发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种基于孕妇拭子获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法,用于解决现有技术中胎儿稀有细胞的获取具有有创性、易污染等问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种基于孕妇拭子获取胎儿稀有细胞的方法,包括如下步骤:
1)提供细胞;
2)采用内质网荧光探针以及与所述内质网荧光探针不同颜色的细胞荧光染料对靶滋养层细胞进行染色;
3)根据靶细胞与背景细胞之间的荧光强度差异,筛选得到胎儿滋养层细胞;
4)通过细胞分选平台挑取得到目标细胞。
可选地,所述步骤1)中,所述细胞来源于孕妇产道。
可选地,所述步骤1)中,所述细胞是通过无创的方式从孕妇产道中获得。
可选地,所述步骤1)中,所述细胞是通过棉签拭子或巴氏涂片从孕妇产道中获得。
可选地,所述步骤1)中,所述孕妇的孕周为5~25周,具体可以为5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周等。通常,25周以后意义不大,5周以前胚胎发育未稳,不建议做标本获取。
可选地,所述步骤1)中,将拭子上脱下的细胞制成细胞悬液,离心弃去上清后,过滤去除鳞状上皮细胞。
可选地,所述步骤1)中,采用30μm孔隙的滤网过滤。
可选地,所述步骤2)中,所述内质网荧光探针选自ER-Tracker Red、ER-TrackerGreen中的至少一种,该内质网荧光探针可从市场上购买得到。
可选地,所述步骤2)中,所述细胞荧光染料选自DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、Hoechst33342中的至少一种,该细胞荧光染料可从市场上购买得到。
可选地,所述步骤3)中,在高倍镜视野下观察、确认、拍照,使用Image J软件对每一个细胞进行细胞圈取,自动荧光强度定量,并计算靶细胞与背景细胞之间的荧光强度差异。
可选地,所述步骤3)中,靶细胞荧光强度/背景细胞平均荧光强度≥3时,认为靶细胞荧光为强阳性,靶细胞用于下一步的单细胞挑取。检测限如果降低太多,易造成非特异性细胞的污染,以平均值为3的阈值界限较为合适。
可选地,所述步骤4)中,采用CellCelectorTM全自动细胞筛选系统挑取细胞。
可选地,所述步骤4)中,采用装有细胞裂解液的试剂管回收挑取的单细胞。
可选地,还包括步骤5)稀有胎儿滋养层细胞的全基因组扩增与鉴定.
可选地,所述步骤5)包括如下步骤:
51)单细胞多次退火环状循环扩增;
52)短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)分析和/或单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)分析,得到来源于胎儿的滋养层细胞。
可选地,所述步骤51)包括细胞裂解、挑取单个细胞、孵育样本、预扩增、扩增。
本发明还提供一种无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒,包括内质网荧光探针、与所述内质网荧光探针不同颜色的细胞荧光染料。
可选地,所述内质网荧光探针选自ER-Tracker Red。
可选地,所述细胞荧光染料选自DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)。
可选地,还包括细胞裂解液。
可选地,所述细胞裂解液包括Cell Lysis Buffer、Cell Lysis Enzyme。
可选地,还包括预扩增混合液。
可选地,所述预扩增混合液包括Pre-Amp Buffer、Pre-Amp Enzyme Mix。
可选地,还包括扩增混合液。
可选地,所述扩增混合液包括Amplification Buffer、Amp Enzyme Mix。
