CN114107182A - 一种提高囊胚形成率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高囊胚形成率的方法。具体地，本发明提供一种囊胚的制备方法，所述的方法包括步骤：(1)将受精卵培养成胚胎；(2)对胚胎的透明带进行单点贯穿打孔后，继续培养，得到囊胚。本发明所述的方法能够显著提高囊胚形成率和囊胚可利用率，从而提高不孕症的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，具体涉及一种提高囊胚形成率的方法。
背景技术
体外受精—胚胎移植(俗称试管婴儿)技术是治疗不孕症的有效手段，目前治疗的成功率在50-60％，移植高质量的胚胎是获得治疗成功的关键因素，然而体外培养形成的胚胎中约有40％发育质量较差，更有近2成治疗患者因无法获得高质量的胚胎使其治疗效率低下失去进一步治疗的机会。
囊胚是早期胚胎发育的高级阶段，将囊胚移植入子宫有极高的种植机会，目前在试管婴儿治疗中移植囊胚的比例日趋增加。然而不是所有早期胚胎都能发育至囊胚，尤其是低等级胚胎，其形成囊胚的概率更低。目前对于试管婴儿中形成的低等级胚胎，可选择直接用于移植，但妊娠的几率较低；对其进行囊胚培养后移植形成的囊胚可以提高移植周期的妊娠率，但存在囊胚形成率低下的现实。
针对低等级胚胎的囊胚培养手段，目前主要有以下一些操作技术：(1)姑息培养：将低等级胚胎直接置入囊胚培养液中培养至胚胎龄的第五或第六天，然后根据发育结果选择可利用的囊胚进行相应处置。(2)显微美容：通过对低等级胚胎进行去碎片化美容，减少有害物质对胚胎发育的影响，增加获得囊胚的机会。(3)激光削薄透明带：对培养至第二或第三天对胚胎进行部分透明带激光削薄，然后进行囊胚培养。然而，在对低等级胚胎进行姑息培养时，由于胚胎本身质量问题，并且多数低等级胚胎内部含有较高比例的碎片等物质，对胚胎发育有毒害作用，因此这种姑息式培养方法的囊胚形成率较低。去碎片化美容可以减少有害物质对胚胎发育的影响，但由于操作过程也可造成胚胎有效成分的丢失，也降低胚胎的发育；并且这种技术操作耗时耗力，缺乏临床应用价值，多停留于研究阶段。选择第二或第三天对胚胎进行部分透明带激光削薄是临床较常使用的一种操作方法，但由于该阶段胚胎处于母胎基因转换的关键时期，高能量激光作用可能影响基因的正常表达，因此临床上并未显示能改善囊胚形成效果。
因此，本领域需要开发一种有效、易于临床操作的技术手段提高低等级胚胎的囊胚形成率，从而提高不孕症的治疗成功率。
发明内容
本发明的目的在于开发一种囊胚形成率和囊胚可利用率显著提高的囊胚制备方法。
本发明第一方面，提供一种囊胚的制备方法，所述的方法包括步骤：
(1)将受精卵培养成胚胎；
(2)对胚胎的透明带进行单点贯穿打孔后，继续培养，得到囊胚。
优选地，所述的囊胚为低等级胚胎囊胚。
优选地，所述的方法为体外方法。
优选地，所述的方法为非诊断和非治疗性方法。
优选地，所述的囊胚为人或非人哺乳动物囊胚。
优选地，所述的非人哺乳动物为灵长类动物。
优选地，所述的非人哺乳动物为猩猩、猴、狒狒、狗、猫或鼠。
优选地，所述步骤(1)中，所述的胚胎为第四天胚龄的胚胎。
优选地，所述步骤(1)中，所述的培养为体外培养。
优选地，所述步骤(1)中，所述培养的培养液为COOK公司的序贯培养体系。
优选地，所述步骤(1)中，所述的受精卵的受精培养液为FM。
优选地，所述步骤(1)中，所述胚胎的培养液为CM。
优选地，所述的方法能够提高囊胚形成率。
优选地，所述的步骤(2)中，得到的囊胚的囊胚形成率为48-60％，较佳地50-55％，更佳地50-53％。
优选地，所述的方法能够提高可利用囊胚率。
优选地，所述的步骤(2)中，得到的囊胚的可利用囊胚率为28-40％，较佳地30-35％，更佳地30-33％。
优选地，所述的“可利用囊胚率”是指能够用于移植到母体子宫的囊胚比率。
优选地，所述的打孔采用激光进行打孔。
