CN110241262A - 一种基于pgd的卵裂期胚胎单细胞检测hbv病毒基因组垂直传播方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播方法，本发明通过利用PGD技术分离检测物单个细胞，并应用单细胞扩增试剂盒得到全基因组，进行全基因组测序能早期、准确的了解HBV病毒基因组是否插入到胚胎中的情况，不会影响胚胎继续发育，也不影响最终胚胎移植。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其涉及一种基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测 HBV病毒基因组垂直传播方法。
背景技术
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisb virus，HBV)引起的传染性疾病，其发病率居我国传染病首位，严重危害人类的健康和生命。随着辅助生殖技术的广泛应用，对于合并HBV感染的不孕不育症患者，在实施ART过程中HBV能否经生殖细胞垂直传播给子代已成为被关注的焦点和热点。垂直传播是HBV的主要传播途径之一。狭义的垂直传播是指患者的生殖细胞受病毒感染，在受精时经由精子或卵细胞作为载体将病毒基因带入胚胎进而使子代患病，即存在生殖细胞传播。
传统方法一般采用取整个胚胎进行mRNA提取后逆转录再进行测序检测的方法，不但检测范围小，而且操作繁琐，对技术精度要求高。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的就在于提供一种基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明包括以下步骤：
1)获取携带HBV病毒的样本胚胎；
2)分离单个细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解；
3)进行全基因组扩增：对裂解后的细胞样本进行全基因组扩增并纯化、对扩增产物使用蛋白质定量，并对片段长度分布进行检测。
4)使用扩增产物DNA，超声打断后构建DNA小片段文库。
5)经过末端修复,对DNA片段进行加碱基A和加测序接头；
6)对待测样本进行PCR扩增，构建得到最终文库；
7)对所述待测样本构建的最终文库后进行上机测序以获得每个DNA片段的碱基序列，并对碱基序列进行分析以获得染色体变异信息，比对测序结果进行分析，对获得的基因组序列与参考基因组进行比对，从而获得基因组序列在参考基因组上的位置信息以检测子代胚胎中HBV病毒是否能垂直传播。
具体地，在所述步骤3)中，单细胞使用MDA方法或MALBAC方法进行全基因组扩增。
进一步地，所述单细胞扩增为扩增前引物延伸PCR、退变寡核苷酸引物 PCR、多重置换扩增技术或多次退火环状循环扩增技术中的任意一种或至少两种的组合。
具体地，步骤(5)所述的测序采用高通量测序平台进行测序。
进一步地，所述测序类型为单端测序和/或双端测序，优选为单端测序。
具体地，所述测序的长度为不小于30bp。
进一步地，所述参考基因组包括全基因组；优选地，所述参考基因组的覆盖率达到全基因组的50％以上，优选为60％以上，进一步优选为70％以上，再优选为80％以上，最优选为95％以上；
本发明的有益效果在于：
本发明通过利用PGD技术分离检测物单个细胞，并应用单细胞扩增试剂盒得到全基因组，进行全基因组测序能早期、准确的了解HBV病毒基因组是否插入到胚胎中的情况，不会影响胚胎继续发育，也不影响最终胚胎移植。
附图说明
图1为单细胞扩增直接得到全基因组进行全基因组测序检测整体流程示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施操作做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
参看附图1所示，本发明包括以下步骤：
1)获取携带HBV病毒的样本胚胎；
2)分离单个细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解；
3)进行全基因组扩增：对裂解后的细胞样本进行全基因组扩增并纯化、对扩增产物使用蛋白质定量，并对片段长度分布进行检测。
4)使用扩增产物DNA，超声打断后构建DNA小片段文库。
5)经过末端修复,对DNA片段进行加碱基A和加测序接头；
6)对待测样本进行PCR扩增，构建得到最终文库；
7)对所述待测样本构建的最终文库后进行上机测序以获得每个DNA片段的碱基序列，并对碱基序列进行分析以获得染色体变异信息，比对测序结果进行分析，对获得的基因组序列与参考基因组进行比对，从而获得基因组序列在参考基因组上的位置信息以检测子代胚胎中HBV病毒是否能垂直传播。
在所述步骤3)中，单细胞使用MDA方法或MALBAC方法进行全基因组扩增。
所述单细胞扩增为扩增前引物延伸PCR、退变寡核苷酸引物PCR、多重置换扩增技术或多次退火环状循环扩增技术中的任意一种或至少两种的组合。
步骤(5)所述的测序采用高通量测序平台进行测序。
所述测序类型为单端测序和/或双端测序，优选为单端测序。
所述测序的长度为不小于30bp。
所述参考基因组包括全基因组；优选地，所述参考基因组的覆盖率达到全基因组的50％以上，优选为60％以上，进一步优选为70％以上，再优选为80％以上，最优选为95％以上；
实施例1
本实施例选择感染HBV病毒并行辅助生殖的子代卵裂期胚胎为实验材料，分离其中一个细胞进行了单细胞全基因组扩增后测序检测HBV基因序列是否能通过精卵垂直传播到子代胚胎。
1.获取4-8细胞期胚胎的单个细胞：
1)选在胚胎发育的第3d上午，一般是在ICSI或IVF68～72h后。此时胚胎在6～8个细胞阶段。卵裂球应含有至少5个细胞。
2)由于此阶段的胚胎具有细胞之间联结紧密的特点，选用不含有钙和镁的溶液有助于减少细胞之间的联结，从而有助于操作的进行。
3)用激光或机械/化学的方法在透明带(ZP)上打一个小孔，直径大约是待检细胞的三分之一。
4)一次取1个或2个卵裂球。可以用吸入、机械挤压或液体挤压的方法。其中以吸入的活检方法最为常用。
5)取出的细胞必须是完整的，细胞核必须是清晰可见。此过程控制在5min 内。用于PCR诊断，转移细胞时必须带手套，以避免外源DNA的污染。
