретения. Рисунок 16 представляет собой фотографию положительных клеток, полученных методом магнитной сортировки. Из сравнения ясно видно, что количество клеток, отсортированных двумя способами, значительно различается по порядку величины. Способ по настоящему изобретению значительно лучше, чем способ магнитных шариков. Статистические данные показывают, что количество отсортированных положительных клеток по способу настоящего изобретения может достигать примерно 3000-13000 кл.
Вышеупомянутые варианты осуществления представляют собой лишь несколько вариантов осуществления настоящего изобретения, и их описания являются более конкретными и подробными, однако их не следует рассматривать как ограничение объема патента на изобретение. Следует отметить, что для специалистов в данной области, не отступая от концепции настоящего изобретения, могут быть сделаны несколько модификаций и улучшений, которые входят в объем защиты настоящего изобретения. Таким образом, объем защиты патента на изобретение регулируется прилагаемой формулой изобретения.
Claims (22)
1. Микрожидкостный сортировочный чип для отделения клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин, включает подложку и прикрепленную к ней крышку; при этом
одна сторона подложки снабжена основным каналом, боковым каналом А и боковым каналом В, при этом два боковых канала расположены вблизи левого и правого конца основного канала соответственно и соединяются с ним; при этом ширина всех каналов составляет не более чем 1000 мкм, а глубина – не более чем 500 мкм; при этом
другая сторона подложки снабжена входным отверстием для образца клеток (входом C), входным отверстием буферного раствора (входом S), отверстием для хранения нецелевых клеток (выходом N) и отверстием для хранения целевых клеток (выходом T), при этом
все четыре отверстия проходят через другую сторону подложки и соединяются с каналами, при этом
положение входа С соответствует левому концу основного канала, положение входа S соответствует концу А бокового канала, положение выхода N соответствует правому концу основного канала, а положение выхода T соответствует концу бокового канала B, при этом
основной канал снабжен устройством отклоняющего электрода для сортировки клеток, а положение устройства отклоняющего электрода находится в месте стыка выхода N и выхода T; при этом
электроды выполнены с возможностью включения и выключения в зависимости от наличия или отсутствия сигналов проточной кюветы.
2. Способ отделения клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин посредством микрожидкостного сортировочного чипа по п. 1, который включает следующие этапы:
(1) приготавливают образец жидкости отслоившихся клеток шейки матки в виде клеточной суспензии образца; при этом системой клеточной суспензии является 1xPBS, содержащий 0,2%-0,4% FBS;
(2) добавляют специфические антитела к клеточной суспензии образца для выполнения инкубации; условия инкубации первичного антитела: реакция в течение 30-90 минут при 4°C; условия инкубации комплекса вторичных антител-флуоресцентных меток: реакция в течение 20 минут при 2°С - 8°С;
при этом специфические антитела представляют собой комбинацию: HLA-G+CK7, HLA-G+CK18, HLA-G+β -ХГЧ, CD31+HPL, MMP9+CD31, HLA-G+HPL, HLA-G+MMP9, HLA-G+CD31, HLA-G+P, CD31+P, HLA-G+CDH5, CD31+CDH5, CD31 +CK7+HLA-G, HLA-G+CK18+CD31, HLA-G+β-HCG+CD31, CD31+HPL+HLA-G, MMP9+CD31+HLA-G, CD31+P+HLA-G или HLA -G+CDH5+CD31; и
(3) с помощью микрожидкостного сортировочного чипа клеточную ресуспендированную жидкость, инкубированную на этапе (2), подвергают сортировке микрожидкостных клеток с флуоресцентным мечением для получения отделенных и очищенных клеток плацентарного трофобласта;
при этом жидкофазная система для сортировки клеток представляет собой 0,2%-0,4% Triton-X-100.
3. Способ по п.2, в котором на этапе (2): посредством инкубации указанный комплекс первичных антител, указанный комплекс вторичных антител-флуоресцентных меток последовательно специфически связывается с целевым антигеном, при этом во избежание перекрестного загрязнения используют промежуточные способы промывки и центрифугирования.
