CN109536581A - 一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品。具体地，本发明提供了一种体外利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供第一囊胚培养体系，所述第一囊胚培养体系含有体外培养天数为D5‑D6的囊胚；(b)将所述囊胚转移到含新鲜囊胚培养液的第二囊胚培养体系中进行换液培养，所述换液培养的时间为T1，从而获得经培养的囊胚培养液；(c)将所述经培养的囊胚培养液取出，从而获得无细胞的经培养的囊胚培养液，即为检测样本；和(d)对所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述囊胚的健康状况。本发明提供的方法可去除IVF和ICSI技术过程中多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险，并可精确的鉴定胚胎的健康状况。

Description

一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品
技术领域
本发明涉及生物医学和分子细胞生物学领域，具体地，涉及一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品。
背景技术
胚胎植入前遗传学筛查(Preimplantation Genetic Screen，PGS)对体外培养胚胎的染色体状态进行检测，以筛选染色体正常的胚胎置入母亲子宫,从而将受孕成功率提高到60％左右。各种检测所需的生物样本都是从体外培养的胚胎中采集的一个至数个细胞、俗称活检，通过对这少量细胞的检测反映整个胚胎的染色体是否正常。理论上讲，吸取出来的几个细胞中的染色体状态与胚胎中其它细胞一致，检测这几个细胞即可了解该胚胎的染色体状态是否正常。一般认为，此时吸取几个滋养层细胞不会对胚胎发育造成不良影响，目前从已出生婴儿的健康状况来看，这一操作也确实没有健康影响。但是，细胞取样时对胚胎操作技术要求较高，如果稍操作不当会导致胚胎严重损伤，损伤过于严重可造成胚胎发育终止；即使良好操作，细胞取样时不可避免地对胚胎造成细胞损失和轻微损伤，尽管现在尚无证据表明细胞损失和轻微损伤会对胚胎发育和出生后健康发生不良影响，但该技术出现的时间尚短(仅数年)，其对人的终生健康是否存在远期影响仍然有待观察；在少数情况下，存在取样获得的几个细胞的染色体状态与胚胎中其它细胞的染色体状态不同的情况，导致检测结果失误。
近期，一种非活检的、不取胚胎细胞，仅利用废弃的囊胚培养液反应胚胎健康状况的方法得到研究，将原本废弃的囊胚培养液处理后进行检测分析，该检测分析结果可以间接的、且高精确性的反应出囊胚胚胎的健康状态，不取任何胚胎本身组分、不存在伦理问题，不会对胚胎带来任何损失、消除健康影响隐患，且操作简单，安全性高，反应胚胎结果的准确性更高。
具体的常规的处理方式为：新鲜的体外受精卵在培养基中培养至D3，D3将胚胎转移至囊胚培养液中继续培养至D5或D6，于D5或D6取走囊胚观察胚胎评级达到可冷冻级别后立刻实施冷冻操作，剩余的囊胚培养液即检测时所需要收集的样本；临床上选择体外受精的方式通常为IVF和ICSI两种，IVF通过多个精子和卵母细胞共培养完成受精，ICSI为单精子注射完整受精。IVF胚胎的透明带周围通常挂有多余精子，为避免精子的父源性DNA干扰，一般采用ICSI受精方式。
如Galluzzi-Extracellular embryo genomic DNA and its potential forgenotyping applications,该方法利用D3更换培养液，在该囊胚培养液中将胚胎从D3培养至D5/D6，然后采集囊胚培养液作为检测样本。如Vera-Rodriguez-IGENOMIX-Origin andcomposition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture duringpreimplantation development，该文献也是利用D3更换培养液，在该囊胚培养液中将胚胎从D3培养至D5/D6，然后采集囊胚培养液作为检测样本，并且只针对ICSI受精方式。如CN201510746098.X也是D3换培养液后直接培养至D5/D6，并且只针对ICSI受精方式。该常规处理方式与活检检测方式相比，胚胎结果的准确性大大提高，但是依然有约15％的假阴性率，主要是因为检测样本不可避免的受外源干扰，特别是母源干扰。