CN111440857B - 用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法，属于生物检测技术领域，该方法使用上述试剂盒对囊胚培养液样本进行全基因组扩增，扩增产物及父母双方DNA样本进行短串联重复序列分析检测母源污染，扩增产物进行文库制备、二代测序检测，确定染色体数目是否异常；提供的试剂盒对预扩增混合液和扩增混合液进行了优化。本发明提供的方法可对囊胚培养液进行母源污染的检测，从而判断培养液染色体非整倍体检测结果是否准确可靠，提供了一种颗粒细胞是否去除完全的检测方法，通过试剂盒的优化有效避免了培养液中的成分对扩增产生抑制作用，使得扩增均一性好，单细胞扩增产量高；检测方法简单，结果准确，提升了数据质量。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法。
背景技术
随着人类辅助生殖技术的快速发展，人工授精(Artificial Insemination，AI)、体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilizationand Embryo Transfer，IVF-ET)以及胞浆内单精子注射技术(Intra-Cytoplasmic Sperm Injection，ICSI)已经进入了规模性的临床应用。在体外受精形成的胚胎中，约50％存在染色体异常，可导致移植后早期胚胎丢失、自然流产和死产，是限制辅助生殖技术成功率和有效推广的重要原因之一。传统的胚胎筛选方法是通过静态的胚胎形态学观察对胚胎的质量进行评级，该方法操作简便，但评估指标较单一，依赖医护人员的个人经验，主观经验影响较大，不能完全代表胚胎基因组的状态，无法准确判断胚胎的发育状态和潜能。有研究发现在形态学良好的胚胎中仅42％的染色体是正常的，其中内细胞团评级为A的囊胚中仅30％的染色体正常。
自1990年开始，植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)技术逐渐广泛的应用于辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)。其中植入前染色体非整倍体检测(PGT for aneuploidies，PGT-A)是利用分子生物学技术，在胚胎植入之前对早期胚胎进行23对染色体数目异常的检测，分析胚胎是否存在染色体及大片段的拷贝数异常。PGT-A通过对高龄女性、反复种植失败、反复流产及严重男性不育等患者的胚胎进行活检筛选染色体正常的胚胎进行移植，提高种植率、降低流产率从而提高了IVF的成功率，在ART和临床优生学中占有重要的地位。
PGT领域的不断应用与发展，非整倍体筛查准确性及胚胎实验操作技术得以提高，目前国际通用的PGT-A检测技术主要通过机械法、Tyrodes酸法或激光法对卵裂期的卵裂球或囊胚期的滋养外胚层细胞进行透明带打孔取样，卵裂期活检移取1-2个细胞、囊胚活检采集5-10个滋养层细胞，检测方法有聚合酶链反应(PCR)、荧光原位杂交技术(FISH)、微阵列比较基因组杂交(aCGH)、单核苷酸多态性微阵列(SNP-array)、全基因组扩增技术(WGA)以及高通量测序技术(NGS)。
但是常用的活检技术无论是卵裂球活检还是囊胚活检均为有创的过程，活检取样过程对操作人员要求较高，操作复杂，各中心活检操作差异可能造成妊娠率和活产率不同。侵入性胚胎活检是否对胚胎造成损伤、发育潜能及出生后代的健康造成影响目前还存在争议。临床研究发现经PGT-A生育的18个月大小的幼儿，在精细运动功能、姿势和肌张力方面有轻微异常；两岁儿童具有细微的神经缺陷。动物实验研究发现有创性的活检可能会造成神经退行性病变，表观遗传修饰的异常，后代胎盘异常，降低下一代冷应激能力。且同时还存在活检样本细胞易丢失，少量活检细胞可能不能完全代表整个胚胎的嵌合情况，进而造成误判的问题。
近年来大量研究证实在囊胚发育过程中，DNA可能通过细胞裂解、细胞凋亡或细胞碎片脱落，从内细胞团和滋养外胚层细胞释放到培养基中，并与胚胎发育潜能、形态等方面相关。研究发现胚胎发育至第二天开始向培养液中释放大量游离DNA，对胚胎整倍体和染色体组成有很高的预测价值，可作为胚胎染色体检查的材料来源。2016年，无创染色体筛查通过对42个囊胚培养液中基因组DNA进行全基因组扩增、NGS技术分析胚胎染色体的非整倍性，并与其对应胚胎的活检结果进行比较，并已成功获得了全球第一例无创染色体筛查出生的健康试管婴儿。
