CN106086199A - 一种利用不含透明带的囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用不含透明带的囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，具体地，本发明提供了一种体外非治疗性的利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，包括步骤：(a)提供一来自囊胚培养体系的培养液，其中，所述囊胚培养体系中的胚胎在培养前已去除透明带，所述胚胎在所述囊胚培养体系中培养3‑6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出所述培养液；(b)对所述培养液进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。本发明提供的方法可去除IVF和ICSI技术过程中多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险，并可精确的鉴定胚胎染色体是否异常。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学和分子细胞生物学领域，具体地，涉及一种利用不含透明带的囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法。
背景技术
辅助生殖技术已经成为治疗不孕不育的重要手段，随着技术水平的不断提高，辅助生殖的临床妊娠率也不断升高，但是胚胎种植率并没有显著性升高。胚胎的质量是影响胚胎种植的主要因素，目前优质胚胎的选择主要通过胚胎发育形态学评分，主观性较大并不能从根本上区分胚胎质量好坏。有研究表明即使是一些形态良好的优质囊胚是非整倍体，或者染色体整倍体胚胎它的形态学评分并不高。因此仅仅依靠胚胎形态学评价并不能保证移植的胚胎染色体是正常的。大量研究表明体外受精来源的胚胎有相当部分是染色体非整倍体，尤其是来自高龄不孕女性的胚胎。移植非整倍体胚胎导致移植后着床失败或流产，也是目前试管婴儿成功低的主要原因。
应用胚胎植入前遗传学筛查(Pre-implementation Genetic Screen，PGS)选择染色正常的胚胎，能够有效提高试管婴儿胚胎种植成功率，同时降低妊娠流产率。然而PGS检测需对胚胎进行活检，从胚胎中取出1至数个细胞进行检测，存在胚胎损伤风险。而目前的利用囊胚培养液检查胚胎染色体的方法也存在着IVF和ICSI技术过程中多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险。
在IVF技术过程中，数亿条精子与一个卵子在体外人工培养环境中混合。其结果是有多条精子同时卵子结合，虽然只有一条精子与卵子完成正常受精，其他无法完成受精的多余精子仍滞留在卵细胞外周的透明带中。另外，此时也会有大量母体来源的颗粒细胞粘附在卵子外周的透明带上。这些滞留在透明带中的多余精子和粘附在透明带表面的颗粒细胞在受精卵体外培养，发育成囊胚的过程中可能将DNA释放到培养液中，因此囊胚培养液中的DNA容易受到精子和颗粒细胞DNA的污染。
在ICSI技术过程中，将单个精子注射入卵子的技术方法避免了多余精子对囊胚培养液的污染。但卵子透明带上粘附的母体来源的颗粒细胞仍然会对对囊胚培养造成污染并对后续检测形成干扰。
因此，本领域迫切需要开发一种既可去除IVF和ICSI技术过程中多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险，又能精确的鉴定胚胎染色体是否异常的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种既可去除IVF和ICSI技术过程中多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险，又能精确的鉴定胚胎染色体是否异常的方法。
本发明的第一方面提供了一种体外利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，包括步骤：
(a)提供一来自囊胚培养体系的培养液，其中，所述囊胚培养体系中的胚胎在培养前已去除透明带，所述胚胎在所述囊胚培养体系中培养3-6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出所述培养液；
(b)对所述培养液进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
在另一优选例中，所述囊胚培养体系中仅含有一个胚胎。
在另一优选例中，所述囊胚培养体系为单胚胎培养体系，并且在所述单胚胎培养体系中没有透明带，含有10-100微升，较佳地，15-50微升，更佳地，20-35微升的培养液。
在另一优选例中，所述步骤(a)中分离出的培养液的体积为所述单胚胎培养体系中培养液体积的30-100％，较佳地，40-100％，更佳地，50-100％，最佳地，80-100％。
在另一优选例中，所述步骤(b)中还包括步骤(c)：
(i)将所述培养液与裂解液混合，从而获得含有所述培养液与裂解液的第一混合物；
(ii)将所述第一混合物与裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，从而获得裂解产物；和
(iii)对所述裂解产物进行基因组分析，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