在一些文件中可以看到稍区别于常规处理方式的方法，如Medium-Based Noninvasive Preimplantation GeneticDiagnosis for Human-Thalassemias-SEA，在D3更换培养基后，在D4再次更换培养基培养至D5/D6、采集该囊胚培养液作为检测样本。如Kuznyetsov-Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach，其中有一种利用新鲜胚胎，也在D4更换培养基培养至D5，收集激光皱缩后的囊胚腔液，只能针对ICSI样本，无法针对IVF样本。这些文献中将体外孵育时间提前到D4，于D5/D6采集，一方面检测样本体外孵育时间为12-36小时，孵育时间过长，依然不可避免的受外源干扰，使得胚胎来源的DNA比重降低，胚胎结果的准确性没有明显提高，依然约15％的假阴性率，且无法同时针对ICSI样本和IVF样本；另一方面在D4对胚胎进行观察或者操作，增加了额外的操作步骤，对胚胎发育会造成不可预知的影响，D4胚胎通常发育为桑葚期胚胎，是胚胎发育成囊胚的关键时期，桑椹胚的下一个时期即囊胚期，而成囊率是胚胎发育的关键指标，囊胚成囊后方可考虑移植或者冷冻等体外操作，因此临床上通常不会在D4的桑葚期对胚胎进行换培养液等体外操作，以免影响成囊率。
然而，目前的检测方法，由于检测样本不可避免的受外源干扰，特别是母源干扰，从而导致假阳性率太高，且无法同时针对ICSI样本和IVF样本。
因此，本领域迫切需要开发一种能够提高准确性、降低假阴性率的利用囊胚培养液作为检测样本，从而检测胚胎健康状况的适用于ICSI和IVF的方法和产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够提高准确性、降低假阴性率的利用囊胚培养液作为检测样本，从而检测胚胎健康状况的适用于ICSI和IVF的方法和产品。
本发明的第一方面提供了一种体外利用囊胚培养液检测囊胚健康状况的方法，包括步骤：
(a)提供第一囊胚培养体系，所述第一囊胚培养体系含有体外培养天数为D5-D6的囊胚；
(b)将所述囊胚转移到含新鲜囊胚培养液的第二囊胚培养体系中进行换液培养，所述换液培养的时间为T1，从而获得经培养的囊胚培养液；
(c)将所述经培养的囊胚培养液取出，从而获得无细胞的经培养的囊胚培养液，即为检测样本；和
(d)对所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述囊胚的健康状况。
在另一优选例中，所述第一囊胚培养体系包括从头培养的囊胚培养体系(即从D1开始培养，并且未经换液)。
在另一优选例中，所述第一囊胚培养体系包括经历一次或多次换液后的末次囊胚培养体系(例如，所述的换液培养在D2－D3或D3-D4进行)。
在另一优选例中，“培养天数为D5-D6”包括D5±12小时或D6±12小时，较佳地D5±6小时，更佳地D5至D5+6小时。
在另一优选例中，所述的培养天数为D5指从培养开始后的第5天，其中，培养开始时设为第1天(D1)。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述囊胚体外培养之前为分阶段培养。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述囊胚体外培养之前包括第一期囊胚培养和第二期囊胚培养。
在另一优选例中，所述第一期囊胚培养包括在D1-D3(较佳地，D3±12h，更佳地，D3±8h，更佳地，D3±6h)，用卵裂期培养液进行培养。
在另一优选例中，所述第二期囊胚培养包括在D3－D5，用囊胚培养液进行培养。
在另一优选例中，所述T1时间为2-8h，较佳地，3-5h。
在另一优选例中，所述囊胚培养体系中对囊胚的透明带进行打孔。
在另一优选例中，所述透明带打孔的孔径为10－40μm，较佳地，10－30μm，更佳地，10－20μm。
在另一优选例中，所述方法具有以下一种或多种特征：
(i)信噪比高，信噪比(S1/S0＞2，较佳地，＞5，更佳地，＞10，其中S1为来自胚胎的信号，S0为来自背景的信号；
(ii)低假阴性率，假阴性率＜8％，较佳地，＜5％，更佳地，＜3％；
(iii)高准确性，准确率≥80％，较佳地，85％≥，更佳地，≥90％。
在另一优选例中，所述囊胚培养体系为单精受精的培养体系(或ICSI培养体系)。
在另一优选例中，所述囊胚培养体系为多精受精的培养体系(或IVF培养体系)。
在另一优选例中，所述囊胚培养体系中仅含有一个囊胚(胚胎)。
