JP6211511B2 - miRNAに基づくユニバーサルスクリーニングテスト(UST) - Google Patents
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Description
本出願は、2011年4月18日に出願された米国特許仮出願第61/476,591号、2011年4月25日に出願された米国特許仮出願第61/478,766号、および2011年10月12日に出願された米国特許仮出願第61/546,431号に基づく優先権を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
本発明は、体液中の器官系/器官/組織/細胞タイプに濃縮されたmiRNAを定量することにより、器官系、特定の器官、組織および/または細胞における病的変化の非侵襲性または最小侵襲性の早期検出のための方法を記載する。
いかなる疾患の処置も、可能な限り早期に潜在的な病変が診断されれば、より容易でより効果的であることは広く認められている。いくつかの疾患では、病変がより進行し、不可逆的なステージへ移行する場合もあるので、早期診断(好ましくは、明白な臨床症状が出現する前に)は非常に重要である。例えば、アルツハイマー病や他の神経変性疾患の薬剤開発および治療における主要な問題点のひとつは、脳の高い代償能力のために臨床所見および診断が遅れることである。その結果、これらの疾患は、通常多数のニューロンがすでに死滅してから診断され、現在、最良の症例シナリオは、病変が悪化することを阻止することであり、本当の回復ではない。がんはもうひとつの例であり、疾患の転移性ステージの治療は、原発性腫瘍の治療に比べてはるかに困難である。この種の病変は他にも多数あるが、どの疾患の治療も、早期に診断されればより効果的である。
1.細胞/組織/器官に特異的または有意に濃縮されていること(例えば、他の細胞/組織/器官に比較して少なくとも5倍濃度が高いこと)
2.細胞外空間へ分泌され、身体内の様々なバリアを通過する能力
3.最小侵襲性で得ることが可能な体液に検出可能な量で存在すること
4.安定性
5.比較的低い費用で高い感度と特異度で検出可能であること
1.タンパク質
2.mRNAおよびmRNA断片
3.miRNA
4.DNA断片
5.DNAのメチル化
6.脂質
7.糖類
a.前記対象から採取した体液サンプル中の、様々な器官系に濃縮されたmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中の予め選択したノーマライザー(normalizer)miRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する特定の器官系に濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高い場合は前記対象が該器官系の病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する該器官系に濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高くない場合は前記対象が該器官系の病変を有さないと特定することを含む方法が提供される。
a.前記対象から採取した体液サンプル中の該器官系に濃縮された少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比より高い場合は前記対象が該器官系の病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比より高くない場合は前記対象が該器官系の病変を有さないと特定することを含む方法を提供する。
前記方法のある実施態様では、器官系に濃縮されたmiRNAが下記の表2に記載のmiRNAから選択される。
前記方法のさらに他の実施態様では、器官系が呼吸器系であり、かつmiRNA/ノーマライザーのペアが下記の表5に記載のものから選択される。
前記の方法の他の実施態様では、器官系が胃腸(GI)系であり、かつmiRNA/ノーマライザーのペアが下記の表7に記載のものから選択される。
a.前記対象から採取した体液サンプル中の様々な器官に濃縮されたmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中の予め選択したノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する特定の器官に濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高い場合は前記対象が該器官の病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する該器官に濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高くない場合は前記対象が該器官の病変を有さないと特定することを含む方法を提供する。
a.前記対象から採取した体液サンプル中の該器官に濃縮された少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比より高い場合は前記対象が該器官の病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比より高くない場合は前記対象が該器官の病変を有さないと特定することを含む方法を提供する。
前記2つの方法のある実施態様では、器官に濃縮されたmiRNAが下記の表1および2に記載のmiRNAから選択される。
前記2つの方法の他の実施態様では、器官が胃腸(GI)器官であり、かつmiRNA/ノーマライザーのペアが下記の表9に記載のものから選択される。
a.前記対象から採取した体液サンプル中の様々な組織に濃縮されたmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する特定の組織に濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高い場合は前記対象が該組織の病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する該組織に濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高くない場合は前記対象が該組織の病変を有さないと特定することを含む方法を提供する。