在另一优选例中，所述基因组分析的方法选自下组：二代测序、核酸芯片、免疫荧光检测、荧光PCR检测、一代测序、三代测序、质谱检测、或其组合。
在另一优选例中，所述裂解液选自下组：Tris缓冲液、螯合剂、盐酸盐、非离子型表面活性剂、或其组合。
在另一优选例中，所述Tris缓冲液包括Tris-Cl。
在另一优选例中，所述Tris缓冲液的浓度为10-60mM，较佳地，15-50mM，更佳地，20-40mM。
在另一优选例中，所述Tris缓冲液的pH为5-10，较佳地，6-9，更佳地，7-8。
在另一优选例中，所述螯合剂包括EDTA。
在另一优选例中，所述螯合剂的浓度为0.2-8mM，较佳地，0.5-6mM，更佳地，1-4mM。
在另一优选例中，所述盐酸盐选自下组：KCl、NaCl、或其组合。
在另一优选例中，所述盐酸盐的浓度为5-60mM，较佳地，8-40nM，更佳地，10-40mM。
在另一优选例中，所述非离子型表面活性剂选自下组：Triton X-100、Triton X-114、吐温20、NP40、SDS、或其组合。
在另一优选例中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.02-10％，较佳地，0.05-5％，更佳地，0.1-3％，以所述裂解液的总重计。
在另一优选例中，所述步骤(i)中，培养液与裂解液的体积比为1：10－10：1，较佳地，1：5－5：1，更佳地，1：2—2：1。
在另一优选例中，所述裂解酶选自下组：蛋白酶K、Qiagen Protease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、或其组合。
在另一优选例中，所述裂解酶的浓度为1-25μg/ml，较佳地，5-20μg/ml，更佳地，10-15μg/ml。
在另一优选例中，所述裂解酶的添加量为0.1-10μl，较佳地，0.5-6μl，更佳地，0.8-3μl。
在另一优选例中，所述步骤(c)包括选自下组的一个或多个特征：
(i)孵育温度为20-70℃，较佳地，30-60℃；
(ii)孵育时间为1min－12h，较佳地，10min－6h，更佳地，30min－2h；
(iii)失活温度为60-100℃，较佳地，75-95℃；
(iv)失活时间为0.5-20min，较佳地，10-15min；
在另一优选例中，所述培养液用如下方法获得：
(i)培养受精卵胚胎至3-6天(较佳地，4天)后，去除所述胚胎的透明带，从而获得不含透明带的胚胎；
(ii)将步骤(i)的不含透明带的胚胎转移到囊胚培养微滴中培养0.5-3天(较佳地，1－2天)，从而获得含有囊胚的培养液；和
(iii)分离步骤(ii)中获得的培养液，即为用于鉴定所述胚胎染色体是否异常的培养液。
在另一优选例中，所述囊胚培养微滴的体积为10-100微升，较佳地，15-50微升，更佳地，20－35微升。
在另一优选例中，所述方法为非治疗和非诊断性的。
本发明第二方面提供了一种制备基因检测样本或染色体检测样本的方法，包括步骤：
(i)提供一培养体系，所述培养体系中含有去除透明带的胚胎，培养3-6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出液体，即为所述检测样本。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(ii)：对获得的所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
在另一优选例中，所述培养体系中仅含有一个胚胎。
在另一优选例中，所述培养体系为单胚胎培养体系，含有10-100微升，较佳地，15-50微升，更佳地，20－35微升的培养液。
在另一优选例中，步骤(ii)中，所述检测样本的体积为所述培养体系中培养液体积的30-100％，较佳地，40-100％，更佳地，50-100％，最佳地，80-100％。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，对所述检测样本进行离心，取上清液，进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了在对常规的ICSI胚胎进行检测时，因受到颗粒细胞污染的干扰，NICS检测结果(1a)出现偏差，与常规PGS(胚胎有损活检)检测结果(1b)不一致。
图2显示了在对常规的IVF胚胎进行检测时，因受到多余精子污染的干扰，NICS检测(2a)结果出现偏差，与常规PGS(胚胎有损活检)检测结果(2b)不一致。
图3显示了使用本发明的技术方案对一个正常IVF胚胎进行检测时，因排除了干扰，NICS检测(3a)结果准确，与常规PGS(胚胎有损活检)检测结果(3b)一致。
图4显示了使用本发明的技术方案对一个异常IVF胚胎进行检测时，因排除了干扰，NICS检测(4a)结果准确，与常规PGS(胚胎有损活检)检测结果(4b)一致。
具体实施方式
本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次意外地发现，完在去除透明带后，采用单胚胎培养体系，在20-30微升的培养液中对胚胎进行培养，取出少量培养液进行检测后发现，所得到的染色体异常的检测结果具有极高的精确性，可极大程度的排除多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险。在此基础上，本发明人完成了本发明。
IVF胚胎
