CN105861712A - 使用来自体液的miRNA来早期检测和监控轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)的方法 - Google Patents

使用来自体液的miRNA来早期检测和监控轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用来自体液的miRNA来早期检测和监控轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)的方法，记载了通过定量体液中的神经突和/或突触miRNA对轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)早期诊断和进展监控的方法。

Description

使用来自体液的miRNA来早期检测和监控轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海 默病(AD)的方法
本申请是申请日为2012年4月18日，申请号为201280030048.6，发明名称为“使用来自体液的miRNA来早期检测和监控轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)的方法”的申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请要求2011年4月18日提交的美国临时申请序列号61/476,591、2011年4月25日提交的美国临时申请序列号61/478,766和2011年10月12日提交的美国临时申请序列号61/546,431的优先权，将所有这些的全部内容引入于此以作参考。
技术领域
本发明针对通过定量体液中的神经突和/或突触miRNA对轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)早期诊断和进展监控的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)为最常见的神经退行性疾病，其包括由脑细胞的代谢变化、神经元的突触和其它区室(compartment)的损失以及最终的神经元死亡引起的一大组病理(为参考，参见Neurodegenerative diseases:From MolecularConcepts to Therapeutic Targets.编辑：R.von Bernhardi,N.C.Inestrosa,NovaPublishers,2008)。由于寿命延长，通常的神经退行性疾病，特别是AD在发达国家中已变得十分普遍。仅在美国，目前便存在超过540万(和全世界3600万)患AD的人群，并且估计有7000-8000万超过55岁的人群被认为处于发病的风险。2011年，在美国AD患者医疗服务的年费用估计达$1830亿(Rocca,W.A.等，Alzheimer's&Dementia.2011,7:80-93；http://www.alz.org/downloads/Facts_Figures_2011.pdf)。AD和其它神经退行性疾病的药物开发和成功治疗因缺乏对它们早期诊断和监控的有效方法而异常复杂。有效诊断方法的开发因脑经长时间补偿功能紊乱和神经元缺失的潜能强大而更加复杂。这导致当由于脑中严重的形态学变化(包括神经元的大量损失)而不能非常成功地治疗时疾病症状的临床表现晚。因此，特别期望基于发病早期事件检测的诊断方法。
阿尔茨海默病的特征在于特征在于在几种疾病特异的脑区如海马体和皮质中神经元死亡。然而，神经元损失是疾病进展中相对晚的事件，其典型地在突触机能障碍、突触损失、神经突退缩和其它畸形出现如轴突输送缺陷之后(参见，例如Crews,Masliah,Human Mol Gen.,2010,19:R12-R20；Bredesen,Molecular Neurodegeneration 2009,4:27；Nimmrich和Ebert,RevNeurosci.2009,20:1-12；Yoshiyama等,Neuron.2007,53:337-351；Wishart等,J Neuropathol Exp Neurol.2006,65:733-739；Gylys等,Neurochem Int.2004；44:125-131；Conforti等,Trends Neurosci.2007,30:159-166；Revuelta,等Am J Alzheimers Dis Other Demen 2008,23:97-102)。许多研究致力于描述伴随膜封闭的"轴小体"脱落，轴突、树突和脊柱修剪(pruning)以及突触解体的轴突破坏(Goda,Davis,Neuron 2003,40:243-264；Eaton,Davis,GenesDevelopment,2003,17:2075-2082；Koirala,Ko,Neuron,2004,44:578-580；Bishop等,Neuron,2004,44:651-661；Low,Cheng,Phil.Trans.R.Soc.B 2006361,1531-1544)。
目前尝试开发能够恢复树突棘状突起密度和突触的抗-AD疗法(Adlard等,PLoS ONE,2011,6:el7669)。
表现为轻度临床症状的阿尔茨海默病的第一症状阶段为轻度认知障碍(MCI)，其通常被定义为正常老龄化和痴呆症之间的中间状态(DeCarli,LancetNeurol.,2003,2:15-21；Stephan等,Alzheimer's Res Therapy,2009,1:1-9；Apostolova等,Human Brain Mapping,2010,31:786-797)。一般来说，MCI患者以每年10-15％的速度转化为痴呆症(Petersen等,Arch Neurol.2001,58:1985-1992；Apostolova等,Human Brain Mapping,2010,31:786-797)。然而，目前无法可靠地预测MCI结果。首先，多达40％的MCI患者恢复为正常状态(Larrieu等,Neurology,2002,59:1594-1599；Brooks,Loewenstein,Alzheimer's Res Therapy,2010,2:28-36)，并且尸体解剖研究表明大量MCI患者不具有AD病理的迹象(Jicha等,Arch Neurol,2006,63:674-681；Khan,Alkon,Neurobiol.10Aging,2010,31:889-900)。其次，约20％的转化为痴呆症的MCI患者诊断为未患有AD但患有其它神经退行性疾病如血管症、路易氏体(Lewy body)症、亨廷顿症、帕金森症及其它痴呆症(Jicha等,Arch Neurol,2006,63:674-681；Stephan等,Alzheimer's Res Therapy,2009,1:1-9)。第三，AD患者的疾病进展从缓慢到中等和快速变化(Doody等,Alzheimer's ResTherapy,2010,2:2-10)。甚至临床MCI也并不是均一的病理且可描述为两种病况，健忘症状(aMCI)和无健忘症状(Dlugaj等,Dement Geriatr Cogn Disord.,2010,30:362-373；Brooks,Loewenstein,Alzheimer's Res Therapy,2010,2:28-36)。一些出版物已证实，aMCI更经常转化为痴呆症并且是AD较好的预测指标(Mariani等,J Alzheimer's Dis.,2007,12:23-35；Luck等,PsychiatrPrax.,2008,35:331-336；Koivunen等,Neurology,2011,76:1085-1099)。然而，其他作者还未发现两种MCI形式的转化率的显著差异(Rountree等,DementGeriatr Cogn Disord.,2007,24:476-482)。
目前，AD和其它形式的痴呆症的诊断是基于患者认知功能的分析。如上所述，由于脑中有效的代偿机制，通常当疾病处于其后期时才显露出认知功能降低并且几乎没有治疗可行。神经元之间的淀粉状蛋白斑、神经元纤维τ-缠结和脑组织的整体收缩为AD的显著特征，并且有许多基于这些现象开发诊断试验的尝试。新的成像技术，包括β-淀粉状蛋白沉积物的体内检测(例如，正电子成像术(PET)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、多光子成像、脑磁图描记术(magnetoencephalography)(MEG)、脑电描记术(EEG)等)(Mucke,Nature,2009,461:895-897；Mistur等,J.Clin.Neurol.,2009,55:153-166；Miller,Science,2009,326:386-389；Perrin等,Nature,2009,461:916-922)正变得日益流行，但不能用于筛查目的。
现有的AD和其它形式痴呆症的诊断分子试验可分成两组。第一组是基于单核苷酸多态性(SNP)的分析，其有助于预测高风险疾病但不用于诊断(Bettens等,Hum Mol Genet.2010,19(R1):R4-R11)。第二组使用体液中参与AD发病机理的蛋白质或脑特异性蛋白如神经丝蛋白(NTP)的分析(Schipper,Alzheimer's&Dementia.2007,3:325-332)。然而，这些实验不足够灵敏和特异。近来的公布数据已表明，通过测量脑脊液(CSF)中三种蛋白质生物标记物(β-淀粉样蛋白1-42、总τ蛋白和磷酸化τl81P蛋白)的浓度的AD检测的灵敏度高(Meyer等,Arch Neurol.2010,67:949-956；Pagan A.M.等Arch,Neurol2011,68:1137-1144)。CSF采集过程的高侵袭性使得此类试验不实用且对日常临床应用造成挑战。若干小组已报道了根据人血液中的大量蛋白质或抗体的AD诊断试验(Ray S.等2007,Nat.Med.13,1359-1362；Reddy M.M.等2011,Cell 144,132-142；Nagele E.等2011,PLoS One 6,e23112)。然而，其他研究者还未能够证实这些研究的结果(Bjorkqvist M等2012,PLoS One 7,e29868)。
在2011年4月19日，老龄化国家研究所/阿尔茨海默病协会(NationalInstitute on Aging/Alzheimer's Association)提出了新的阿尔茨海默病诊断指南(Khachaturian ZS,2011Alzheimer's and Dementia,7,253-256)。新指南发表在四份论文中，致力于：(i)AD阶段的分类，即痴呆阶段、有症状的痴呆前期阶段(MCI)和AD的无症状、临床前阶段(前期MCI)(Jack等,2011,Alzheimer'sand Dementia.7,257-262)；(ii)NIA推荐的由AD引起的痴呆症的诊断(McKhann等,2011,Alzheimer's and Dementia.7,263-269)；(iii)NIA推荐的由AD引起的MCI的诊断(Albert等,2011,Alzheimer's and Dementia.7,270-279)；和(iv)NIA推荐对前期MCI的定义(Sperling等,2011,Alzheimer'sand Dementia.7,280-292)。新指南强调目前缺少和非常需要可用于检测前期MCI和症状发生前AD以及MCI和AD的可靠的生物标记物。
因此，存在对能够检测AD的MCI或甚至更早的无症状阶段(前期MCI)的无创或微创分子试验的极大需求。另外，如果此类试验可用于疾病结果的预后(prognosis)以及疾病和治疗的监控，则会更好。
发生在AD和其它神经退行性疾病中的代谢变化引起棘状突起、树突、轴突的破坏和突触损失，后者可能诱发神经元死亡(Bredesen,MolecularNeurodegeneration 2009,4:27；Crews,Masliah,Human Mol Gen.,2010,19:R12-R20)。类似的过程发生在胚胎脑发育期间。许多神经元S试图建立细胞间接触，成功建立细胞间接触的那些神经元存活，而其它神经元死亡(Butts等,Cell Death Differ.2008,15:1178-1186；Enokido和Hatanaka,Gan To KagakuRyoho.1994,21:615-620；Gasic and Nicotera,Toxicol Lett.2003,20139:221-227)。
伴随膜封闭的"轴小体"脱落，轴突、树突和棘状突起的修剪以及突触解体的轴突破坏导致出现包含神经元、轴突、神经突、棘状突起和突触的胞质成分(包括蛋白质、RNA及其降解产物)的无细胞囊泡。还存在导致这些化合物释放于胞外基质的其它过程，特别是起泡(blebbing)(Charras等,Biophys.J.2008,94:1836-1853；Fackler,Grosse,J.Cell Biol.2008,181:879-884)、胞吐作用(Skog等Nat Cell Biol.,2008,10:1470-1476)和其它形式的主动分泌(Wang等Nucleic Acids Res.,2010,38:7248-7259；Kosaka等,J Biol Chem.,2010,285:17442-30 17452；Pigati等,PLoS ONE,2010,el3515)。
微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA，其终产物为约22nt的功能性RNA分子。它们通过结合至信使转录本的互补区域来抑制它们的翻译或调控降解而在靶基因调控中起到重要作用(Griffiths-Jones Nucleic Acids Research,2006,34,Database issue:D140-D144)。通常，一种miRNA可靶向多种mRNA，并且一种mRNA可受靶向3'UTR的不同区域的多种miRNA调控。一旦结合至mRNA，miRNA便可通过影响例如mRNA翻译和稳定性来调节基因表达和蛋白质产生(Baek等,Nature 455(7209):64(2008)；Selbach等,Nature455(7209):58(2008)；Ambros,2004,Nature,431,350-355；Bartel,2004,Cell,116,281-297；Cullen,2004,Virus Research.,102,3-9；He等,2004,Nat.Rev.Genet.,5,522-531；和Ying等,2004,Gene,342,25-28)。还有特征较少的其它类型的小RNA(综述于Kim,Mol.Cells,2005,19:1-15)。
许多miRNA特异于或过表达于某一器官/组织/细胞(参见，例如，Hua等,BMC Genomics,2009,10:214；Liang等,BMC Genomics.2007,8:166；Landgraf等,Cell.2007,129:1401-1414；Lee等,RNA.2008,14:35-42)。
包括细胞特异的那些miRNA在内的某些miRNA在某些细胞区室中富集，特别是在轴突、树突和突触中富集(参见，例如Schratt等,Nature.439:283-289,2006；Lugli等,J Neurochem.106:650-661,2008；Bicker和Schratt,J Cell Mol Med.,12:1466-1476,2008；Smalheiser和Lugli,Neuromolecular Med.11:133-140,2009；Rajasethupathy,Neuron.63:714-716,2009；Kye,RNA13:1224-1234,2007；Yu等,Exp Cell Res.314:2618-2633,2008；Cougot,等,JNeurosci.28:13793-13804,2008；Kawahara,Brain Nerve.60:1437-1444,2008；Schratt G.Rev Neurosci.2009；10:842-849；Pichardo-Casas等Brain Research.1436:20-33,2012)。