ICSI技术选择活力好、形态正常的单个精子用显微注射器将其直接注入卵母细胞内，并继续培养确定卵细胞已受精并分裂后，再将胚胎移植到子宫腔内使其继续生长发育成胎儿。ICSI技术可有效避免父源样本污染，但卵母细胞周围包围着前颗粒细胞，随着卵泡形成成熟期卵泡，颗粒细胞也逐渐分化为两类，一类是紧紧包裹着卵母细胞的卵丘细胞，而另一类则是紧靠着卵泡壁的壁颗粒细胞。颗粒细胞多携带母源正常染色体，如果在囊胚培养过程中没有将其完全去除，残存的颗粒细胞将会向培养液中释放DNA造成母源性污染，常导致假阴性结果。因此，有必要对母源污染进行检测。目前已知专利多在提供去除母源的颗粒细胞方法，即培养中通过去除透明带、换液等技术手段，但均未提供颗粒细胞是否去除完全的检测方法，无法证实颗粒细胞是否去除完全，或颗粒细胞释放的游离DNA是否仍有残留。由于胚胎在早期体外培养发育过程中会向囊胚培养液中释放极少量(约几十皮克)的DNA，如此微量的DNA如果有母源DNA污染，将对染色体非整倍体检测的准确性造成影响，出现假阴性或嵌合体结果。但是在母源污染进行检测中，若使用囊胚培养液进行无创检测，存在囊胚培养液中游离DNA浓度极低，体积范围变化较大(10-20μL)，同时培养液中成分复杂，某些物质可能会对WGA扩增产生抑制作用。现有的检测试剂盒和检测方法不能够有效避免上述问题的产生。因此，有必要对无创胚胎植入前遗传性检测的试剂盒和方法进行优化。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于在无创胚胎植入前使用囊胚培养液进行染色体非整倍体和母源污染检测的试剂盒及方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法，包括以下步骤：
步骤1、获取囊胚培养液样本，进行全基因组扩增；
步骤2、取步骤1所得全基因组扩增产物进行文库制备；
步骤3、取步骤2所得文库样本进行二代测序检测，将得到的数据进行过滤之后，与参考基因组进行比对，基于对比对结果的统计分析，得到待测样本目标染色体数目是否异常的检测结果；
步骤4、取步骤1所得全基因组扩增产物及父母双方DNA样本进行短串联重复序列分析检测母源污染，根据STR基因分型结果，同一STR基因座下，检测全基因组扩增产物是否具有2个母亲特有STR型别，如有则认为囊胚培养液有母源污染。
其中，步骤1中使用用于无创胚胎植入前遗传性检测的试剂盒进行全基因组扩增；所述试剂盒，包括预扩增混合液和扩增混合液；
所述预扩增混合液包括0.7mM dNTP、40mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10％DMSO、1μL1U/μL的高保真DNA聚合酶高保真DNA聚合酶和6uM引物；
所述扩增混合液包括0.6mM dNTP、40mM Tris-HCl、5mM MgCl2、8％DMSO、5U 1U/μL的高保真DNA聚合酶和2.5uM引物。
本发明的有益效果在于：本发明使用同时检测培养液样本和父母双方STR基因分型，来确认培养液样本是否存在母源污染，从而判断培养液染色体非整倍体检测结果是否准确可靠，提供了一种颗粒细胞是否去除完全的检测方法。本发明提供的方法，取样方便快捷，取样时均为胚胎冷冻保存常规操作，避免了复杂的显微操作活检程序及胚胎细胞取样风险，使用上述试剂盒进行针对囊胚培养液微量游离DNA优化的单细胞全基因组扩增技术，方法简单，便于操作，易于标准化，且结果准确。本发明提供的试剂盒可用于无创胚胎植入前遗传性检测，通过对预扩增混合液和扩增混合液配方的优化，使得整个全基因组扩增得到优化，避免了培养液中的成分对扩增产生抑制作用，使得扩增均一性好，单细胞扩增产量高，进而提升了数据质量、保证了较高的重复性和保真度。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式的对比例1的试剂盒用于全基因组扩增的测序结果示意图；
图2所示为本发明具体实施方式的实施例1的试剂盒用于全基因组扩增的测序结果示意图；
图3所示为本发明具体实施方式的实施例2的胚胎样本的囊胚滋养层细胞活检结果示意图；
图4所示为本发明具体实施方式的实施例2的胚胎样本的囊胚培养液检测结果示意图；
图5所示为本发明具体实施方式的实施例3的胚胎样本的囊胚培养液检测结果示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：对针对囊胚培养液样本优化全基因组扩增的试剂，避免培养液中杂质对扩增和检测结果的影响。
本发明的用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法，包括以下步骤：
步骤1、获取囊胚培养液样本，使用上述的试剂盒进行全基因组扩增；
步骤2、取步骤1所得全基因组扩增产物进行文库制备；
