CN108641929A - 确定胚胎是否存在异常的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种确定胚胎是否存在异常的方法和一种确定胚胎是否存在异常的系统。确定胚胎是否存在异常的方法，包括步骤：1)获取生物样本，所称生物样本包含核酸，生物样本选自极体、卵裂球、滋养外胚层细胞、囊胚腔液和囊胚期的培养基中的至少一种；2)对生物样本中的核酸进行序列测定，获得测序结果；以及3)基于测序结果，判断胚胎是否存在异常。该方法对胚胎的伤害很小、对胚胎的发育基本没有影响，而且能准确反映胚胎的遗传信息，能够用于或者辅助用于胚胎植入前遗传筛查/诊断。

Description

确定胚胎是否存在异常的方法和系统
技术领域
本发明涉及遗传检测领域，具体地，涉及一种确定胚胎是否存在异常的方法和系统。
背景技术
试管婴儿的诞生很大程度上解决了不孕不育夫妇对孩子刚性的需求。第一代试管婴儿在受孕成功率及胚胎质量等方面有较多弊端；第二代试管婴儿发展到了单精子注射，可以有效的解决男性少精弱精等问题；第三代试管婴儿发展到了PGS(PreimplantationGenetic Screening)阶段，即胚胎植入前遗传学筛查的范畴，在胚胎植入前进行有效的筛查可以有效的提高胚胎的成活率和有效妊娠率，能够基于对胚胎质量的判断筛选、至少一定程度地解决受孕比例低等问题，利于辅助生殖领域的优生优育。
胚胎发育是指受精卵发育成幼体的过程。一般地，哺乳动物的胚胎发育过程包括：受精卵→卵裂→桑椹胚→囊胚→原肠胚→分化成组织、器官等→幼体。胚胎活检是胚胎植入前遗传学筛查/诊断的重要步骤，胚胎活检既需要获取生物样本以满足遗传学检测的要求，又要尽可能的降低对胚胎的损伤，一般包括极体活检、卵裂球活检和囊胚期滋养外胚层活检。
如何检测胚胎(胚胎活检)以及选择优质正常的胚胎仍旧是生殖领域需要解决的重大问题之一。
发明内容
本发明旨在至少一定程度上解决上述问题或者至少提供一种有用的商业方案，为此，本发明提供了一种能够有效的确定胚胎是否存在异常的方法和系统。
依据本发明的一方面，提供一种确定胚胎是否存在异常的方法，该方法可用于诊断目的也可用于非诊断目的，非诊断目的包括用于对非人动物的胚胎的体外遗传检测，或者利用该方法检测的结果辅助诊断判断等。该方法包括步骤：(1)获取生物样本，所述生物样本包含核酸，所述生物样本选自极体、卵裂球、滋养外胚层细胞、囊胚腔液和囊胚期的培养基中的至少一种；(2)对所述核酸进行序列测定，获得测序结果；以及(3)基于所述测序结果，判断所述胚胎是否存在异常。该方法能够有效的检测胚胎遗传信息，能够用于或者辅助用于胚胎植入前遗传学筛查或者胚胎植入前筛查/诊断(PGS/PGD)。
根据本发明的实施例，该确定胚胎是否存在异常的方法，还可以包括以下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述生物样本为囊胚腔液。体外培养的胚胎通常在5-6天发育至囊胚，此事胚胎的细胞数目明显增多，可以达到100个以上，囊胚滋养外胚层将来会发育成胎盘或胎膜，不参与形成胎儿部分，对滋养外胚层细胞进行活检，不损伤决定胚胎发育的内细胞团细胞。而当胚胎发育至囊胚期时，染色体嵌合比例较卵裂期胚胎明显降低，能提高遗传学检测的准确性，降低误诊率。
按照胚胎发育时间以及胚胎植入需要是特定发育期的胚胎，受限于PGS的检测机构/平台所需的检测时间，目前体外的胚胎一般没办法在同周期进行胚胎回植，一般需要要将胚胎进行冷冻保存，囊胚期胚胎保存时需要将胚胎中的囊胚腔液(囊胚液)抽出再注入冷冻液进行冻存。囊胚液被证明包含来自囊胚细胞的核酸片段，可利用检测囊胚液来判断胚胎遗传信息。囊胚液作为检测样本来说，相较于卵裂球对胚胎的伤害更小，对胚胎的发育的影响更小；而相较于滋养层细胞来说，囊胚液接触的是整个囊胚、包含来自囊胚的核酸碎片(游离DNA)等，能更全面的反应囊胚/胚胎遗传特性。
根据本发明的实施例，步骤(2)包括：(a)对所述囊胚腔液中的游离核酸进行全基因组扩增，获得扩增产物；(b)对所述扩增产物进行序列测定，以获得所述测序结果，所述测序结果包括多条读段(reads)。可利用线性扩增或者非线性扩增来进行全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)，在一个例子中，发明人利用简并寡核苷酸引物PCR(degenerated oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)进行全基因组扩增。基于DOP-PCR的方法在检测大的结构变异如数目异常、拷贝数变异CNV等方向上有优异的表现，利于获得一致性和重复性相对高的变异检测结果。