在另一优选例中，所述囊胚培养体系为单胚胎培养体系，并且在所述单胚胎培养体系中含有10-60微升，较佳地，10-50微升，更佳地，10－15微升的培养液。
在另一优选例中，所述步骤(a)中分离出的培养液的体积为所述单胚胎培养体系中培养液体积的50-100％，较佳地，70-100％，更佳地，80-100％，最佳地，90-100％。
在另一优选例中，所述步骤(d)中还包括步骤(e)：
(i)将所述培养液与裂解液混合，从而获得含有所述培养液与裂解液的第一混合物；
(ii)将所述第一混合物与裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，从而获得裂解产物；和
(iii)对所述裂解产物进行基因组分析，从而鉴定所述囊胚(胚胎)的健康状况。
在另一优选例中，所述胚胎的健康状况包括：染色体非整倍体、线粒体拷贝数、DNA含量是否正常、致病基因检测。
在另一优选例中，所述基因组分析方法包括NICS-INST的扩增方法以及分析方法。
在另一优选例中，所述基因组分析的方法选自下组：二代测序、核酸芯片、免疫荧光检测、荧光PCR检测、一代测序、三代测序、质谱检测、或其组合。
在另一优选例中，所述裂解液选自下组：Tris缓冲液、螯合剂、盐酸盐、非离子型表面活性剂、或其组合。
在另一优选例中，所述Tris缓冲液包括Tris-Cl。
在另一优选例中，所述Tris缓冲液的浓度为10-60mM，较佳地，15-50mM，更佳地，20-45mM。
在另一优选例中，所述Tris缓冲液的pH为5-10，较佳地，6-9，更佳地，7-8。
在另一优选例中，所述螯合剂包括EDTA。
在另一优选例中，所述螯合剂的浓度为0.2-8mM，较佳地，0.3-6mM，更佳地，0.5-4mM。
在另一优选例中，所述盐酸盐选自下组：KCl、NaCl、或其组合。
在另一优选例中，所述盐酸盐的浓度为5-60mM，较佳地，8-40nM，更佳地，10-40mM。
在另一优选例中，所述非离子型表面活性剂选自下组：Triton X-100、TritonX-114、吐温20、NP40、SDS、或其组合。
在另一优选例中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.02-10％，较佳地，0.05-5％，更佳地，0.1-3％，以所述裂解液的总重计。
在另一优选例中，所述步骤(i)中，培养液与裂解液的体积比为1：10－10：1，较佳地，1：5－5：1，更佳地，1：2—2：1。
在另一优选例中，所述裂解酶选自下组：蛋白酶K、Qiagen Protease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、或其组合。
在另一优选例中，所述裂解酶的浓度为1-25μg/ml，较佳地，5-20μg/ml，更佳地，10-15μg/ml。
在另一优选例中，所述裂解酶的添加量为0.1-10μl，较佳地，0.5-6μl，更佳地，0.8-3μl。
在另一优选例中，所述步骤(e)包括选自下组的一个或多个特征：
(i)孵育温度为20-70℃，较佳地，30-60℃；
(ii)孵育时间为1min－12h，较佳地，10min－6h，更佳地，30min－2h；
(iii)失活温度为60-100℃，较佳地，75-95℃；
(iv)失活时间为0.5-20min，较佳地，0.8-15min。
在另一优选例中，在步骤(iii)中，用PCR进行基因组分析时，PCR反应管中含有扩增混合液、0.5％-20％的PCR抑制物对抗剂、5-20mM dNTP、5-100μM NG和NT引物、50-200μM扩增引物、0.5-10单位核酸聚合酶，所述PCR抑制物对抗剂选自DMSO、甜菜碱、甲酰胺、甘油和白蛋白中的一种或多种，所述核酸聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、Klenow Fragment DNA聚合酶I、MMLV反转录酶、AMV反转录酶、HIV反转录酶、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、E.coli DNA聚合酶、LongAmp Taq DNA聚合酶和OneTaq DNA聚合酶中的一种或多种。
在另一优选例中，所述扩增混合液的成分为10-25mM Tris-HCl，5-25mM(NH4)2SO4，5-30mM KCl，0.5-5mM MgSO4，0.1％-20％DMSO和0.05-5％Triton X-100。