可选地,还包括短串联重复序列分析体系。
可选地,所述短串联重复序列分析体系包括
21 5×Master Mix、
21 5×Primer Pair Mix。
可选地,还包括上样混合物。
可选地,所述上样混合物包括WEN ILS 500、Hi-DiTM formamide。
可选地,还包括单核苷酸多态性分析体系。
可选地,所述单核苷酸多态性分析体系包括TaKaRa Taq HS、10×PCR Buffer、dNTP Mixture、引物。
本发明还提供上述试剂盒在制备或筛选单基因疾病诊断试剂中的应用。
可选地,所述单基因疾病包括但不限于地中海贫血、遗传性耳聋、先天性心脏病、先天性骨骼发育不良、血友病、囊性纤维化、脊髓肌萎缩等。
上述地中海贫血包括α-地中海贫血、β-地中海贫血。
常见的α地中海贫血基因型包括3种缺失类型:--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα,3种非缺失类型:ααQS/αα、ααCS/αα、ααWS/αα,1种少见的缺失类型--THA1/αα。
本发明还提供用于检测地中海贫血的试剂盒,包括上述无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒。
可选地,所述试剂盒还包括TaKaRa Taq HS、dNTP Mixture,上述试剂可从市场上购买得到。
可选地,试剂盒还包括引物、缓冲液,引物可根据所要检测的基因缺陷类型进行设计,缓冲液可从市场上购买得到。
如上所述,本发明针对现有检测方法的缺陷,采用单细胞筛选的方法,提供了一种从孕妇分泌物标本中获取纯的胎儿细胞,从而得到完整的胎儿DNA,用于地中海贫血等单基因疾病产前诊断的新技术。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
拭子分泌物标本中的胎儿细胞是随着孕妇子宫中胎儿的发育而自发地脱落并释放到子宫颈及生殖道中的胎盘滋养层细胞。这些滋养层细胞与母体鳞状上皮细胞、白细胞等混杂在一起,但却保留着胎儿完整的基因组信息以及胎盘细胞的主要标志特征。研究表明这些滋养层细胞数量众多,能达到103个数量级,显著比母体血中的胎儿有核红细胞要多,且这些细胞不受孕周、母体年龄、孕产次、BMI等因素的影响。单细胞分析技术是一项突破性的技术,研究人员通过获取母体标本中稀有的胎儿细胞,通过全基因组扩增可以获得纯的、高质量的胎儿基因组,并且整个过程是无创的,同时克服了穿刺诊断的有创性以及游离血浆DNA的母体污染性、片段化等缺点。因此,通过该项技术获取的胎儿DNA可满足于地中海贫血的产前诊断需求,是有创穿刺诊断的一种替代诊断途径。
本发明建立单细胞技术分离孕妇拭子标本中的稀有胎儿滋养层细胞用于地中海贫血等单基因疾病的产前诊断新技术,有助于开辟无创性单基因性疾病诊断的新途径,有效避免有创性诊断带来的创伤,为地中海贫血的产前诊断提供新的途径。
为了实现上述目的,本发明通过以下技术方案实现,总的原理步骤参见图1。
实施例1(利用细胞系模型对内质网探针鉴别效能的验证)
本实施例利用滋养层细胞系模拟临床样本进行实验,观察验证内质网探针对滋养层细胞在母体背景细胞中的鉴别效能。
1、实验仪器
Eppendorf离心机、Olympus倒置荧光显微镜BX51、BD FACSAria流式细胞仪。
2、实验试剂
HTR8-S/Vneo、JEG-3、JAR细胞系购于中国科学院细胞库。
RPMI 1640培养基(货号:11875093)、DMEM高糖培养基(货号:10569044)、胎牛血清(货号:10437028)、胰酶(货号:25300054)、磷酸盐缓冲液PBS(货号:C10010500BT-1)购于赛默飞世尔科技公司。
红细胞裂解液(货号:AR1118)购买于武汉博士德生物工程有限公司。
ER-Tracker Red(货号:KGMP016-1)染料购于江苏凯基生物技术股份有限公司。
3、实验步骤
3.1显微镜下统计滋养层细胞与上皮细胞、白细胞内质网探针荧光差异