a.前記対象から採取した体液サンプル中の該組織に濃縮された少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比より高い場合は前記対象が該組織の病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比より高くない場合は前記対象が該組織の病変を有さないと特定することを含む方法を提供する。
前記2つの方法のある実施態様では、組織に濃縮されたmiRNAが下記の表1および2に記載のmiRNAから選択される。
a.前記対象から採取した体液サンプル中の様々な細胞タイプに濃縮されたmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する特定の細胞タイプに濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高い場合は前記対象が該細胞タイプの病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する該細胞タイプに濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高くない場合は前記対象が該細胞タイプの病変を有さないと特定することを含む方法を提供する。
a.前記対象から採取した体液サンプル中の該細胞タイプに濃縮された少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比より高い場合は前記対象が該細胞タイプの病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比より高くない場合は前記対象が該細胞タイプの病変を有さないと特定することを含む方法を提供する。
前記2つの方法のある実施態様では、細胞タイプに濃縮されたmiRNAが下記の表1および2に記載のmiRNAから選択される。
前記方法は組み合わせることができる。例えば、器官系の病変を検出することの後に、疾患のある器官および/または組織および/または細胞タイプを決定することなどを行ってもよい。
a.前記対象から採取した体液サンプル中の、がんと関連する少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中の、炎症と関連する少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること;
c.前記対象から採取した同一体液サンプル中の前記関与した器官系、器官、組織または細胞タイプに濃縮された少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること;
d.前記対象から採取した同一体液サンプル中の少なくとも1つのノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
e.ステップ(a)、(b)、(c)および(d)で測定したmiRNAのレベルのペアとなる比(例えば、a/b、a/c、a/d、b/c、b/dおよびc/d比)
を計算すること;
f.ステップ(e)で計算したmiRNAのレベルの比を、がんおよび炎症に特徴的な対応する所定の比と比較すること、および
g.(i)ステップ(e)で計算したmiRNAのレベルの比ががんに特徴的な所定範囲内である場合は前記病変ががんであると特定すること、または(ii)ステップ(e)で計算したmiRNAのレベルの比が炎症に特徴的な所定範囲内である場合は前記病変が炎症であると特定することを含む。
前記方法のある実施態様では、病変が肺に関与するものであり、かつmiRNAペアが下記の表6に記載のものから選択される。
前記方法のある実施態様では、病変が胃腸(GI)系に関与するものであり、かつmiRNAペアが下記の表8に記載のものから選択される。
前記方法のある実施態様では、病変が呼吸器系または胃腸(GI)系に関与するものであり、かつmiRNAペアが下記の表11に記載のものから選択される。
前記の方法のいずれも、その後、前記対象へ疾患特異的診断テストを施すことが可能である。
前記の方法のいずれも、その後、病変を有すると診断された前記対象に治療処置を施すことが可能である。
前記の方法のいずれも、その後、前記対象を臨床試験に募集することが可能である(これは、病変を有すると診断された対象および病変を有さないと診断された対象の両方に適用可能である)。
本発明の前記方法は、該器官系または器官または組織または細胞タイプの病変を示す臨床症状を有さない対象を含む、任意の対象において病変を検出することに適用できる。
a.前記の器官系または器官または組織または細胞タイプの病変を有する対象から、テスト化合物の投与の前に採取した1つ以上の体液サンプル中の、前記の器官系または器官または組織または細胞タイプに濃縮された少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記テスト化合物の投与前に採取した前記対象からの同一体液サンプル中のノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定した、前記テスト化合物の投与前に前記対象から採取した各体液サンプル中のmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.前記テスト化合物投与後に前記対象から採取した1つ以上の体液サンプル中の同一miRNAのレベルをステップ(a)と同様に測定すること;
e.前記テスト化合物投与後に前記対象から採取した同一体液サンプル中の同一ノーマライザーmiRNAのレベルをステップ(b)と同様に測定すること;
f.ステップ(d)および(e)で測定した、前記テスト化合物投与後に前記対象から採取した各体液サンプル中のmiRNAのレベルの比を計算すること;
g.ステップ(c)および(f)で計算したmiRNAのレベルの比を比較すること、および
h.(i)ステップ(f)で計算したmiRNAのレベルの比がステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比よりも低い場合は前記テスト化合物が該器官系もしくは器官もしくは組織もしくは細胞タイプの該病変の進行を遅延させるか、たは治療を行うことに有用であると特定すること;(ii)ステップ(f)で計算したmiRNAのレベルの比がステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比よりも低くない場合は前記テスト化合物が該器官系もしくは器官もしくは組織もしくは細胞タイプの該病変の進行を遅延させるか、または治療を行うことに有用でないと特定することを含む方法を提供する。