IVF指in vitro fertilization(试管婴儿、体外受精),具体指体外受精联合胚胎移植技术(IVF)，又称试管婴儿，是指分别将卵子与精子取出后，置于试管内使其受精，再将胚胎前体—受精卵移植回母体子宫内发育成胎儿的技术。
ICSI
ICSI(Intracytoplasmic sperm injection)即卵胞浆内单精子显微注射技术，也就是第二代“试管婴儿”，该技术是借助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精。
透明带
卵的外面具有外被(coat)，其成分主要是糖蛋白，是由卵细胞或其它细胞分泌的。在哺乳动物中这种外被叫做透明带(zona pellucida)，其作用是保护卵子，阻止异种精子进入。
检测方法
本发明提供了一种对囊胚进行培养后的乏培养液(depleted medium)(即从所述培养体系中分离出的培养液)进行基因检测，从而鉴定胚胎染色体是否异常的方法。
在本发明中，对囊胚进行培养后的“乏”培养液(即从所述培养体系中分离出的培养液)进行基因检测的方法不受特别的限制，可用常规方法进行检测，如二代测序、核酸芯片、免疫荧光检测、荧光PCR检测、一代测序、三代测序、质谱检测、或其组合。
在一种实施方式中，所述检测方法包括如下步骤：
(a)提供一来自囊胚培养体系的培养液，其中，所述囊胚培养体系中的胚胎在培养前已去除透明带，所述胚胎在所述囊胚培养体系中培养3-6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出所述培养液；
(b)对所述培养液进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
在一优选实施方式中，所述步骤(b)中还包括步骤(c)：
(i)将所述培养液与裂解液混合，从而获得含有所述囊胚培养液与裂解液的第一混合物；
(ii)将所述第一混合物与裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，从而获得裂解产物；和
(iii)对所述裂解产物进行基因组分析，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
样本制备及其检测
本发明还提供了一种制备基因检测样本或染色体检测样本的方法，包括步骤：
(i)提供一培养体系，所述培养体系中含有去除透明带的胚胎，培养3-6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出液体，即为所述检测样本。
在一优选实施方式中，所述方法还包括步骤(ii)：对所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
透明带的去除
去除透明带的方法包括(但不限于)：机械剥除、激光去除、Tyrode液消化等方法。具体去除透明带的方法参见参考文献1(A comparison of four different techniquesof assisted hatching,2002)。
在本发明中，由于机械剥除方法去除透明带的效果更好，并且所得到的胚胎更完整，能够排除各种物质的干扰，因此，本发明选择机械剥除方法去除透明带，具体地，在本发明中，用常规机械剥除方法和市售设备去除透明带。
本发明的主要优点包括：
(1)在本发明中，完全去除透明带后，将胚胎在20-30微升的培养液中培养，并且对少量的培养液进行检测，所得到的染色体异常的检测结果居然具有极高的精确性，可极大程度的排除多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险。
(2)本发明采用单胚胎培养体系，即一个培养液微滴中只培养一个胚胎，该体系所得到的染色体异常的检测结果更准确。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明所用的材料如无特别说明，均为市售产品。
Qiagen Protease：粗制蛋白酶，购自凯杰公司。
通用方法
培养液的获得
(1)受精卵(在志愿者夫妇中，从女性志愿者中获取卵子，从男性志愿者中获取精子，体外受精，即得到受精卵)在体外培养至第3天到第6天，较佳地，第4天，即胚胎发育至桑葚胚，卵裂球完全融合时，此时胚胎与透明带之间产生较大空隙。
(2)利用机械剥除方法(如PIZO等机械方法)剥除胚胎周围透明带，用135微米剥卵针轻柔吹吸胚胎，使透明带与胚胎完全分离。
(3)将至少3个去除透明带的胚胎分别依次转移到至少3个30微升囊胚培养液微滴(保证一个微滴中只有一个胚胎)，每个微滴轻柔吹吸漂洗2-3次，之后再将胚胎转移至37℃，5％CO2，5％O2条件下，过夜平衡微滴(30微升)中继续培养至囊胚。
(4)将步骤(3)中获取囊胚的培养液(即乏培养液)(体积约为24-30微升)转移至30微升裂解液(pH 7.8的30mM Tris-Cl,2mM EDTA,20mM KCl,0.2％Triton X-100)中，用记号笔在采集管上标记样本名称。微型离心机离心30秒。样本可立即进入下一步全基因组扩增步骤或放入-20℃或-80℃冷冻保存。
囊胚培养液中微量DNA的全基因组扩增
(1)将囊胚培养液与裂解液的混合物于室温下融解。
(2)向管中加入1微升裂解酶(12.5μg/ml Qiagen Protease)，上下吹打混匀。
(3)将管子置于50℃孵育90分钟。
(4)将管子置于80℃10分钟以失活裂解酶。
(5)从管中取出10微升裂解产物加入一个PCR反应管中.