4. Способ по п.3, в котором на этапе (3): инкубированную клеточную ресуспендированную жидкость пропускают через вход С микрожидкостного сортировочного чипа и пропускают в буферный раствор через вход S; затем помещают микрожидкостный сортировочный чип в сортировщик клеток и запускают программу сортировки, после завершения программы собирают образцы из выхода Т для получения отсортированных клеток трофобласта.
5. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для идентификации коротких тандемных поворотов (short tandem repeats; STR) человека.
6. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для обнаружения плоидности хромосом человека.
7. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для тестирования гена талассемии.
8. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для тестирования гена глухоты.
9. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для секвенирования всего экзомного гена.
10. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для обнаружения микроделеций/дупликаций хромосом.
11. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для обнаружения структурных вариаций хромосом.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110549947.8 | 2021-05-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2808260C1 true RU2808260C1 (ru) | 2023-11-28 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111304153A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-06-19 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | 一种分离滋养层细胞的方法 |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111304153A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-06-19 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | 一种分离滋养层细胞的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
STROMBERG K. et al. Isolation of functional human trophoblast cells and their partial characterization in primary cell culture, In Vitro, 1978, vol. 14, pp. 631-638. MOSER G. et al. Trophoblast retrieval and isolation from the cervix: origins of cervical trophoblasts and their potential value for risk assessment of ongoing pregnancies, Hum Reprod Update, 2018, vol. 24, N. 4, pp. 484-496. МУСАТОВА Е.В. и др. Метод фильтрации для выделения трофобластов из образцов периферической крови с целью детекции анеуплоидий в единичных клетках плодного происхождения, Медицинская генетика, 2016, Т. 15, No. 1, 163, c. 38-42. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Cheung et al. | Prenatal diagnosis of sickle cell anaemia and thalassaemia by analysis of fetal cells in maternal blood | |
US7732143B2 (en) | Method for the diagnosis of genetic diseases by molecular combing and diagnostic kit | |
Hahn* et al. | Current applications of single-cell PCR | |
US20230092810A1 (en) | Fetal cell capture module and microfluidic chip for fetal cell capture and methods for using the same | |
US20070243549A1 (en) | Enrichment of circulating fetal dna | |
CN104745718B (zh) | 一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法 | |
US20080254460A1 (en) | Method of Fetal Cell Enrichment | |
Sekizawa et al. | Fetal cell recycling: diagnosis of gender and RhD genotype in the same fetal cell retrieved from maternal blood | |
Sekizawa et al. | Improvement of fetal cell recovery from maternal blood: suitable density gradient for FACS separation | |
CN106544411A (zh) | 一种利用标识蛋白分析鉴定哺乳动物y精子分型的方法 | |
WO2005047532A1 (en) | Improved method of performing genetic analyses on reproductive tract cell samples | |
CN101323877A (zh) | 检测21号染色体和性染色体数目异常的试剂盒 | |
KR102626620B1 (ko) | 임산부 자궁경부 탈락 세포로부터 태반 영양막 세포를 분리하는 방법 | |
Holzgreve et al. | Fetal cells in cervical mucus and maternal blood | |
RU2808260C1 (ru) | Способ отделения клеток плацентарного трофобласта от отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин | |
WO2021021735A1 (en) | Methods and compositions for characterizing inflammatory bowel disease | |
Al-Mufti et al. | Distribution of fetal and embryonic hemoglobins in fetal erythroblasts enriched from maternal blood | |
Bianchi | Progress in the genetic analysis of fetal cells circulating in maternal blood | |
CN105506066B (zh) | 一种用于新一代无创产前诊断领域的细胞鉴定方法 | |
Cha et al. | The utility of an erythroblast scoring system and gender‐independent short tandem repeat (STR) analysis for the detection of aneuploid fetal cells in maternal blood | |
US20160090631A1 (en) | Method for detection of fetal abnormalities | |
Chiu et al. | Non-invasive prenatal diagnosis: on the horizon? | |
Pachot et al. | A rapid semi automated method for DNA extraction from dried-blood spots: application to the HLA-DR shared epitope analysis in rheumatoid arthritis | |
EP3202912A1 (en) | Noninvasive method and system for determining fetal chromosomal aneuploidy | |
US20220298588A1 (en) | Development of a nucleic acid based lateral flow immunoassay for bk virus detection from esrd urines and contaminated sewage samples |