在另一优选例中，所述扩增混合液的成分优选为15mM Tris-HCl，15mM(NH4)2SO4，20mM KCl，1mM MgSO4，5％DMSO和2％Triton X-100。
在另一优选例中，所述NG和NT引物从5’端到3’端包含通用序列和可变序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四种碱基中的三种或者两种组成，条件是所述通用序列不同时包括G和C；所述扩增引物包含所述通用序列且不包含所述可变序列。
在另一优选例中，所述可变序列选自下组：(N)nGGG、(N)nTTT，(N)mTNTNG，(N)xGTGG(N)y，其中N为任意的可与天然核酸进行碱基配对的核苷酸，n是选自3-17的正整数，m是选自3-15的正整数，x和y分别是选自3-13的正整数。
在另一优选例中，在步骤(iii)中，用PCR进行基因组分析时的全基因组扩增的热循环程序如下所述：
(1)在介于90-98℃之间的第一变性温度反应5-20s；
(2)在介于5-15℃之间的第一退火温度反应5-60s，在介于15-25℃之间的第二退火温
度反应5-60s，在介于25-35℃之间的第三退火温度反应30-80s，在介于35-45℃之间的第
四退火温度反应5-60s，在介于45-55℃之间的第五退火温度反应5-60s；
(3)在介于55-80℃之间的第一延伸温度反应10-150min；
(4)在介于90-98℃之间的第二变性温度反应5-30s；
(5)在介于45-70℃之间的第六退火温度反应10-30s；
(6)在介于60-80℃之间的第二延伸温度反应1-10min；
(7)重复步骤(4)到(6)5至50个循环；
(8)在介于60-80℃之间的温度下继续延伸反应1-10min；
(9)将扩增后的产物在0-5℃下冷藏保存。
在另一优选例中，在步骤(iii)中，用PCR进行基因组分析时的全基因组扩增的热循环程序如下所述：
(1)在第一变性温度95℃下反应10s；
(2)在第一退火温度10℃下反应45s，在第二退火温度20℃下反应45s，在第三退火温
度30℃下反应60s，在第四退火温度40℃下反应45s，在第五退火温度50℃下反应45s；
(3)在第一延伸温度62℃下反应90min；
(4)在第二变性温度95℃下反应20s；
(5)在第六退火温度59℃下反应20s；
(6)在第二延伸温度72℃下反应3min；
(7)重复步骤(4)到(6)10至30个循环；
(8)在72℃下继续延伸反应5min；
(9)将扩增后的产物在4℃下冷藏保存。
在另一优选例中，所述方法为非治疗和非诊断性的。
本发明第二方面提供了一种制备基因检测样本或染色体检测样本的方法，包括步骤：
(a)提供第一囊胚培养体系，所述第一囊胚培养体系含有体外培养天数为D5-D6的囊胚；
(b)将所述囊胚转移到含新鲜囊胚培养液的第二囊胚培养体系中进行换液培养，所述换液培养的时间为T1，从而获得经培养的囊胚培养液；
(c)将所述经培养的囊胚培养液取出，从而获得无细胞的经培养的囊胚培养液，即为检测样本。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(d)：对获得的所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述囊胚(胚胎)的健康状况。
在另一优选例中，所述培养体系中仅含有一个囊胚(胚胎)。
在另一优选例中，所述培养体系为单胚胎培养体系，含有10-60微升，较佳地，10-50微升，更佳地，10－15微升的培养液。
在另一优选例中，步骤(c)中，所述检测样本的体积为所述培养体系中培养液体积的50-100％，较佳地，70-100％，更佳地，80-100％，最佳地，90-100％。
在另一优选例中，在步骤(d)中，对所述检测样本进行离心，取上清液，进行基因检测，从而鉴定所述囊胚(胚胎)的健康状况。
本发明第三方面提供了一种利用囊胚培养液检测囊胚健康状况的试剂盒，包括：
(i)第一容器，以及位于第一容器的卵裂期培养液；
(ii)第二容器，以及位于第二容器的第一囊胚培养液；
(iii)第三容器，以及位于第三容器的第二囊胚培养液；和
(iv)标签或说明书。
在另一优选例中，所述第一容器、第二容器、第三容器不同。
在另一优选例中，所述位于第一容器的卵裂期培养液用于D1-D3(较佳地，D3±12h，更佳地，D3±8h，更佳地，D3±6h)的卵裂胚培养。
在另一优选例中，所述位于第二容器的第一囊胚培养液用于D3-D5的囊胚培养。
在另一优选例中，所述位于第三容器的第二囊胚培养液用于D5-D6后的囊胚培养。
