CN104745718A - 一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法,步骤如下:通过对体外培养的细胞进行全基因组扩增,并将DNA分子打断,对DNA片段测序,得到测序读段;与参考序列比对,将其定位于参考序列上;筛选参考序列非重复区域,保留非重复区域;通过正常样本建立窗口内读段数目矩阵,对正常样本数据进行分析,统计非重复区域内各窗口读段数,建立读段数及染色体整倍体的概率矩阵;计算位点的拷贝数即A/B/C状态;将连续m个位点为A状态选择为微重复位点,连续m个位点为C状态选择为微缺失位点;与已有CNV和疾病数据库进行对照,进行基本的基因注释和缺失部分涉及的基因功能分析,标注出微缺失综合征疾病类型。
Description
技术领域
本发明涉及分子细胞生物领域,具体涉及一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法,其能够对人类胚胎囊胚期滋养层细胞染色体DNA片段拷贝数变异进行检测。
背景技术
染色体微缺失/微重复是指染色体上出现长度为1.5kb-10Mb的缺失或重复。人类染色体微缺失/微重复综合征是一种因人类染色体上出现微小片段缺失或重复,即DNA片段拷贝数变异,缩写为CNV,引起复杂表型疾病,可导致严重的疾病和异常,如先天性心脏病、生长发育迟缓、肢体畸形等。常见的微缺失综合征包括22q11微缺失综合征、猫叫综合征、安格曼综合症、AZF缺失等。
2009《中国不孕不育现状调研报告》显示,全国不孕不育患者人数已超过5000万,而试管婴儿技术能够有效帮助不孕不育患者解决生育难题。试管婴儿技术是将卵子与精子取出后置于特定的培养液内培养、受精,受精卵在恒温孵箱中发育为胚胎后移植回母体子宫,最终发育成胎儿。试管婴儿技术作为有效的辅助生殖手段成为大多数不孕不育夫妇的重要选择,而挑选健康胚胎移植是成功妊娠的关键。但是,通过试管婴儿方法获得的胚胎有40-60%存在染色体异常,且随着孕妇年龄越大,胚胎染色体异常的风险越高,而染色体异常是导致妊娠失败和自然流产的主要原因,因此,对于植入前的胚胎进行遗传学筛查是至关重要的。胚胎植入前遗传学筛查是指胚胎植入着床之前进行染色体数目和结构异常的检测,挑选正常的胚胎植入子宫,以期获得正常的妊娠,提高患者的临床妊娠率。除了常见的3体综合症外,微缺失和微重复也是胚胎染色体异常的常见类型。
尽管每种微缺失综合征发病率都很低,如较常见的22q11微缺失综合征发生率为1:4000,但由于临床检测技术的限制,大量的微缺失综合征患者在产前筛查和产前诊断中无法检出,更为重要的是作为胚胎植入前诊断的最主要的样本类型,平衡易位患者的胚胎必须通过分析微重复和微缺失来判定胚胎是否发生异常。因此,如果在试管婴儿技术中能够避免移植有染色体微缺失/微重复的胚胎,将具有很重要的意义。
此外,试管婴儿通常会进行多个卵子的体外受精,但为了避免多胎妊娠给孕妇和胎儿带来的风险,移植的胚胎数目最好是1个。为了提高妊娠率,必须对移植的胚胎进行筛选,从而对质量最佳的胚胎进行移植。目前胚胎质量的评估主要依赖于胚胎的形态判断,但胚胎的形态和最终的成功怀孕之间的关联性还不够高。理论上,对胚胎的染色体进行检查是筛选优质胚胎的最佳途径。胚胎染色体检测的最大瓶颈是可以用于检测的细胞数量太少。
现有的针对微缺失/微重复综合征的诊断方法主要有高分辨率染色体核型分析、荧光原位杂交、微阵列-比较基因组杂交、多重连接探针扩增技术和定量PCR的方法等。
高分辨率染色体核型分析采用细胞同步化的方法,通过获得大量优质的有丝分裂晚前期或早中期的显带核型,使单套染色体的条带数量增至数百条以上,从而提高识别染色体细微结构改变的能力,但其分辨率的极限只有约5M,不足以检测更小的染色体水平上的微缺失/微重复变异。而且由于胚胎细胞数量的有限,也无法获得足够的染色体。
荧光原位杂交,缩写为FISH,是微缺失/微重复检测的黄金标准,其可以有效地检测出大部分染色体缺失。如果被检测的染色体或DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性-退火-复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体,而经荧光检测体系显示核酸探针,即可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。中期染色体FISH的分辨率可达1-2M,间期染色体FISH分辨率可达50K,但该技术需在已知缺失位点的情况下,设计探针进行验证,不宜用于发现新的染色体水平的微缺失或重复异常。