优选地，激光的工作参数为1460-1500nm红外-二极管波长激光，聚焦能量为145-155J，发射时间为2.4-2.8ms，开口直径为8-12μm。
优选地，激光的工作参数为1480nm红外二极管波长激光，聚焦能量为150J，发射时间为2.6ms，开口直径为10μm。
优选地，所述的步骤(2)中，所述的继续培养的天数为1天、2天或3天。
优选地，所述的步骤(2)中，所述囊胚为第五天或第六天胚龄的囊胚。
优选地，所述的步骤(2)中，所述囊胚为第六天胚龄的囊胚。
优选地，所述的培养条件为6％CO2、5％O2和89％N2，温度为37.0℃。
本发明第二方面，提供一种囊胚，所述的囊胚通过如本发明第一方面所述的方法制备。
本发明第三方面，提供一种如本发明第二方面所述的囊胚的用途，其用于制备治疗不孕症的组合物。
优选地，所述的囊胚通过移植到母体子宫进行发育来治疗不孕症。
本发明第四方面，提供一种治疗治疗不孕症的方法，所述的方法包括步骤：
将如本发明第二方面所述的囊胚移植到母体子宫进行发育来治疗不孕症
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
附图说明
图1为不同操作处理后的胚胎状况，其中，(a)第四天胚龄未行激光技术操作的含碎片低等级胚胎；(b)未进行激光技术操作的含碎片低等级胚胎形成的第六天胚龄囊胚，容易发生细胞发黑退化现象，囊胚的细胞结构模糊；(c)第四天胚龄的胚胎进行透明带单点贯穿打孔的含碎片低等级胚胎；(d)第四天胚龄的胚胎进行透明带单点贯穿打孔的含碎片低等级胚胎形成的第六天胚龄囊胚，囊胚容易从透明带内孵出，细胞结构清晰。
具体实施方式
本发明开发了一种囊胚的制备方法，所述方法通过对胚胎的透明带进行单点贯穿打孔后，得到囊胚形成率和囊胚可利用率显著提高的低等级胚胎囊胚的形成，通过将囊胚移植到母体子宫进行发育来提高不孕症的治疗效果。
术语
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“胚龄”是指胚胎发育持续的时间，受精卵形成(第1天胚龄)后，培养一天为第2天胚龄，依次类推，如第六天胚龄的囊胚为受精卵形成后培养5天形成的囊胚。
囊胚及其制备方法
本发明提供一种囊胚的制备方法，所述的方法包括步骤：
(1)将受精卵培养成胚胎；
(2)对胚胎的透明带进行单点贯穿打孔后，继续培养，得到囊胚。
在本发明的一个优选例中，所述的方法为体外方法、非诊断和/或非治疗性方法。
本发明所述的囊胚优选为人或非人哺乳动物囊胚。所述的非人哺乳动物可以为灵长类动物，例如猩猩、猴、狒狒、狗、猫或鼠。
在本发明的一个优选例中，所述步骤(1)中，所述的胚胎为第四天胚龄的胚胎。
本发明所述的的培养体系可以为COOK公司的序贯培养体系。例如所述的受精卵的受精培养液为FM，所述胚胎的培养液为CM。本发明所述的培养条件为6％CO2、5％O2和89％N2，温度为37.0℃。
本发明所述的囊胚的制备方法能够提高囊胚形成率。
在本发明的一个优选例中，所述的步骤(2)中，得到的囊胚的囊胚形成率为48-60％，较佳地50-55％，更佳地50-53％。
本发明所述的囊胚的制备方法能够提高可利用囊胚率。
在本发明的一个优选例中，所述的步骤(2)中，得到的囊胚的可利用囊胚率为28-40％，较佳地30-35％，更佳地30-33％。
优选地，所述的“可利用囊胚率”是指能够用于移植到母体子宫的囊胚比率。
在本发明的一个优选例中，所述的打孔采用激光进行打孔。
优选地，激光的工作参数为1460-1500nm红外-二极管波长激光，聚焦能量为145-155J，发射时间为2.4-2.8ms，开口直径为8-12μm。
优选地，激光的工作参数为1480nm红外二极管波长激光，聚焦能量为150J，发射时间为2.6ms，开口直径为10μm。
在本发明的一个优选例中，所述的步骤(2)中，所述的继续培养的天数为1天、2天或3天。
优选地，所述的步骤(2)中，所述囊胚为第五天或第六天胚龄的囊胚。
用途
本发明还提供一种本发明所述的囊胚的用途，用于制备治疗不孕症的组合物。