miRNA的表达和浓度受各种生理和病理信号的调控。某些miRNA的表达变化发现于阿尔茨海默病和其它神经退行性疾病患者的神经元中(Hebert和De Strooper,Trends Neurosci.32:199-206,2009；Saba等,PLoS One.2008；3:e3652；Kocerha等,Neuromolecular Med.2009；11:162-172；Sethi和Lukiw,Neurosci Lett.2009,459:100-104；Zeng,Mol Pharmacol.75:259-264,2009；Cogswell等,Journal of Alzheimer’s Disease。14:27-41,2008；Schaefer等,J.Exp.Med.204:1553-1558,2007；Hebert,Proc Natl Acad Sci USA 2008；105:6415-6420；Wang等,J Neurosci.2008,28:1213-1223；Nelson等,BrainPathol.2008；18:130-138；Lukiw,Neuroreport.2007；18:297-300)。
由于它们的尺寸小，miRNA可穿过血脑、胎盘和肾脏屏障。miRNA释放可被病理如恶性肿瘤等活化(Pigati等,PLoS ONE,2010,el3515)。已提出体液中细胞/组织-特异性miRNA的分析用于检测体内细胞死亡(美国专利公布20090081640号；Laterza等,Clin Chem.2009,55:1977-1983)。
目前作为用作神经退行性疾病如AD诊断的主要方法的认知功能试验和脑成像仅允许检测疾病的晚期，并且不够特异。本领域中仍然存在对开发在发生主要的形态学变化和大量神经细胞死亡前早期诊断MCI和AD的方法的极大需求。
发明内容
如上述背景部分所述，对用于阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)和无症状前阶段以及其它神经退行性疾病的无创或微创的早期检测和监控试验存在极大的需求。本发明通过基于定量体液中的突触和/或神经突miRNA来提供新的高灵敏和无创或微创诊断和监控方法来满足该需求。本发明的方法允许在发生主要的形态变化和大量神经细胞死亡之前诊断和监控前期MCI、MCI、AD以及其它神经退行性疾病，因而具有许多临床意义。例如，使用本发明的方法可导致目前神经退行性疾病的可行性治疗的有效性增强，因为此类治疗可在疾病的显著更早期阶段施用。使用本发明的方法还可允许开发新的有效的治疗性和/或预防性处理，并可降低费用和提高与此类开发相关的临床试验的效率(例如，通过简化和增强患者选择和分组(stratification)的确定性，和/或通过简化和提高药物效力评价方法的效率)。
在一方面，本发明提供一种用于检测受试者中的前期MCI或MCI的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
b.比较从受试者采集的体液样品中的所述miRNA水平和所述miRNA的年龄相称的对照水平，和
c.(i)当从受试者采集的体液样品中的所述miRNA的水平与年龄相称的对照相比增加时，将受试者鉴定为患有前期MCI或MCI，或(ii)当从受试者采集的体液样品中的所述miRNA的水平与年龄相称的对照相比不增加时，将所述受试者鉴定为未患有前期MCI或MCI。
在相关方面，本发明提供一种用于检测受试者中的前期MCI或MCI的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的体液样品中的突触或神经突miRNA的水平；
b.测量从受试者采集的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的所述miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的年龄相称的对照比时，将受试者鉴定为患有前期MCI或MCI，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的年龄相称的对照比时，将受试者鉴定为未患有前期MCI或MCI。
在另一方面，本发明提供一种用于预测受试者从前期MCI向MCI进展的可能性的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的两种或多种的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平，其中所述样品已在间隔的时间点获得；
b.比较在从受试者采集的各体液样品中的所述miRNA的水平与所述miRNA的年龄相称的对照水平，和
c.如果在从受试者中采集而由此获得的两种或多种的体液样品中所述miRNA的水平与年龄相称的对照相比增加，则预测所述受试者中的疾病将从前期MCI向MCI进展。
在一个实施方案中，体液样品可间隔几个月，例如间隔1、3、6、12或24个月，优选间隔3-6个月获得。
在相关方面，本发明提供一种用于预测受试者从前期MCI向MCI进展的可能性的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的两种或多种的体液样品中的突触或神经突miRNA的水平，其中所述样品已在间隔的时间点获得；
b.测量从受试者采集的各相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的从受试者采集的各体液样品的所述miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的从受试者采集的各体液样品的所述miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.如果在从受试者中采集而由此获得的两种或多种的体液样品中在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的年龄相称的对照比，则预测受试者的疾病将从前期MCI向MCI进展。
用于上述方法的miRNA的年龄相称的对照水平或年龄相称的对照比可为，例如预定标准(例如，使用具备正常认知功能的年龄相称的群体确定的本领域-接受水平或比)。
在单独的方面，本发明提供一种用于检测受试者中的脑老化的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
b.比较从受试者采集的体液样品中的所述miRNA的水平与(i)事先从相同受试者获得的所述miRNA的对照水平，或与(ii)预定的年轻标准，和
c.当从受试者采集的体液样品中的所述miRNA的水平与对照(i)相比或与所述预定的年轻标准(ii)相比增加时，将受试者鉴定为正经受脑老化。
在相关方面，本发明提供一种用于检测受试者中的脑老化的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的体液样品中的突触或神经突miRNA的水平；
b.测量从受试者采集的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的miRNA的水平比与(i)事先从相同受试者获得的相应的对照比，或与(ii)预定的年轻标准比，和
e.当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比(i)或与所述预定的年轻标准比(ii)相比高时，将受试者鉴定为正经受脑老化。
用于上述两种方法的预定的年轻标准可为，例如使用具备正常认知功能的相对年轻的群体(例如10-20岁，20-30岁，30-40岁，20-50岁)确定的本领域-接受的水平或比。
在另外的方面,本发明提供一种用于确定受试者中的前期MCI或MCI治疗的有效性的方法，所述方法包括：
a.测量从治疗开始前获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
b.测量从治疗期间或之后获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的所述miRNA的水平；
c.比较在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平，和
d.(i)如果在治疗期间或之后miRNA的水平已降低，则确定治疗有效；(ii)如果在治疗期间或之后miRNA的水平并没有降低，则确定治疗不是有效的。
在相关方面，本发明提供一种用于确定受试者中的前期MCI或MCI治疗的有效性的方法，所述方法包括：
a.测量从治疗开始前获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
b.测量从治疗开始前获得的受试者采集的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的从治疗开始前获得的受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比；
d.测量从治疗期间或之后获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的相同突触或神经突miRNA的水平；
e.测量来自治疗期间或之后获得的受试者的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
f.计算在步骤(d)和(e)中测量的从治疗期间或之后获得的受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比；
g.比较在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比，和
h.(i)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则确定治疗有效；(ii)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则确定治疗不是有效的。
在单独的方面,本发明提供一种用于确定延缓受试者中的脑老化的治疗的有效性的方法，所述方法包括：
a.测量从治疗开始前获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
b.测量从治疗期间或之后获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的所述miRNA的水平；
c.比较在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平，和
d.(i)如果在治疗期间或之后miRNA的水平已降低，则确定治疗有效；(ii)如果在治疗期间或之后miRNA的水平并没有降低，则确定治疗不是有效的。
在相关方面，本发明提供一种用于确定延缓受试者中的脑老化的治疗的有效性的方法，所述方法包括：
a.测量从治疗开始前获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
b.测量来自治疗开始前获得的受试者的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的从治疗开始前获得的受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比；
d.测量从治疗期间或之后获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的相同突触或神经突miRNA的水平；
e.测量来自治疗期间或之后获得的受试者的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
f.计算在步骤(d)和(e)中测量的从治疗期间或之后获得的受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比；
g.比较在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比，和
h.(i)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则确定治疗有效；(ii)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则确定治疗不是有效的。
在上述用于确定治疗有效性的方法的一个实施方案中，样品可例如在治疗期间或之后每隔1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月或24个月获得。
在额外的方面，本发明提供一种用于鉴定对减缓前期MCI或MCI的进展或治疗前期MCI或MCI有用的化合物的方法，所述方法包括：
a.测量从患有前期MCI或MCI的受试者采集的一种或多种的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平，其中所述体液样品在试验化合物给药前获得；
b.测量从试验化合物给药后获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的所述miRNA的水平；
c.比较步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平，和
d.(i)如果在试验化合物给药后miRNA的水平已降低，则鉴定该化合物对减缓前期MCI或MCI的进展或治疗前期MCI或MCI有用；(ii)如果在试验化合物给药后miRNA的水平并没有降低，则鉴定该化合物对减缓前期MCI或MCI的进展或治疗前期MCI或MCI不是有用的。
在相关方面,本发明提供一种用于鉴定对减缓前期MCI或MCI的进展或治疗前期MCI或MCI有用的化合物的方法，所述方法包括：
a.测量从患有前期MCI或MCI的受试者采集的一种或多种的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平，其中所述体液样品在试验化合物给药前获得；
b.测量来自试验化合物给药前获得的受试者的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的从试验化合物给药前获得的受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比；
d.测量从试验化合物给药后获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的相同突触或神经突miRNA的水平；
e.测量来自试验化合物给药后获得的受试者的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
f.计算在步骤(d)和(e)中测量的从试验化合物给药后获得的受试者采集的各体液样品的所述miRNA的水平比；
g.比较在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比，和
h.(i)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则鉴定该试验化合物对减缓前期MCI或MCI的进展或治疗前期MCI或MCI有用；(ii)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则鉴定该试验化合物对减缓前期MCI或MCI的进展或治疗前期MCI或MCI不是有用的。
在单独的方面,本发明提供一种用于鉴定对延缓脑老化有用的化合物的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的一种或多种的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平，其中所述体液样品在试验化合物给药前获得；
b.测量从试验化合物给药后获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的所述miRNA的水平；
c.比较在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平，和
d.(i)如果在试验化合物给药后miRNA的水平降低，则鉴定该化合物对延缓脑老化有用；(ii)如果在试验化合物给药后miRNA的水平并没有降低，则鉴定该化合物对延缓脑老化不是有用的。
在相关方面,本发明提供一种用于鉴定对延缓脑老化有用的化合物的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的一种或多种的体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平，其中所述体液样品在试验化合物给药前获得；