微阵列-比较基因组杂交技术,缩写为Array CGH,可将特异DNA片段作为靶探针固化在载体上形成微阵列,通过将荧光素标记的待测DNA和参考DNA与微阵列杂交从而检测DNA拷贝数变异。Array CGH理论上可检测5至10kb甚至更小的DNA序列,但该方法价格昂贵且一般并不覆盖全基因组的所有位点。
多重连接探针扩增技术,缩写为MLPA,是一种针对待测DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。MLPA技术目前在临床实验室已应用于Y染色体微缺失、22q11.2染色体微缺失等的检测,优点是高效、特异、快速、简便,缺点是不适合检测未知的点突变类型。
PCR方法常用于Y染色体微缺失方面的检测,如Y染色体上与男性生殖相关的AZF基因,AZFa、AZFb、AZFc等的缺失则多用PCR的方法进行检测。对于已知的染色体微缺失位点的验证也可以用PCR方法。该方法简便易行,缺点是只能针对已知位点进行检测,且一次仅能针对几个位点进行检测。
虽然,2014年Wells等人报道了采用NGS技术进行染色体CNV检测,实现了全基因组覆盖,但该技术的分辨率仍然不够高,只能做染色体非整倍体的检测,不能检测出染色体微缺失/微重复。其采用的算法是均值比较,该算法的缺点是要求DNA片段长,对整个染色体计算平均值,只能在染色体范围做异倍体分析。
综上所述,目前对于染色体微缺失/微重复的检测方法存在的限制因素主要有分辨率低、不能覆盖全基因组、低通量和高成本。
因此亟需开发一种检测试管婴儿技术中胚胎染色体微缺失/微重复的新方法,以解决现有技术存在的上述不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法,以克服目前现有技术存在的上述不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法,包括以下步骤:
1)将获自体外培养的囊胚滋养层细胞进行全基因组扩增,将扩增后的基因组DNA分子随机打断,得到DNA片段,并对得到的DNA片段进行测序,获得测序的读段(reads),读段(reads)是指测序获得的序列片段;
2)将步骤1)中测定的DNA序列与人类基因组参考序列进行比对,将所测DNA序列定位于参考序列上;
3)筛选参考序列非重复区域,去除参考序列上长度为n并在参考序列其它位置出现完全一致序列的区域,保留非重复区域;
4)通过正常样本建立窗口内读段数目矩阵,对预先准备正常样本数据进行分析,统计步骤3)中非重复区域内各窗口读段数,建立读段数及染色体整倍体的概率矩阵,所述窗口范围为100-600k;
5)根据步骤4)中概率矩阵及预先建立的转移矩阵,计算位点的拷贝数即A/B/C状态,具体步骤如下:
对于参考序列上的位点b,计算b=1位点的部分概率δ(i, 1),δ(i, b)表示b位点到状态i的所有可能中最大的的概率;
计算b>1位点的部分概率,利用b-1位点计算b位点的部分概率为δ(i, b)=max(δ(j,b-1)ajibik),其中aji表示从状态 j 转移到状态i的概率,bik表示状态i的读段数为k的概率;
回溯序列,在每一个中间位点和结束位点均有一个部分最优概率 δ(i, b),记录形成某个位点最大局部概率的前一个状态,得到所有位点的状态序列;
6)基于步骤5)中得到的待测样品数据的状态序列,将连续m个位点为A状态选择为微重复位点,连续m个位点为C状态选择为微缺失位点,所述m值在4以上即为异常;
7)将所述微缺失位点和/或微重复位点与已有的CNV和疾病数据库进行对照,并进行基本的基因注释和缺失部分涉及的基因功能分析,标注出微缺失综合征疾病类型。
进一步的,所述读段为测序获得的序列片段。
进一步的,所述断点为染色体上发生拷贝数变异的分界点。
优选的,步骤1)中基因组DNA的获取自胚胎囊胚期,取出的外围滋养层细胞数目为3-5个。
优选的,步骤1)中,DNA分子的随机打断处理可以采用酶切、雾化、超声或物理剪切法 (HydroShear
DNA剪切仪)。
优选的,步骤1)中,所述DNA分子被打断至平均长度为100bp-200bp。
优选的,步骤1)中,所述的测序方法为高通量测序方法,采用个人化操作基因组测序仪,即Ion Torrent/PGM,所述DNA的平均长度为120bp。
