CN109929918B

CN109929918B - 一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法

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Publication number: CN109929918B
Application number: CN201910232981.5A
Authority: CN
Inventors: 张松英; 张银丽; 马烨榕; 金佳敏; 杨玮杰
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: CN109929918A

Abstract

本发明涉及生物技术领域。目的是提供一种评估卵母细胞及胚胎质量的方法，该方法具有准确率高的特点，有利于提高胚胎移植成功率，减少医疗费用。技术方案是：一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法；按以下步骤依次进行：1)在管性因素有生殖问题的取卵病人取卵日，收集其卵子外围多余的颗粒细胞；2)将收集的颗粒细胞作为样品，使用RNA提取试剂盒获得颗粒细胞样品中的总RNA；3)使用逆转录试剂盒配置混合物后在普通PCR仪中实验获得cDNA模板；4)使用实时定量PCR试剂盒，在步骤3)获得的cDNA模板中分别加入如下序列的ADAMTS1引物、HSPG2引物以及管家基因β‑actin引物。

Description

一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种卵母细胞及胚胎质量的评估方法。

背景技术

随着社会节奏的加快，人们不孕不育的比例逐渐上升，越来越多的患者试图通过以下方式获得试管婴儿：促排卵、取卵、体外受精、移植；但不是每一个获得的卵子都可以进一步正常发育至胚胎、正常着床、妊娠，因而寻找一些可以指示卵子质量的标记物则显得非常重要，这可以帮助我们在既有的基础上选择更加优质的胚胎进行移植。目前对卵子质量的评估主要通过从外观形态判断，包括是否有完全扩展的卵丘细胞、完全分散排列的放射冠、卵母细胞的透明带和胞质等情况，对胚胎质量的评价主要从卵裂球大小、碎片和胞质是否透明评估，仍缺乏对卵母细胞及胚胎质量的定量评估方法。

颗粒细胞通常被认为与卵子质量密切相关；既往研究中发现含凝血酶敏感素1型基序的解聚素样金属蛋白酶(ADAMTS1)，属于基质金属蛋白酶(MMP)家族，与排卵相关，底物为多功能蛋白聚糖(versican)，ADAMTS1与versican结合后可以改变细胞外基质(ECM)的结构，帮助排卵。ADAMTS1敲除老鼠中发现versican的含量显著上升，排卵数显著下降。人硫酸乙酰肝素蛋白多糖2(HSPG2)的产物为基底膜聚糖(perlecan)，也是ECM的重要组成之一，在卵泡液中的一些实验说明它的含量与卵子能否成功受精有相关性。

发明内容

本发明的目的是克服上述背景技术存在的不足，提供一种评估卵母细胞及胚胎质量的方法，以对于生殖结局作出预测；该方法具有准确率高的特点，有利于提高胚胎移植成功率，减少医疗费用。

本发明提供的技术方案是：

一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法；按以下步骤依次进行：

1)在管性因素有生殖问题的取卵病人取卵日，收集其卵子外围多余的颗粒细胞；

2)将收集的颗粒细胞作为样品，使用RNA提取试剂盒获得颗粒细胞样品中的总RNA；

3)使用逆转录试剂盒配置混合物后在普通PCR仪中实验获得cDNA模板；

4)使用实时定量PCR试剂盒，在步骤3)获得的cDNA模板中分别加入如下序列的ADAMTS1引物、HSPG2引物以及管家基因β-actin引物：

ADAMTS1 Forward,AAGACGAGGACGAAGGGACTReverse,TAGCGGTGACTGGACACAAA

HSPG2 Forward,CCAGCTCTCTTTTGGCAACTReverse,GGTGTATCGCAACTTCCCAC

β-Actin Forward,GCAAAGACCTGTACGCCAAReverse,GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC

5)采用实时定量PCR仪进行实时定量实验，获得不同样品的ADAMTS1、HSPG2、β-actin的CT值；

6)使用EXCEL根据公式计算每个样品的ADAMTS1及HSPG2的相对含量，根据PCR仪原理：引物及模板cDNA在PCR仪温度的变化下可以进行成倍复制，仪器检测cDNA浓度达到一定值需要的复制倍数即为CT值，同时由于只有信使RNA(mRNA)在逆转录时可以被逆转录成为cDNA，倒推可以得到目标样品对相对β-actin的mRNA相对含量的计算公式为：