b.测量来自试验化合物给药前获得的受试者的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的从试验化合物给药前获得的受试者采集的各体液样品的所述miRNA的水平比；
d.测量从试验化合物给药后获得的受试者采集的一种或多种的体液样品中的相同突触或神经突miRNA的水平；
e.测量来自试验化合物给药后获得的受试者的相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
f.计算在步骤(d)和(e)中测量的从试验化合物给药后获得的受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比。
g.比较在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比，和
h.(i)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则鉴定该试验化合物对延缓脑老化有用；(ii)如果在步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于在步骤(c)中计算的miRNA的水平比，则鉴定该试验化合物对延缓脑老化不是有用的。
上述试验化合物筛查方法还可包括将试验化合物向受试者给药的步骤。
在单独的方面，本发明提供一种用于预测已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段的进展的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的体液样品中的miR-451的水平；
b.测量相同体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.如果在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的年龄相称的对照比，则确定受试者的疾病将从MCI向AD的痴呆阶段进展。
在单独的方面，本发明提供一种用于预测已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的体液样品中的miR-7、miR-125b和miR-16的至少一种的水平；
b.测量相同体液样品中标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.如果在步骤(c)中计算的至少一种比例高于相应的年龄相称的对照比，则确定受试者的疾病将从MCI向AD的痴呆阶段进展。
在相关方面，本发明提供一种用于预测已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的方法，所述方法包括在一次试验中组合两种生物标记物/标准物miRNA比，即miR-451与突触或神经突miRNA的比以及miR-7、125b或miR-16与标准物miRNA的比。如果两种比例高于相应的年龄相称的对照比，则将预期受试者的疾病从MCI向AD的痴呆阶段进展。
在单独的方面，本发明提供一种用于监控已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的体液样品中的miRNA-451的水平，其中所述样品已经以间隔的时间点采集；
b.比较从受试者采集的各体液样品中的miRNA-451的水平与相应的年龄相称的对照水平，和
c.如果从受试者采集的各体液样品中的miRNA-451的水平高于相应的年龄相称的对照水平，则确定受试者的疾病从MCI向AD的痴呆阶段进展。
在相关方面，本发明提供一种用于监控已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的体液样品中的miRNA-451的水平，其中所述样品已在间隔的时间点采集；
b.测量从受试者采集的各相同体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的从受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的从受试者采集的各体液样品的miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.如果对于从受试者采集的各体液样品，在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的年龄相称的对照比，则确定受试者的疾病从MCI向AD的痴呆阶段进展。
在单独的方面，本发明提供一种用于监控已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的方法，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的体液样品中的miR-7、125b和miR-16的至少一种的水平，其中所述样品已在间隔的时间点采集；
b.测量从受试者采集的各相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的从受试者采集的各相同体液样品中的miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的从受试者采集的各相同体液样品的miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.如果对于从受试者采集的各相同体液样品，在步骤(c)中计算的至少一种比例高于相应的年龄相称的对照比，则确定受试者的疾病将从MCI向AD的痴呆阶段进展。
在相关方面,本发明提供一种用于监控已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的方法，所述方法包括在一次试验中组合两种生物标记物/标准物miRNA比，即(i)miR-451与突触或神经突miRNA的比和(ii)miR-7、miR-125b和miR-16的至少一种与标准物miRNA(例如，miR-491-5p或选自由miR-9、miR-127、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的两种或多种的标准物的平均值)的比。如果对于从受试者采集的各体液样品，(i)和(ii)两种比例高于相应的年龄相称的对照比，则将预期受试者的疾病从MCI向AD的痴呆阶段进展。
在上述方法的一个实施方案中，体液样品可间隔几个月，例如间隔1、3、6、12或24个月，优选间隔3-6个月采集。
在本发明的方法中有用的突触或神经突miRNA的非限制性实例包括，例如miR-7、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-98、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-137、miR-138、miR-146、miR-154、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-200c、miR-218、miR-292-5p、miR-297、miR-322、miR-323-3p、miR-329、miR-325、miR-337、miR-339、miR-345、miR-350、miR-351、miR-369-3、miR-369-5p、miR-381、miR-382、miR-409-3p、miR-425、miR-429、miR-433-5p、miR-446、miR-467、miR-483-3p、miR-485-5p、miR-487b、miR-494、miR-495、miR-496、miR-541、miR-543、miR-656、miR-668、miR-874、miR-889、miR-935和miR-939。
在本发明的前期MCI和MCI诊断、预后和筛查方法中有用的突触或神经突miRNA的优选实例包括miR-128、miR-132、miR-874、miR-134、miR-323-3p、miR-382、miR-7和miR-125b。
在脑老化相关的诊断、预后和筛查方法中有用的突触或神经突miRNA的优选实例包括miR-128、miR-132、miR-874、miR-134、miR-323-3p和miR-382。
为了增加本发明方法的准确性，优选使用两种或多种的突触或神经突miRNA的水平。进一步优选证实在两种或多种的连续采集的体液样品中突触或神经突miRNA的水平的变化。
在本发明的方法中有用的标准物miRNA包括脑富集的标准物miRNA以及在多种组织中表达但在脑中不显著表达的miRNA(例如，miR-10b或miR-141)。本发明的方法包括单一标准物(例如，miR-491-5p、miR-370等)以及两种或多种的标准物的平均值(例如，选自由miR-9、miR-127、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的两种或多种的标准物)。
在本发明的方法中有用的脑富集的标准物包括，例如神经元体miRNA；主要在脑区表达但不参与要评价的病理的miRNA；主要在胶质细胞中表达的miRNA和在要评价的病理中表达、分泌或二者下调的脑富集的miRNA。
在本发明的方法中有用的脑富集的标准物miRNA的非限制性实例包括，例如miR-9、miR-181a、miR-127、miR-370和miR-491-5p，其可单独或组合使用。
在一个特定的实施方案(适用于本发明方法的每一种)中，突触或神经突miRNA选自由miR-128、miR-132和miR-874(统称为"miR-132家族")组成的组，标准物miRNA选自由miR-491-5p、miR-9、miR-181a和miR-141组成的组。
在另一特定的实施方案(适用于本发明方法的每一种)中，突触或神经突miRNA选自由miR-134、miR-323-3p和miR-382(统称为"miR-134家族")组成的组，标准物miRNA为miR-370或miR-127。
在另一特定的实施方案(适用于本发明的所有方法，除了脑老化相关的方法以外)中，突触或神经突miRNA为miR-7，标准物miRNA为miR-9、miR-27、miR-181a、miR-370、miR-491-5p，或所有这些标准物的平均血浆浓度。
在另一特定的实施方案(适用于本发明的所有方法，除了脑老化相关的方法以外)中，突触或神经突神经突miRNA为miR-125b，标准物miRNA为miR-9、miR-181a、miR-370、miR-491-5p，或所有这些标准物的平均血浆浓度。
用于本发明的方法的受试者包括，例如神经退行性疾病或其它神经元病理的人、兽医用动物和实验动物模型。对于本发明的诊断、预后和治疗监控方法，受试者优选人。对于筛查方法，受试者优选实验动物。
可用于本发明方法的体液的非限制性实例包括，例如血浆或血清、尿液和唾液。在一些实施方案中，miRNA从体液样品纯化。
在一些实施方案中，本发明的方法包括(例如作为初始步骤)从受试者采集体液样品的步骤。
在本发明的方法中，miRNA的水平可使用任何适合的技术，例如杂交、RT-PCR或测序来确定。
在一些实施方案中，本发明的方法可进一步包括减少或消除miRNA降解的步骤。
在一些实施方案中，本发明的诊断方法可进一步包括向已诊断为患有病况或诊断为处于向更严重的病况进展的风险中的受试者施以治疗性或预防性处理的步骤。
在一些实施方案中，本发明的诊断方法可进一步包括招募临床试验受试者的步骤。
连同上述诊断和筛查方法，本发明还提供各种包括对检测靶miRNA特异的一种或多种的引物和/或探针组的试剂盒。此类试剂盒可进一步包括对检测标准物miRNA特异的引物和/或探针组。试剂盒中引物或探针组合的非限制性实例如下：
1.对选自由miR-7、miR-125b和miR-16组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-491-5p、miR-9、miR-127、miR-181a和miR-370组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
2.对miR-451特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-7、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-98、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-137、miR-138、miR-146、miR-154、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-200c、miR-218、miR-292-5p、miR-297、miR-322、miR-323-3p、miR-329、miR-325、miR-337、miR-339、miR-345、miR-350、miR-351、miR-369-3、miR-369-5p、miR-381、miR-382、miR-409-3p、miR-425、miR-429、miR-433-5p、miR-446、miR-467、miR-483-3p、miR-485-5p、miR-487b、miR-494、miR-495、miR-496、miR-541、miR-543、miR-656、miR-668、miR-874、miR-889、miR-935和miR-939组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针)。
3.对选自由miR-7、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-98、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-137、miR-138、miR-146、miR-154、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-200c、miR-218、miR-292-5p、miR-297、miR-322、miR-323-3p、miR-329、miR-325、miR-337、miR-339、miR-345、miR-350、miR-351、miR-369-3、miR-369-5p、miR-381、miR-382、miR-409-3p、miR-425、miR-429、miR-433-5p、miR-446、miR-467、miR-483-3p、miR-485-5p、miR-487b、miR-494、miR-495、miR-496、miR-541、miR-543、miR-656、miR-668、miR-874、miR-889、miR-935和miR-939组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-10b、miR-141、miR-9、miR-127、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
4.对选自由miR-128、miR-132、miR-874、miR-134、miR-323-3p、miR-382、miR-7和miR-125b组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-10b、miR-141、miR-9、miR-127、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
5.对选自由miR-128、miR-132和miR-874组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-491-5p、miR-9、miR-181a和miR-141组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
6.对选自由miR-134、miR-323-3p和miR-382组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针(任选地，进一步包括对miR-370或miR-127的至少一种标准物特异的引物或探针).