(1)将已长到80%-90%的人绒毛膜细胞株HTR8-S/Vneo、JEG-3、JAR细胞用含EDTA-0.25%的胰酶消化,将细胞瓶放在显微镜下观察,直到细胞变圆,加含10%胎牛血清的培养基3ml,吹打细胞,使细胞掉落并转移至无菌的离心管中,1000rpm离心3分钟得到细胞沉淀。
(2)用PBS缓冲液清洗细胞2次,1000rpm离心3分钟,得到细胞沉淀,用PBS缓冲液重悬。
(3)抽取正常人外周血1mL,用红细胞裂解液裂解红细胞,2000转离心10分钟,弃上清,用红细胞裂解液重复2遍,最终用PBS重悬,得到白细胞悬液。
(4)妇女处于截石位,使用窥阴器暴露阴道,用女性棉签拭子收集阴道内分泌物,可于阴道内将棉签拭子旋转360°以收集细胞。将取完的棉签拭子标本放于标本瓶中,加入2~3mL的液基细胞保存液覆盖住棉签拭子,将拭子轻旋震荡,使细胞从拭子中脱出,吸取2mL细胞悬液,4000rpm离心5min,弃上清。用2mL的PBS重悬后得到上皮细胞细胞悬液。
(5)于上述细胞悬液中加入1μM ER-Tracker Red于37℃孵育30分钟。
(6)将以上染色的细胞于六孔板中,于倒置荧光显微镜上观察、拍照。
(7)拍取的照片使用Image J软件对每一个细胞进行细胞圈取,自动荧光强度定量,并计算细胞的荧光强度。
3.2流式细胞术检测滋养层细胞与上皮细胞、白细胞内质网探针荧光差异
(1)按3.1所述方法得到HTR8-S/Vneo、JEG-3、JAR滋养层细胞系悬液、上皮细胞悬液、白细胞悬液。
(2)于上述细胞悬液中加入1μM ER-Tracker Red,于37℃孵育30分钟。
(3)打开BD FACSAria仪器电源,对系统进行预热;打开气体阈,调节压力,获得适宜的液流速度;开启光源冷却系统;在样品管中加入去离子水,冲洗液流的喷嘴系统。
(4)利用校准标准样品,调整仪器,使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上,0°和90°散射的荧光强度最强,并要求变异系数为最小。
(5)选定流速、测量细胞数、测量参数等,在同样的工作条件下检测以上染色的细胞悬液样品;同时选择计算机屏上数据的显示方式,从而能直观掌握测量进程。
(6)利用FlowJo V10软件对流式细胞结果进行分析。
4、分析及结论
显微镜下各滋养层细胞系与上皮细胞、白细胞内质网探针荧光差异如图2所示,滋养层细胞会分泌大量β-HCG、孕酮等蛋白质,因此其细胞内的内质网含量异常丰富,其荧光强度约为上皮细胞、白细胞荧光强度的3倍。基于此,结合细胞形态、大小,可快速对滋养层细胞进行区分、鉴定。
流式细胞术检测结果如图3。通过内质网荧光探针染色,90%以上的HTR8-S/Vneo、JEG-3、JAR滋养层细胞系可以与上皮细胞、白细胞进行区分。
实施例2(稀有胎儿滋养层细胞的获取)
本实施例提供了一种快速获取孕妇分泌物标本中纯的胎儿稀有细胞的方法,包括胎儿滋养层细胞的筛查、快速鉴定以及单细胞的挑取等。本实施例利用孕妇产道中的滋养层细胞会分泌大量β-HCG、孕酮等蛋白质,因此其细胞内的内质网含量异常丰富,可以同鳞状上皮细胞与白细胞等母体细胞区分的原理,通过对样本进行内质网特异性染色,并进行相应的评分,便可快速、简单地与背景细胞进行区分。
1、实验仪器
Olympus倒置荧光显微镜BX51、AVIOS GmbhCellCelector全自动细胞分离筛选系统、Eppendorf离心机。
2、实验试剂
Panera液基细胞保存液(货号:AAPR466-1)、女性拭子(货号:YLSmsz)购于广州科尔生物有限公司;世泰病理级载玻片(货号:10127105P-G)购于江苏世泰实验器材有限公司;
SmartStrainers滤网(货号:130-098-458)购于上海优宁维生物科技股份有限公司;磷酸盐缓冲液PBS(货号:C10010500BT-1)购于赛默飞世尔科技公司;ER-Tracker Red(货号:KGMP016-1)、DAPI(货号:KGA215)染料购于江苏凯基生物技术股份有限公司;
