CN111500692A - 一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，包括精液标本采集、精子RNA提取、精子RNA测序、生物信息学分析、Real‑time PCR验证、统计学分析的步骤，本发明的方案选定3个单个外显子SPATA19,OSBP2和ACE作为衡量精子受孕潜力的生物标记物，并成功建立方程模型，利用这三个基因的CT值代入方程，计算每个样本得出的数值作为参考值，作为精子受孕潜能的评估数值。在双盲测试中，利用方程得出的结论与临床反馈精子受孕力契合度高于85％。本发明的实验结论充分说明精子所携带的RNA可以作为评估精子受孕潜力的生物标记物，并准确地去除受孕力及其低下的那部分供精，大大提高了精子库供精质量。

Description

一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法。
背景技术
辅助生殖技术的发展，已能帮助那些因严重男性因素导致不育的夫妇获得健康子代。然而迄今为止，尚缺乏有效的精子功能评估指标。生殖生物学和生殖遗传学的发展为评估精子结构和功能提供了许多值得借鉴的评估方法，如精子膜功能检测、顶体功能检测、线粒体功能检测、中心体功能检测及遗传物质完整性检测，但这些检测对精子功能评估的准确性非常有限，难以作为独立的临床指标，故寻找一种有效的评价精子功能方法可能更有助于临床实际。
生殖是一个复杂的生理过程，但人们对其中的生理、病理学机制认识有限，对男性不育的了解尤其有限。目前对于男性不育的疾病大多难以进行病因学分类并进行针对性诊疗。临床上已广泛采用WHO标准精液分析，项目包括精子密度、活力和形态学检查等，作为评估男性生育力的重要指标。但它们仅仅是关于精液中活动的结构上正常的精子数量上的浅表的分析，对精子功能和受精潜能，则所提供的信息是有限的，不能对男性生育力提供精确的诊断及预后估计。
人类成熟精子中RNA的存在已经被证实，主要包括mRNA和非编码RNA家族成员。随着研究深入，发现精子mRNA表达差异，与精子活力和男性生育功能相关。而部分精子中特异存在的mRNA和小RNA在精卵融合和早期胚胎发育调控中有重要作用。已经获得的结果提示精源性RNA的表达具有个体差异性，并且是胚胎发育所必需的。对精子RNA功能的深入研究将会对男性不育、人类辅助生育技术以及核移植技术等相关领域产生推动作用，如何根据这些研究选择出适合临床检测使用的标志物，建立一种临床应用价值大的精子功能检测方法是目前男性生殖医学转化医学研究的重点。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供了一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，以精子所携带的RNA可以作为评估精子受孕潜力的生物标记物，能够非常准确地去除受孕力及其低下的那部分供精，大大提高了精子库供精质量。
为此，本发明公开如下技术方案：
一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，包括如下步骤：
(1)精液标本采集及冷冻：统计妊娠满5例及妊娠≤2例的精液样本外供周期数据分布情况，据此制订高受孕力组及低受孕力组，让捐精者通过手淫取精，再使用“一步薰蒸法”进行精液冷冻；
(2)精子RNA提取：用试剂盒mirVana RNA isolation kit提取精子RNA；
(3)精子RNA测序：用提取到的10例高受孕力和10例低受孕力精子总RNA100ng按照BGI HiSeq Strand-Specific Transcriptome library方法构建cDNA文库，应用BGI HiSeq2500PE126测序平台进行RNA测序；
(4)生物信息学分析：将测序获得的数据进行生物信息学分析，获得高、低生育率组差异表达的mRNA；
(5)Real-time PCR验证：将提取到精总RNA用DNase I消化去除基因组DNA，反转录后，用2.5倍体积去离子水稀释cDNA作为q-PCR模板，进行定量PCR检测；
(6)统计学分析：数据采用SPSS软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，两组比较用t检验，采用线性回归分析；P≤0.05为具有统计学意义；
(7)结果分析：两组样本中具有明显差异表达的基因单个外显子作为衡量精子受孕潜力的生物标记物，分别为SPATA19,OSBP2和ACE，并且成功建立方程模型，利用这三个基因的CT值代入方程，计算每个样本得出的数值作为参考值，作为精子受孕潜能的评估数值。