7.对miR-7特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-9、miR-27、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
8.对miR-125b特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-9、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
此类试剂盒可用于从患者分离的体液样品中的直接miRNA检测或可用在纯化的RNA样品上。
附图说明
图1A-E为示出MCI患者(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中miR-7(A),miR-874(B),miR-9(C),miR-181a(D)和miR-491-5p(E)浓度比较的图。所有浓度相对于掺标的(spiked)ath-miR-159a归一化(normalization)。这里及其它盒须图(box and whisker plots)中，盒表示结果的50％的分布，盒上下的棒表示结果的80％。点表示位于80％数据以外的分析值。分析的中值由盒内部的线表示。归一化miRNA浓度以相对单位(对数标尺)示于纵轴。
图2A-C为示出MCI患者(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中miR-874(A)、miR-134(B)和miR-539(C)的浓度比较的图。所有浓度相对于miR-141归一化。
图3A-C为示出MCI患者(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中miRNA的浓度比较的图。miR-7(A)、miR-128(B)和miR-134(C)的浓度相对于miR-181a归一化。
图4为示出MCI患者(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中miR-125b的浓度比较的图。miR-125b的浓度相对于miR-9归一化。
图5A-C为示出MCI患者(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中miRNA的浓度比较的图。miR-128(A)、miR-134(B)和miR-874(C)的浓度相对于miR-491-5p归一化。
图6为示出MCI(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中miRNA浓度比较的图。miR-134的浓度相对于miR-127归一化。
图7A-B为示出比较MCI患者(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中miRNA的浓度的图。miR-132(A)和miR-323-3p(B)的浓度相对于miR-16归一化。
图8A-C为示出MCI(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中miRNA浓度比较的图。miR-134(A)、miR-874(B)、miR-539(C)的浓度相对于miR-10b归一化。
图9A-C为示出MCI(MCI)和AD患者(AD)以及年龄相称的对照(AMC)的血浆中miRNA浓度比较的图。miR-7(A)、miR-132(B)、miR-874(C)的浓度相对于miR-141归一化。
图10A-E为示出MCI(MIC)和AD患者(AD)以及年龄相称的对照(AMC)的血浆中miRNA浓度比较的图。miR-7(A)、miR-128(B)、miR-132(C)、miR382(D)和miR-874(E)的浓度相对于miR-9归一化。
图11A-E为示出MCI和AD患者以及年龄相称的对照的血浆中miRNA浓度比较的图。miR-132(A)、miR-134(B)、miR-323-3p(C)、miR-382(D)和miR-874(E)的浓度相对于miR-127-3p归一化。
图12A-G为示出MCI和AD患者以及年龄相称的对照的血浆中miRNA浓度比较的图。miR-7(A)、miR-128(B)、miR-132(C)、miR-134(D)、miR323-3p(E)、miR-382(F)和miR-874(G)的浓度相对于miR-181a归一化。
图13A-H为示出MCI和AD患者以及年龄相称的对照的血浆中miRNA浓度比较的图。miR-7(A)、miR-125(B)、miR-128(C)、miR-132(D)、miR-134(E)、miR323-3p(F)、miR-382(G)和miR-874(H)的浓度相对于miR-370归一化。
图14A-H为示出MCI和AD患者以及年龄相称的对照的血浆中miRNA浓度比较的图。miR-7(A)、miR-125(B)、miR-128(C)、miR-132(D)、miR-134(E)、miR323-3p(F)、miR-382(G)和miR-874(H)的浓度相对于miR-491-5p归一化。
图15A-C呈现利用相对于miR-491-5p归一化的miR-128(A)、miR-132(B)和miR-874(C)获得的MCI患者(MCI)与年龄相称的对照(AMC)之间差异的受试者操作特征(Receiver-Operating Characteristic,ROC)曲线分析。记录ROC曲线(AUC)下的面积。对于各生物标记物/标准物对的灵敏性、特异性和准确性计算作为生物标记物/标准物比的“截留(cutoff)”点(表示为各图上的点)，此处样品属于AMC或MCI组的可能性相等。
图16A-C呈现利用相对于miR-370归一化的miR-134(A)、miR-323-3p(B)和miR-382(C)获得的MCI患者(MCI)与年龄相称的对照(AMC)之间差异的受试者操作特征(ROC)曲线分析。记录ROC曲线(AUC)下的面积。对于各生物标记物/标准物对的灵敏性、特异性和准确性，计算作为生物标记物/标准物比的“截留(cutoff)”点(表示为各图上的点)，此处样品属于AMC或MCI组的可能性相等。
图17A-F呈现miR128和miR-132(A)、miR-128和miR-874(B)、miR-132和miR-874(C)、miR-134和miR-323-3p(D)、miR-134和miR-382(E)、以及miR-382和miR-323-3p(F)之间的关联分析。比较各种生物标记物对的Ct值，并计算斯皮尔曼等级相关系数(Spearman's rank correlation coefficient)r以及95％置信区间(MIN&MAX)。
图18A-J为示出21-50岁(CY)和76-86岁(CO)对照的血浆中miRNA浓度比较的图。生物标记物miRNA的浓度相对于各种miRNA标准物归一化并以相对单位(纵轴)示出。A：miR-128/miR-181a；B：miR-132/miR-181a；C：miR-874/miR-181a；D：miR-134/miR-370；E：miR-323-3p/miR-370；F：miR-382/miR-370；G：miR-132/miR-9；H：miR-382/miR-127-3p；I：miR-132/miR-491-5p；J：miR-874/miR-491-5p。
图19示出具备初始正常的认知功能的老年受试者在2-5年期间的血浆中生物标记物的浓度分析。测量miR-128、miR-132和miR-874(生物标记物)的水平并相对于miR-491-5p归一化。如果三种生物标记物中的至少两种的浓度高于由ROC曲线(图15)的截留点预定的对照值，则认为患者是病理阳性的。灰色和黑色分别表示对照和病理。小框提供血浆miRNA试验的结果，外部颜色表示临床诊断；因此，仅在其中临床诊断不同于当前方法的预测的情况中看到两种颜色。
-无MCI患者，如通过认知功能试验所诊断的，还通过血浆miRNA试验确定为阴性；-无MCI患者，通过血浆miRNA试验确定为阳性；-具有MCI临床症状的患者，通过血浆miRNA试验确定为阴性；■-具有MCI临床症状的患者，通过血浆miRNA试验确定为阳性。在0时间点从患者1采集的样品中分离的miRNA由于RT-PCR的强抑制而未通过质量控制(QC)；对该样品未进行分析。
图20A-G为示出MCI(MCI)和AD患者(AD)以及年龄相称的对照(AMC)的miR-451浓度比较的图。
miR-451的浓度相对于miR-141(A)，miR-9(B)，miR-181a(C)，miR-370(D)，miR-491-5p(E)，标准物miR-9、miR-127-3p、miR-181a、miR-370和miR-491-5p的平均值(F)，和研究中分析的所有15种miRNA的平均值(AVER)(参见实施例3)(G)归一化并以相对单位示出(纵轴)。
图21A-B为示出MCI和AD患者的血浆中miR-451与神经突/突触miR-132(A)或miR-874(B)的浓度之比的图。
图22A-F为示出MCI患者(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中两种miRNA浓度的比较的图。所有浓度相对于miR-451-5p归一化，并以相对单位示出(对数标尺)。A：miR-7和miR-451；B：miR-16和miR-451；C：miR-125b和miR-451；D：miR-7和miR-16；E：miR-7和miR-125b；F：miR-16和miR-125b。
图23A-F为示出MCI患者(MCI)和年龄相称的对照(AMC)的血浆中两种miRNA浓度的比较的图。所有浓度相对于5种标准物(miR-9、miR-127、miR-181a、miR-370和miR-491-5p)的平均值归一化并以相对单位示出(对数标尺)。A：miR-7和miR-451；B：miR-16和miR-451；C：miR-125b和miR-451；D：miR-7和miR-16；E：miR-7和miR-125b；F：miR-16和miR-125b。
图24比较图21、图14和图20中示出的数据。在"与AD相比的MCI"栏中，灰色单元格表示临床诊断的MCI患者，其血浆miR-451/miR-132和miR-451/miR-874比在AD痴呆症患者的特征范围内。在"与AMC相比的MCI"栏中，灰色单元格表示的患者为相对于miR-491-5p归一化的miR-7、miR-16和miR-451的血浆浓度将该患者与年龄相称的对照以及其它MCI患者相区分的患者。两种方法展示了相同的MCI患者，确认两种方法预测MCI-痴呆症进展的能力。
具体实施方式
本发明基于本发明人对如下问题的领悟，由于AD(MCI和前期)和其它神经退行性疾病发展期间神经突(轴突和/或树突和/或棘状突起)破坏和突触损失以及一些代谢事件在神经元死亡之前，因此基于这些现象的检测的方法可用于比基于检测细胞死亡更早的疾病诊断。此外，由于此类试验将反映病理发展中的重要事件，因而其可用于疾病和治疗监控。
本发明进一步基于本发明人的如下发现：与相应的年龄相称的对照相比，突触和/或神经突miRNA的水平在患有轻度认知障碍(MCI)的患者的体液中增加，反映了过度的神经突损坏和/或突触损失。
在本发明的含义内，术语"突触和/或神经突miRNA"是指以下miRNA：(i)其为"脑富集"的，即与可为要测试的体液中大量miRNA来源的其它器官相比其在脑中以增加的量存在(例如，浓度至少高出5倍)，和(ii)其存在于突触和/或神经突(即，轴突和/或树突和/或棘状突起)。潜在的miRNA生物标记物的脑富集对筛查和初步诊断目的是重要的，这是因为在神经元中表达的许多miRNA还在其它组织和细胞类型中表达。结果，此类miRNA血浆浓度的变化可反映其它器官的病理。另一方面，当已检测出疾病如MCI时，在神经元中表达但不在脑富集的miRNA可用于鉴别诊断(differential diagnosis)、疾病结果的预后和监控，特别是与脑富集的miRNA生物标记物和标准物组合。例如，由于在神经元病理发展期间一些突触和/或神经突miRNA更加有效地从异常细胞分泌，因此即使它们不是脑富集的，此类突触和/或神经突miRNA也可在本发明的方法中作为潜在的生物标记物而被试验。要想在本发明的方法中有用，作为此类突触和/或神经突miRNA从神经元释放的结果(例如，由于分泌、神经突/突触破坏或神经元死亡)，其应当在体液中是可检测的。
本发明提供用于诊断受试者的轻度认知障碍(MCI)和可进展为(例如，阿尔茨海默病(AD))的各种神经退行性病理的新的高灵敏度和无创或微创方法，所述方法包括确定来自受试者的体液样品(例如，血浆或血清、尿液、唾液或其它体液)中一种或多种的突触和/或神经突miRNA的水平。
本发明的诊断法使得可早期诊断MCI以及AD、神经退行性疾病和其它神经退行性紊乱的前期，例如，在与此类疾病和紊乱相关的主要形态变化和/或大量神经细胞死亡发生之前。
此外，与检测突触和神经突中不存在或贫乏的神经体miRNA相比，分析突触和/或神经突miRNA明显增强miRNA检测的灵敏性，这是因为突触和神经突在脑中的量比神经元的量高103倍。由于神经元中的各种特异事件(例如，miRNA谱的变化、它们的分泌、神经突降解、突触损失和最终的神经元死亡)可被检测和定量，该方法还提供监控发病和治疗效果的详细且综合的信息。
尽管规模较小，但类似的过程为正常年龄所特有的并可使用相同的方法检测和监控。在下述实施例中记载的实验数据表明，利用miR-128、miR-132、miR-874、miR-134、miR-323-3p和miR-382的适当归一化的血浆浓度，老年对照组比"年轻"对照组(20-50岁)高40％-60％。MCI患者各自的数量明显较高(血浆中生物标记物miRNA浓度当与"年轻"对照相比时增加200％-500％)。
通过本发明的方法可检测的MCI、前期MCI或其它神经退行性疾病的受试者体液中突触和/或神经突miRNA的水平与年龄相称的健康个体相比的差异可能是由于(i)神经突和/或突触的疾病相关的破坏，(ii)在这些miRNA表达或代谢方面与疾病相关的变化，(iii)在这些miRNA运输和细胞内分布方面与疾病相关的变化，(iv)在这些miRNA分泌方面与疾病相关的变化(Rabinowits等Clin Lung Cancer,2009,10:42-46；例如，miR-451、miR-1246–参见Pigati等,PLoS ONE,2010,el3515)，(v)在血/脑屏障渗透性方面与疾病相关的变化，以及其它原因。
由于体液中miRNA浓度水平取决于许多因素，数据归一化变成非常重要的问题。几种方法可用于数据归一化：(i)相对于掺标的非人miRNA(例如，ath-miR-159a)的归一化提供提取期间miRNA产量和潜在的RT-PCR抑制的信息；(ii)相对于遍在miRNA(例如，miR-16)的归一化，对其的限制可为在其表达、分泌等的疾病相关的变化；(iii)相对于在许多组织中表达但在脑中表达不足的miRNA(例如，miR-10b、miR-141)的归一化；(iv)相对于脑富集的miRNA的归一化，其应补偿如血液供给、血/脑屏障渗透性等变化的因素。当下述情况下后一方法可特别地多产(productive)：(1)miRNA生物标记物在神经突和/或突触中富集，miRNA标准物主要存在于胶质细胞中，例如miR-127(Wu等2009；Mol.Therapy,17：2058-2066)；(2)miRNA生物标记物位于神经突或突触，miRNA标准物对神经体特异；在该情况中，在AD的早期，miRNA生物标记物将优选由于轴突、神经突、棘状突起和突触破坏而释放，例如，主要位于神经元的核周区的脑富集的miR-9可用作标准物(Truettner等2011.J.Cerebral Blood Flow&Metabolism,epub.April 20),(3)miRNA生物标记物位于首先受AD折磨的海马体，并且miRNA标准物位于其它脑区；(4)miRNA"标准物"的表达或分泌由于AD发展而下调；因此，生物标记物/"标准物"比的测量可用于早期MCI和AD检测。使用各种脑富集的miRNA作为标准物的另一重要的优势是它们在外周血细胞中缺失或非常低的表达，这防止了由溶血引起的数据失真；(v)相对于几种标准物的平均值的归一化，如果分析许多，如>15种miRNA，则相对于所有试验的脑富集的miRNA的平均值归一化。