a.前記対象が前記の化合物または環境因子に暴露される前に前記対象から採取した1つまたは2つ以上の体液サンプル中の該器官系または器官または組織または細胞タイプに濃縮された少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象が前記の化合物または環境因子に暴露される前に前記対象から採取した同一体液サンプル中のノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定した、前記対象が前記化合物または環境因子に暴露される前に前記対象から採取した各体液サンプル中のmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.前記対象が前記化合物または環境因子に暴露された後に前記対象から採取した1つまたは2つ以上の体液サンプル中の該器官系または器官または組織または細胞タイプに濃縮された同一miRNAのレベルを測定すること;
e.前記対象が前記化合物または環境因子に暴露された後に前記対象から採取した同一体液サンプル中の同一ノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
f.ステップ(d)および(e)で測定した、各体液サンプル中のmiRNAのレベルの比を計算すること;
g.ステップ(c)および(f)で計算したmiRNAのレベルの比を比較すること、および
h.(i)ステップ(f)で計算したmiRNAのレベルの比がステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比よりも高くない場合は前記化合物または環境因子が該器官系または器官または組織または細胞タイプに対して毒性でないと特定すること;(ii)ステップ(f)で計算したmiRNAのレベルの比がステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比よりも高い場合は前記化合物または環境因子が該器官系または器官または組織または細胞タイプに対して毒性であると特定することを含む方法を提供する。
前記2つの方法のある実施態様では、器官系または器官または組織または細胞タイプに濃縮されたmiRNAが下記の表1および2に記載のmiRNAから選択される。
前記2つの方法のある実施態様では、器官系が中枢神経系であり、かつmiRNA/ノーマライザーのペアが下記の表4に記載のものから選択される。
前記2つの方法のある実施態様では、器官系が呼吸器系であり、かつmiRNA/ノーマライザーのペアが下記の表5に記載のものから選択される。
前記2つの方法のある実施態様では、器官系が胃腸(GI)系であり、かつmiRNA/ノーマライザーのペアが下記の表7に記載のものから選択される。
本発明の方法で使用する対象としては、例えば、ヒト、家畜および疾患の実験動物モデルが挙げられる。本発明の前記方法に有用なバイオマーカーmiRNAおよびノーマライザーmiRNAの例は、限定することなく、例えば下記の表1〜11に挙げられる。
本発明の方法に使用できる体液サンプルの例は、限定することなく、例えば、尿、血漿および血清が挙げられる。尿が使用される場合、尿サンプルが膀胱に保持されている時間は4時間未満であることが好ましい。
いくつかの実施態様では、本発明の方法は(例えば、最初のステップとして)前記対象から体液サンプルを採取するステップを含む。
2.miR−1、22、95、133a、133b、140および206からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
4.miR−34b、135b、146、146b、147b、155、199b−5p、200b、200c、205、219−5p、223、302bおよび375からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
6.miR−10a、10b、30a−3p、30c、107、135a、135b、184、187、190、194、196b、200a、204、211、324−5p、489、500、501−5p、502−3p、502−5p、503、506、508−3p、508−5p、509−3p、509−5p、510、532−5p、768−3p、886−3p、886−5p、891a、10b*、30a*、30c−2*、30e*、200a*、200b*、424*および500*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
6.miR−10b、30、99a、139−3p、139−5p、193a−5p、196a、224、335、365、378/378*、422b、494、518d−3p、642a−3p、708、10b*および335*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
8.miR−Let−7a、let−7b、let−7c、10b、17−3p、26a、100、125a、125b、127、195、199a−5p、202、214、298、382、503、672、741、742、883−3p、199a*および202*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
10.miR−Let−7c、10b、26a、99a、100、125a−5p、125b、130a、140、143、145、195、196b、199b、204、214、222、939および199*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
12.miR−Let−7c、1、23b、24、27b、28、34a、99a、100、125b、130a、143、145、147b、187、188−3p、199b−5p、205、214、222、328、373、410、455−5pおよび490−3pからなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
15.miR−15a、15b、126、139、142−3p、142−5p、146、150、155、181a、181b、181d、223、302bおよび342からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
17.miR−Let−7g、15a、20b、21、106b、140、142−3p、146、146b、150、181b、181d、342および431からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