优选的,测序深度为0.01-0.1X。
本发明的有益效果为:通过采用新的算法,分析精度可达2Mb,能有效检测出染色体微缺失/微重复,可以对全基因组范围进行染色体CNV分析,不需依赖已知的探针和设计探针,可发现新的染色体异常,并且高通量地进行染色体CNV分析,并且成本低、灵敏度高,适合于试管婴儿技术中胚胎移植前的检测。
附图说明
下面为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中CNV分析流程图;
图2是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中CNV分析算法的流程示意图;
图3是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中基于正常样本读段数的概率矩阵;
图4是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中的状态转移矩阵图;
图5是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中的样本1(A)的数字核型图;和
图6是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中的样本2(B)的数字核型图;
图7是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中的状态转移概率分布图;
图8是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中的样本3(C)的数字核型图;
图9是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中的样本4(D)的数字核型图;
图10是本发明实施例所述的检测人类胚胎染色体微缺失和微重复方法中的样本5(E)的数字核型图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一
一、材料:
1、标本:合作医院活检的囊胚期细胞,样本来源为两例试管婴儿的胚胎样本,该父母核型检查为平衡易位携带者,在此之前怀过一例异常胎儿并导致流产。
2、试剂:Qiagen的全基因组扩增试剂盒、MDA产物检测试剂盒、MDA产物纯化试剂盒、life文库构建试剂盒、Agencourt®AMPure®XP磁珠、life模板制备试剂盒,life测序试剂盒。
3、仪器:PCR仪,琼脂糖凝胶电泳系统,ion torrent的PGM测序平台。
4、耗材:1.5ml、0.2ml进口离心管,瑞宁移液枪及带滤芯枪头。
二、操作步骤:
1、滋养外胚层细胞活检
采用二步法,第一步是在活检前段D3对所有的胚胎进行透明带打孔,D5或D6天在显微镜下对形成的2个优质囊胚行滋养层细胞采集术,每个囊胚各采集滋养层细胞5-10个,放入装有1µl磷酸缓冲液(PBS)的PCR管底,离心管编号1。
2、MDA法全基因组扩增:
准备Buffer DLB:对Buffer DLB管进行离心处理从而使干粉聚集到管底,加入500µl无核酸酶的水,涡旋彻底混匀使其溶解,然后短暂离心,溶解后的Buffer DLB可在-20℃保存6个月;
准备Buffer D2:如表1所示,可配制12个反应,-20℃可保存3个月;
扩增方法如下:
1)将细胞样本离心,使其离心至管底,用PBS补至4µl;
2)加3µl D2缓冲液,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心;
3)在PCR仪上65℃条件下孵育10min,加热盖,取出时放冰上;
4)加入3µl裂解终止液,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心,放置冰上;
5)冰上融化DNA全基因组扩增酶,其余组分室温融化后涡旋混匀,瞬时离心后放置在冰上,按照表2配制反应:
6)取上述混匀后的反应液40µl,将其加入步骤2.4的10µl DNA中,混匀,瞬时离心;
7)PCR仪上30℃条件下孵育8h;
8)PCR仪上65℃条件下孵育3min使酶失活。
3、MDA产物纯化
产物纯化方法如下:
1)加入50µl膜结合液于50µl MDA产物中,混匀后转移至纯化柱内,室温放置1min,12000rpm离心1min;