如在下述实施例中详细讨论的，为了选择最佳的生物标记物和标准物miRNA，通过RT-PCR分析在MCI和AD患者以及年龄相称的对照组的血浆中的许多脑富集的miRNA(包括神经突/突触miRNA)的浓度。然后将所有分析的miRNA作为潜在的生物标记物和标准物及组合来试验，将在MCI患者和年龄相称的对照之间提供统计上的显著差异的miRNA选择为最有前景的miRNA。数据已阐明，最佳的潜在的生物标记物为神经突/突触miRNA，最佳的标准物为其它脑富集的miRNA。两个家族的生物标记物和几种标准物已阐明，MCI检测时miR-132家族和miR-134家族的灵敏性(84％-92％)和特异性(84％-90％)最高。miR-134家族成员之间的高度相关可容易通过如下事实解释：该家族的所有成员，即miR-134、miR-323-3p和miR-382，属于相同的簇，并且在相同的细胞类型中表达。miR-132家族成员，即miR-128、miR-132和miR-874之间的紧密关系之前还未记载过。同样有趣的是，miR-132和miR-134生物标记物家族与不同的标准物产生更好的结果。在标准物miR-491-5p、miR-181a、miR-9和miR-141的情况下miR-132家族比miR-134家族作用地更好。另一方面，在标准物miR-370和miR-127的情况下miR-134家族表明比miR-132家族具有更好的结果。
如本文所公开的，招募的具备正常认知功能的老年患者的MCI发展的可回顾性纵向研究阐明，血浆miRNA生物标记物的增加在MCI临床表现前1至5年的无症状疾病阶段是可检测的。
由于MCI/AD进展和正常老化共享某些共同的过程，例如神经突和突触破坏和最终的神经元死亡，因此本发明人分析正常老化是否还可使用miRNA标记和标准物的相同组合来检测。比较来自两组认知正常的受试者的血浆样品中的miRNA，组1(21-50岁)和组2(76-86岁)。分析显示，组2受试者的血浆中神经突/突触miR-132和miR-134家族的中值浓度与组1相比高40-80％(p<0.05至p<0.001)。
其它具有发展前景的生物标记物，如miR-7和miR-125b，检测MCI患者的较小的亚群(约60％灵敏性)但具有高特异性(86％-93％)。这些miRNA未检测年龄相关的脑变化，这意味着MCI和AD发展期间它们血浆浓度的增加是由于较少的共同过程，可能是AD的那些特征。
从MCI向AD的痴呆症阶段进展期间，体液中生物标记物/标准物比由于各种因素而变化。首先，由于在MCI进展的早期无症状阶段期间许多突触和神经突被破坏，在AD的晚期期间，突触和神经突较少，突触/神经突miRNA的分泌总量降低。第二，由于在AD晚期期间神经细胞死亡增加，所以体液中神经体miRNA的浓度增加。第三，随着疾病进展，新的脑区和胶质细胞变得参与到疾病进展的病理中，这导致体液中相应的miRNA标准物的浓度进一步增加。上述现象可用于监控AD发展期间的MCI-痴呆症转化。
当与MCI患者的血浆相比时，从病理细胞的分泌明显较高的miR-451的水平增加在AD患者的血浆中是统计学显著的。miR-451与miR-132和miR-134家族的miRNA以及与其它脑富集的miRNA的比确保AD与MCI的最佳区分。然而，在约40-50％的MCI病例中，这些参数与AD患者获得的数字重叠。可能这些患者将从MCI向AD痴呆症进展。当相对于各种miRNA归一化后与年龄相称的对照相比时，miR-7、125b和miR-16检测到通过miR-451分析表征为AD的相同MCI病例，这表明两种方法可用于预测MCI向痴呆症的进展。
由于不同的脑区参与各种导致痴呆症发展的神经退行性疾病(Geldmacher&Whitehouse,Neurology.1997,48:S2-9；Levy&Chelune,JGeriatr Psychiatry Neurol.2007 20:227-238；Gong&Lippa,Am J Alzheimer'sDis Other Demen,2010,25:547-555)，并且由于在各种脑区的不同miRNA表达谱(Landgraf等,Cell.2007,129:1401-1414；The miR-Ontology DataBase：http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/)，分析体液中的神经突和/或突触miRNA谱可用于区分将导致AD痴呆症的前期MCI和MCI或由其它神经退行性疾病引起的痴呆症。
本发明的方法可用于诊断前期MCI和MCI并预测和/或监控从前期MCI和MCI向各种更严重的神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)、帕金森症(PD)、路易氏体痴呆症、亨廷顿症(HD)、额颞痴呆(FTD)、血管性痴呆症、HIV相关的神经认知紊乱(HAND)、混合型痴呆症等的进展。
用于本发明方法的脑富集的miRNA的非限制性实例包括，例如7、9、96、98、99a、103、107、124a、125a、125b、127、128a、132、134、137、138、149、153、154、181a、181b、181c、182、183、204、212、213、218、219、221、222、299-3p、299-5p、323-3p、324-5p、328、329、330、331、335、337、338、342、346、369-3p、369-5p、370、379、381、382、383、409-3p、411、425、432、433-5p、485-3p、485-5p、487b、488、491-5p、494、495、496、504、539、541、543、584、656、668、758、874、889、935、939、1193、1197、9*。
用于本发明方法的神经突和/或突触miRNAs包括但不限于，miR-7、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-98、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-137、miR-138、miR-146、miR-154、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-200c、miR-218、miR-292-5p、miR-297、miR-322、miR-323-3p、miR-329、miR-325、miR-337、miR-339、miR-345、miR-350、miR-351、miR-369-3、miR-369-5p、miR-381、miR-382、miR-409-3p、miR-425、miR-429、miR-433-5p、miR-446、miR-467、miR-483-3p、miR-485-5p、miR-487b、miR-494、miR-495、miR-496、miR-541、miR-543、miR-656、miR-668、miR-874、miR-889、miR-935和miR-939(参见，Schratt等,Nature 439:283-289,2006；Lugli等,JNeurochem.106:650-661,2008；Bicker and Schratt,J Cell Mol Med.12:1466-1476,2008；Smalheiser和Lugli,Neuromolecular Med.11:133-140,2009；Rajasethupathy,Neuron,63:714-716,2009；Kye,RNA,13:1224-1234,2007；Yu,等,Exp Cell Res.314:2618-2633,2008；Cougot等,J Neurosci.28:13793-13804,2008；Kawahara,Brain Nerve,60:1437-1444,2008；http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/)。用于本发明方法的另外的miRNA可例如基于它们在神经元中(并且根据疾病在脑的某些区域中)的富集和轴突和/或树突和/或棘状突起和/或突触中的细胞内定位来鉴定。如果选择尿液样品用于进行本发明的诊断方法，优选的用于检测的miRNA会是在泌尿系统的细胞中不明显表达的那些miRNA。类似地，如果将血液样品(例如，血清或血浆)用于进行本发明的诊断方法，则优选的用于检测的miRNA会是在血液细胞中不表达或以非常低水平存在的那些miRNA。
本发明的方法基于体液中某些miRNA的水平的测量。使用可通过无创或微创技术(例如，与在脑中或CSF中检测截然相反)采集的体液允许有成本效益且微创或无创诊断步骤。用于本发明方法的优选体液为血浆、血清、尿液和唾液。然而，任何其它体液也可使用。
对于测量体液中miRNA水平有用方法的实例包括与选择性探针的杂交(如，使用RNA印迹法(Northern blotting)、基于珠的流式细胞仪、寡核苷酸微芯片[微阵列]或溶液杂交试验如Ambion mirVana miRNA检测试剂盒)、基于聚合酶链式反应(PCR)的检测(如，茎-环反转录-聚合酶链式反应[RT-PCR]、基于定量RT-PCR的阵列法[qPCR-阵列])或通过下一代测序技术(如，Helicos小RNA测序(Helicos small RNA sequencing)、miRNA BeadArray(Illumina)、Roche 454(FLX-钛)和ABI SOLiD)之一的直接测序法。为了参考其它适用的技术，参见例如Chen等，BMC Genomics,2009,10:407；Kong等，J Cell Physiol.2009；218:22-25。
在一些实施方案中，在定量前纯化miRNA。可通过各种方法从体液分离并纯化miRNA，包括使用商品化试剂盒(如，miRNeasy试剂盒[Qiagen]、MirVana RNA分离试剂盒[Ambion/ABI]、miRACLE[Agilent]、高纯miRNA分离试剂盒[Roche]和miRNA纯化试剂盒[Norgen Biotek Corp.])、Trizol提取(参见下述实施例1)、基于阴离子交换剂的浓缩和纯化、由RNA结合底物覆盖的磁珠或基于互补寡核苷酸的某一miRNA的吸附。
在一些实施方案中，减少或消除体液样品中和/或miRNA纯化期间的miRNA降解。用于减少或消除miRNA降解的有用的方法包括，但不限于，添加RNase抑制剂(如，RNasin Plus[Promega]、SUPERase-In[ABI]等)、使用氯化胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)或其组合。当在miRNA纯化前需要样品储运时减少体液样品中miRNA的降解特别重要。
为了解释纯化期间给定miRNA的可能损失、潜在的RT-PCR抑制、样品分离和处理期间源自染色或损伤的血液或尿液细胞的miRNA污染、肾脏滤过的变化等，可采用各种实验数据归一化的额外方法。例如，下列归一化方法可用于本发明：
a)靶miRNA的浓度可与遍在miRNA(如miR-16)、小核仁RNA(snoRNA)、U6小核RNA(U6RNA)等中的一种归一化。
b)合成小RNA(如非人miRNA)寡核苷酸可合成并用作纯化和RT-PCR抑制期间的损失对照(在RNA纯化之前将它们添加至体液样品)。
c)为了解释肾脏滤过(当用尿液样品作业时)的变化，尿中的miRNA浓度可基于肌酸酐和/或白蛋白水平归一化。
在本发明中开发用于早期检测MCI和AD的以下选择miRNA生物标记物的方法：
1.除了已知的神经突/突触富集的miRNA外，在初步研究中还包括其它脑富集的miRNA，并在来自AD和MCI患者的血浆中分析并与年龄相称的对照比较。
2.相对于所有其它单独的miRNA归一化各miRNA的数据，并选择对MCI检测最有发展前景的miRNA生物标记物和标准物。
3.这些miRNA用于包括来自青年和年龄相称的供体的MCI和AD患者的血浆样品的较大研究。
4.最后，使用从个体采集的血浆进行回顾性纵向研究，这些个体在最初招募时以及随后几年不具有MCI或AD的症状。之后一些供体发展为MCI，一些发展为AD，一些保持没有AD和MCI。
5.除了脑中富集的miRNA外，研究中还包括更有效地从病理细胞分泌的miR-451。
连同上述诊断和筛查方法，本发明提供包括对检测靶miRNA特异的一种或多种的引物和/或探针组的各种试剂盒。此类试剂盒可进一步包括对检测标准物miRNA特异的引物和/或探针组。试剂盒中引物或探针组合的非限制性实例如下：
1.对选自由miR-7、miR-125b和miR-16组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-491-5p、miR-9、miR-127、miR-181a和miR-370组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
2.对miR-451特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-7、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-98、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-137、miR-138、miR-146、miR-154、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-200c、miR-218、miR-292-5p、miR-297、miR-322、miR-323-3p、miR-329、miR-325、miR-337、miR-339、miR-345、miR-350、miR-351、miR-369-3、miR-369-5p、miR-381、miR-382、miR-409-3p、miR-425、miR-429、miR-433-5p、miR-446、miR-467、miR-483-3p、miR-485-5p、miR-487b、miR-494、miR-495、miR-496、miR-541、miR-543、miR-656、miR-668、miR-874、miR-889、miR-935和miR-939组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
3.对选自由miR-7、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-98、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-137、miR-138、miR-146、miR-154、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-200c、miR-218、miR-292-5p、miR-297、miR-322、miR-323-3p、miR-329、miR-325、miR-337、miR-339、miR-345、miR-350、miR-351、miR-369-3、miR-369-5p、miR-381、miR-382、miR-409-3p、miR-425、miR-429、miR-433-5p、miR-446、miR-467、miR-483-3p、miR-485-5p、miR-487b、miR-494、miR-495、miR-496、miR-541、miR-543、miR-656、miR-668、miR-874、miR-889、miR-935和miR-939组成的组的至少两种miRNA特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-10b、miR-141、miR-9、miR-127、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
4.对选自由miR-128、miR-132、miR-874、miR-134、miR-323-3p、miR-382、miR-7和miR-125b组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-10b、miR-141、miR-9、miR-127、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
5.对选自由miR-128、miR-132和miR-874组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-491-5p、miR-9、miR-181a和miR-141组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
6.对选自由miR-134、miR-323-3p和miR-382组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针(任选地，其进一步包括对miR-370或miR-127的至少一种标准物特异的引物或探针).