在另一优选例中，所述第一囊胚培养液和第二囊胚培养液的成分相同，均为G-2PLUS medium(Vitrolife)或Quinn’s Advantage Protein Plus blastocystmedium(SAGE)囊胚培养液。
在另一优选例中，所述卵裂期培养液为G-1PLUS medium(Vitrolife)或Quinn’sEmbryo maintenance medium(SAGE)卵裂期培养液。
本发明第四方面提供了一种辅助诊断囊胚健康状况的设备，包括：
(a)培养模块，所述培养模块包括囊胚后期培养模块，所述囊胚后期培养模块用于对培养天数为T1的囊胚进行换液，并进行囊胚后期培养一段时间(T2)；
(b)取样模块，所述取样模块用于将囊胚后期培养模块中经囊胚后期培养的囊胚的培养液取出，并作为检测样本；
(b)检测模块，所述检测模块用于将来自所述取样模块中的检测样本进行基因检测，从而获得检测结果；
(c)囊胚的健康状况的判别处理模块，基于所述检测结果，对胚胎的健康状况进行评价，从而获得囊胚的健康状况的评价结果
(d)输出模块，所述输出模块用于输出所述的囊胚的健康状况的评价结果。
在另一优选例中，所述T1为D5-D6。
在另一优选例中，所述T2时间为2-8h，较佳地，3-5h。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了检测样本暴露时间常规方式与本发明对比示意图。
图2显示了D3-D5采集培养液的CNV分析结果。
图3显示了D5采集培养液CNV分析结果。
具体实施方式
本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次意外地发现，在本发明的10-20微升的囊胚培养体系中的胚胎(囊胚)在囊胚培养液中培养至D5-D6天后，将所述胚胎转移到新鲜的囊胚培养液中进行培养，从所述新鲜的囊胚培养液中取出少量培养液进行检测后发现，所得到的胚胎健康状况(如染色体非整倍体、线粒体拷贝数，DNA含量是否正常，致病基因检测)的检测结果具有极高的精确性，并且，假阴性率极低(＜8％，较佳地，＜5％)，可极大程度的排除多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险。在此基础上，本发明人完成了本发明。
如本文所用，术语“囊胚”、“胚胎”可互换使用，指胚胎体外培养的终末阶段，它通常形成于卵子受精后的第5-7天。
IVF胚胎
IVF指in vitro fertilization(试管婴儿、体外受精),具体指体外受精联合胚胎移植技术(IVF)，又称试管婴儿，是指分别将卵子与精子取出后，置于试管内使其受精，再将胚胎前体—受精卵移植回母体子宫内发育成胎儿的技术。
ICSI
ICSI(Intracytoplasmic sperm injection)即卵胞浆内单精子显微注射技术，也就是第二代“试管婴儿”，该技术是借助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精。
检测方法
本发明提供了一种对囊胚进行培养后的乏培养液(depleted medium)(即从所述培养体系中分离出的培养液)进行基因检测，从而鉴定胚胎的健康状况。
在本发明中，对囊胚进行培养后的“乏”培养液(即从所述培养体系中分离出的培养液)进行基因检测的方法不受特别的限制，可用常规方法进行检测，如二代测序、核酸芯片、免疫荧光检测、荧光PCR检测、一代测序、三代测序、质谱检测、或其组合。
在一种实施方式中，所述检测方法包括如下步骤：
(a)提供第一囊胚培养体系，所述第一囊胚培养体系含有体外培养天数为D5-D6的囊胚；
(b)将所述囊胚转移到含新鲜囊胚培养液的第二囊胚培养体系中进行换液培养，所述换液培养的时间为T1，从而获得经培养的囊胚培养液；
(c)将所述经培养的囊胚培养液取出，从而获得无细胞的经培养的囊胚培养液，即为检测样本；和
(d)对所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述囊胚的健康状况。
在一优选实施方式中，所述步骤(d)中还包括步骤(e)：
(i)将所述培养液与裂解液混合，从而获得含有所述囊胚培养液与裂解液的第一混合物；
(ii)将所述第一混合物与裂解酶混合，孵育，失活裂解酶，从而获得裂解产物；和
(iii)对所述裂解产物进行基因组分析，从而鉴定所述胚胎的健康状况。
在一具体的实施方式中，本发明的一种利用囊胚培养液作为检测样本反应胚胎健康状况的方法的主要步骤：