(6)向PCR反应管中加入60微升预扩增混合液。
(7)将PCR反应管置于PCR仪中进行预扩增，热循环程序为：
(8)向PCR反应管中加入60微升扩增混合液(所述扩增混合液的成分为10-25mMTris-HCl，5-25mM(NH4)2SO4，5-30mM KCl，0.5-5mM MgSO4，0.1％-20％DMSO和0.05-5％Triton X-100。优选地，所述扩增混合液的成分为15mM Tris-HCl，15mM(NH4)2SO4，20mMKCl，1mM MgSO4，5％DMSO和2％Triton X-100)。
(9)将PCR反应管置于PCR仪中进行指数式扩增，热循环程序为：
NICS方法
(1)将囊胚培养液与裂解液的混合物于室温下融解。
(2)向管中加入1微升裂解酶(12.5μg/ml Qiagen Protease，上下吹打混匀。
(3)将管子置于50℃孵育90分钟。
(4)将管子置于80℃10分钟以失活裂解酶。
(5)从管中取出10微升裂解产物加入一个PCR反应管中.
(6)向PCR反应管中加入60微升预扩增混合液。
(7)将PCR反应管置于PCR仪中进行预扩增，热循环程序为：
(8)向PCR反应管中加入60微升扩增混合液(所述扩增混合液的成分为10-25mMTris-HCl，5-25mM(NH4)2SO4，5-30mM KCl，0.5-5mM MgSO4，0.1％-20％DMSO和0.05-5％Triton X-100。优选地，所述扩增混合液的成分为15mM Tris-HCl，15mM(NH4)2SO4，20mMKCl，1mM MgSO4，5％DMSO和2％Triton X-100)。
(9)将PCR反应管置于PCR仪中进行指数式扩增，热循环程序为：
(10)将扩增后的DNA产物按常规方法进行二代测序，以鉴定胚胎的染色体状态是否正常。
样品的处理与样本的获得
样品：从5对志愿者夫妇中，分别取5个受精卵(其中，从女性志愿者中取卵子，从男性志愿者中取精子，体外受精，从而获得受精卵)。
样品处理及样本获得：
(1)将受精卵体外培养至第3天到第6天，较佳地，第4天，即胚胎发育至桑葚胚，卵裂球完全融合时，此时胚胎与透明带之间产生较大空隙。
(2)利用机械剥除方法(如PIZO等机械方法)剥除胚胎周围透明带，用135微米剥卵针轻柔吹吸胚胎，使透明带与胚胎完全分离。
(3)将至少3个去除透明带的胚胎分别依次转移到至少3个30微升囊胚培养液微滴(保证一个微滴中只有一个胚胎)，每个微滴轻柔吹吸漂洗2-3次，之后再将胚胎转移至37℃，5％CO2，5％O2条件下，过夜平衡微滴(30微升)中继续培养至囊胚。
(4)将取30微升(体积)(已补充)的培养液(即乏培养液)(体积约为24-30微升)，并将其转移至30微升裂解液(pH 7.8的30mM Tris-Cl,2mM EDTA,20mM KCl,0.2％Triton X-100)中，即获得去除透明带的培养液样本,微型离心机离心30秒,进入下一步全基因组扩增步骤或放入-20℃或-80℃冷冻保存。
实施例1
利用本发明的检测方法(即在桑葚胚期对胚胎透明带进行剥离，再换液培养)，对两个IVF胚胎(样本C和D)分别以囊胚细胞活检检测的方法和囊胚培养液检测的方法评估其染色体状态。囊胚培养液检测方法获得了与囊胚细胞检测方法相同的结果。
二代测序数据的结果表明，在C样本中，囊胚培养液检测方法(图3a)与囊胚细胞检测方法(图3b)均检出染色体正常。在D样本中，囊胚培养液检测方法(图4a)与囊胚细胞检测方法(图4b)均检出2号染色体部分区段有缺失，4号染色体部分区段有扩增。
将C样本的受精卵植入夫妻亲本母亲的子宫中，可得到染色体状态正常，且能够正常发育的胚胎。
对比例1
利用常规NICS方法(即仅换液，不去透明带培养)对一个ICSI胚胎的囊胚培养液和囊胚活检细胞分别进行检测以评估其染色体状态。以囊胚活检细胞检测结果作为标准对囊胚培养液检测结果进行评估。
二代测序的结果表明，与囊胚活检细胞检测方法(图1b)相比，囊胚培养液检测方法(图1a)检测结果存在颗粒细胞污染，导致X染色体出现假阳性扩增，同时6号染色体和16号染色体的扩增变异不能检出。
对比例2
利用常规NICS方法(即仅换液，不去透明带培养)对一个IVF胚胎的囊胚培养液和囊胚活检细胞分别进行检测以评估其染色体状态。以囊胚活检细胞检测结果作为标准对囊胚培养液检测结果进行评估。
二代测序的结果表明，与囊胚活检细胞检测方法(图2b)相比，囊胚培养液检测方法(图2a)结果存在有精子污染，导致X染色体拷贝数假阳性缺失，一号染色体缺失未能检出，两种方法检测结果不一致。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种体外非治疗性的利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一来自囊胚培养体系的培养液，其中，所述囊胚培养体系中的胚胎在培养前已去除透明带，所述胚胎在所述囊胚培养体系中培养3-6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出所述培养液；
(b)对所述培养液进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊胚培养体系为单胚胎培养体系，并且在所述单胚胎培养体系中没有透明带，含有10-100微升，较佳地，15-50微升，更佳地，20-35微升的培养液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中分离出的培养液的体积为所述单胚胎培养体系中培养液体积的30-100％，较佳地，40-100％，更佳地，50-100％，最佳地，80-100％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中还包括步骤(c)：
(i)将所述培养液与裂解液混合，从而获得含有所述培养液与裂解液的第一混合物；
(ii)将所述第一混合物与裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，从而获得裂解产物；和
(iii)对所述裂解产物进行基因组分析，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因组分析的方法选自下组：二代测序、核酸芯片、免疫荧光检测、荧光PCR检测、一代测序、三代测序、质谱检测、或其组合。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解液选自下组：Tris缓冲液、螯合剂、盐酸盐、非离子型表面活性剂、或其组合。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中，培养液与裂解液的体积比为1：10－10：1，较佳地，1：5－5：1，更佳地，1：2—2：1。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解酶的浓度为1-25μg/ml，较佳地，5-20μg/ml，更佳地，10-15μg/ml。