7.对miR-7特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-9、miR-27、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
8.对miR-125b特异的引物或探针(任选地，进一步包括对选自由miR-9、miR-181a、miR-370和miR-491-5p组成的组的至少一种标准物miRNA特异的引物或探针)。
此类试剂盒可用于从患者分离的体液样品中的直接miRNA检测或可用在纯化的RNA样品上。
本发明的试剂盒还可提供引物延伸和扩增反应的试剂。例如，在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括一种或多种下列组分：逆转录酶、DNA聚合酶(诸如热稳定性DNA聚合酶等)、聚合酶链式反应缓冲液、逆转录缓冲液和脱氧核苷三磷酸(dNTP)。可选地(或另外地)，试剂盒可包括用于进行杂交分析的试剂。检测试剂可包括核苷酸类似物和/或标记部分，如直接可检测部分如荧光团(荧光染料)或放射性同位素，或者间接可检测部分，如结合对的成员例如生物素，或能够催化非可溶性比色或发光反应(luminometric reaction)的酶。另外，试剂盒可进一步包括包含用于核酸电泳检测用试剂的至少一种容器。此类试剂包括直接检测核酸的那些，如荧光嵌合剂或银染试剂，或用于检测标记的核酸的那些试剂，例如但不限于ECL试剂。试剂盒可进一步包括miRNA分离或纯化手段以及阳性和阴性对照。试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置(housing)中。
试剂盒的组分可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器手段。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含另外的组分可单独放置于其中的第二、第三或其它另外的容器。然而，组分的各种组合可包括在容器中。
此类试剂盒还可包括保持或维持DNA或RNA的组分，例如抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
定义
本文所使用的术语"阿尔茨海默病"或"AD"是指以痴呆症为特征的后期MCI AD阶段。
术语"前期轻度认知障碍"或"前期MCI"是指AD和其它导致痴呆症的神经退行性疾病的无症状的临床前期(Jack等,Alzheimer's and Dementia.2011,Epub April 19)。
术语"神经元胞体"是指神经细胞的包含被细胞质和质膜包围的核但不包括树突或轴突的部分。
本文所使用的术语"神经突"是指来自神经元的胞体的任何突起。该突起可为轴突、树突或棘状突起。
术语"轴突"是指将电脉冲传导出神经元的胞体(cell body)或体细胞(soma)的长的纤细的突起。轴突因若干特征而不同于树突，包括形状(树突通常呈锥形，而轴突一般保持固定的半径)、长度(树突局限于胞体周围的小区域，而轴突可更长)和功能(树突通常接收信号而轴突通常传送信号)。轴突和树突在称为突触的接点与其它细胞(通常为其它神经元，但有时也为肌细胞或腺细胞)相接触。
术语"树突"是指神经元的枝状突起，起到将从其它神经细胞接收的电化学刺激传送至发射树突的神经元的胞体的作用。
术语"棘状突起"或"树突的棘状突起"是指来自神经元的树突的小的膜状突出物，其典型地接收来自轴突的单个突触的输入。树突棘状突起充当突触强度的存储位置并辅助传送电信号至神经元胞体。大多数棘状突起具有球根状头(棘状突起头)和连接棘状突起的头与树突的轴的细颈。一个神经元的树突可包含成百上千个棘状突起。棘状突起除了提供记忆存储和突触传送的解剖学基质以外，它们还可用于增加神经元之间可能的接触数量。
术语"突触"是指专门的接点，通过该接点神经元向彼此和向非神经细胞如肌肉或腺体中的那些细胞发信号。典型的神经元产生几千个突触。大多数突触将轴突与树突相连，但还存在其它种类的连接，包括轴突-胞体、轴突-轴突和树突-树突。在脑中，每个神经元与许多其它神经元形成突触，并且同样地，各自从许多其它神经元接收突触输入。结果，神经元的输出可取决于许多其它神经元的输入，每一个神经元可具有不同的影响程度，这取决于其突触与该神经元的强度。有两大类突触，化学突触和电突触。在电突触中，细胞彼此在约3.5nm内靠近，而不是化学突触中分隔细胞的20-40nm的距离。在化学突触中，通过化学递质打开离子通道引起突出后电位，而在电突触中，其由两个神经元之间的直接电偶联引起。电突触因而比化学突触快。
在本发明的含义中，术语"突触和/或神经突miRNA"是指下述miRNA，(i)"脑富集的"，即，与可为要试验的体液中miRNA量的显著来源的其它器官相比，在脑中以增加的量存在(例如，浓度至少高5倍)的miRNA，和(ii)存在于突触和/或神经突(即，轴突和/或树突和/或棘状突起)中的miRNA。
由于一些突触和/或神经突miRNA在神经元病理发展期间更加有效地从异常细胞分泌，此类突触和/或神经突miRNA还可作为本发明方法中的潜在的生物标记物来试验，即使它们不是脑富集的。要想在本发明的方法中有用，作为此类突触和/或神经突miRNA从神经元释放的结果(例如，由于分泌、神经突/突触破坏或神经元死亡)，其应可在体液中检测。
本文所使用的术语"标准物miRNA"是指用于神经突/突触miRNA浓度归一化以解释影响血浆中神经突/突触miRNA的出现和稳定性的各种因素的miRNA。
本文所使用的术语"神经体miRNA"是指下述miRNA：(i)"脑富集的"，即与可为要试验的体液中miRNA量的显著来源的其它器官相比，在脑中以增加的量存在(例如，浓度至少高5倍)的miRNA，和(ii)神经突或突触中缺失或以不明显地低于神经元胞体的浓度存在的miRNA。
本文所使用的术语"神经元病理"和"神经元中的病理变化"是指与神经突和/或突触功能障碍和/或神经突破坏和/或突触损失相关的神经元中的代谢和/或结构变化。
术语"与……相关"用于包括任何相关性、共现性和任何因果关系。
本文所使用的术语"神经元病理的发展"是指在单个神经元中的代谢和/或结构变化的程度/严重性中的任何负面变化和/或在受影响的神经元中数量的任何增加。短语"神经元病理的改善"以及类似的术语是指在单个神经元中的代谢和/或结构变化的程度/严重性中的任何正面变化和/或在受影响的神经元中数量的任何降低。
如本文所使用的，术语"小RNA"通常是指一组异质性非编码RNA，具有包括染色质结构/表观遗传记忆、转录、RNA剪接、RNA编辑、mRNA翻译和RNA倒置(turnover)的各种调控功能。本发明的诊断方法依靠检测可在体液中被检测到的神经突和/或突触的小RNA，例如微小RNA(miRNA)、脑胞质RNA BC1/BC200等。还有其它类特征较少的小RNA，也可用于本发明的方法(介绍于Kim,Mol.Cells,2005,19:1-15)。
本文所使用的术语"微小RNA"或"miRNA"是指一类小的大约22nt长的非编码RNA分子。它们在通过结合至信使转录本(mRNA)的互补区以抑制其翻译或调控降解的靶基因调控中起到重要作用(Griffiths-Jones Nucleic AcidsResearch,2006,34,Database issue：D140-D144)。通常，一种miRNA可靶向多种mRNA，且一种mRNA可受靶向3'UTR不同区域的多种miRNA调控。一旦结合至mRNA，miRNA可通过影响如mRNA翻译和稳定性来调节基因表达和蛋白质产生(Baek等，Nature 455(7209):64(2008)；Selbach等，Nature455(7209):58(2008)；Ambros,2004,Nature,431,350-355；Bartel,2004,细胞,116,281-297；Cullen,2004,Virus Research.,102,3-9；He等，2004,Nat.Rev.Genet.,5,522-531；and Ying等，2004,Gene,342,25-28)。用于本发明方法的神经突和/或突触miRNA的实例包括，但不限于miR-7、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-98、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-137、miR-138、miR-146、miR-154、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-200c、miR-218、miR-292-5p、miR-297、miR-322、miR-323-3p、miR-329、miR-325、miR-337、miR-339、miR-345、miR-350、miR-351、miR-369-3、miR-369-5p、miR-381、miR-382、miR-409-3p、miR-425、miR-429、miR-433-5p、miR-446、miR-467、miR-483-3p、miR-485-5p、miR-487b、miR-494、miR-495、miR-496、miR-541、miR-543、miR-656、miR-668、miR-874、miR-889、miR-935和miR-939。大多数目前已知的miRNA的信息可见于miRNA数据库miRBase(可于万维网mirbase.org获得)。还参见Burside等,BMC Genomics 9:185(2008)；Williams等,BMC Genomics 8:172 30(2007)；Landgraf等,Cell 129:1401(2007)。
术语"miRNA阵列"是指用于分子生物学和医学的复杂技术。其由排列的一系列多重(例如，上千)微小的寡核苷酸点组成，这些寡核苷酸点各自包含与特定靶miRNA互补的特异序列(探针)。在高严格条件下探针-靶标杂交后，所得杂交体通常通过定量荧光团-、银-或化学发光-标记的靶标来检测和定量。在本发明的方法中，定制和商购可得的miRNA阵列均可使用。有用的商购可得的miRNA阵列的实例(基于靶标标记、杂交检测和分析的各种方法)包括由Agilent、Illumina、Invitrogen、Febit和LC Sciences生产的阵列。
术语"下一代测序技术"广义上是指平行产生多个测序反应的测序方法。这使得极大地增加数据的通量和产量。常用的下一代测序平台的非限制性实例包括Helicos小RNA测序、miRNA BeadArray(Illumina)、Roche 454(FLX-钛)和ABI SOLiD。
如本文所使用的，"个体"或"受试者"或"动物"是指神经退行性疾病或其它神经性病理的人、兽医用动物(例如，猫、狗、牛、马、羊、猪等)和实验动物模型。在优选实施方案中，受试者为人。
术语"泌尿道"是指参与尿从身体分泌和消除的器官和管。
本文所使用的术语"纯化的"是指已在减少或消除不相关物质即污染物(包括由其获得所述物质的原料)的存在的条件下分离的物质。例如，RNA纯化包括存在于体液中的蛋白质、脂质、盐及其它不相关化合物的消除。此外，对于一些分析方法，纯化的miRNA优选基本上包含于体液样品中的其它RNA寡核苷酸(例如，rRNA和mRNA片段、在几乎所有组织中高水平表达的遍在miRNA[如miR-16]等)。如本文所使用的，术语"基本上无"在物质的分析试验的背景下可操作地使用。优选地，基本上无污染物的纯化物质为至少50％纯度；更优选地，至少90％纯度，和仍更优选至少99％纯度。纯度可通过色谱、凝胶电泳、组合物分析、生物学试验以及本领域已知的其它方法来评价。
如本文所使用的，术语"类似处理的"是指使用相同操作手册获得的样品(如，体液样品或纯化的RNA)。
术语"约"或"大约"是指在统计学上有意义的值的范围。此类范围可在数量级内，优选在给定值或范围的50％内、更优选在20％内，仍更优选在10％内，甚至更优选在5％内。术语"约"或"大约"所包括的允许的变化取决于研究中的特定系统，并可容易被本领域普通技术人员所理解。