2)加入700µl膜洗脱液,12000rpm离心1min,弃上清液;
3)加入500µl膜洗脱液,12000rpm离心1min,弃上清液;
4)12000rpm空转2min弃去多余液体,室温晾干3min;
5)加50µl无核酸酶水至离心柱膜上,室温放置5min后12000rpm离心1min,收集产物DNA。
4、产物检测
产物检测方法如下:
1)浓度:取1µl稀释至20µl,再取2µl用Qubit方法测浓度,1号样本浓度为:16.3ng/µl,则原液浓度为:246ng/µl;
2)MDA产物检测试剂盒检测:
a. PCR体系如表3示:
b. PCR程序:
95℃-5min;
(95℃-30s;60℃-30s;72℃-30s)-40cycles;
72℃-10min;
4℃-holding;
c. 120v,30min,3%的琼脂糖凝胶电泳检测。
5、文库构建
构建文库步骤如下:
1)DNA片段化:
a. DNA 起始量为100ng,取4.5µl DNA 于PCR 管中,补水至35µl;
b. 将10X 酶切反应液和片段化酶震荡混匀,瞬时离心5s后放置冰上;
c. 加5µl的10X 酶切反应液于PCR 管中;
d. 加10µl片段化酶,吹吸20次混匀,勿用涡旋混匀,避免产生气泡,瞬时离心5s使液体汇集于管底;
e. PCR仪上,37℃孵育35min;
f. 孵育后立即加入5μl 终止液,vortex 彻底混匀,瞬时离心后置于冰上;
2)纯化
a. 将上述DNA全部转入至一个1.5ml无核酸酶离心管中,加入99μl平衡到室温且充分混匀的纯化磁珠 (约1.8 倍样本体积),震荡混匀10s,室温孵育5 min,瞬时离心5s;
b. 磁吸3-4 min至液体为澄清,弃上清。如果磁吸后液体仍浑浊,需延长磁吸时间,或改用磁性较强的磁力架;
c. 加入500μl 新鲜配制75%乙醇,将1.5ml离心管在磁力架上旋转2周(所有样本依次旋转1/4周,共旋转8次),弃上清;
d. 重复步骤c;
e. 室温稍晾干沉淀,时间为2-3min;
f. 加20μl DNA洗脱液,震荡5s,瞬时离心2s,磁吸3 min至液体澄清,吸取全部上清至新的PCR管中;
3)连接头
当使用表4中特异性接头时,应使用带滤芯的吸头,这是因为特异性接头一次只能打开一管,且加样管只能打开对应管盖,应避免交叉污染。不同的样本应使用不同的接头,确保一张芯片中不会发生特异性接头出现相同的情况,加样顺序如表4所示:
配好体系后吹吸混匀,放入PCR仪,反应条件如表5所示:
将全部反应液转移到一个新的1.5ml 离心管中,用于纯化;
4)纯化
a.加入180μl平衡到室温且充分混匀的DNA纯化磁珠(约1.8倍样本体积),震荡10s,室温孵育5min,离心5s;
b.重复步骤2)b-e;
c.加入20μl DNA洗脱液,震荡5s,瞬时离心2s,磁吸3min至液体澄清,吸取全部上清至新的PCR管中;
5)片段选择(使用E-Gel预制凝胶电泳系统)
a.准备好E-Gel预制凝胶电泳系统,连接好电源。取出胶上的梳子后放好位置。选择“SizeSelect™2%”程序,调整时间为15min;
b.样本上样20μl,Marker上样10μl,按照如下位置点样:
Marker片段大小依次为50bp、100bp、150bp、200bp(目标条带)、250bp、300bp、350bp(主带);
c.启动电泳;
d.观察Marker的200bp条带达到在收集孔位置时,时间在13-14min范围内,250bp条带在孔的上边缘,暂停电泳,吸取第二排收集孔内的液体20μl(未扩增文库),具体操作时,收集液体时间以Marker 位置为准;
6)PCR扩增
a. 室温解冻PCR反应液和引物混合液,震荡混匀10s,瞬时离心5s,使液体离心至管底,放置于冰上;
b. 制备PCR反应液(冰上),体系如表6所示:
c.反应体系加好后,震荡混匀10s,瞬时离心5s,使液体离心至管底;
d. 放入PCR 中反应,程序如表7所示:
7)纯化
a. 将上述液体完全转移至一个新的无核酸酶1.5ml离心管中,加入195μl 平衡到室温且充分混匀的DNA纯化磁珠(约1.5倍样本体积),震荡10s,离心5s,室温孵育5 min;
b. 重复步骤2)b-e;
c. 加20μl DNA洗脱液,震荡10s,离心5s,磁吸3 min至液体澄清,吸取全部液体至新的无核酸酶1.5ml离心管中;