步骤3、取步骤2所得文库样本进行二代测序检测，将得到的数据进行过滤之后，与参考基因组进行比对，基于对比对结果的统计分析，得到待测样本目标染色体数目是否异常的检测结果；
步骤4、取步骤1所得全基因组扩增产物及父母双方DNA样本进行短串联重复序列分析检测母源污染，根据STR基因分型结果，同一STR基因座下，检测全基因组扩增产物是否具有2个母亲特有STR型别，如有则认为囊胚培养液有母源污染。
进一步的，步骤1中使用用于无创胚胎植入前遗传性检测的试剂盒进行全基因组扩增；所述试剂盒包括预扩增混合液和扩增混合液；
所述预扩增混合液包括0.7mM dNTP、40mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10％DMSO、1μL1U/μL的高保真DNA聚合酶高保真DNA聚合酶和6uM引物；
所述扩增混合液包括0.6mM dNTP、40mM Tris-HCl、5mM MgCl2、8％DMSO、5U 1U/μL的高保真DNA聚合酶和2.5uM引物。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明使用同时检测培养液样本和父母双方STR基因分型，来确认培养液样本是否存在母源污染，从而判断培养液染色体非整倍体检测结果是否准确可靠，提供了一种颗粒细胞是否去除完全的检测方法。本发明提供的方法，取样方便快捷，取样时均为胚胎冷冻保存常规操作，避免了复杂的显微操作活检程序及胚胎细胞取样风险，使用上述试剂盒进行针对囊胚培养液微量游离DNA优化的单细胞全基因组扩增技术，方法简单，便于操作，易于标准化，且结果准确。本发明提供的试剂盒可用于无创胚胎植入前遗传性检测，通过对预扩增混合液和扩增混合液配方的优化，使得整个全基因组扩增得到优化，避免了培养液中的成分对扩增产生抑制作用，使得扩增均一性好，单细胞扩增产量高，进而提升了数据质量、保证了较高的重复性和保真度。
进一步的，所述Tris-HCl的pH为7.5。
进一步的，上述的试剂盒中，还包括裂解液和裂解酶。
进一步的，所述裂解液包括pH为8.3的25mM Tris-HCl、裂解液总体积0.05％的Triton X-100和1.5mM EDTA；所述裂解酶为2mg/ml的蛋白酶K。
实施例1：
用于无创胚胎植入前遗传性检测的试剂盒，由以下试剂组成：
预扩增混合液：0.7mM dNTP、40mM Tris-HCl(pH＝7.5)、10mM MgCl2、10％DMSO、6uM引物、1μL高保真DNA聚合酶(1U/μL)(TAKARA)；
扩增混合液：0.6mM dNTP、40mM Tris-HCl(pH＝7.5)、5mM MgCl2，8％DMSO、2.5uM引物，5U高保真DNA聚合酶(1U/μL)(TAKARA)；
裂解液：25mM Tris-HCl(pH＝8.3)、0.05％Triton X-100、1.5mM EDTA；
裂解酶：2mg/mL蛋白酶K；
末端修复反应液；末端修复酶；DNA连接缓冲液；DNA连接酶；接头；PCR扩增反应液；通用引物；标签引物；去离子水。
对比例1：
一种试剂盒，由以下组分组成：
预扩增混合液：1mM dNTP、40mM Tris-HCl(pH＝7.5)、15mM MgCl2、12％DMSO、6uM引物、1μL高保真DNA聚合酶(1U/μL)(TAKARA)；
扩增混合液：0.5mM dNTP、40mM Tris-HCl(pH＝7.5)、8mM MgCl2，6％DMSO、2.5uM引物，5U高保真DNA聚合酶(1U/μL)(TAKARA)；
裂解液：15mM Tris-HCl(pH＝8.3)、0.1％Triton X-100、1.5mM EDTA；
裂解酶：2mg/mL蛋白酶K；
末端修复反应液；末端修复酶；DNA连接缓冲液；DNA连接酶；接头；PCR扩增反应液；通用引物；标签引物；去离子水(与实施例1相同)。
实验例1：
比较实施例1和对比例1两个试剂盒对同一样本分别进行全基因组扩增，并进行文库制备和上机测序。对扩增效果进行对比，结果见表1、图1和图2所示。
表1
| 样本 | WGA浓度值(ng/ul) |
| 对比例1 | 28.5 |
| 实施例1 | 46.7 |
通过本申请对试剂盒的优化，可以看出，本申请优化后的试剂盒WGA浓度较优化前明显提高，测序结果CNV结果离散度优化后明显优于优化后。
实施例2：
将胞浆内单精子注射授精的胚胎样本，培养至囊胚期，分别采用常规PGT-A囊胚滋养层细胞活检和囊胚培养液检测染色体非整倍体，评估胚胎染色体是否正常。
具体步骤如下：
1、获取囊胚培养液样本
ICSI授精后，将受精卵培养至囊胚期，囊胚培养液用干净的吸管吸净，培养液5-20μL作为染色体非整倍体检测样本。吸取培养液后对胚胎进行活检，取囊胚滋养层细胞进行PGT-A检测。