19.miR−142−3p、146a、155、181a、205、223および424からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
21.miR−Let−7i、1、7、135a、135b、206および345からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
22.miR−Let−7g、7、15a、26b、27a、99b、124、127、132、134、137、139、152、181a、187、195、192、202、299、302b、323、324−3p、324−5p、328、330−3p、331、335、340、365、369−3p、375、379、382、409−5p、429、431、432、455−5p、483−5p、514、126*、182*および202*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
27.miR−31、106a、106b、143、145、148a、203、205、210、211および221からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
28.miR−7、26a、26b、29c、31、106a、106b、124b、130b、141、145、148a、182、188、192、197、203、375および650からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
32.miR−9、96、99a、103、124a、125b、128a、132、134、137、138、181a、181b、212、219、221、222、324−5p、328、330、331、335−5p、338、369−3p、381、382、383、425、433−5p、485−5pおよび491−5pからなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
34.miR−9、103、124a、125b、128、132、134、137、138、181a、181b、181c、204、212、213、218、338、381、382、425、432および489からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
36.miR−218、219、338、451および486からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
38.miR−34b、135b、146、146b−5p、155、199b−5p、200c、205、223、302bおよび375からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
39.miR−15b、18b、21、126、142−3p、142−5p、224、449a、449b、450b−5p、486、492、522、566、574−3p、650、766および886−5pからなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
41.miR−31、130b、136、141、143、145、148a、192、203、215、375、376c、429、455−5pおよび650からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
42.miR−106a、106b、205および210および221からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
44.miR−194、200a、200b、200cおよび321からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
45.miR−147b、194、200a、200b、200c、219−3p、378、450−5p、487a、490−3p、492、504、565、574−3p、622、801、143*および200b*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
47.miR−7、18a、21、29a、34a、103、127−3p、129−3p、134、135a、135b、182、183、184、193a−3p、193a−5p、195、199a−3p、199a−5p、200b、200c、204、216a、216b、217、224、340、365、367、374a、374b、376a、379、382、383、432、451、485−5p、487b、497、539、543、642、758、939、130b*、136*、183*、200b*および493*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
49.miR−Let−7a、7、9、124a、125a、125b、128a、132、134、135a、137、138、181a、181c、182、184、211、212、213、218、219、222、323−3p、338−5p、369、381、382、425、433−5p、485−5p、491−5p、539、541、543、656、874、935および9*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
51.miR−330−3pおよびmiR−342に特異的なプライマーまたはプローブ。
53.miR−103、181b、204、432および489からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
54.miR−103およびmiR−183に特異的なプライマーまたはプローブ。
56.miR−22、133a、221、222および30e*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
57.miR−1、30a−3p、30e−3p、133b、197、208a、208b、302a、302c、367、378および499−5pからなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
60.miR−10a、31、34b、34c、135a、135bおよび449からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
62.miR−99aおよびmiR−939に特異的なプライマーまたはプローブ。