8)文库检测
Qubit方法检测文库浓度:
a. 配置Qubit反应液:根据待测样本数量配置,每份样本取1μl染料至199μl的Qubit工作液混合,震荡10s,离心,室温保存;
b. 取2μl样本和198μl Qubit反应液充分混匀,避光于室温,温度不低于20度,反应3分钟;
c. 分别取10μl 标准品1和标准品2,各自和190μl Qubit反应液充分混匀,避光室温反应3分钟;
d. 文库检测Qubit方法检测文库浓度,样本1号的文库浓度为:0.82ng/µl;
9)OneTouch,使用Life Tech的模板制备试剂盒
根据Qubit检测的文库浓度,稀释文库至2.5pg/µl,用于OneTouch,运行5.5h;
10)PGM(Life Tech的测序试剂盒)
程序设定中测序Flow数量选择260Flows,参考基因组选择hg19,Ion xpress选择barcode1,318v2芯片测序,运行2.5h。
三、结果分析
1)比对与统计
利用软件TMAP将得到的读段与NCBI(美国国立生物技术信息中心)库中版本37(hg19;NCBI Build 37)的人类基因组参考序列进行比对,得到DNA序列定位于基因组相应位置的信息,作为后续CNV分析的数据,统计读段数目T,所述样本读段数目分别为T1= 637,855,T2= 643,550;
2)数据分析
基于预先统计的概率矩阵和转移矩阵,对于参考序列上的位点b,计算b=1位点的部分概率δ(i, 1),计算b>1位点的部分概率,利用b-1位点计算b位点的部分概率为δ(i, b)=max(δ(j,b-1)ajibik),直至得到每条染色体上所有位点的部分概率,记录形成某个位点最大局部概率的前一个状态,得到所有位点的状态序列;
设置m=4,连续m个窗口的拷贝数异常输出结果,得到每条染色体微重复和微缺失片段;
CNV分析结果输出并绘图:
表6为2例胚胎细胞CNV检测结果,其数字核型图如图5和图6。
实施例二
一、材料:
1、标本:合作医院活检的囊胚期细胞,样本来源为三例试管婴儿的胚胎样本,该父母之前出现反复流产。
2、试剂:Qiagen的全基因组扩增试剂盒、MDA产物检测试剂盒、MDA产物纯化试剂盒、life文库构建试剂盒、Agencourt®AMPure®XP磁珠、life模板制备试剂盒,life测序试剂盒。
3、仪器:PCR仪,琼脂糖凝胶电泳系统,ion torrent的PGM测序平台。
4、耗材:1.5ml、0.2ml进口离心管,瑞宁移液枪及带滤芯枪头。
二、操作步骤:
1、滋养外胚层细胞活检
采用二步法,第一步是在活检前段D3对所有的胚胎进行透明带打孔,D5或D6天在显微镜下对形成的2个优质囊胚行滋养层细胞采集术,每个囊胚各采集滋养层细胞5-10个,放入装有1µlPBS的PCR管底,离心管编号2。
2、MDA法全基因组扩增
准备Buffer DLB:对Buffer DLB管进行离心处理从而使干粉聚集到管底,加入500µl无核酸酶的水,涡旋彻底混匀使其溶解,然后短暂离心,溶解后的Buffer DLB可在-20℃保存6个月;
准备Buffer D2:如表1所示,可配制12个反应,-20℃可保存3个月;
扩增方法如下:
1)将细胞样本离心,使其离心至管底,用PBS补至4µl;
2)加3µl D2缓冲液,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心;
3)在PCR仪上65℃条件下孵育10min,加热盖,取出时放冰上;
4)加入3µl裂解终止液,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心,放置冰上;
5)冰上融化DNA全基因组扩增酶,其余组分室温融化后涡旋混匀,瞬时离心后放置在冰上,按照表2配制反应:
6)取上述混匀后的反应液40µl,将其加入步骤2.4的10µl DNA中,混匀,瞬时离心;
7)PCR仪上30℃条件下孵育8h;
8)PCR仪上65℃条件下孵育3min使酶失活。
3、MDA产物纯化
产物纯化方法如下:
1)加入50µl膜结合液于50µl MDA产物中,混匀后转移至纯化柱内,室温放置1min,12000rpm离心1min;
2)加入700µl膜洗脱液,12000rpm离心1min,弃上清液;
3)加入500µl膜洗脱液,12000rpm离心1min,弃上清液;
4)12000rpm空转2min弃去多余液体,室温晾干3min;