优选地，所述步骤(1)之前，需要明确样本来源并对其进行分组：
回顾性分析广东省人类精子库2010年1月至2016年12月AID周期妊娠反馈结局，统计妊娠满5例及妊娠≤2例的精液样本外供周期数据分布情况，据此制订高受孕力组及低受孕力组的入组标准：从妊娠满5例组中选取外供周期最少的捐精者编入高受孕力组；妊娠≤2例组选取外供周期最多的捐精者编入低受孕力组。
优选地，所述步骤(1)中，精液是以1∶2的体积比向精液中缓慢添加改良甘油-卵黄-柠檬酸型精子冷冻保护剂，使用“一步薰蒸法”进行精液冷冻；一步薰蒸法为距离液氮面5cm熏蒸10min，后放入液氮。
优选地，所述步骤(2)中，精子RNA提取具体为：
将冷冻精子37℃水浴10分钟，取300ul精液3000g离心5分钟后收集沉淀；
用PBS洗涤2次，用试剂盒mirVana RNA isolation kit(Invitrogen)提取精子RNA：用500ul裂解液加入到精子沉淀中去，70℃孵育15分钟已裂解精子头部，将裂解物过柱，去除基因组DNA，保留过滤液进行RNA纯化，加入1.25倍体积的乙醇第二次过柱，精子RNA保留在柱子上，用30ul去离子水洗脱，获得精子总RNA。
优选地，所述步骤(5)中，Real-time PCR验证具体为：将提取到精总RNA用DNase I消化去除基因组DNA，用300ng RNA按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录，用2.5倍体积去离子水稀释cDNA作为q-PCR模板.设计、合成33个差异基因的引物，应用
Figure BDA0002481660310000031
Premix Ex TaqTM(Takara,Cat.RR420A)进行定量PCR检测。
本发明的方案中通过选取两组外供精子样本，即高受孕力精子组(外送次数小于20并获得5次成功受孕)和低受孕力精子组(外送大于20次并获得0次受孕)，每组各10份样本，进行RNA测序。然后对RNA测序结果进行生物信息学分析，得到33个在两组样本中具有差异表达的基因作为候选生物标记物，其中23个为精子发生相关基因，10个为能量代谢相关基因。本发明的方案进一步对这33个基因进行了单个外显子表达谱描绘，并针对单个外显子设计引物，在扩大样本量的两组精子标本(高、低受孕力组各20份)中进行q-PCR验证实验。最终本发明的优选方案选定3个在两组样本中具有明显差异表达的基因单个外显子作为衡量精子受孕潜力的生物标记物，分别为SPATA19,OSBP2和ACE，并且成功建立方程模型。利用这三个基因的CT值代入方程，计算每个样本得出的数值作为参考值，作为精子受孕潜能的评估数值。在双盲测试中，利用方程得出的结论与临床反馈精子受孕力契合度高于85％。本发明的实验数据说明，精子所携带的RNA可以作为评估精子受孕潜力的生物标记物，而本发明所建立的方法虽然无法百分百准确的判定单份样本的受孕能力，但是可以百分百的去除受孕力及其低下的那部分供精，大大提高了精子库供精质量。与此同时，本发明的方案能够启发下一步将继续研究精子中其他种类的RNA，进一步优化精子筛选的方法，进一步提高精子库的外供精液质量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。
图1为高、低受精率组差异表达的33个mRNA；
图2为获得9个评估精子质量的候选标记物；
图3为建立线性回归方程模型；
图4为过方程预测的结果与临床数据结果比较。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规方式进行操作。
实施例1
1、研究对象
1.1样本来源与分组
本实验研究均获得志愿者知情同意，并经广东省计划生育专科医院生殖伦理委员会批准。回顾性分析广东省人类精子库2010年1月至2016年12月AID周期妊娠反馈结局。统计妊娠满5例及妊娠≤2例的精液样本外供周期数据分布情况，据此制订高受孕力组及低受孕力组的入组标准：从妊娠满5例组中选取外供周期最少的捐精者编入高受孕力组(外供周期<10，使5名妇女受孕)；妊娠≤2例组选取外供周期最多的捐精者编入低受孕力组(外供周期>30，使0～2名妇女受孕)。本研究分析60例志愿者精液标本：高受孕力组(n＝30例)、低受孕力组(n＝30例)。记录捐精志愿者的年龄、身高、体重。
1.2女方入组与排除条件
入组条件：年龄<35岁，以男性不育或单纯女性输卵管梗阻行ART。
排除条件：内分泌因素、子宫内膜因素、宫腔因素等导致的女方不孕。
2、精液标本的处理与常规分析
2.1精液标本采集及冷冻