单细胞全基因组扩增试剂盒(货号:KT110700150)购于江苏亿康基因科技有限公司,该试剂盒配套有细胞裂解液。
3、样本来源
本实施例所使用的所有与人体相关的拭子样本,均来自南方医科大学南方医院。
4、实验步骤
4.1、样品采集及准备:
(1)孕妇患者(孕周为4~32周)处于截石位,使用窥阴器暴露阴道,用女性棉签拭子收集阴道内分泌物,可于阴道内将棉签拭子旋转360°以收集细胞。将取完的棉签拭子标本放于标本瓶中,加入2~3mL的液基细胞保存液覆盖住棉签拭子,贴好标签,拭子标本于4℃保存。
(2)将拭子轻旋震荡,使细胞从拭子中脱出,吸取2mL细胞悬液,4000rpm离心5min,弃上清。用2mL含防黏附PBS重悬后,采用
SmartStrainers滤网(30μm孔隙)对细胞悬液进行细胞过滤,去除30μm以上的鳞状上皮细胞。
(3)收集细胞滤液,加入1μM ER-Tracker Red于37℃孵育30分钟;加入300nM DAPI37℃孵育30分钟。
4.2、胎儿滋养层细胞的筛查与鉴定:
(1)将细胞悬液4000rpm离心5min后,用1mL含防黏附剂PBS重悬,吹打至少20次以上。
(2)以100μL/片的量将细胞悬液均匀涂于载玻片上,静置2分钟,使细胞沉降,将载玻片置于倒置荧光显微镜上,在低倍视野上扫描出ER-Tracker高荧光强度/DAPI阳性的细胞,并于高倍镜视野下观察、确认、拍照。
DAPI的作用是区分非细胞性杂质与细胞,没有细胞核的非细胞性杂质DAPI为阴性。
(3)将拍取的照片使用Image J软件对每一个细胞进行细胞圈取,自动荧光强度定量,并计算靶细胞与背景细胞之间的荧光强度差异。靶细胞荧光强度/背景细胞平均荧光强度≥3时,认为靶细胞荧光为强阳性,靶细胞用于下一步的单细胞挑取与胎源性验证。
4.3、胎儿滋养层单细胞的挑取:
(1)打开CellCelector电脑主机、总开关阀门和荧光电源,打开电脑软件;
(2)放置含有需挑取细胞的玻片等至CellCelector的显微镜上,观察并找到需挑取的目标细胞;
(3)在收集单细胞的区域放置装有5μL细胞裂解液(
单细胞全基因组扩增试剂盒配套提供)的PCR管,对毛细管放置细胞的高度进行校正,其高度应没入液面以下;
(4)校正毛细管吸取细胞的高度,接着调整CellCelector吸取细胞的液体量、力度以及速度等参数,将其调整至最佳的参数组合,并尝试进行细胞挑取;
(5)成功挑取细胞后,对目标细胞进行挑取,挑取时通过仔细观察挑取过程,对挑取前后照片进行比较以及肉眼观察细胞放置的情况,确认成功挑取目标细胞后,可将目标细胞用于下游分析。
实施例3(稀有胎儿滋养层细胞的全基因组扩增与鉴定)
1、实验仪器
所用仪器包括Eppendorf核酸扩增仪、Nanodrop 2000核酸检测仪、北京六一电泳仪、BioRad凝胶曝光仪。STR所用的毛细管电泳检测由上海翼和应用生物技术有限公司完成;Sanger测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
2、实验试剂
单细胞全基因组扩增试剂盒(货号:KT110700150)购于江苏亿康基因科技有限公司;
21 STR检测试剂盒(货号:DC8902)购于普洛麦格(promega)生物技术有限公司;Hot Start型Ex Taq PCR试剂盒(货号:RR006Q)、100bp DNA Maker(货号:3422A)、6×loading buffer(货号:9156)购于宝日医生物技术(Takara)有限公司;引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,PAGE纯化,浓度为10μM;Biowest西班牙琼脂糖(货号:111860)购于广州科尔生物有限公司;4S Red核酸染料(货号:A606695)购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
3、实验步骤
本实施例涉及通过单细胞获得足够量的胎儿DNA的方法,包括以下步骤:胎儿滋养层单细胞的扩增及其胎源性验证:
3.1、单细胞多次退火环状循环扩增(MALBAC):
(1)根据反应的数量(N),混合Cell Lysis Buffer和Cell Lysis Enzyme,用于准备细胞裂解混合液,反应体系如下表:
表1
细胞裂解混合液 |
体积 |
Cell Lysis Buffer |
5μl×N |
Cell Lysis Enzyme |
0.1μl×N |
总体积 |
5.1μl×N |
(2)将4.5μl细胞裂解混合液置于200μl的PCR管盖上,用CellCelector挑取单个细胞,加入至PCR管盖的细胞混合液中,轻弹管壁混匀并离心;
(3)在预热的核酸扩增仪中孵育样本,条件如下表:
表2
(4)根据反应的数量(N),混合Pre-Amp Buffer和Pre-Amp Enzyme Mix,用于准备预扩增混合液,反应体系如下表:
表3
预扩增混合液 |
体积 |
Pre-Amp Buffer |
30μl×N |
Pre-Amp Enzyme Mix |
1μl×N |
总体积 |
31μl×N |
(5)在5μl细胞裂解产物中加入30μl预扩增混合液,在核酸扩增仪中扩增,反应条件如下:
表4
(6)根据反应的数量(N),混合Amplification Buffer和Amp Enzyme Mix,准备扩增混合液,反应体系如下:
表5
扩增混合液 |
体积 |
Amplification Buffer |
30μl×N |
Amp Enzyme Mix |
0.8μl×N |
总体积 |
30.8μl×N |
(7)在35μl的预扩增产物中加入30μl扩增混合液,在核酸扩增仪中进行扩增,反应条件如下:
表6
3.2、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析:
(1)在冰上缓慢解冻所有反应成分。涡旋混匀各反应成分15秒,短暂离心15秒。
(2)按下表所示准备反应体系:
表7
(3)涡旋PCR反应混合液5~10秒,将反应混合液分装至各反应管,加入0.5ng的模板DNA(单细胞扩增产物DNA),按以下条件进行PCR反应:
表8
(4)在进行毛细管电泳前,打开Applied
3500 or 3500xL分析仪,预热30分钟。
(5)涡旋混匀WEN Internal Lane Standard 500(WEN ILS 500)内参,短暂离心15s。
(6)按以下体系配制上样混合物:
表9
成分 |
每管反应体积 |
总体积 |
WEN ILS 500 |
0.5μl |
0.5μl×N |
Hi-Di<sup>TM</sup> formamide |
9.5μl |
9.5μl×N |
(7)涡旋混匀上样混合物,在反应孔中加入10μl的上样混合物。
(8)加入1μl扩增的PCR产物,封闭反应板,并短暂离心。
(9)于95℃变性3分钟,后直接置于冰上冰浴3分钟。
(10)将反应板置于检测仪器上,进行毛细管电泳反应,反应结果使用
4.2进行分析。
3.3、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)分析:
(1)取1μl单细胞扩增产物加到Nanodrop 2000核酸检测仪检测基座上,根据吸光度值,得出核酸浓度,并依据核酸浓度得出PCR反应时应加入的模板量。
(2)根据TaKaRa Hot Start型Ex Taq PCR试剂盒说明书分别配制22种SNP的反应体系,反应体系如下:
表10
PCR反应液组成(共50μl) |
体积 |
TaKaRa Taq HS (5 U/μl) |
0.25μl |
10×PCR Buffer |
5μl |
dNTP Mixture(各2.5mM) |
4μl |
Template |
<500ng |
引物F |
10pmol(final conc.0.2μM) |
引物R |
10pmol(final conc.0.2μM) |
灭菌水 |
up to50μl |
(3)22个SNP位点的名称及引物序列如下表