5)加50µl无核酸酶水至离心柱膜上,室温放置5min后12000rpm离心1min,收集产物DNA。
4、产物检测
产物检测方法如下:
1)浓度:取1µl稀释至20µl,再取2µl用Qubit方法测浓度,2号样本浓度为:20ng/µl,则原液浓度为:400ng/µl;
2)MDA产物检测试剂盒检测:
a. PCR体系如表3示:
b. PCR程序:
95℃-5min;
(95℃-30s;60℃-30s;72℃-30s)-40cycles;
72℃-10min;
4℃-holding;
c. 120v,30min,3%的琼脂糖凝胶电泳检测
5、文库构建
采用Life Tech公司的转座酶构建测序文库,其步骤如下:
1)DNA片段化
按下面表4的反应体系,一次加入反应溶液:
PCR仪上30℃片段化5min,后放置冰上加入片段化反应终止液3µl,吹吸混匀;
2)纯化
加49.5µl平衡到室温且充分混匀的Agencourt®AMPure®XP磁珠,加入体积为1.5倍样本体积,吹吸次数约10次,震荡混匀,离心2s,室温孵育5min,磁吸3-4 min,弃上清,加500µl新鲜配制的70%乙醇清洗,磁力架上旋转2周,时间约30s,弃上清,重复一次清洗后,室温稍晾干沉淀,时间约为2-3min,加25µl low TE 洗脱,震荡混匀5s,离心2s,磁吸3 min,吸25µl上清至新的PCR管中;
3)连接头及片段扩增
按照下面的表5配置反应体系后,充分震荡混匀分装至0,2µlPCR管中,每管均装入50µl混合液;
放入PCR仪,反应程序如下:66℃3min,98℃30s预变性,然后98℃变性10s,60℃杂交50s,72℃延伸10s,一共9个循环,72℃10min;
PCR结束后,将反应液全部转移至新的1.5ml离心管中,用于纯化;
4)纯化
加360µl平衡到室温且充分混匀的Agencourt®AMPure®XP磁珠,加入体积为1.8倍样本体积,吹吸次数约10次,室温孵育5min,磁吸3-4min,弃上清,加500µl新鲜配制的70%乙醇清洗,磁力架上旋转2周,时间约30s,弃上清,重复一次清洗后,室温稍晾干沉淀,时间约2-3min,加20µllow TE洗脱,震荡混匀5s,离心2s,磁吸3 min,吸20µl上清至新的PCR管中;
5)片段选择
使用2%的预制琼脂糖凝胶,样本上样20µl,Marker上样10µl,电泳进行至约13-14 min时,Marker的200bp条带在收集孔中,250bp条带在孔的上边缘,此时收集液体,再用10µl水洗收集孔,两次加一起共约25µl,文库插入片段应在100bp-110bp;
6)文库检测
Qubit方法检测文库浓度,文库浓度为1.3ng/ul
7)乳液PCR(One
Touch)
根据Qubit检测的文库浓度,稀释文库至2.5pg/µl,用于OneTouch,使用Ion PGM模板制备试剂盒试剂盒对文库DNA进行扩增,运行5.5h;
8)PGM(转座酶测序试剂盒)
程序设定中测序Flow数量选择260Flows,参考基因组选择hg19,314芯片测序,运行1.5h。
三、结果分析
1)比对与统计
利用软件TMAP将得到的读段与NCBI数据库中版本37(hg19;NCBI Build
37)的人类基因组参考序列进行比对,得到DNA序列定位于基因组相应位置的信息,作为后续CNV分析的数据,统计读段数目T,所述样本读段数目分别为T1= 508,622,T2= 359,072,T3=510,156;
2)数据分析
为了避免重复序列影响,去除基因组中重复区域位置及转座子区域位置,以600kb为单位窗口长度统计比对到基因组上每个窗口的读段数目(Reads Counts,RC),基于RC利用均值漂移算法对连续的窗口进行分段,对于每段使用T检验方法判断其染色体拷贝数;
首先对染色体每个参与分析的窗口按照位置进行编号,基于每个窗口的RC及相邻的窗口计算特定窗口的正负方向性:
公式中i,j表示窗口编号,Hb为相邻窗口个数,即j的取值范围为(i-Hb)到(i+Hb),ri及rj为编号为i,j窗口的RC值,第i个窗口的Hr值为:
或者
Hs为染色体所有窗口的标准偏差,Hb的取最小值为4,最大值为64,以4为间隔递增,以窗口正负方向分段,连续正向窗口和连续负向窗口为一段,若分段与左右相邻两段窗口平均值在p<0.05水平T检验有差异,则该段窗口不再变化,否则增加Hb,重新计算分段,直至所有相邻分段都有差异;