ADAMTS1的mRNA相对含量＝2^{β-actin的CT值-ADAMTS1的CT值}；

HSPG2的mRNA相对含量＝2^{β-actin的CT值-HSPG2的CT值}；

7)运用EXCEL，将步骤6)获得的数据代入公式P＝1/[e^2.014 ^{-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量}]，计算预测概率值P；若预测概率值大于等于0.438时可判为阳性，即判断该病人胚胎移植后可成功着床。

所述步骤7)中的公式P＝1/[e^{2.014-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量}]，是将统计分析软件SPSS行ROC分析后得到的表1中的系数代入统计学公式：预测概率值P＝1/[e^(常量+系数1*HSPG2的相对含量+系数2*ADAMTS1的相对含量)]后得到；

所述表1是统计分析软件SPSS行ROC分析过程中自动生成的方程中的变量；

所述统计学公式中的变量、系数1、系数2分别为表1中第一列的常量、HSPG2以及ADAMTS1；其中常量为2.014，HSPG2为-78.316、ADAMTS1为-1.888。

所述步骤7)中，预测概率值大于等于0.438的依据是：根据统计学要求诊断节点需使得灵敏度和特异度均较高，因此在ROC曲线具体值表中划定诊断点大于20％至小于80％区间，然后取该区间的两个端点作为两个诊断点，在ROC曲线具体值表中找到两个诊断点相对应的真阳性率(P1、P2)数据和假真阳性率(R1、R2)数据，再根据统计学公式：：

(R1-R2):[R1-(R＝X)]＝(P1-P2):[P1-P(R＝X)]

即可计算获得预测概率值P(R＝X)＝0.438。

所述步骤1)中的收集，是在保证卵丘复合物的完整性的前提下，由专业胚胎实验室人员采用专业配套切割针，切取卵丘复合物外层过多的颗粒细胞。

本发明通过对颗粒细胞中ADAMTS1及HSPG2表达mRNA情况进行定量检测，从而定量评估卵子质量，帮助预测辅助生育结局，具有以下有益效果：

1、提供了一种新的预测辅助生育临床结局的方法；

2、可以更加准确、标准化、定量地评估卵子质量；

3、有助于选择合适的促排周期获得的胚胎进行移植，增加成功率，减少医疗费用。

附图说明

图1是ADAMTS1的mRNA相对含量与卵子及胚胎发育的相互关系示意图。

图2是HSPG2的mRNA相对含量与卵子及胚胎发育的相互关系示意图。

图3是ADAMTS1的mRNA相对含量对预测胚胎移植后是否着床的RDC曲线图。

图4是本发明所述方法的步骤流程图。

具体实施方式

以下结合附图所示的实施例，进一步说明本发明的形成过程。

一、研究分析过程

1、颗粒细胞采集

对因管性因素(输卵管因素)或男方因素在浙江大学医学院附属邵逸夫医院生殖中心行辅助生育的103名患者的颗粒细胞进行了采集分析；同时对这些患者的取卵数、卵子质量情况(完成第二次减数分裂的MII期卵数、排极体率、受精率、正常受精率)、胚胎情况(可移植胚胎数、优胚数、可移植胚胎率、优胚率)、是否着床、是否正常妊娠的临床结局进行了统计。

1)入选标准

管性或男性因素病人：

(1)年龄在20-39周岁；(2)身体质量指数(BMI)在18-26kg/m²；(3)正常月经周期；(4)管性或男性因素不孕；

2)排除标准

管性或男性因素病人：(1)内分泌异常；(2)基础内分泌卵泡生成素(FSH)大于10IU/l；(3)卵巢过度刺激征(OHSS)；

2、实验方法

1)将每一个病人获得的卵子外围的颗粒细胞作为一个样品，使用RNA提取试剂盒(QIAGEN RNeasy Plus Micro Kit,Cat No./ID:74034)获得颗粒细胞样品中的总RNA；