63.miR−Let−7g、101、134、186、197、218、320、497および154*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
65.miR−7、127および493*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
66.miR−Let−7i、1、135a、135b、206および345からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
68.miR−9、21、130b、184、195、216a、216b、217、376a、376c、497および939からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
70.miR−126、139、155、223および302bからなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
71.miR−17−5p、20b、106a、106b、149、155、181c、182、183および213からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
73.miR−Let−7g、9、17、19b、20a、31、106a、124a、124b、128a、137、186、191、197、222、223、328、431、454、484、766、27*および223*からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
75.miR−Let−7ファミリー、10b、17−92ファミリー、21、29a、31、34a、106a、b、126、146a、b、155、184、195、200/141ファミリー、210、373、375、423−5p、451および486からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
77.miR−270、373および424からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
78.(i)miR−128、miR−132およびmiR−874からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ、ならびに(ii)miR−9、miR−181a、miR−491−5pおよびmiR−141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
80.(i)miR−34b、miR−486−5pおよびmiR−192からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ、ならびに(ii)miR−142−5p、miR−146b−5p、miR−155、miR−223およびmiR−409−3pからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
82.miR−486b−5pおよびmiR−192の少なくとも1つおよびmiR−146b−5pに特異的なプライマーまたはプローブ。
83.(i)miR−192、miR−194、miR−203およびmiR−215からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ、ならびに(ii)miR−30e−3p、miR−145およびmiR−148aからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAに特異的なプライマーまたはプローブ。
85.(i)miR−203に特異的なプライマーまたはプローブならびに(ii)miR−148aおよびmiR−192の少なくとも1つに特異的なプライマーまたはプローブ。
86.(i)miR−194に特異的なプライマーまたはプローブならびに(ii)miR−148aおよびmiR192の少なくとも1つに特異的なプライマーまたはプローブ。
本発明のキットは、使用説明書を更に含むことができる。
本発明は、疾患特異的スクリーニングテストから、胃腸、神経、血液などの特定の器官系または特定の器官または組織または細胞タイプの病変を検出するが疾患非特異的であるユニバーサルスクリーニングテスト(UST)への、臨床スクリーニングおよび診断学領域におけるパラダイムシフトという考えに基づいている。さらに、そのようなテストは、例えば炎症性疾患や腫瘍などのいくつかの広範な病変過程タイプを区別することが可能であろう。病変が検出された後に、より具体的な診断のために疾患特異的テストを適用することが可能である。前記のテストは、(例えば、薬剤開発または臨床試験中における)薬物スクリーニングならびに様々な化合物および環境因子の毒性の評価に使用することも可能である。本発明は、体液中の器官系、器官、組織および/または細胞タイプに濃縮されたmiRNAの、器官および/または組織および/または細胞の病変のバイオマーカーとしての使用、そのようなmiRNAの選択の根拠の記載およびUST解釈の方法に基づいている。本発明のUSTは、例えば、低酸素症、炎症、発癌などのいくつかの一般病変学的プロセスのためのmiRNAバイオマーカーを含むことが可能である。
a.前記対象から採取した体液サンプル中の様々な器官系/器官/組織/細胞タイプに濃縮されたmiRNAのレベルを測定すること;
b.前記対象から採取した同一体液サンプル中の予め選択したノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること;
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること;
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する特定の器官系/器官/組織/細胞タイプに濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高い場合は前記対象が該器官系の病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算したそれぞれのmiRNAノーマライザーに対する該器官系/器官/組織/細胞タイプに濃縮されたmiRNAのレベルの比が前記対応するコントロール比よりも高くない場合は前記対象が該器官系の病変を有さないと特定することを含むものである。