嘱捐精者禁欲3-5d后手淫取精，合格捐精者应满足以下条件：无全身性疾病和严重器质性疾患，如心脏病、糖尿病、肺、结核、肝脏病、泌尿生殖系统疾病、血液系统疾病、高血压、精神病和麻风病；无长期接触放射线和有毒有害物质等情况；无吸毒、酗酒、嗜烟等不良嗜好和同性恋史、冶游史；无各种性传播疾病，包括乙肝、丙肝、梅毒、淋病、艾滋病、衣原体、支原体、巨细胞病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒和弓形体、致病菌感染等；无遗传病史和遗传病家族史；一般体格检查及生殖器检查无异常。以1∶2的体积比向精液中缓慢添加改良甘油-卵黄-柠檬酸型精子冷冻保护剂，使用“一步薰蒸法”进行精液冷冻。一步薰蒸法为距离液氮面5cm熏蒸10min，后放入液氮。
2.2精子RNA提取
将冷冻精子37℃水浴10分钟，取300ul精液3000g离心5分钟后收集沉淀，用PBS洗涤2次，用试剂盒mirVana RNA isolation kit(Invitrogen)提取精子RNA。用500ul裂解液加入到精子沉淀中去，70℃孵育15分钟已裂解精子头部，将裂解物过柱，去除基因组DNA，保留过滤液进行RNA纯化，加入1.25倍体积的乙醇第二次过柱，精子RNA保留在柱子上，用30ul去离子水洗脱，获得精子总RNA。
2.3精子RNA测序
用提取到的10例高受孕力和10例低受孕力精子总RNA100ng按照BGI HiSeqStrand-Specific Transcriptome library方法构建cDNA文库，应用BGI HiSeq 2500PE126测序平台进行RNA测序。
2.4生物信息学分析
将测序获得的数据进行生物信息学分析，获得高、低生育率组差异表达的mRNA。通过RNA测序和生物信息学分析，获得高、低受精力组差异表达的mRNA有33个，如图1所示。
2.5Real-time PCR验证
将提取到精总RNA用DNase I消化去除基因组DNA，用300ng RNA按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara,Cat.6110)试剂盒进行反转录，用2.5倍体积去离子水稀释cDNA作为q-PCR模板.设计、合成33个差异基因的引物，应用
Figure BDA0002481660310000061
Premix ExTaqTM(Takara,Cat.RR420A)进行定量PCR检测。通过Real-time PCR在另外20个高受孕力样本和20个低受孕力样本中进一步验证，
如图2所示，获得9个评估精子质量的候选标记物：GAPDHS,HSF2BP,HSPAIL,ADAM21,WBP2NL,DDX20,TSGA10,SPEM1 and PGK2，可作为评估精子受孕功能的候选指标。
2.6统计学分析
数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料用x±s表示，两组比较用t检验，采用线性回归分析。P≤0.05为具有统计学意义。
3、实验结果
本发明实施中的方案通过选取两组外供精子样本，即高受孕力精子组(外送次数小于20并获得5次成功受孕)和低受孕力精子组(外送大于20次并获得0次受孕)，每组各10份样本，进行RNA测序。然后对RNA测序结果进行生物信息学分析，得到33个在两组样本中具有差异表达的基因作为候选生物标记物，其中23个为精子发生相关基因，10个为能量代谢相关基因。本发明的方案进一步对这33个基因进行了单个外显子表达谱描绘，并针对单个外显子设计引物，在扩大样本量的两组精子标本(高、低受孕力组各20份)中进行q-PCR验证实验。最终本发明的优选方案选定3个在两组样本中具有明显差异表达的基因单个外显子作为衡量精子受孕潜力的生物标记物，分别为SPATA19,OSBP2和ACE，并且成功建立方程模型。
如图3所示，我们选定3个单个外显子SPATA19,OSBP2和ACE作为衡量精子受孕潜力的生物标记物，并成功建立方程模型，利用这三个基因的CT值代入方程，计算每个样本得出的数值作为参考值，作为精子受孕潜能的评估数值。
利用这三个基因的CT值代入方程，计算每个样本得出的数值作为参考值，作为精子受孕潜能的评估数值。在双盲测试中，利用方程得出的结论与临床反馈精子受孕力契合度高于85％。本发明的实验数据说明，精子所携带的RNA可以作为评估精子受孕潜力的生物标记物，而本发明所建立的方法虽然无法百分百准确的判定单份样本的受孕能力，但是可以百分百的去除受孕力及其低下的那部分供精，大大提高了精子库供精质量。