2)使用逆转录试剂盒(

Q Select RT SuperMix for qPCR,Cat No./ID:R132-01)获得cDNA；

3)使用实时定量PCR试剂盒(SYBR Green Master Mix，Bestar,Cat No./ID:DBI-2044)，分别加入匹配的ADAMTS1、HSPG2和管家基因β-actin引物，引物序列来自哈佛大学的primerbank(网址为https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)，由北京擎科新业生物技术有限公司杭州合成部合成；

引物序列为：

4)使用实时定量PCR仪进行实时定量实验，获得不同病人ADAMTS1、HSPG2、β-actin的CT值，使用EXCEL计算ADAMTS1及HSPG2的mRNA相对含量；

计算公式为：

ADAMTS1的mRNA相对含量＝2^{β-actin的CT值-ADAMTS1的CT值}；

HSPG2的mRNA相对含量＝2^{β-actin的CT值-HSPG2的CT值}；

在EXCEL中的函数为power(2,β-actin的CT值-ADAMTS1/HSPG2的CT值)；

3、分析

1)结合取卵数、卵子质量情况(完成第二次减数分裂的MII期卵数、排极体率、受精率、正常受精率)、胚胎情况(可移植胚胎数、优胚数、可移植胚胎率、优胚率)、是否着床、是否正常妊娠进行分析，评估ADAMTS1与HSPG2在颗粒细胞中含量高低与这类临床结局是否有关系。

所有分析采用美国国际商用机器公司(International Business MachinesCorporation,USA)的SPSS 23.0版本软件；具体检验步骤为：

第一步:运用SPSS中K-S检验数据是否为正态分布；

第二步：如果为正态分布应用t检验，当P值小于0.05时判定两组间存在显著性差异；若为非正态分布，选用非参数检验，同样当P值小于0.05时判定两组间存在显著性差异；

第三步：运用SPSS的ROC分析工具，对ADAMTS1、HSPG2的mRNA相对含量及是否成功着床的临床结局进行分析，判断ADAMTS1、HSPG2的mRNA相对含量对能否成功着床的预测能力。

2)制作图表

(1)将获得的样本分类，按ADAMTS1的相对含量从小到大排列，含量较低的52个样本为低ADAMTS1组，含量较高的51个样本为高ADAMTS1组；列成图表(图1)进行对照。

与之类似，将HSPG2的相对含量从小到大排列，含量较低的52个样本为低HSPG2组，含量较高的51个样本为高HSPG2组；列成图表(图2)进行对照。

(2)将高、低ADAMTS1组的获卵数、MII卵数、可移植胚胎数、优胚数进行比较，在SPSS中进行正态性检验后进行t检验，比较两组间是否存在显著性差异；

将高、低HSPG2组的获卵数、MII卵数、可移植胚胎数、优胚数、可移植胚胎率、优胚率进行比较，在SPSS中进行正态性检验后进行t检验，比较两组间是否存在显著性差异；

(3)ROC曲线的绘制

将103名病人的相对ADAMTS1和HSPG2的mRNA相对含量，以及移植后是否着床的临床结局(着床记为1，未着床记为0)数据列成表格(表3中的前3列)，然后在统计学软件SPSS中行多因素ROC分析，得到ROC曲线(受试者工作特征曲线，图3中斜直线上边的曲线；区域＝0.73是指ROC曲线下的面积比例为0.738，P＜0.001是ROC曲线的概率，小于0.05说明有统计学意义，可以通过ADAMTS1及HSPG2的mRNA相对含量预测能否成功着床＝，制作过程中软件自动生成方程中的变量(表1)以及ROC曲线数值表(表2)；

SPSS的自动生成原理为：依次将预测为成功着床的概率值作为阈值，当测试样本属于成功着床样本的概率大于或等于这个阈值时，软件认为它为成功着床样本，否则为无法成功着床样本。举例来说：