将所有分段窗口RC平均值(avgSEG)与染色体所有窗口RC(avgRC)平均值做T检验比较,在p<0.01的水平,若avgSEG明显高于avgRC,则认为该分段染色体异常重复,若avgSEG明显低于avgRC,则认为该分段染色体异常缺失;表6为3例胚胎细胞检测结果,其数字核型图如图8-10。
本发明用于对适用人群进行染色体CNV分析,有利于提供遗传咨询和提供临床决策依据:进行植入前诊断或产前诊断可有效防止患儿出生。
本发明适用人群可以是常规染色体核型分析为平衡易位携带者或者有以下临床表现的人群:
1)多次胚胎停育或自然流产的女性或其配偶;
2)曾生育过畸形胎儿的女性或其配偶;
3)男性无精少精不育症患者;
4)原因不明的男性不育症患者;
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其它各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将获自体外培养的囊胚滋养层细胞进行全基因组扩增,将扩增后的基因组DNA分子随机打断,得到DNA片段,并对得到的DNA片段进行测序,获得测序的读段;
2)将步骤1)中测定的DNA序列与人类基因组参考序列进行比对,将所测DNA序列定位于参考序列上;
3)筛选参考序列非重复区域,去除参考序列上长度为n并且在参考序列其它位置出现完全一致序列的区域,保留非重复区域;
4)通过正常样本建立窗口内读段数目矩阵,对预先准备正常样本数据进行分析,统计步骤3)中非重复区域内各窗口读段数,建立读段数及染色体整倍体的概率矩阵;
5)根据步骤4)中概率矩阵及预先建立的转移矩阵,计算位点的拷贝数即A/B/C状态,具体步骤如下:
对于参考序列上的位点b,计算b=1位点的部分概率δ(i,
1),δ(i,
b)表示b位点到状态i的所有可能中最大的的概率;
计算b>1位点的部分概率,利用b-1位点计算b位点的部分概率为δ(i,
b)=max(δ(j,b-1)ajibik),其中aji表示从状态 j 转移到状态i的概率,bik表示状态i的读段数为k的概率;
回溯序列,在每一个中间位点和结束位点均有一个部分最优概率 δ(i, b),记录形成某个位点最大局部概率的前一个状态,得到所有位点的状态序列;
6)基于步骤5)中得到的待测样品数据的状态序列,将连续m个位点为A状态选择为微重复位点,连续m个位点为C状态选择为微缺失位点;
7)将所述微缺失位点和/或微重复位点与已有的CNV和疾病数据库进行对照,并进行基本的基因注释和缺失部分涉及的基因功能分析,标注出微缺失综合征疾病类型。
2.根据权利要求1所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法,其特征在于,所述读段为测序获得的序列片段。
3.根据权利要求2所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法,其特征在于,断点为染色体上发生拷贝数变异的分界点。
4.根据权利要求3所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法,其特征在于,步骤1)中基因组DNA的获取自胚胎囊胚期,取出的外围滋养层细胞数目为3-5个。
5.根据权利要求4所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法,其特征在于,步骤1)中,DNA分子的随机打断处理采用酶切、雾化、超声或物理剪切法。
6.根据权利要求5所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法,其特征在于,步骤1)中,所述DNA分子被打断至平均长度为100bp-200bp。
7.根据权利要求6所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法,其特征在于,步骤1)中,所述的测序方法为高通量测序方法Ion Torrent/PGM,所述DNA的平均长度为120bp。
8.根据权利要求7所述的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法,其特征在于,测序深度为0.01-0.1X。
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