例えば肝臓におけるmiR−122や脳におけるmiR−124など、いくつかのmiRNAは特定の器官または組織に高度に濃縮されているが、ある器官または組織に100%特異的なmiRNAは知られていない。もちろん、他のすべての器官系/器官/組織/細胞タイプと比較して、ある特定の器官系/器官/組織/細胞タイプにおいてmiRNAがより高度に濃縮されているほど、バイオマーカーとしてはより有望である。実際には、もしある器官のmiRNA濃度が他より少なくとも4〜5倍高ければ、それらはUST用に有望なバイオマーカーとして選択することが可能である。多くの器官に関して、そのようなmiRNAを文献から見つけることができる(例えば、Hua et al., BMC Genomics 2009, 10:214; Liang et al., BMC Genomics. 2007, 8:166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129:1401-1414; Lee et al., RNA. 2008, 14:35-42; http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/; http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/参照)。表1に、数多くの公表データから得た様々な器官に濃縮されたmiRNAを示す。いくつかのmiRNAは、同一器官系の異なる器官に濃縮されていることがわかる。これは、特に胃腸器官、神経器官、生殖器官および血液器官に特徴的である(表2)。これらのmiRNAを使用すれば、器官を特定せずにこれらの器官系における病変を検出するテストを設計することが可能となる。同時に、ある器官系の1〜2の器官に濃縮されたmiRNAがあり、これらのmiRNAはより精確に病変の位置を限定することが可能なテストに使用可能である。これらのmiRNAのリストを表2の3列目に示す。通常胚形成の間に同一細胞タイプから発生した2つ以上の器官に濃縮されたmiRNAもある。そのような場合、体液中のmiRNA濃度の増加を明白に解釈することはできない。しかしながら、この問題は、異なる器官のセットに濃縮された数種のmiRNAを組み合わせることで解決され、本発明には、そのような数種のmiRNAについて得られたデータの解析のためにコンピュータで実行する方法も含まれる。2番目の器官に濃縮されたmiRNAは、もしこれらのmiRNAが体液中に現れる確率が低ければ、テスト結果に重大な影響を与えないであろうことに留意することも重要である。例えば、多数のmiRNAが(他の器官に加えて)皮膚に濃縮されているが、もしこれらのmiRNAが表皮に存在していれば、これらが皮膚から血流に現れる確率はとても低く、本発明の方法はこれらを使用するものである。
もし標的器官系/器官/組織/細胞タイプ中の有望なmiRNAバイオマーカー濃度が十分に高ければ、より多くのmiRNAバイオマーカー分子が体液中に出現することが期待できるので、テストの開発はより容易であり感度はより高くなる。従って、もし多くの有望なmiRNAバイオマーカーの選択肢があるのなら、標的に濃縮されているだけでなく高度に発現しているmiRNAを選択すべきである(例えば、細胞あたり1000コピー以上)。これは、小型器官またはそれらの一部、または膵β島細胞などの器官内の特定細胞タイプにとっては特に重要である。高度に発現していないmiRNAがUSTの開発に使用できないという意味ではないが、低レベルで発現しているmiRNAの検出は、miRNA定量のために、より多量の体液やより感度の高い技法を必要とするかもしれない。同時に、体液中のmiRNA濃度は、細胞から細胞外空間への分泌および体液への輸送の有効性にも依存するので(次の段落を参照)、最も有望なバイオマーカーの実験的選択のためには、できるだけ多くの器官系/器官/組織/細胞タイプに濃縮されたmiRNAを分析すべきである。
細胞遊離miRNAが体液中に出現する方法は多数ある(Hunter et al., PLoS ONE. 2008, 3:e3694;Wang et al., Nucleic Acids Res. 2010, 38:7248-7259;Pigati et al., PLoS ONE. 2010, 5:e13515;Gupta et al., Circ. Cardiovasc. Genet. 2010, 3:484-488;Iguchi et al., Commun. Integr. Biol. 2010, 3:478-481;Kosaka et al., J. Biol. Chem. 2010, 285:17442-17452)。miRNAは、下記の結果、細胞外空間にその後体液中に出現する:(i)細胞死および細胞膜透過処理;(ii)ニューロンにおける軸索、樹状突起、スパインなどの細胞区画の破壊;(iii)エキソサイトーシス(Skog et al. Nat Cell Biol., 2008, 10:1470-1476);(iv)小疱形成(Charras et al., Biophys. J. 2008, 94:1836-1853;Fackler, Grosse, J. Cell Biol. 2008, 181:879-884);(v)遊離またはタンパク質結合miRNAの分泌(Wang et al., Nucleic Acids Res. 2010, 38:7248-7259)。後者の機構により、細胞遊離miRNAの50%以上が生細胞から細胞外媒体へ遊離する。miRNAの分泌は選択的であり、様々なmiRNAの細胞内と細胞外媒体中における濃度比は異なる。miRNA分泌の選択性は、有望なバイオマーカーの選択に大変重要である。病変の発生中および正常細胞からのmiRNA分泌の機構(Rabinowits et al. Clin Lung Cancer, 2009, 10:42-46)は研究されていないので、より多くのmiRNAを分析する必要があるが、標的器官/組織における高度の発現と濃縮のために有望にみえるそれらのいくつかは、分泌レベルが低いかもしれず、その逆もありえることに注意を要する。また、正常細胞からの分泌レベルがとても低い例えばmiR−451およびmiR−1246などのいくつかのmiRNAは、病変細胞からはより効果的に分泌されることが最近実証された(Pigati et al. PLoS ONE, 2010, 5:e13515)。これらのmiRNAも、特定の器官系、器官または組織に高度に濃縮されなくとも、それらを器官/組織により特異的なmiRNAと併用することで病変の検出に有用な追加の情報が提供されるであろうから、有望なバイオマーカーとして分析することが可能である。