2、囊胚培养液全基因组扩增
2.1囊胚培养液样本裂解
将每例采集的培养液样本管中分别加入10-20μL裂解液，0.6-1.2μL裂解酶。震荡混匀，短暂离心后将PCR管置于PCR仪中50℃20min，95℃10min。
2.2预扩增
向上步的PCR管中加入5-10μL预扩增混合液，震荡混匀，短暂离心后置于PCR仪中，运行表2所示程序。
表2
2.3扩增
加入60-120μL扩增混合液于2.2的15-30μL预扩增反应产物中，运行表3所示程序。
表3
3、二代测序快速DNA建库
100ng-1μg打断的双链DNA
3.1 DNA末端修复反应
①向200μL PCR管中加入6.5μL末端修复反应液、2μL末端修复酶、50μL打断的双链DNA和6.5μL去离子水；
②用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底；
③将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，运行表4所示程序。
表4
| 循环数 | 温度 | 时间 |
| 1 | 12℃ | 15min |
| 1 | 37℃ | 15min |
| 1 | 72℃ | 20min |
| 1 | 4℃ | Hold |
3.2接头连接
①向上述已完成DNA末端修复的反应液中加入14μL DNA连接缓冲液、2μL DNA连接酶、1μL 10pM接头和1.5μL去离子水；
②用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底；
③将上述PCR管置于PCR仪中，20℃温浴15min。
3.3DNA片段纯化
①将上步连接反应液转移至一新的1.5mL离心管中；
②将磁珠溶液涡旋振荡20s，加入一倍体积磁珠溶液至上一步离心管中，涡旋震荡5s后室温静置5min；
③短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠；
④继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μL新鲜配置的80％乙醇，室温放置30s，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清；
⑤保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μL新鲜配置的80％乙醇，室温放置30s，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清；
⑥保持离心管固定于磁力架上，室温静置10min，使磁珠在空气中干燥；
⑦将离心管从磁力架上取下，加入30μL去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5min；
⑧短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清，将洗脱液转移至一个新的PCR管中约25μL。
3.4 PCR扩增
①在PCR管中加入23μL上述已完成纯化的DNA片段.、25μL PCR扩增反应液、1μL通用引物和1μL标签引物；
②用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底。
③将上述PCR管置于PCR仪中，运行表5所示程序。
表5
3.5PCR产物纯化
纯化步骤同3.3。
4、上机测序
①样本稀释到4nM；
②样本进行NaOH变性，文库稀释到1.8pM浓度；
③在illumina测序平台进行测序。
5、数据分析
使用以上流程进行样品处理之后得到的数据进行过滤之后，与参考基因组进行比对，基于对比对结果的统计分析，得到待测样本目标染色体数目是否异常的检测结果，结果见图3和图4所示。
本实施例中所用试剂均为实施例1的用于无创胚胎植入前遗传性检测的试剂盒中的试剂。
根据图3和图4可以看出，PGT-A囊胚滋养层细胞活检和囊胚培养液检测结果一致。
实施例3：
将1例胞浆内单精子注射授精的胚胎样本，培养至囊胚期，取囊胚培养液检测染色体非整倍体，以及是否存在母源污染。
本实施例中所用试剂均为实施例1的用于无创胚胎植入前遗传性检测的试剂盒中的试剂。
具体包括以下步骤：
1、囊胚培养液样本采集
获取囊胚培养液样本：胞浆内单精子注射技术方式(ICSI)授精后，将受精卵培养至囊胚期。囊胚培养液用干净的吸管吸净，培养液5-20μL作为染色体非整倍体检测样本。
2、囊胚培养液全基因组扩增
2.1培养液样本裂解