根据本发明，可采用本领域技术内的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术完整解释于文献中。参见，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,分子克隆：实验室手册，第二版。冷泉港，NY：冷泉港实验室出版社，1989(这里，"Sambrook等，1989")；DNA克隆：实用方法，第I和II卷(D.N.Glover编辑，1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编辑，1984)；核酸杂交[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)]；转录和翻译[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984)]；动物细胞培养[R.I.Freshney编辑(1986)]；固定化细胞和酶[IRL出版社(1986)]；B.Perbal,分子克隆实用指南(1984)；Ausubel,F.M.等(编辑)；分子生物学现有操作手册。John Wiley&Sons,Inc.,1994。这些技术包括如下述记载的定位诱变：Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)，美国专利号5,071,743，Fukuoka等，Biochem.Biophys.Res.Commun.263：357-360(1999)；Kim和Maas,BioTech.28：196-198(2000)；Parikh和Guengerich,BioTech.24：4 28-431(1998)；Ray和Nickoloff,BioTech.13：342-346(1992)；Wang等，BioTech.19：556-559(1995)；Wang和Malcolm,BioTech.26：680-682(1999)；Xu和Gong,BioTech.26：639-641(1999)，美国专利号5,789,166和5,932,419，Hogrefe,Strategies 14.3：74-75(2001)，美国专利号5,702,931、5,780,270和6,242,222，Angag和Schutz,Biotech.30：486-488(2001)，Wang和Wilkinson,Biotech.29：976-978(2000)，Kang等，Biotech.20：44-46(1996)，Ogel和McPherson,Protein Engineer.5：467-468(1992)，Kirsch和Joly,Nucl.Acids.Res.26：1848-1850(1998)，Rhem和Hancock,J.Bacteriol.178：3346-3349(1996)，Boles和Miogsa,Curr.Genet.28：197-198(1995)，Barrenttino等，Nuc.Acids.Res.22：541-542(1993)，Tessier和Thomas,Meths.Molec.Biol.57：229-237，以及Pons等，Meth.Molec.Biol.67：209-218。
实施例
还借助下列实施例描述和说明本发明。然而，在说明书任何位置的这些及其它实施例的使用仅为说明性，并决不限制本发明或任何示例性术语的范围及含义。同样地，本发明不限于这里所述的任何特定的优选实施方案。的确，本发明的许多修改和变化对于本领域技术人员在阅读该说明书时可以是显而易见的，并且此类变化可在不偏离本发明的精神或范围下进行。因此，本发明仅受所附权利要求的用语连同这些权利要求所具有的等同物的完整范围的限定。
实施例1：用于从血清或血浆纯化miRNA的不同方法的比较。
有许多用于miRNA分离的商用试剂盒，包括miRNeasy试剂盒(Qiagen)、MirVana RNA分离试剂盒(Ambion/ABI)、miRACLE(Agilent)、高纯度miRNA分离试剂盒(Roche)和miRNA纯化试剂盒(Norgen Biotek Corp.)。另外，可使用基于使用Trizol(Invitrogen)的内部技术。在该技术中(Invitrogen的操作手册)，在Trizol LS去蛋白作用后，用异丙醇沉淀RNA或另外在硅胶柱上纯化。在一些实验中，用无RNAse的DNAse处理纯化的RNA(Qiagen、ABI、Invitrogen等)。
使用RT-PCR比较通过不同方法获得的miRNA制备物。使用TrizolLS(Invitrogen的操作手册)和MirVana RNA分离试剂盒(Ambion/ABI的操作手册)从相同的5名健康供体获得的血浆和血清样品中纯化miRNA。在添加含胍溶液后相对于每1ml血浆或血清掺标107个拷贝的拟南芥(Arabidopsis thaliana)miR-159a(ath-miR-159a)用于评价miRNA的产量。比较两种技术，一种基于MirVana Paris试剂盒(Ambion/ABI)，另一种基于Trizol(Invitrogen)去蛋白作用，并随后在硅胶柱上纯化。在RNA纯化后，通过RT-PCR测量在最终的制备物中掺标的miRNA和人内源性miR-9、miR-16和miR-134的浓度。MirVanaParis试剂盒和基于Trizol/二氧化硅过滤的技术两者对miRNA分离是有效的，并用于进一步实验。尽管所有分析的miRNA在血清和血浆中是可检测的，并且两种样品类型适用于miRNA试验，但血浆的最终PCR Ct值低约2个循环，因而将后者用于随后的实验。基于掺标的ath-miR-159a的定量测量，来自血浆的miRNA的平均产量为约70％。
使用血浆样品和miRNeasy试剂盒(Qiagen)进行类似的分析。在添加胍后掺标合成的非人miRNA以计算miRNA产量。
实施例2：试验miRNA的选择。
试验的miRNA最初基于关于它们在脑区室中的丰度和在神经突(即轴突和/或树突和/或棘状突起)和/或突触中的存在(Hua等,BMC Genomics 2009,10:214；Liang等,BMC Genomics.2007,8:166；Landgraf等,Cell.2007,129:1401-30 1414；Lee等,RNA.2008,14:35-42；Schratt等,Nature.439:283-289,2006；Lugli等,J Neurochem.106:650-661,2008；Bicker和Schratt,J Cell Mol Med.,12:1466-1476,2008；Smalheiser和Lugli,Neuromolecular Med.11:133-140,2009；Rajasethupathy,Neuron.63:714-716,2009；Kye,RNA13:1224-1234,2007；Yu等，Exp Cell Res.314:2618-2633,2008；Cougot,等,J Neurosci.28:13793-13804,2008；Kawahara,Brain Nerve.60:1437-1444,2008；Schratt G.Rev Neurosci.2009；10:842-849；Pichardo-Casas等BrainResearch.1436:20-33,2012)以及关于它们暗示的参与神经突-和突触-相关过程(miR-Ontology Data Base：http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/)的文献数据来选择。对于归一化，除了掺标的miRNA以外，使用遍在miRNA如miR-16，以及在许多组织中表达但不在脑中表达的miRNA，如miR-10b和miR-141。
实施例3：miRNA生物标记物和标准物的实验预选。
从诊断为患有健忘症状的MCI(aMCI)(Dlugaj等,Dement Geriatr CognDisord.,2010,30:362-373；Brooks,Loewenstein,Alzheimer's Res Therapy,2010,2:28-36)的患者获得血浆样品。用针对各单独的miRNA的引物和探针(ABI)使用RT-PCR分析来自这些患者的血浆的脑富集的miRNA的谱。在各RT反应中取相当于30μL血浆的RNA的量，并将1/15的RT产物加入终PCR中。因而，检测相当于2μL血浆的miRNA的量。各miRNA的所得结果相对于各潜在的标准物miRNA归一化，根据ABI操作手册(2-Ct)转化为miRNA的相对浓度(RC)，并与年龄相称的对照(AMC)的miRNA谱相比较。实际上，所有分析的miRNA作为潜在的生物标记物和标准物及其组合来试验，选择提供了MCI患者与年龄相称的对照之间的统计上的显著差异的miRNA用于进一步研究。由如下所示的数据明确两个结论。第一，最佳的潜在生物标记物为神经突/突触miRNA，第二，最佳的标准物为其它脑富集的miRNA。
当进行相对于掺标的非人miRNA(ath-miR-159a)归一化时，给出了相对于1ml血浆的相对miRNA浓度，来自MCI患者的一些血浆样品包含更多的神经突和/或突触miRNA(图1，miR-7(A)和miR-874(B))。
同时，其它脑富集的miRNA的浓度在MCI患者血浆中并未变化(图1，miR-9(C)、miR-181a(D)和miR-491-5p(E))。
当血浆中的miRNA浓度相对于在许多器官中表达但不在脑中表达的miR-141或miR-10b归一化时获得了类似的结果(图2A-C和8A-C)。遍在miR-16对于区别MCI和AMC不是好的潜在标准物(图7)。
同时，血浆中神经突/突触miRNA浓度相对于其它脑富集miRNA的归一化揭示了几种具有发展前景的标准物。这些标准物miRNA中的一些为神经体miRNA，其它主要在不参与病理的脑区中表达，或者在胶质细胞中表达。它们中的一些还可能在病理中下调。
图3A-C、4、5A-C和6分别呈现相对于脑富集的miR-181a、miR-9、miR-491-5p和miR-127归一化后的MCI和AD患者vs对照的血浆中各种神经突/突触miRNA浓度的所得结果的实例。基于所得数据，选择8种神经突/突触miRNA(miR-7、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-323-3p、miR-382和miR-874)作为最具有发潜力的生物标记物，选择7种miRNA(miR-9、miR-127、miR-141、miR-181a、miR-370和miR-491-5p)作为最具有发展潜力的标准物。
实施例4：通过血浆中miRNA分析的MCI检测。
在本研究中，使用健忘的MCI患者、AD患者和年龄相称的对照(AMC)的血浆，每组20。通过Trizol-二氧化硅法根据Asuragen步骤从两个200μl等分的血浆样品中分离RNA。使用2μl血浆等同物以终PCR为10μl的反应体积运行单独的靶miRNA qRT-PCR试验(Applied Biosystems)三次，以测量神经突/突触miRNA生物标记物的浓度以及如实施例3中所述选择的标准物miRNA的水平。本研究还包括miR-451，这是由于其存在于神经元中，明显高于异常细胞的分泌(Pigati等,PLoSOne,2010,5:el3515)并在先天无脑畸形胎儿的脑中上调(Zhang等,Int.J.Biochem.Cell Biol.2010；42:367-374)。
示于图9-14的数据表明当与年龄相称的对照比较时，在MCI和AD患者的血浆中神经突/突触miRNA(miR-7、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-323-3p、miR-382、miR-874)的中值浓度增加2-5倍。当相对于脑富集的miRNA如miR-9、miR-127、miR-181a、miR-370和miR-491-5p进行归一化时效果更显著。
两个生物标记物家族，miR-132家族和miR-134家族，以及几种标准物已显示最高的灵敏性和特异性。生物标记物miR-128、当相对于miR-491-5p归一化时miR-132和mir-874("miR-132家族")显示为84％-92％灵敏性和84％-90％特异性(图15A-C)。生物标记物和标准物的这些组合的受试者操作特征(ROC)曲线示于图15A-C。miR-128、miR-132和miR-874的ROC曲线下的面积(AUC)分别为0.95、0.93和0.95。第二具有发展潜力的生物标记物组由miR-134、miR-323-3p和miR-382("miR-134家族")组成，并且当相对于miR-370归一化时显示为78％-91％灵敏性和85-87％特异性(图16A-C)。miR-134、miR-323-3p和miR-382的AUC分别为0.91、0.94和0.92。