根据本发明的实施例，在测序平台上进行所述序列测定，测序平台选自边合成边测序和边连接边测序平台中的至少一种。可选择的测序平台包括通常所说的一代测序平台、二代测序平台和三代测序平台，包括但不限于来自Illumina、TermoFisher、PacBio、华大基因和牛津纳米孔等公司或机构的测序仪。
根据本发明的实施例，所述异常包括染色体非整倍性，步骤(3)包括：(i)将所述读段比对到参考序列，获得比对结果，所述参考序列为参考基因组的至少一部分，所述参考序列包含第一染色体参考序列；(ii)基于所述比对结果，确定第一参数；(iii)基于所述第一参数，判断所述第一染色体的数目是否异常。具体地，可基于比较来自待测样本的特定染色体的读段的数量与来自正常样本的相同染色体的读段的数量的差异，若差异具有统计学意义，则判定待测样本的该染色体异常。在一个例子中，正常样本的测序结果可以预先测定保存，正常样本的数目不少于30个。所称的正常样本来自染色体数目正常的个体。
依据本发明的另一方面，提供一种确定胚胎是否存在异常的系统，该系统用以实施上述任一实施例中的确定胚胎是否存在异常的方法，该系统包括：样本获取装置，用于获取生物样本，所述生物样本包含核酸，所述生物样本选自极体、卵裂球、滋养外胚层细胞、囊胚腔液和囊胚期的培养基中的至少一种；序列测定装置，用于对核酸进行序列测定，获得测序结果；以及判断装置，用于基于测序结果，判断所述胚胎是否存在异常。
上述任一实施例中对胚胎检测方法的附加技术特征和优点的描述，同时也适用该系统。本领域技术人员可以理解，胚胎遗传信息检测方法可选择的步骤或设置处理，可以通过使该系统进一步包括相应的功能装置或模块来实现。
例如，根据本发明的实施例，所述生物样本为囊胚腔液。
根据本发明的实施例，所述序列测定装置，包括用于进行：(a)对所述囊胚腔液中的游离核酸进行全基因组扩增，获得扩增产物；(b)对所述扩增产物进行序列测定，以获得所述测序结果，所述测序结果包括多条读段。
根据本发明的实施例，所述序列测定装置包括测序平台，在所述测序平台上进行所述序列测定，测序平台选自边合成边测序和边连接边测序平台中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述异常包括染色体非整倍性，所述判断装置包括用于进行：(i)将所述读段比对到参考序列，获得比对结果，所述参考序列为参考基因组的至少一部分，所述参考序列包含第一染色体参考序列；(ii)基于所述比对结果，确定第一参数；(iii)基于所述第一参数，判断所述第一染色体的数目是否异常。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明的一个实施例的胚胎遗传检测流程示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明检测方法和/或试剂盒进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的，比如全基因组扩增试剂盒购自SIGMA公司等。
囊胚液是囊胚腔的液体组分，其中包含着囊胚细胞代谢包含的DNA组分，包含了囊胚发育生长过程中代谢的囊胚DNA。可以真实的反应囊胚的染色体情况，作为无创检测的方法可以有效解决现行方法中，卵裂球活检对胚胎发育造成迟缓或者影响的现状，同时用滋养层细胞进行活检也有较大争议认为滋养层细胞不能真实的表达胚胎的具体状况，因为滋养层细胞将分化发育为胎盘组织，而并非胎儿。由于在进行PGS过程中固定步骤中需要抽取囊胚液后填补冷冻液进行冷冻，即囊胚液是容易获得且包含胚胎/胎儿信息较完整且具有无创特性的样品。
在获得囊胚液之后，进行全基因组DNA扩增(WGA,whole genome amplification)后，进行酶切打断，之后进行测序接头连接，进行杂交测序。试验检测流程如图1所示。
样品制备：
样品取自罗湖人民医院试管婴儿培养3-5天废弃囊胚中包裹的囊胚液，在囊胚进行冷冻前需要抽出并注入冷冻液，其囊胚液的体积约为3-5微升。