(1)103名病人样本中实际成功着床人数为66，未着床人数为37，SPSS对所有103个病例样本的概率输出(属于成功着床组的概率)从大到小排序(见表3中第4列)，表3中第21个数据预测为成功着床的概率为0.81228，那么样本1～21被认为是成功着床样本，因为它们的预测概率都大于等于0.81228，而其他样本都被认为是无法成功着床样本，此时真阳性人数为20，真阴性人数为36，假阴性人数46，假阳性人数为1，此时根据灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％，假阳性率＝1-真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数))*100％，得到敏感性为0.3030和假阳性率为0.027。

(2)103名病人样本中实际成功着床人数为66，未着床人数为37，SPSS对所有103个病例样本的概率输出(属于成功着床组的概率)从大到小排序(见表3中第4列)，表3中第80个数据预测为成功着床的概率为0.50232，那么样本1～80被认为是成功着床样本，因为它们的预测概率都大于等于0.50232，而其他样本都被认为是无法成功着床样本，此时真阳性人数为59，真阴性人数为16，假阴性人数7，假阳性人数为21，此时根据灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％，假阳性率＝1-真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数))*100％，得到敏感性为0.8939和假阳性率为0.5676。

这样可以获得103个点，在此基础上生成模拟的ROC曲线，软件再自动从诊断点0至1选择一定量的数据生成表2。

(4)根据表1第一列B中的常量、HSPG以及ADAMTS1(常量为2.014、系数1为HSPG＝-78.316、系数2为ADAMTS1＝-1.888)代入统计学公式P＝1/[e^(常量+系数1*HSPG2的相对含量+系数2*ADAMTS1的相对含量)]，即可得到以下预测概率值P的公式：

P＝1/[e^{2.014-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量}]。

3)结果

(1)管性病人中ADAMTS1高表达组相较低表达组获得更多的卵、更多发育至MII期的卵、更多可移植胚胎及更多的优胚(图1中的低组为低ADAMTS1组；高组为高ADAMTS1组，每一个圆点代表一个病例个体；图中的P为统计学概率，NS为两组统计学计算后P值大于等于0.05，两组间无显著性差异)

图1中：

A：根据ADAMTS1的mRNA相对水平分为低组和高组，两组有不同的获卵数。

B：根据ADAMTS1的mRNA相对水平分为低组和高组，两组有不同的MLL卵数。

C：根据ADAMTS1的mRNA相对水平分为低组和高组，两组有不同的可移植胚胎数。

D：根据ADAMTS1的mRNA相对水平分为低组和高组，两组有不同的优胚数。

(2)管性病人中HSPG2低表达组相较高表达组获得更多发育至MII期的卵、更多可移植胚胎、更多的优胚、更高的可移植胚胎率及更高的优胚率(图2中的低组为低HSPG2组；高组为高HSPG2组，每一个圆点代表一个病例个体；图中的P为统计学概率，NS为两组统计学计算后P值大于等于0.05，两组间无显著性差异)

图2中：

A：根据HSPG2的mRNA相对水平分为低组和高组，两组获卵数无显著差异。

B：根据HSPG2的mRNA相对水平分为低组和高组，两组有不同的MII卵数。

C：根据HSPG2的mRNA相对水平分为低组和高组，两组有不同的可移植胚胎数。

D：根据HSPG2的mRNA相对水平分为低组和高组，两组有不同的优胚数。

E：根据HSPG2的mRNA相对水平分为低组和高组，两组有不同的可移植胚胎数。

F：根据HSPG2的mRNA相对水平分为低组和高组，两组有不同的优胚数。

(3)根据ROC曲线(图3所示)得到结果，综合考虑ADAMTS1和HSPG2在颗粒细胞中mRNA的相对含量，可以对胚胎能否着床有一定的预测作用。

二、本发明的技术方案

1、收集因管性因素有生殖问题的取卵病人取卵日多余的颗粒细胞：B超引导下经阴道选择大卵泡获得卵丘复合物后在体视镜下由专业胚胎实验室人员用专业配套切割针切取外层过多的颗粒细胞，但保证卵丘复合物的完整性。

2、将每一个病人获得的卵子外围获得的颗粒细胞作为一个样品，使用RNA提取试剂盒(QIAGEN RNeasy Plus Micro Kit,Cat No./ID:74034)获得颗粒细胞样品中的总RNA。