表11
(4)向PCR体系中加入单细胞扩增产物作为模板,在核酸扩增仪中进行扩增,反应条件如下:
表12
(5)PCR产物琼脂糖凝胶电泳:
①根据所需琼脂糖浓度和凝胶量配制电泳凝胶(以75ml2%琼脂糖凝胶为例),称取1.5g琼脂糖粉,加入75ml0.5×TBE缓冲液,置于微波炉中高火加热1.5min,使琼脂糖完全溶解;
②向其中加入5μl的1000×4S Red核酸染料,充分混匀后;
③将琼脂糖倒入模具,使凝胶厚度约为5mm,确保无气泡存在;
④室温下放置30min,待琼脂糖凝胶完全凝固,小心取出梳子,将凝胶置于电泳槽中;
⑤加入足量的0.5×TBE缓冲液,让液面高于胶面1mm,把PCR产物和6×LoadingBuffer按5:1的比例混匀后,用移液器将混合液小心加入凝胶的加样孔中,最后在留出的孔中加入等体积100bp DNA Marker;
⑥接通电泳槽与电泳仪的电源,电压选择1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算),使DNA向正极移动,电泳40min;
⑦在Bio-Rad凝胶成像系统中对电泳结果进行观察及拍照。
(6)PCR产物测序:
PCR阳性产物送生物公司进行双向测序(测序引物同扩增引物),测序结果使用Chromas软件进行分析,并与相应基因序列进行核酸序列比对,验证单细胞扩增产物是否确实来源于胎儿。
4、分析及结论
STR检测参见图4,通过ER-Tracker强阳性挑取出来的候选滋养层细胞经过全基因组扩增之后进行STR检测,并与母体DNA STR检测结果比对。最左列为STR位点名称,最上行为检测的样本名称。结果显示STR峰型均为两个峰或一个峰,表明细胞为纯的细胞。图中红色方块表示滋养层单细胞与母体DNA的区分性位点,蓝色方块表示非区分性位点,黑色方块表示PCR扩增错误位点,白色方块表示无信息位点。该结果表明大部分样本中挑取到的滋养层细胞与母体DNA之间具有足够的区分性位点,表明了这些稀有细胞的胎源性。
SNP检测参见图5,通过ER-Tracker强阳性挑取出来的候选滋养层细胞经过全基因组扩增之后进行SNP检测,并与母体DNA SNP检测结果比对。最左2列为SNP位点名称及所在染色体,最上行为检测的样本名称。图中红色方块表示滋养层单细胞与母体DNA的区分性位点,蓝色方块表示非区分性位点,白色方块表示无信息位点。该结果表明大部分样本中挑取到的滋养层细胞与母体DNA之间具有足够的区分性位点,更进一步表明了这些稀有细胞的胎源性。
实施例4(稀有胎儿滋养层细胞的全基因组产物用于地中海贫血的产前诊断)
本实施例涉及通过单细胞扩增产物进行地中海贫血常见突变的诊断方法。包括以下方面:α-地中海贫血与β-地中海贫血的诊断。
1、实验仪器
Eppendorf核酸扩增仪、北京六一电泳仪、BioRad胶曝光仪;Sanger测序所用测序仪购于生工生物工程上海(股份)有限公司。
2、实验试剂
Hot Start型Ex Taq PCR试剂盒(货号:RR006Q)、100bp DNA Maker(货号:3422A)、6×loading buffer(货号:9156)购于宝日医生物技术(Takara)有限公司;引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,PAGE纯化,浓度为10μM;Biowest西班牙琼脂糖(货号:111860)购于广州科尔生物有限公司;4S Red核酸染料(货号:A606695)购于生工生物工程上海(股份)有限公司。
3、实验步骤
3.1、--SEA/缺失突变的诊断
图6为利用胎儿单细胞扩增产物为模板进行--SEA/缺失突变检测的原理图。
(1)按以上步骤获取胎儿单细胞扩增产物并经STR、SNP验证这些稀有滋养层细胞的胎源性。
(2)按Gap-PCR的原理在断裂位点附近设计--SEA/缺失突变的扩增引物,分为2对引物:正常引物对以及缺失引物对。正常人中不存在-SEA/缺失突变,则只能扩增正常引物对;而-SEA/缺失突变的纯合子则只能扩增缺失引物对;两个引物均能扩增则表明个体为-SEA/缺失突变的杂合子。以下为两个引物对的序列:
表13
(3)配制PCR的反应体系,反应体系如下:
表14
PCR反应液组成(共50μl) |
体积 |
TaKaRa Taq HS (5 U/μl) |
0.25μl |
10×PCR Buffer |
5μl |
dNTP Mixture(各2.5mM) |
4μl |
Template |
<500ng |
引物F |
10pmol(final conc.0.2μM) |
引物R |
10pmol(final conc.0.2μM) |
灭菌水 |
up to50μl |
(4)向PCR体系中加入单细胞扩增产物作为模板,在核酸扩增仪中进行扩增,反应条件如下:
表15
(5)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。PCR阳性产物送生物公司进行双向测序(测序引物同扩增引物),测序结果使用Chromas软件进行分析。观察-SEA/缺失情况,若只有正常引物对扩增,则该个体无-SEA/缺失突变;若只有-SEA/缺失引物对扩增,且在测序结果中可观察到断裂位点,则该个体为纯合型-SEA/缺失个体;若正常和缺失引物对均有扩增,且在测序结果中可观察到断裂位点,则该个体为杂合型-SEA/缺失个体。
3.2、-α4.2//缺失突变的诊断
图7为利用胎儿单细胞扩增产物为模板进行-α4.2//缺失突变检测的原理图。
(1)按以上步骤获取胎儿单细胞扩增产物并经STR、SNP验证这些稀有滋养层细胞的胎源性。
(2)根据α基因簇中X2同源框与X1同源框的保守性位点不同,设计能同时对X2同源框与X1同源框进行扩增的引物对,当发生-α4.2//缺失突变时,缺失使X2同源框与X1同源框连接在一起,可根据保守位点的纯合与杂合性对个体是否发生-α4.2//缺失突变进行判断。以下为引物对的序列:
表16
(3)配制PCR的反应体系,反应体系如下:
表17
PCR反应液组成(共50μl) |
体积 |
TaKaRa Taq HS (5U/μl) |
0.25μl |
10×PCR Buffer |
5μl |
dNTP Mixture(各2.5mM) |
4μl |
Template |
<500ng |
引物F |
10pmol(final conc.0.2μM) |
引物R |
10pmol(final conc.0.2μM) |
灭菌水 |
up to50μl |
(4)向PCR体系中加入单细胞扩增产物作为模板,在核酸扩增仪中进行扩增,反应条件如下:
表18
(5)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。PCR阳性产物送生物公司进行双向测序(测序引物同扩增引物),测序结果使用Chromas软件进行分析。结果根据X2同源框与X1同源框保守序列的情况进行判断。
3.3、β-地中海贫血突变的诊断
(1)按以上步骤获取胎儿单细胞扩增产物并经STR、SNP验证这些稀有滋养层细胞的胎源性。
(2)根据编码β珠蛋白基因HBB的序列,设计出3对引物扩增HBB基因,这3个片段覆盖了能引起β-地中海贫血的大部分常见突变位点。以下为引物对的序列:
表19
(3)配制PCR的反应体系,反应体系如下:
表20
PCR反应液组成(共50μl) |
体积 |
TaKaRa Taq HS (5U/μl) |
0.25μl |
10×PCR Buffer |
5μl |
dNTP Mixture(各2.5mM) |
4μl |
Template |
<500ng |
引物F |
10pmol(final conc.0.2μM) |
引物R |
10pmol(final conc.0.2μM) |
灭菌水 |
up to50μl |
(4)向PCR体系中加入单细胞扩增产物作为模板,在核酸扩增仪中进行扩增,反应条件如下:
表21