(a)卵母细胞采用IVF或ICSI方式进行受精，受精后将受精卵转移至培养液中培养至D3卵裂期，D3将胚胎转移至囊胚培养液，培养至D5；
(b)D5进行囊胚评级，然后将囊胚发育良好的胚胎在D5±0.5天转移至另一新囊胚培养液中，于高倍镜下利用激光破膜仪在透明带上打孔使得胚胎发生皱缩，于3-5小时后取走囊胚，囊胚进行玻璃化冷冻操作而剩余的原囊胚培养液即为检测时所需要收集的样本；
(c)将步骤(b)中获取的原囊胚培养液转移至裂解液中，离心后，样本进入下一步的全基因组扩增步骤，包含但不限于NICS-INST的扩增方法以及分析方法，得到反应胚胎健康状况的检测结果。
本发明在D5±0.5天更换培养液，经过3-5小时短时培养获取囊胚培养液作为检测样本，检测结果准确性明显提高、假阴性率降低至5％以下，最大程度的避免外源干扰特别是母源干扰，ICSI和IVF受精方式均可。
在本发明中，检测结果准确性明显提高的原理是：首先检测样本的暴露时间极其短，相比常规操作方式2-3天的暴露时间大大缩短(如图1所示)，最大程度的避免外源干扰特别是母源干扰，因此不受受精方式限制，极大提高检测结果准确性；其次由于胚胎有自我修复的能力，常规方式培养期间会把异常片段释放到培养基中，可能对准确性有影响，而本发明D5培养3-5小时后采集培养时间短，且胚胎已在D5换培养液前的D3-D5培养阶段完成自我修复，异常片段主要在该阶段释放，在本发明采集的检测样本异常片段释放的概率较低，因此提高检测结果准确性。在本发明之前，未见有人尝试对IVF胚胎进行培养液的收集，而一般采用ICSI受精方式。外源干扰最主要的因素是检测样本体外孵育过长，本发明采用短时孵育的培养液采集方法，避免因孵育时间过长受到精子和颗粒细胞等外源干扰，使得胚胎来源的DNA比重降低从而影响结果的准确性。
所述步骤(b)的检测样本的量为8-15ul，优选10ul。新囊胚培养液(即第二囊胚培养液)的量优选10-15ul。
其中囊胚评级当胚胎发育到4期以上为发育良好的胚胎。
该步骤的打孔操作，增加了囊胚腔液的释放，也就是游离核酸的释放，满足了在3-5小时短时孵育的前提下，使得检测样本的核酸物质起始量增加，足够后续扩增和检测，保证检测的成功率可达97％以上。通常在囊胚期进行胚胎观察、评级以及冻存，认为囊胚期的操作不会对胚胎造成损伤，本发明也同样选择在D5囊胚期进行激光打孔及体外培养，是在不影响胚胎发育的前提下进行的。
在本发明中，该步骤还可以包括，在D5换培养液前可以增加清洗胚胎的步骤，该步骤对提高检测结果准确性有一定的帮助。
在本发明中，所述步骤(a)在D3更换囊胚培养液后，可混合培养也可以单独培养胚胎。
样本制备及其检测
本发明还提供了一种制备基因检测样本或染色体检测样本的方法，包括步骤：
(a)提供第一囊胚培养体系，所述第一囊胚培养体系含有体外培养天数为D5-D6的囊胚；
(b)将所述囊胚转移到含新鲜囊胚培养液的第二囊胚培养体系中进行换液培养，所述换液培养的时间为T1，从而获得经培养的囊胚培养液；
(c)将所述经培养的囊胚培养液取出，从而获得无细胞的经培养的囊胚培养液，即为检测样本。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(d)：对获得的所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述胚胎的健康状况。
透明带打孔
当胚胎扩增至囊胚期，将囊胚置于操作台上，选择远离内细胞团且滋养外胚层稀疏的位置，使用激光束破囊腔，在透明带产生小孔后，让囊胚腔液释放到囊胚培养液中。对透明带的孔径没有特别限制，一种优选的透明带孔径为10－40μm，较佳地，10－30μm，更佳地，10－20μm。
在本发明中，透明带的打孔操作增加了囊胚腔液的释放，也就是游离核酸的释放，满足了在3-5小时短时孵育的前提下，使得检测样本的核酸物质起始量增加，足够后续扩增和检测，检测的成功率可达97％以上。
如果不进行激光打孔操作，检测的成功率也很高，有70％左右。
试剂盒
在本发明中，提供了一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的试剂盒，包括：
(i)第一容器，以及位于第一容器的卵裂期培养液；
(ii)第二容器，以及位于第二容器的第一囊胚培养液；
(iii)第三容器，以及位于第三容器的第二囊胚培养液；和
(iv)标签或说明书。
辅助诊断胚胎健康状况的设备
在本发明中，提供了辅助诊断胚胎健康状况的设备，包括：
(a)培养模块，所述培养模块包括囊胚后期培养模块，所述囊胚后期培养模块用于对培养天数为T1的囊胚进行换液并进行囊胚后期培养T2时间；