3、用逆转录试剂盒(

Q Select RT SuperMix for qPCR,Cat No./ID:R132-01)获得cDNA。

4、实时定量PCR试剂盒(SYBR Green Master Mix，Bestar,Cat No./ID:DBI-2044)，分别加入匹配的ADAMTS1、HSPG2和管家基因β-actin引物；引物序列为：

基因引物序列(5’-3’)

ADAMTS1前向引物Forward,AAGACGAGGACGAAGGGACT反向引物Reverse,TAGCGGTGACTGGACACAAA

HSPG2前向引物Forward,CCAGCTCTCTTTTGGCAACT反向引物Reverse,GGTGTATCGCAACTTCCCAC

β-Actin前向引物Forward,GCAAAGACCTGTACGCCAA反向引物Reverse,GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC

5、利用实时定量PCR仪器进行实时定量实验，获得不同病人ADAMTS1、HSPG2、β-actin的CT值；使用EXCEL计算ADAMTS1及HSPG2的相对含量，计算公式为ADAMTS1的相对含量＝2^{β-actin的CT值-ADAMTS1的CT值}，HSPG2的相对含量＝2^{β-actin的CT值-HSPG2的CT值}，在EXCEL中的函数为power(2,β-actin的CT值-ADAMTS1/HSPG2的CT值)。

6、运用EXCEL，将步骤5获得的数据代入以下统计学公式：

P＝1/[e^{2.014-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量}]，

计算预测概率值P；若预测概率值大于等于0.438时可判为阳性，即判断该病人胚胎移植后可成功着床。

前款结论的依据是：在ROC曲线具体值表(表2；SPSS制作ROC曲线时生成的数据，诊断点从小到大排列而成)中根据统计学要求诊断节点需使得灵敏度和特异度均较高，因此划定诊断点大于20％至小于80％区间，然后取该区间的两个端点作为两个诊断点，在ROC曲线具体值表中找到两个诊断点相对应的真阳性率(P1、P2)数据和假阳性率(R1、R2)数据，从表2中查得数据：

假阳性率：R1＝0.838,R2＝0.081；敏感性：P1＝0.985，P2＝0.318；

将数据代入统计学公式(R1-R2):[R1-(R＝X)]＝(P1-P2):[P1-P(R＝X)]，得：

P(R＝X)＝1-(0.838-0.200)*(0.985-0.318)/(0.838-0.081)＝1-0.638*0.667/0.757＝0.438；

因此，预测概率值大于等于0.438时可判为阳性(则判断该病人胚胎移植后可成功着床)。

具体实施例

实施例1

患者A，因管性因素行IVF(in vitro fertilization；第一代试管婴儿)治疗，测其颗粒细胞中HSPG2、ADAMTS1、β-actin的CT值为27.95、29.58、20.05，在EXCEL中运用函数power(2,β-actin的CT值-ADAMTS1/HSPG2的CT值)计算，则HSPG2、ADAMTS1的相对含量值分别为0.004，0.0014；再代入公式P＝1/[e^{2.014-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量}]，得预测概率为0.87864，大于等于0.438；则预测其移植胚胎后可以成功着床。

实施例2

患者B，因男方因素行ICSI(Intracytoplasmic sperm injection，卵胞浆内单精子注射)治疗，测其颗粒细胞中HSPG2、ADAMTS1、β-actin的CT值为23.56、25.82、19.04，在EXCEL中运用函数power(2,β-actin的CT值-ADAMTS1/HSPG2的CT值)计算，则HSPG2、ADAMTS1的相对含量值分别为0.0477，0.0091；再代入公式P＝1/[e^2.014 ^{-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量}]，得预测概率为0.1494，小于0.438；则预测其移植胚胎后无法成功着床。