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b)標的miRNAの濃度は、偏在性miRNA(例、miR−16、miR−30e、miR−103など)、核小体低分子RNA(snoRNA)、U6核内低分子RNA(U6RNA)の1つに対してノーマライズすることが可能である。
e)同一器官、組織、器官系に濃縮された他のmiRNAに対する標的miRNAのノーマライズは、バイオマーカーおよびノーマライザーmiRNAが同一系の異なる細胞タイプまたは異なる器官に発現する場合に有効でありうる。
g)組織に濃縮されたmiRNAに対する標的miRNAのノーマライズは、例えば標的miRNAの発現および/または分泌の変化が特定の病変(がん、炎症など)に特徴的であるが、そのmiRNAが対象となっている器官/組織に濃縮されない場合には、有用である。そのような場合、組織に濃縮されたmiRNAに対してノーマライズすることは、病変を特定の器官または器官系に関係付けるのに役立つであろう。
i)(尿サンプルを使用する場合)腎臓ろ過における変動を考慮するために、尿中のmiRNA濃度をクリアチニンおよび/またはアルブミンレベルでノーマライズすることが可能である。
・KベースおよびIベースへのアクセスおよび管理に使用されるデータベース管理システム(DBMS)。業界標準システムの1つが使用でき、限定するものではないが、SQLサーバ、Oracle、MySQLなどがある。
a)MCI(軽度認知機能障害)
b)アルツハイマー病(AD)
2.胃腸管系:
a)食道がん
b)胃がん
c)結腸がん
d)クローン病
3.呼吸器系:
a)喘息
b)肺炎
c)COPD(慢性閉塞性肺疾患)
d)肺がん
神経系用のスクリーニングテストの開発のために提案したアプローチを、軽度認知機能障害(MCI)とアルツハイマー病(AD)の早期検出により確認した。ADは最も一般的な神経変性疾患であり、脳細胞における代謝変化、シナプスやニューロンの他の区画の損失、そして最終的なニューロンの死により引き起こされる多数の病変グループを含んでいる(総説は、Neurodegenerative diseases:From Molecular Concepts to Therapeutic Targets. Editors:R. von Bernhardi, N.C. Inestrosa, Nova Publishers, 2008参照)。ADは、神経突起退縮、軸索輸送欠陥、シナプス障害、シナプス損失、および最終的には、海馬や皮質など脳の数箇所の疾患特異的部位におけるニューロンの死により特徴付けられる(例、Crews, Masliah, Human Mol Gen., 2010, 19:R12-R20; Bredesen, Molecular Neurodegeneration 2009, 4:27; Nimmrich and Ebert, Rev Neurosci. 2009, 20:1-12; Yoshiyama et al., Neuron. 2007, 53:337-351; Wishartet al., J Neuropathol Exp Neurol. 2006, 65:733-739; Gylys et al., Neurochem Int. 2004; 44:125-131; Conforti et al., Trends Neurosci. 2007, 30:159-166; Revuelta, et al. Am J Alzheimers Dis Other Demen 2008, 23:97-102参照)。
脳の様々な部位が認知症を発症させる異なる神経変性疾患に関与していること(Geldmacher & Whitehouse, Neurology. 1997, 48:S2-9;Levy & Chelune, J Geriatr Psychiatry Neurol. 2007 20:227-238; Gong & Lippa, Am J Alzheimer's Dis Other Demen, 2010, 25:547-555)、脳の様々な部位におけるmiRNA発現プロフィールが多様であること(Landgraf et al., Cell. 2007, 129:1401-1414; The miR-Ontology Data Base: http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/)の理由で、他の脳に濃縮されたmiRNAの分析は、脳において異なる神経病変が引き起こす変化およびプロセスを区別するのに役立つであろう。
3つの胃腸(GI)器官(食道、胃、結腸)のステージ1〜2のがん患者、あるいはクローン病(GI管の任意の部位に影響する炎症性腸疾患)患者の血漿サンプルを使用して、GI系のスクリーニングテストの開発のために提案したアプローチを確認した。GI系または特定のGI器官に濃縮されたmiRNA、例えば結腸および小腸に高度に濃縮されたmiR−215、食道に濃縮され胃にもより低濃度であるが濃縮されたmiR−203、偏在性miR−30e−3pの血漿中濃度を測定した。すべての可能なmiRNAペアの比率を計算し、最も有望なバイオマーカー/ノーマライザーの組み合わせを見出した。得られたデータは、miR−192、miR−194、miR−203、miR−215が最も有効なバイオマーカーであり、miR−145、miR−148a、miR−30e−3pが最も有効なノーマライザーであることを示している。バイオマーカー/ノーマライザー比により、すべての研究した疾患の患者がコントロールと効果的に区別される。食道および胃に高度に濃縮されたmiR−203は、これらの器官のがんを検出することに特に効果的であり、結腸に高度に濃縮されたmiR−215は、結腸がんやクローン病の患者をコントロールと区別することに最も効果的である。特異度と感度を向上するためにバイオマーカー/ノーマライザー比を2つまたは3つ以上組み合わせて使用できる。例えば、miR−30e−3pに対してノーマライズしたmiR−192とmiR−203により、GI系のすべての病変の患者をコントロールから94%の感度、100%の特異度で効果的に区別した。すべてのテストする腫瘍はステージ1または2であったことが重要であり、つまり、提案したアプローチはスクリーニングや早期診断に効果的に使用可能であることを意味する。次に、対をなす異なるがんやクローン病対GI系のすべてのがんをより詳細に比較した。その結果、特定の病変を区別可能な以下のバイオマーカー/ノーマライザー比を見出した:
2.食道がん対胃がん:miR−194/miR−145;miR194/miR−148a;miR194/miR−30e−3p。