(b)取样模块，所述取样模块用于将囊胚后期培养模块中培养天数为T2后的囊胚的培养液取出，并作为检测样本；
(b)检测模块，所述检测模块用于将来自所述取样模块中的检测样本进行基因检测，从而获得检测结果；
(c)胚胎的健康状况的判别处理模块，基于所述检测结果，对胚胎的健康状况进行评价，从而获得胚胎的健康状况的评价结果
(d)输出模块，所述输出模块用于输出所述的胚胎的健康状况的评价结果。
本发明的主要优点包括：
(1)在本发明中，首次发现，将体外培养天数为D5-D6的囊胚转移到囊胚培养液中进行培养，从经培养的囊胚培养液中分离出所述培养液，并取少量的培养液进行基因检测，所得到的胚胎的健康状况(如染色体是否异常、染色体非整倍体、线粒体拷贝数，DNA含量是否正常、致病基因检测等)的检测结果居然具有极高的精确性和极低的假阴性率(低于8％，较佳地，低于5％)，可极大程度的排除多余精子和母源颗粒细胞污染干扰的风险。
(2)本发明采用单胚胎培养体系，即一个培养液中只培养一个胚胎，该体系所得到的胚胎的健康状况的检测结果更准确。
(3)本发明的方法为通用型方法，可用于单精受精培养，也可以用于多精受精培养，优选多精受精培养。
(4)本发明的方法中可对透明带进行打孔，所得到的结果更好。
(5)本发明的方法具有很高的信噪比。
(6)本发明的在胚胎培养到D5再进行胚胎培养液的收集操作，操作时间极短，培养时间可控，受外间干扰的可能性最低，此外样本采集不受限于受精方式，是一种IVF和ICSI胚胎同样适用的培养液采集方法。
(7)本发明的D5的短时培养方案，其优势在于控制了体外孵育的时间，从而最大限度的控制了母源干扰和精子干扰等外源性干扰，使得本发明的应用不受限于ICSI胚胎，还可应用于IVF胚胎。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明所用的材料如无特别说明，均为市售产品。
通用方法
囊胚培养液的获得：
(1)受精卵(在志愿者夫妇中，从女性志愿者中获取卵子，从男性志愿者中获取精子，采用IVF或ICSI方式进行体外受精，即得到受精卵)在体外培养至第3天到第5天/第6天；
(2)当胚胎发育到4期以上的囊胚时，将胚胎分别依次转移到至少3个30微升囊胚培养液微滴(保证一个微滴中只有一个胚胎)，每个微滴轻柔吹吸漂洗2-3次，之后再将胚胎转移至37℃，5％CO2，5％O2条件下，过夜平衡微滴10-15ul中，于高倍镜下，利用激光破膜仪在透明带上打孔，使得胚胎发生皱缩；继续培养3-5小时。
(3)将步骤(2)中获取囊胚的培养液(体积约为10-15微升)转移至5微升裂解液(pH7.8的30mM Tris-Cl,2mM EDTA,20mM KCl,0.2％Triton X-100)中，用记号笔在采集管上标记样本名称。微型离心机离心30秒。样本可立即进入下一步全基因组扩增步骤或放入-20℃或-80℃冷冻保存。
本发明的检测方法参照序康医疗科技(苏州)有限公司的基因测序通用文库试剂盒(商品名NICSInstTM，通用名：基因测序通用文库试剂盒；英文名：Universal LibraryPreparation Kit)的说明书进行。
实施例1
经大量实验数据证明，本发明检测结果准确性明显提高、假阴性率降低至5％以下，对比常规D3-D5采样(130组样本)，与PGS的对比(62组样本)，其假阴性率如下：
D3-D5采样 D5当天采样
假阴性率 12.3％ 1.6％
准确率 73.1％ 91％
D5更换新囊胚培养液经短时培养采样，其假阴性率可以控制1.6％，而在D3-D5的采集方法，对于母源干扰无法有效控制，其假阴性率为12.3％，易造成临床的误诊。
其中，D3-D5造成的假阴性案例，如下：
本发明D5更换新囊胚培养液经短时培养采样，可最大程度的降低母源干扰，如下所示：图2对比图3。
在D3-D5采集培养液，难以避免母源干扰的现象，可能造成CNV判读结果的不准确，比如，把46XY(男性)的结果判读成46XY/XX(男女嵌和)，如图2所示。而在D5当天采集的培养液，可最大程度的降低母源干扰，还原真实CNV结果，如图3，CNV的判读为46XY(男性)。
经过对比试验还发现，应用本发明采集的囊胚培养液，无论是ICSI和IVF胚胎与整胚相比，性别准确性无影响，不会因为母源干扰或父源干扰，造成假阴性。部分案例，如下所示：
因此，本发明的方法具有非常好的准确性和非常低的假阴性率。
对比例1