(5)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。PCR阳性产物送生物公司进行双向测序(测序引物同扩增引物),测序结果使用Chromas软件进行分析。根据测序结果并与NCBI数据库、HGMD数据库对比,判断HBB基因突变情况。
4、分析及结论
一例--SEA/缺失突变检测结果参见图8。具有ER-Tracker强阳性荧光的候选滋养层细胞挑取、并经STR、SNP验证为胎源性细胞。稀有滋养层细胞全基因组扩增产物与母体DNA用--SEA/缺失突变检测引物进行扩增。结果显示母体DNA可以扩增出--SEA/缺失突变引物与正常引物,表明母体为--SEA/缺失杂合子;而稀有滋养层细胞仅可扩增出--SEA/缺失突变引物,且测序结果可观察到缺失结合处的碱基序列,表明胎儿为--SEA/缺失纯合子。
一例-α4.2//缺失突变检测结果参见图9。具有ER-Tracker强阳性荧光的候选滋养层细胞挑取、并经STR、SNP验证为胎源性细胞。稀有滋养层细胞全基因组扩增产物与母体DNA用-α4.2/缺失突变检测引物进行扩增。当无-α4.2/缺失突变时,几个保守碱基为…C/T…C/T…G…delC…;当为-α4.2/缺失杂合突变时,测序结果显示为…C/T…C/T…G/A…delC…;当为-α4.2/缺失纯合突变或为-α4.2/--SEA时,测序结果显示为…C…C…A…delC…,测序结果显示为几个保守碱基处。根据结果显示,母体DNA表现出-α4.2/缺失突变杂合型;而胎儿DNA表现为-α4.2/缺失纯合突变或为-α4.2/--SEA突变。
一例β-地中海贫血突变检测结果参见图10。具有ER-Tracker强阳性荧光的候选滋养层细胞挑取、并经STR、SNP验证为胎源性细胞。稀有滋养层细胞全基因组扩增产物与母体DNA用β-地中海贫血检测引物进行扩增。根据结果显示,母体DNA表现出HBB基因CDs41/42(-TCTT)缺失突变杂合型;而胎儿表现为正常基因型。
本发明对9例疑似怀有地中海贫血胎儿的孕妇均能检测到胎儿的基因型,且都符合孟德尔遗传定律(结果如图11所示)。--SEA/缺失突变、-α4.2/缺失突变以及β-地中海贫血突变采用与本发明实施例4是相同的方法与试剂。“-”表示收集不到该病例诊断的信息,或是该病例未进行该项检测。对于病例1中,由于穿刺诊断未进行HBB基因的检测,因此未发现如本发明结果所示的IntM(T-C)突变。而对于未进行羊水穿刺或绒毛膜穿刺检测的病例,两种方法之间的结果尚无法进行对比。
如上所述,本发明的一种无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法,至少具有以下有益效果:1、本发明首次开创了一种从孕妇分泌物中获取胎儿细胞的新方法,操作步骤简单、耗时短、获取细胞个数稳定、获取的胎儿滋养层细胞具有完整的胎儿基因组;在较低成本的基础上获取足够纯的胎儿基因组,且这些过程完全无创,对孕妇、对胎儿无伤害,既克服了有创穿刺的有创伤害的缺点,也克服了母体血中游离胎儿DNA片段化、不完整的缺陷,这是目前产前诊断手段所不及的技术效果。
2、本发明的方法经多次试验后诊断效能高、准确性好,适用于产前诊断α-地中海贫血、β-地中海贫血以及其他单基因性疾病,目前这些单基因性疾病尚无法通过母体血中游离胎儿DNA进行无创产前诊断,因此该方法可以作为除穿刺手段外阻止患有单基因性疾病患儿出生的重要技术手段。另外,该方法具有广谱的诊断效能,不仅仅适用于地中海贫血的诊断,也适用于其他单基因疾病的诊断。
3、本发明突破性地以稀有胎儿细胞为基础的无创产前诊断,对孕妇无伤害,对开展地贫和其他单基因疾病的无创产前诊断具有重大的意义。广西壮族自治区与广东省人群中地中海贫血患病率为全国最高,该技术的研发及应用将大大促进单基因疾病的筛查工作,在广西、广东及全国范围内推广都有着深远的临床医学意义。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法
<130> PCQNF194011
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