将采集的培养液样本管中加入10-20μL裂解液，0.6-1.2μL裂解酶。震荡混匀，短暂离心后将PCR管置于PCR仪中50℃20min，95℃10min。
2.2预扩增
上步PCR管中加入5-10μL预扩增反应液，震荡混匀，短暂离心后置于PCR仪中，运行表6所示程序。
表6
2.3扩增
加入60-120μl扩增混合液于上步15-30μl预扩增反应产物中，运行表7所示程序。
表7
3、二代测序快速DNA建库
100ng-1μg打断的双链DNA
3.1DNA末端修复反应
①向200μL的PCR管中加入6.5μL末端修复反应液、2μL末端修复酶、50μL打断的DNA和6.5μL去离子水；
②用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底；
③将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，运行表8所示程序。
表8
| 循环数 | 温度 | 时间 |
| 1 | 12℃ | 15min |
| 1 | 37℃ | 15min |
| 1 | 72℃ | 20min |
| 1 | 4℃ | Hold |
3.2接头连接
①向上述已完成DNA末端修复的反应液中加入14μL DNA连接缓冲液，2μLDNA连接酶，1μL10pM接头，1.5μl去离子水；
②用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底；
③将上述PCR管置于PCR仪中，20℃温浴15min。
3.3DNA片段纯化
①将上步连接反应液转移至一新的1.5mL离心管中。
②将磁珠溶液涡旋振荡20s，加入一倍体积磁珠溶液至上一步离心管中，涡旋震荡5s后室温静置5min；
③短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠；
④继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μL新鲜配置的80％乙醇，室温放置30s，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清；
⑤保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80％乙醇，室温放置30s，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清；
⑥保持离心管固定于磁力架上，室温静置10min，使磁珠在空气中干燥；
⑦将离心管从磁力架上取下，加入30μL去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5min；
⑧短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清，将洗脱液转移至一个新的PCR管中约25μL。
3.4 PCR扩增
①在PCR管中加入23μl上述已完成纯化的DNA片段，25μL PCR扩增反应液、1μL通用引物、1μl标签引物。
②用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底。
③将上述PCR管置于PCR仪中，运行表9所示程序。
表9
3.5PCR产物纯化
纯化步骤同3.3。
4、上机测序
①样本稀释到4nM；
②样本进行NaOH变性，文库稀释到1.8pM浓度
③在illumina测序平台进行测序。
5、数据分析
使用以上流程进行样品处理之后得到的数据进行过滤之后，与参考基因组进行比对，基于对比对结果的统计分析，得到待测样本目标染色体数目是否异常的检测结果。
6、PCR反应
分别使用2.3中全基因组扩增产物及父母双方血液基因组DNA作为模板，不同突变位点及STR Marker的内引物在6管进行PCR反应，STR引物如表10所示，反应体系如表11所示，PCR反应程序如表12所示，引物序列见表13所示。
表10
| STR | 引物1 | 引物2 |
| D9S1794 | F1 | R1 |
| Vwa | F1 | R1 |
| D16S3112 | F1 | R1 |
| DXS8098 | F1 | R1 |
表11
表12
表13
7、毛细管基因分析仪
将PCR产物稀释后取少量与内标标记混匀后直接上ABI3130xl进行毛细管电泳。数据文件用GeneMapper4.0(Applied biosystems)进行分析。结果见表14和图5所示。
表14
| 染色体 | STR名称 | 培养液样本 | 母方 | 父方 |
| Chr.9 | D9S1794 | 149/158/154 | 149/158 | 154/156 |