2.单细胞扩增全基因组：
接收含单细胞的0.2mL采样管后，直接以其为起始模板进行实验。使用MDA 方法或MALBAC方法进行全基因组扩增，扩增产物检测合格后，继续进行DNA小片段文库构建；
3.经过末端修复、加碱基A、加测序接头、PCR扩增，得到最终文库。
4.文库构建完成后，使用Agilent 2100/LabChip GX Touch对文库的片段长度分布进行检测，符合预期后，使用Q-PCR对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度需＞10nmol/L)，以保证文库质量。
5.检测合格的文库，在HiSeq测序平台上运行PE150双端测序程序。
6.分析测序结果。
选择PGD技术分离单个细胞为实验材料仅是为了举例，证明此方法可以成功应用于人卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播，但本发明同样可以应用于人类及其他哺乳动物的遗传病筛查。
遗传分析往往需要大量的gDNA和cDNA，全基因组扩增的同时扩增可以克服DNA或RNA量少的限制，可对一个只含有少量细胞的样本进行分析。
本方法利用PGD技术单取卵裂期胚胎的1个细胞来进行检测且取样不影响胚胎发育。检测用单细胞DNA分析法，用基因组测序法配合以HiSeq测序平台上运行PE150双端测序程序。检测合并乙型肝炎病毒(HBV)感染的不孕不育症患者行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)及衍生技术助孕后子代卵期胚胎中HBV表达情况，为HBV经人类生殖细胞垂直传播子代提供可靠证据。
此方法具有如下优点：a.分辨率高，起始样品量为单个细胞；b.灵敏度高； c.数字化信号，可以直接检测单个碱基差异、基因家族中相似基因以及可变剪接造成的不同表达；d.检测范围广，不仅能检测基因，还能检测RNA拼接体；e.重现性好。此方法最重要的环节是用单细胞DNA分析，使用检测合格的扩增产物DNA，超声打断后构建DNA小片段文库。经过末端修复、加碱基A、加测序接头、PCR扩增，得到最终文库；单细胞DNA被高效且均一的逆转录和扩增。
在提取基因组DNA后，用超声波打断或酶切打断，然后跑胶得到300-500bp 的小片段，因为打断是随机打断的，可能有粘性末端，所以用酶来形成平末端，再在平末端后面加上A碱基得到粘性末端，在加上adapter，加到flow cell上，进行几轮的PCR扩增，就得到了测序文库。
在测序时，首先是测序引物和序列结合，然后进行边合成边测序(连上一个碱基，测一次，然后进行化学反应，再连碱基，再测序，这样循环下去)，测够长度后，将合成的序列去掉，然后加上另外一个primer来测index，这样每个reads 都有一个index(用来识别样品来源)，然后在进行一次桥式PCR扩增，去掉已经测过序的那条链，再进行一次测序。
当插入的序列(也就是超声波打断的小片段)如果比较短的话，就可能测到primer和index，当然这种情况比较少见，所以得到数据后，要进行去adapter。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播方法，其特征在于：
包括以下步骤：
1)获取携带HBV病毒的样本胚胎；
2)分离单个细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解；
3)进行全基因组扩增：对裂解后的细胞样本进行全基因组扩增并纯化、对扩增产物使用蛋白质定量，并对片段长度分布进行检测。
4)使用扩增产物DNA，超声打断后构建DNA小片段文库。
5)经过末端修复,对DNA片段进行加碱基A和加测序接头；
6)对待测样本进行PCR扩增，构建得到最终文库；
7)对所述待测样本构建的最终文库后进行上机测序以获得每个DNA片段的碱基序列，并对碱基序列进行分析以获得染色体变异信息，比对测序结果进行分析，对获得的基因组序列与参考基因组进行比对，从而获得基因组序列在参考基因组上的位置信息以检测子代胚胎中HBV病毒是否能垂直传播。
2.根据权利要求1所述的基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播方法，其特征在于：在所述步骤3)中，单细胞使用MDA方法或MALBAC方法进行全基因组扩增。
3.根据权利要求2所述的基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播方法，其特征在于：所述单细胞扩增为扩增前引物延伸PCR、退变寡核苷酸引物PCR、多重置换扩增技术或多次退火环状循环扩增技术中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1所述的基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播方法，其特征在于：步骤(5)所述的测序采用高通量测序平台进行测序。
5.根据权利要求4所述的基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播方法，其特征在于：所述测序类型为单端测序和/或双端测序，优选为单端测序。
6.根据权利要求2所述的基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播方法，其特征在于：所述测序的长度为不小于30bp。
7.根据权利要求1所述的基于PGD的卵裂期胚胎单细胞检测HBV病毒基因组垂直传播方法，其特征在于：所述参考基因组包括全基因组；优选地，所述参考基因组的覆盖率达到全基因组的50％以上，优选为60％以上，进一步优选为70％以上，再优选为80％以上，最优选为95％以上。
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2019
- 2019-06-26 CN CN201910558025.6A patent/CN110241262A/zh active Pending
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