如图4所示，在4份高受孕力标本和11份低受孕力标本，我们通过方程预测的结果与临床数据结果比较，发现4份高受孕力预测结果与临床结果的符合率为100％，11份低受孕力标本中有8份结果与临床结果相符，符合率为72.7％。我们的数据说明，精子所携带的RNA可以作为评估精子受孕潜力的生物标记物，本项目的成果可以百分百的去除受孕力及其低下的那部分供精，大大提高了人类精子库的供精质量，同时为临床上评估精子受精功能提供参考指标。
与此同时，本发明的方案能够启发下一步将继续研究精子中其他种类的RNA，进一步优化精子筛选的方法，进一步提高精子库的外供精液质量。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)精液标本采集及冷冻：统计妊娠满5例及妊娠≤2例的精液样本外供周期数据分布情况，据此制订高受孕力组及低受孕力组，让捐精者通过手淫取精，再使用“一步薰蒸法”进行精液冷冻；
(2)精子RNA提取：用试剂盒mirVana RNA isolation kit提取精子RNA；
(3)精子RNA测序：用提取到的10例高受孕力和10例低受孕力精子总RNA100ng按照BGIHiSeq Strand-Specific Transcriptome library方法构建cDNA文库，应用BGI HiSeq2500PE126测序平台进行RNA测序；
(4)生物信息学分析：将测序获得的数据进行生物信息学分析，获得高、低生育率组差异表达的mRNA；
(5)Real-time PCR验证：将提取到精总RNA用DNase I消化去除基因组DNA，反转录后，用2.5倍体积去离子水稀释cDNA作为q-PCR模板，进行定量PCR检测；
(6)统计学分析：数据采用SPSS软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，两组比较用t检验，采用线性回归分析；P≤0.05为具有统计学意义；
(7)结果分析：两组样本中具有明显差异表达的基因单个外显子作为衡量精子受孕潜力的生物标记物，分别为SPATA19,OSBP2和ACE，并且成功建立方程模型，利用这三个基因的CT值代入方程，计算每个样本得出的数值作为参考值，作为精子受孕潜能的评估数值。
2.如权利要求1所述的根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，其特征在于，所述步骤(1)之前，需要明确样本来源并对其进行分组：
回顾性分析广东省人类精子库2010年1月至2016年12月AID周期妊娠反馈结局，统计妊娠满5例及妊娠≤2例的精液样本外供周期数据分布情况，据此制订高受孕力组及低受孕力组的入组标准：从妊娠满5例组中选取外供周期最少的捐精者编入高受孕力组；妊娠≤2例组选取外供周期最多的捐精者编入低受孕力组。
3.如权利要求1所述的根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，精液是以1∶2的体积比向精液中缓慢添加改良甘油-卵黄-柠檬酸型精子冷冻保护剂，使用“一步薰蒸法”进行精液冷冻；一步薰蒸法为距离液氮面5cm熏蒸10min，后放入液氮。
4.如权利要求1所述的根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，精子RNA提取具体为：
将冷冻精子37℃水浴10分钟，取300ul精液3000g离心5分钟后收集沉淀；
用PBS洗涤2次，用试剂盒mirVana RNA isolation kit(Invitrogen)提取精子RNA：用500ul裂解液加入到精子沉淀中去，70℃孵育15分钟已裂解精子头部，将裂解物过柱，去除基因组DNA，保留过滤液进行RNA纯化，加入1.25倍体积的乙醇第二次过柱，精子RNA保留在柱子上，用30ul去离子水洗脱，获得精子总RNA。
5.如权利要求1所述的根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，Real-time PCR验证具体为：将提取到精总RNA用DNase I消化去除基因组DNA，用300ng RNA按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录，用2.5倍体积去离子水稀释cDNA作为q-PCR模板.设计、合成33个差异基因的引物，应用
Figure FDA0002481660300000021
Premix Ex TaqTM(Takara,Cat.RR420A)进行定量PCR检测。
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