| Chr.12 | Vwa | 222/235/226 | 222/235 | 213/226 |
| Chr.16 | D16S3112 | 119/127 | 119/127 | 123/129 |
| Chr.X | DXS8098 | 165/167 | 165/167 | 159 |
可以看出，4个STR Marker，其2个等位基因均来自母方，提示这个样品存在母源污染。
综上所述，本发明使用同时检测培养液样本和父母双方STR基因分型，来确认培养液样本是否存在母源污染，从而判断培养液染色体非整倍体检测结果是否准确可靠，提供了一种颗粒细胞是否去除完全的检测方法。本发明提供的方法，取样方便快捷，取样时均为胚胎冷冻保存常规操作，避免了复杂的显微操作活检程序及胚胎细胞取样风险，使用上述试剂盒进行针对囊胚培养液微量游离DNA优化的单细胞全基因组扩增技术，方法简单，便于操作，易于标准化，且结果准确。本发明提供的试剂盒可用于无创胚胎植入前遗传性检测，通过对预扩增混合液和扩增混合液配方的优化，使得整个全基因组扩增得到优化，避免了培养液中的成分对扩增产生抑制作用，使得扩增均一性好，单细胞扩增产量高，进而提升了数据质量、保证了较高的重复性和保真度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (4)
1.非诊断目的的用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、获取囊胚培养液样本，使用用于无创胚胎植入前遗传性检测的试剂盒进行全基因组扩增；
步骤2、取步骤1所得全基因组扩增产物进行文库制备；
步骤3、取步骤2所得文库样本进行二代测序检测，将得到的数据进行过滤之后，与参考基因组进行比对，基于对比对结果的统计分析，得到待测样本目标染色体数目是否异常的检测结果；
步骤4、取步骤1所得全基因组扩增产物及父母双方DNA样本进行短串联重复序列分析检测母源污染，根据STR基因分型结果，同一STR基因座下，检测全基因组扩增产物是否具有2个母亲特有STR型别，如有则认为囊胚培养液有母源污染；
所述试剂盒包括预扩增混合液、扩增混合液和STR引物；
所述预扩增混合液包括0.7mM dNTP、40mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10％DMSO、1μL1U/μL的高保真DNA聚合酶高保真DNA聚合酶和6uM引物；
所述扩增混合液包括0.6mMdNTP、40mM Tris-HCl、5mM MgCl2、8％DMSO、5U 1U/μL的高保真DNA聚合酶和2.5uM引物；
所述STR引物为D9S1794、Vwa、D16S3112、DXS8098中的至少一种；
所述D9S1794的正向引物的核苷酸序列为5’-GCAACCTATGTATGGGACTG-3，反向引物的核苷酸序列为5’FAM-CATAGATGGGCTTGATTAAAATG-3’；
所述Vwa的正向引物的核苷酸序列为5’AGGACAGATGATAAATACATAGGAT-3’，反向引物的核苷酸序列为5’FAM-GGTAGAGTTCCCACCTTCCA-3’；
所述D16S3112的正向引物的核苷酸序列为5’-CCCTGCAATTCTGGCTTC-3’，反向引物的核苷酸序列为5’-FAM-CCTGGGAGACCCTGTCAAA-3；
所述DXS8098的正向引物的核苷酸序列为5’-AGCAAAGACTACAACAGAATCCTA-3’，反向引物的核苷酸序列为5’FAM-AAGTAGACCCTGGACTCTGGA-3’。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的的用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法，其特征在于，所述Tris-HCl的pH为7.5。
3.根据权利要求1所述的非诊断目的的用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法，其特征在于，还包括裂解液和裂解酶。
4.根据权利要求3所述的非诊断目的的用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法，其特征在于，所述裂解液包括pH为8.3的25mM Tris-HCl、裂解液总体积0.05％的Triton X-100和1.5mM EDTA；所述裂解酶为2mg/ml的蛋白酶K。
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