9.一种制备基因检测样本或染色体检测样本的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供一培养体系，所述培养体系中含有去除透明带的胚胎，培养3-6天，较佳地，4天后，从所述培养体系中分离出液体，即为所述检测样本。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(ii)：对获得的所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述胚胎染色体是否异常。
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Cited By (6)
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|---|---|---|---|---|
| WO2018006706A1 (zh) * | 2016-07-05 | 2018-01-11 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 一种利用不含透明带的囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法 |
| WO2020135713A1 (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-02 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品 |
| CN111440857A (zh) * | 2020-03-11 | 2020-07-24 | 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 | 用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法 |
| CN112592886A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-04-02 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 一种收集ivf-et患者胚胎培养液的方法及其应用 |
| WO2022017414A1 (zh) * | 2020-07-21 | 2022-01-27 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 用于无创胚胎移植优先级评级的系统和方法 |
| CN114107182A (zh) * | 2022-01-07 | 2022-03-01 | 徐维海 | 一种提高囊胚形成率的方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110846310B (zh) * | 2018-08-21 | 2024-03-22 | 深圳华大法医科技有限公司 | Snp位点集及胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的方法和用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104711362A (zh) * | 2015-03-27 | 2015-06-17 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN105368936A (zh) * | 2015-11-05 | 2016-03-02 | 上海序康医疗科技有限公司 | 一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ASSOU，S. 等: "Non-invasive pre-implantation genetic diagnosis of X-linked disorders", 《MEDICAL HYPOTHESES》 * |
| 戴黎华: "胚胎植入前遗传学诊断的进展", 《江西医学院学报》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018006706A1 (zh) * | 2016-07-05 | 2018-01-11 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 一种利用不含透明带的囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法 |
| WO2020135713A1 (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-02 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品 |
| CN113286892A (zh) * | 2018-12-29 | 2021-08-20 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品 |
| CN113286892B (zh) * | 2018-12-29 | 2024-02-23 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品 |
| CN111440857A (zh) * | 2020-03-11 | 2020-07-24 | 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 | 用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法 |
| WO2022017414A1 (zh) * | 2020-07-21 | 2022-01-27 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 用于无创胚胎移植优先级评级的系统和方法 |
| CN112592886A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-04-02 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 一种收集ivf-et患者胚胎培养液的方法及其应用 |
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