一.利用SIGMA WGA4single cell Amplification kit进行扩增，其步骤如下：
1.保持每个管的体积为9微升。
2.制备反应液及片段化试剂：
2ul PROTINASE K
32ul 10×single cell lysis&fragment buffer
充分混匀
3.加入上一步制备好的2ul反应液至每个PCR管中。
4.孵育反应液，保持55℃1个小时，后迅速加热至99℃，保持4分钟，后立即放置冰上并离心。
5.加入2ul 1×single cell library preparation buffer至每管中。
6.加入1ul library stabilization solution，充分混匀并保持95℃2分钟。
7.冰上放置冷却并离心，加入1ul library preparation enzyme，充分混匀，离心。并按以下步骤进行孵育：
16℃ 20分钟
24℃ 20分钟
37℃ 20分钟
75℃ 5分钟
4℃ forever
8.扩增，向上步中14ul的反应液中加入以下试剂进行扩增。
7.5ul 10×Amplification Master Mix
48.5ul ddH2O
5ul WGA DNA Polymerse
程序：95° 3分钟
25个循环：
94° 30秒
65° 5分钟
4° 保存
纯化后电泳检测，电泳胶图显示核酸得到有效扩增。
二.样品制备
三.样品变性及上机
样品用0.2N NaOH等体积处理5分钟后，进行稀释，达到0.5nM的浓度，进行杂交并
在测序平台上进行测序。
四.测序
五.数据分析
使用以上流程进行样品处理之后得到的数据(读段)进行过滤之后，与参考基因组进行比对，基于对比对结果的统计分析，得到待测样本目标染色体数目是否异常的检测结果。

Claims (10)

1.一种确定胚胎是否存在异常的非诊断方法，其特征在于，包括步骤：
(1)获取生物样本，所述生物样本包含核酸，所述生物样本选自极体、卵裂球、囊胚期滋养外胚层细胞、囊胚腔液和囊胚期的培养基中的至少一种；
(2)对所述核酸进行序列测定，获得测序结果；以及
(3)基于所述测序结果，判断所述胚胎是否存在异常。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述生物样本为囊胚腔液。
3.权利要求2的方法，其特征在于，步骤(2)包括：
(a)对所述囊胚腔液中的游离核酸进行全基因组扩增，获得扩增产物；
(b)对所述扩增产物进行序列测定，以获得所述测序结果，所述测序结果包括多条读段。
4.权利要求3的方法，其特征在于，在测序平台上进行所述序列测定，测序平台选自边合成边测序和边连接边测序平台中的至少一种。
5.权利要求3的方法，其特征在于，所述异常包括染色体非整倍性，步骤(3)包括：
(i)将所述读段比对到参考序列，获得比对结果，所述参考序列为参考基因组的至少一部分，所述参考序列包含第一染色体参考序列；
(ii)基于所述比对结果，确定第一参数；
(iii)基于所述第一参数，判断所述第一染色体的数目是否异常。
6.一种确定胚胎是否存在异常的系统，其特征在于，包括：
样本获取装置，用于获取生物样本，所述生物样本包含核酸，所述生物样本选自极体、卵裂球、滋养外胚层细胞、囊胚腔液和囊胚期的培养基中的至少一种；
序列测定装置，用于对核酸进行序列测定，获得测序结果；以及
判断装置，用于基于测序结果，判断所述胚胎是否存在异常。
7.权利要求6的系统，其特征在于，所述生物样本为囊胚腔液。
8.权利要求7的系统，其特征在于，所述序列测定装置，包括用于进行：
(a)对所述囊胚腔液中的游离核酸进行全基因组扩增，获得扩增产物；
(b)对所述扩增产物进行序列测定，以获得所述测序结果，所述测序结果包括多条读段。
9.权利要求8的系统，其特征在于，所述序列测定装置包括测序平台，在所述测序平台上进行所述序列测定，测序平台选自边合成边测序和边连接边测序平台中的至少一种。
10.权利要求8的系统，其特征在于，所述异常包括染色体非整倍性，所述判断装置包括用于进行：
(i)将所述读段比对到参考序列，获得比对结果，所述参考序列为参考基因组的至少一部分，所述参考序列包含第一染色体参考序列；
(ii)基于所述比对结果，确定第一参数；
(iii)基于所述第一参数，判断所述第一染色体的数目是否异常。
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