表1：

方程中的变量

表2：ROC曲线数值表

表3：

103名患者的HSPG2、ADAMTS1、是否着床及预测为成功着床的概率表

序列表

<110>浙江大学

<120>一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵母细胞及胚胎质量的方法

<160>2

<210>1

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>DNA（或脱氧核糖核酸）序列

<223> ADAMTS1 PCR正向引物

<400>1

AAGACGAGGACGAAGGGACT

<110>浙江大学

<160>2

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222> DNA（或脱氧核糖核酸）序列

<223> ADAMTS1 PCR反向引物

<400>2

TAGCGGTGACTGGACACAAA

<110>浙江大学

<160>2

<210>1

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>DNA（或脱氧核糖核酸）序列

<223> HSPG2 PCR正向引物

<400>1

CCAGCTCTCTTTTGGCAACT

<110>浙江大学

<160>2

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222> DNA（或脱氧核糖核酸）序列

<223> HSPG2 PCR反向引物

<400>2

GGTGTATCGCAACTTCCCAC

<110>浙江大学

<160>2

<210>1

<211> 19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>DNA（或脱氧核糖核酸）序列

<223> β-Actin PCR正向引物

<400>1

GCAAAGACCTGTACGCCAA

<110>浙江大学

<160>2

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222> DNA（或脱氧核糖核酸）序列

<223> HSPG2 PCR反向引物

<400>2

GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC

Claims

1.一种基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法，所述方法不用于疾病诊断治疗；按以下步骤依次进行：

1)使用RNA提取试剂盒提取卵子外围多余颗粒细胞样品中的总RNA；

2)使用逆转录试剂盒配置混合物后在普通PCR仪中实验获得cDNA模板；

3)使用实时定量PCR试剂盒，在步骤3)获得的cDNA模板中分别加入如下序列的ADAMTS1引物、HSPG2引物以及管家基因β-actin引物：

ADAMTS1 Forward,AAGACGAGGACGAAGGGACT

Reverse,TAGCGGTGACTGGACACAAA

HSPG2 Forward,CCAGCTCTCTTTTGGCAACT

Reverse,GGTGTATCGCAACTTCCCAC

β-Actin Forward,GCAAAGACCTGTACGCCAA

Reverse,GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC

4)采用实时定量PCR仪进行实时定量实验，获得不同样品的ADAMTS1、HSPG2、β-actin的CT值；

5)使用EXCEL根据公式计算每个样品的ADAMTS1及HSPG2的mRNA相对含量，得到每个样品相对β-actin的mRNA相对含量的计算公式为：

ADAMTS1的mRNA相对含量＝2^{β-actin的CT值-ADAMTS1的CT值}；

HSPG2的mRNA相对含量＝2^{β-actin的CT值-HSPG2的CT值}；

6)运用EXCEL，将步骤6)获得的数据代入公式P＝1/[e^2.014 ^{-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量}]，计算预测概率值P，若预测概率值大于等于0.438时可判为阳性，即则判断该胚胎移植后可成功着床。

2.根据权利要求1所述的基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法，其特征在于：所述步骤7)中的公式P＝1/[e^{2.014-78.316*HSPG2的相对含量-1.888*ADAMTS1的相对含量}]，是将统计分析软件SPSS行ROC分析后得到的表1中的系数代入统计学公式：预测概率值P＝1/[e^(常量+系数1*HSPG2的相对含量+系数2*ADAMTS1的相对含量)]后得到；

所述表1是统计分析软件SPSS行ROC分析时自动生成的方程中的变量；

所述统计学公式中的变量、系数1、系数2分别为表1中第一列的常量、HSPG2以及ADAMTS1；其中常量为2.014，HSPG2为-78.316、ADAMTS1为-1.888；

表1：

方程中的变量

3.根据权利要求2所述的基于颗粒细胞基因表达情况评估卵及胚胎质量的方法，其特征在于：所述步骤7)中，预测概率值大于等于0.438的依据是：根据统计学要求诊断节点需使得灵敏度和特异度均较高，在ROC曲线具体值表中划定诊断点大于20％至小于80％区间，然后取该区间的两个端点作为两个诊断点，在ROC曲线具体值表中找到两个诊断点相对应的真阳性率(P1、P2)数据和假阳性率(R1、R2)数据，再根据统计学公式：

(R1-R2):[R1-(R＝X)]＝(P1-P2):[P1-P(R＝X)]

即可计算获得预测概率值P(R＝X)＝0.438。