本发明所述的囊胚可以通过移植到母体子宫进行发育来治疗不孕症。
本发明所述的组合物还可以包括载体(如水、缓冲液等等)，所述的载体能够协助将囊胚可以通过移植到母体子宫进行发育来治疗不孕症
本发明取得的主要技术效果包括：
1、本发明开发了一种囊胚的制备方法，所述方法通过对胚胎的透明带进行单点贯穿打孔后，得到囊胚形成率和囊胚可利用率显著提高的低等级胚胎囊胚形成，通过将囊胚移植到母体子宫进行发育来提高不孕症的治疗效果。
2、本发明所述的囊胚的制备方法简单、易于操作。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下具体实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1人囊胚的制备
实验方法
1、体外受精后培养得到第四天胚龄的胚胎，培养液为COOK公司的序贯培养体系，受精培养液为FM，胚胎培养液为CM，培养箱参数为6％CO2、5％O2和89％N2，温度为37.0℃。
2、将第四天胚龄的胚胎置于辅助孵化激光设备下，分别设置设备的如下不同工作模式：
第一种：1/4透明带激光削薄操作是将切面1/4的透明带厚度切除3/4；
第二种：单点透明带贯穿打孔操作是将透明带打穿；
第三种：1/4透明带激光切除操作是将切面1/4的透明带完全切除；
其中，激光的工作参数为1480nm红外二极管波长激光，聚焦能量为150J，发射时间为2.6ms，开口直径为10μm。
3、激光操作后，将胚胎转移至培养箱中继续培养至第五天和第六天胚龄的囊胚，观察第五天和第六天胚龄的囊胚的形成情况和质量。
实验结果
不同胚龄、不同激光操作后的囊胚发育效果如下表1和图1所示：
表1不同胚龄、不同激光操作后的囊胚发育效果(囊胚形成率/可利用囊胚率比较)
备注：“可利用囊胚率”是指能够移植到母体子宫的囊胚比率。
从表1和图1中可以看出，实施例1制备囊胚具有优异的囊胚形成率和囊胚可利用率，因此，可以将囊胚移植到母体子宫进行发育来提高不孕症的治疗效果。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种囊胚的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)将受精卵培养成胚胎；
(2)对胚胎的透明带进行单点贯穿打孔后，继续培养，得到囊胚。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的囊胚为人或非人哺乳动物囊胚。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述的胚胎为第四天胚龄的胚胎。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，得到的囊胚的囊胚形成率为48-60％，较佳地50-55％，更佳地50-53％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，得到的囊胚的可利用囊胚率为28-40％，较佳地30-35％，更佳地30-33％。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，所述囊胚为第六天胚龄的囊胚。
7.一种囊胚，其特征在于，所述的囊胚通过如权利要求1所述的方法制备。
8.一种如权利要求7所述的囊胚的用途，其特征在于，用于制备治疗不孕症的组合物。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的囊胚通过移植到母体子宫进行发育来治疗不孕症。
10.一种治疗治疗不孕症的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
将如权利要求7所述的囊胚移植到母体子宫进行发育来治疗不孕症。
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