方法同实施例1，区别在于，培养至D3－D4天，在D4进行换液，继续培养24or 48小时，结果显示，胚胎健康状况(如胚胎染色体异常)的检测结果的准确率为84.2(16/19)％，假阴性率为10.5(2/19)％，且在样本量只有19组样本的前提下得到。
对比例2
方法同实施例1，区别在于，培养至D3-D5，不换液，直接对培养至D3－D5后的囊胚培养液进行检测，结果显示，胚胎健康状况(如胚胎染色体异常)的检测结果的准确率为73.1％(95/130)，假阴性率为12.3％(16/130)。
讨论
D4胚胎通常发育为桑葚期胚胎，是胚胎发育成囊胚的关键时期，桑椹胚的下一个时期即囊胚期，而成囊率是胚胎发育的关键指标，囊胚成囊后方可考虑移植或者冷冻等体外操作，但是临床上通常不会在D4的桑葚期对胚胎进行换液等体外操作，以免影响成囊率。
在本发明中，在囊胚期进行胚胎观察，评级，以及冻存，对囊胚期的操作不会对胚胎造成损伤。本发明选择在D5囊胚期进行激光打孔及体外培养，是在不影响胚胎发育的前提下进行的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种体外利用囊胚培养液检测囊胚健康状况的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供第一囊胚培养体系，所述第一囊胚培养体系含有体外培养天数为D5-D6的囊胚；
(b)将所述囊胚转移到含新鲜囊胚培养液的第二囊胚培养体系中进行换液培养，所述换液培养的时间为T1，从而获得经培养的囊胚培养液；
(c)将所述经培养的囊胚培养液取出，从而获得无细胞的经培养的囊胚培养液，即为检测样本；和
(d)对所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述囊胚的健康状况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊胚体外培养之前为分阶段培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述囊胚体外培养之前包括第一期囊胚培养和第二期囊胚培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一期囊胚培养包括在D1-D3，用卵裂期培养液进行培养。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二期囊胚培养包括在D3－D5，用囊胚培养液进行培养。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T1时间为2-8h，较佳地，3-5h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下一种或多种特征：
(i)信噪比高，信噪比(S1/S0＞2，较佳地，＞5，更佳地，＞10，其中S1为来自胚胎的信号，S0为来自背景的信号；
(ii)低假阴性率，假阴性率＜8％，较佳地，＜5％，更佳地，＜3％；
(iii)高准确性，准确率≥80％，较佳地，85％≥，更佳地，≥90％。
8.一种制备基因检测样本或染色体检测样本的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供第一囊胚培养体系，所述第一囊胚培养体系含有体外培养天数为D5-D6的囊胚；
(b)将所述囊胚转移到含新鲜囊胚培养液的第二囊胚培养体系中进行换液培养，所述换液培养的时间为T1，从而获得经培养的囊胚培养液；和
(c)将所述经培养的囊胚培养液取出，从而获得无细胞的经培养的囊胚培养液，即为检测样本。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(d)：对获得的所述检测样本进行基因检测，从而鉴定所述囊胚的健康状况。
10.一种辅助诊断囊胚健康状况的设备，其特征在于，包括：
(a)培养模块，所述培养模块包括囊胚后期培养模块，所述囊胚后期培养模块用于对培养天数为T1的囊胚进行换液，并进行囊胚后期培养一段时间(T2)；
(b)取样模块，所述取样模块用于将囊胚后期培养模块中经囊胚后期培养的囊胚的培养液取出，并作为检测样本；
(b)检测模块，所述检测模块用于将来自所述取样模块中的检测样本进行基因检测，从而获得检测结果；
(c)囊胚的健康状况的判别处理模块，基于所述检测结果，对胚胎的健康状况进行评价，从而获得囊胚的健康状况的评价结果
(d)输出模块，所述输出模块用于输出所述的囊胚的健康状况的评价结果。
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