示于图17A-F的相关性分析表明miR-128、miR-132和miR-874形成一个生物标记物家族(成对比较中的斯皮尔曼试验r值在0.93-0.95范围内)，和miR-134、miR-323-p和miR-382形成另一生物标记物家族(成对比较中的斯皮尔曼试验r值在0.87-0.93范围内)。miR-134家族的成员之间的高度相关性可容易通过如下事实解释：该家族的所有成员，即miR-134、miR-323-3p和miR-382属于相同的簇并在相同细胞类型中表达(http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Cluster.cgi)。miR-132家族的成员即miR-128、miR-132和miR-874之间的紧密相关性之前还未记载过。同样有趣的是，生物标记物家族miR-132和miR-134与不同的标准物产生更好的结果。在标准物miR-491-5p、miR-181a、miR-9和miR-141的情况下，miR-132家族比miR-134家族作用得更好。另一方面，在标准物miR-370和miR-127的情况下，miR-134家族表现出比miR-132家族更好的结果。miR-132和miR-134生物标记物家族之间的相关性相对低(成对比较斯皮尔曼试验中的r值在0.56-0.79范围内)，表明它们反映了不同的病理过程或位于不同的脑区。
当与任意标准物分析时，两种其它神经突/突触miRNA、miR-7和miR-125b的浓度在MCI患者的血浆中增加约40-50％。
实施例5：神经突/突触miRNA血浆浓度的年龄相关的变化的检测。
存在许多共同的过程例如神经突和突触破坏和最终的神经元死亡，尽管以较小规模且由不同因素引起，但为正常老化和MCI/AD发展所特有的特征。由于MCI可通过本发明提出的方法检测，因此研究正常老化是否可使用相同的miRNA生物标记物和标准物分析和监控是有意义的。
本研究中使用来自具备正常认知功能的组1(21-50岁)和组2(76-86岁)受试者的血浆样品，每组20个样品。通过Trizol-二氧化硅法根据Asuragen步骤从两个200μL等分的血浆样品中分离RNA。使用2μl血浆等同物以终PCR为10μl的反应体积运行单独的靶miRNA qRT-PCR试验(AppliedBiosystems)三次，以测量神经突/突触miRNA生物标记物的浓度以及如实施例3中所述选择的标准物miRNA的水平。
示于图18A-J中的数据表明，在相对于各种脑富集的miRNA标准物如miR-9、miR-181a、miR-370或miR-491-5p归一化后，实施例4中所述的神经突/突触miRNA生物标记物如miR-128、miR-132、miR-874、miR-134、miR-323-3p或miR-382的中值浓度与组1的那些相比时组2受试者的血浆中高40-60％。因此，技术人员可期望受试者体液中的神经突/突触miRNA和miRNA标准物的预期纵向分析将提供与他/她的正常老化相关的脑过程的信息。这也意味着两种生物标记物家族检测正常老化和MCI发展共有的神经元过程，例如神经突和突触破坏。
神经突/突触miR-7和miR-125b(图18)以及miR-451，不依赖于所使用的miRNA标准物，在老化期间不增加，因而在两组之间无区别。
实施例6：招募时具备正常认知功能的老年患者的MCI发展的回顾性纵向研究。
在本研究中招募具备正常认知功能的≥70岁的受试者。已研究了他们的认知功能损害的动态，并且已定期采集血浆样品4-5年。一些受试者在该期间保持无MCI，其它进展为MCI。如实施例4所示提取并分析miRNA。测量神经突和/或突触miR-128、miR-132和miR-874的浓度并相对于miR-491-5p归一化。如果三种生物标记物的至少两种的浓度比预定的对照值高，则认为患者是MCI-阳性的。图19所示的数据表明，在70％的病例中，在从患者招募开始的症状发生前的疾病阶段，血浆生物标记物miRNA的增加是可检测的，这早于MCI诊断1至5年。
实施例7：MCI转化为AD的痴呆症阶段的检测。
miR-451，尽管不是脑富集的，但存在于神经突和突触中，并从病理细胞中明显更有效地分泌，因而也包括在本研究中。
图20示出，当与年龄相称的对照相比时，miR-451的中值浓度在MCI的血浆中稍高，并且在AD患者的血浆中明显(2-4倍)增加。miR-451与神经突/突触miRNA生物标记物浓度的比甚至更好地区分MCI和AD群体(图21)。同时约40-50％的MCI患者中，该参数不能与AD患者相区分，这表明这些MCI患者将向AD痴呆症进展。因此，在血浆中连续测量的特别是与神经突/突触miRNA组合的miR-451浓度可用作MCI-AD进展的标记。
由于miR-7和miR-125b还检测出约40-50％的MCI患者为病理的(实施例4)，并且miR-451不区分青年和老年受试者(实施例5)，因此将这些生物标记物与miR-451相比较。在所有实验中出乎意料地表现得与miR-7非常类似的miR-16也包括在本研究中。图22中的2D图比较了在相对于miR-491-5p归一化后，这些miRNA在MCI患者和年龄相称的对照的血浆中的浓度。在所有情况中，都有一组MCI患者具有比两种相比较的miRNA高的血浆浓度。当生物标记物miRNA相对于脑富集的标准物miRNA的平均值归一化时获得了类似的数据(图23)。图24结合了示于图21-23的数据，并表明实际上通过所述方法将相同的患者检测为病理性的(MCI，其将进展为AD痴呆症)。
***
本发明不限于在此记载的具体实施方案的范围。的确，本发明的各种修改，除了这里所述的那些以外，从前述记载对于本领域技术人员将变得显而易见。这种修改意于落入所述权利要求的范围内。
本文所引用的所有专利、申请、出版物、试验方法、文献和其他材料在此以其全部内容引入以作参考，如同实际存在于本说明书中。

Claims (9)

1.引物和/或探针组在制备通过下述方法预测已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的试剂盒中的用途，其中
所述引物和/或探针组包括对检测从所述受试者采集的体液样品中的miR-451特异的引物和/或探针组，和对检测至少一种突触或神经突miRNA特异的引物和/或探针组；
所述方法包括：
a.测量从所述受试者采集的体液样品中的miR-451的水平；
b.测量相同体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的所述miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.如果在步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比高于相应的年龄相称的对照比，则确定所述受试者的疾病将从MCI向AD的痴呆阶段进展。
2.引物和/或探针组在制备通过下述方法预测已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的试剂盒中的用途，其中
所述引物和/或探针组包括对检测从所述受试者采集的体液样品中的miR-7、miR-125b和miR-16的至少一种特异的引物和/或探针组，和对检测标准物miRNA特异的引物和/或探针组；
所述方法包括：
a.测量从所述受试者采集的体液样品中的miR-7、miR-125b和miR-16的至少一种的水平；
b.测量相同体液样品中标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的所述miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.如果在步骤(c)中计算的至少一种比例高于相应的年龄相称的对照比，则确定所述受试者的疾病将从MCI向AD的痴呆阶段进展。
3.引物和/或探针组在制备通过下述方法监控已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的试剂盒中的用途，其中
所述引物和/或探针组包括对检测从所述受试者采集的体液样品中的miRNA-451特异的引物和/或探针组；
所述方法包括：
a.测量从所述受试者采集的体液样品中的miRNA-451的水平，其中所述样品已在间隔的时间点采集；
b.比较从所述受试者采集的各体液样品中的miRNA-451的水平与相应的年龄相称的对照水平，和
c.如果从所述受试者的各体液样品中的miRNA-451的水平高于相应的年龄相称的对照水平，则确定所述受试者的疾病从MCI向AD的痴呆阶段进展。
4.引物和/或探针组在制备通过下述方法监控已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的试剂盒中的用途，其中
所述引物和/或探针组包括对检测从所述受试者采集的体液样品中的miRNA-451特异的引物和/或探针组，和对检测至少一种突触或神经突miRNA特异的引物和/或探针组；
所述方法包括：
a.测量从所述受试者采集的体液样品中的miRNA-451的水平，其中所述样品已在间隔的时间点采集；
b.测量从所述受试者采集的各相同体液样品中的至少一种突触或神经突miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的从所述受试者采集的各体液样品的所述miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的从所述受试者采集的各体液样品的所述miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.如果对于从所述受试者采集的各体液样品，在步骤(c)中计算的所述miRNA的水平比高于相应的年龄相称的对照比，则确定所述受试者的疾病从MCI向AD的痴呆阶段进展。
5.引物和/或探针组在制备通过下述方法监控已诊断为患有MCI的受试者从MCI向AD的痴呆阶段进展的试剂盒中的用途，其中
所述引物和/或探针组包括对检测从所述受试者采集的体液样品中的miR-7、125b和miR-16的至少一种特异的引物和/或探针组，和对检测标准物miRNA特异的引物和/或探针组；
所述方法包括：
a.测量从所述受试者采集的体液样品中的miR-7、125b和miR-16的至少一种的水平，其中所述样品已在间隔的时间点采集；
b.测量从所述受试者采集的各相同体液样品中的标准物miRNA的水平；
c.计算在步骤(a)和(b)中测量的从所述受试者采集的各相同体液样品中的所述miRNA的水平比；
d.比较在步骤(c)中计算的从所述受试者采集的各体液样品的所述miRNA的水平比与相应的年龄相称的对照比，和
e.如果对于从所述受试者采集的各体液样品，在步骤(c)中计算的至少一种比例高于相应的年龄相称的对照比，则确定所述受试者的疾病将从MCI向AD的痴呆阶段进展。
6.一种试剂盒，其包括对选自由miR-7、miR-125b和miR-16组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其进一步包括对选自由miR-491-5p、miR-9、miR-127、miR-181a和miR-370组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针。
8.一种试剂盒，其包括对miR-451特异的引物或探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其进一步包括对选自由miR-7、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-98、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-128、miR-132、miR-134、miR-137、miR-138、miR-146、miR-154、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-200c、miR-218、miR-292-5p、miR-297、miR-322、miR-323-3p、miR-329、miR-325、miR-337、miR-339、miR-345、miR-350、miR-351、miR-369-3、miR-369-5p、miR-381、miR-382、miR-409-3p、miR-425、miR-429、miR-433-5p、miR-446、miR-467、miR-483-3p、miR-485-5p、miR-487b、miR-494、miR-495、miR-496、miR-541、miR-543、miR-656、miR-668、miR-874、miR-889、miR-935和miR-939组成的组的至少一种miRNA特异的引物或探针。
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