3.食道がん対結腸直腸がん:miR−192/miR−145;miR192/miR−148a;miR192/miR−30e−3p。
この様に、GI系の器官に濃縮されたmiRNAの血漿中濃度の分析は、(i)食道、胃、結腸におけるクローン病などの炎症性病状や腫瘍の検出;(ii)炎症性疾患をがんと区別すること;(iii)GI系の様々な器官にあるがんを区別することに有効である。
4つの疾患、すなわち喘息、肺炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、非小細胞肺がん(NSCLC、ステージ1〜4)の患者の血漿サンプルを使用して、呼吸器系のスクリーニングテストの開発のために提案したアプローチを確認した。登録された喘息と肺炎の患者は非喫煙者であり、COPDとNSCLCの患者は喫煙者であったので、2つの異なるコントロール群、すなわち喫煙者と非喫煙者からも血漿サンプルを採取した。肺に濃縮されたmiRNAと、多くの器官に存在するが肺に低発現したmiR−409−3pの血漿中濃度を測定した。また、GI系に関して先に述べたように、すべての可能なmiRNAのペアの比を計算して、最も有望なバイオマーカー/ノーマライザー組み合わせを見出した。
体液中の器官に濃縮されたmiRNAの分析に基づくテストが特定の器官系の病変を有する対象を検出可能であるという考えを確認するために、異なる器官系の病変を区別可能なmiRNAの組み合わせがあることを示す必要がある。例において詳細に述べるように、miRNAは、GI系(クローン病、食道がん、胃がん、結腸直腸がん)や呼吸器系(喘息、肺炎、COPD、NSCLC)の疾患を有する患者から得られた血漿サンプルから精製した。肺やGI系に濃縮されたmiRNAと様々な器官の病変学的プロセスに関与する数種のmiRNAの濃度を分析した。更に、偏在性miR−30e−3pとmiR−409−3pを有望なノーマライザーとして研究に追加した。各miRNAの濃度は、miR−30e−3p、miR−409−3pおよびそれぞれに対してノーマライズし、ABI社プロトコール(2−ΔCt)に従ってmiRNAの相対量(RQ)に変換し、肺系およびGI系疾患の患者に特徴的なmiRNAプロフィールを比較した。それらのデータは、多くのmiRNAペアが、肺系およびGI系疾患の患者を効果的に区別することを示した:miR−192/miR−126;miR−155/miR−126;miR−145/miR−126;miR−155/miR−30e−3p;miR−192/miR−30e−3p;miR−155/miR−409−3p;miR−486−5p/miR−17−5p;miR−155/miR−17−5p;miR−192/miR−17−5p;miR−146b−5p/miR−31;miR−155/miR−31;miR−192/miR−31;miR−486−5p/miR−155;miR−192/miR−155;miR−145/miR−155;miR−146b−5p/miR−155;486−5p/miR−203;miR−192/miR−203;miR−145/miR−203;miR−192/miR−215;miR−155/miR−215。miRNAペアを2つ組み合わせることにより、テストの正確度が向上する。例えば、miR−145/miR−155比およびmiR−486−5p/miR−155比の組み合わせは、GI系のすべての病変の患者を、95%の感度、90%の特異度、93%の正確度で肺疾患患者から区別した。
様々な器官における炎症性疾患やがん発達中のいくつかのmiRNAの発現および分泌における特徴的な変化のため、体液中のそれらの濃度を分析することでこれらの病変を区別することができるであろうと仮定した。同一血漿サンプルをmiRNAの精製に使用し、上述のセクションで記載した同一miRNAについて分析した。この研究では、様々なmiRNA組み合わせが、炎症性疾患患者(喘息、肺炎、COPD、クローン病)を様々ながん患者(食道がん、胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん)から区別する能力を調査した。データは、数種のmiRNAペアが、炎症性疾患患者をがん患者から効果的に区別することを示した:miR−17−5p/miR−155;mir−192/miR−155;miR−215/miR−155;miR146b−5p/miR155;miR192/miR−30e;miR−146b−5p/miR−30e−3p;miR155/miR−30e−3p。GI系疾患から呼吸器系疾患を区別するmiRNAペアの数に比べて、がんから炎症疾患を区別するmiRNAペアの数は少ない。まず、多数のmiRNAの発現における変化は、両方の病変タイプに特徴的である。次に、多数の症例で、発癌が比較的顕著な炎症に伴われている。miRNAペアを2つ組み合わせることで、テストの正確度が向上する。例えば、miR−146b−5p/miR−155比とmiR−146b−5p/miR−30e−3p比を組み合わせると、すべての炎症性疾患患者をがん患者から、80%の感度、98%の特異度、89%の正確度で区別した。
前記の診断方法およびスクリーニング方法と共に、本発明は、標的miRNAの検出に特異的なプライマーおよび/またはプローブの1つ以上のセットを含む様々なキットを提供する。そのようなキットはさらに、ノーマライザーmiRNAの検出に特異的なプライマーおよび/またはプローブのセットを含むことができる。キットに含まれるプライマーまたはプローブの組み合わせは、例えば、表1〜11に記載した分子の様々な組み合わせに基づくことができる。
そのようなキットは、患者から単離される体液サンプル中のmiRNAを直接検出するのに有用であり、または精製したRNAサンプルに使用可能である。
そのようなキットには、核酸分解を阻止する試薬などのDNAまたはRNAを保存または維持する構成要素を含むこともできる。そのような構成要素は、例えば、ヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼを含まないか、リボヌクレアーゼに対して保護するものでもよい。ここに記載した組成物または試薬はいずれも、キットの構成要素であることができる。
「スクリーニングテスト」という用語は、ここでは、疾患の早期検出、好ましくは臨床症状が現れる前に使用されるテストを意味するために使われる。ここでは主に2つのタイプのスクリーニングテストが述べられている:(i)特定の器官系/器官/組織/細胞タイプにおける病変を検出するスクリーニングテストおよび(ii)特定の器官系/器官/組織/細胞タイプを限定しないが、例えば低酸素症、炎症または発癌などの特定の一般病変学的変化を検出するスクリーニングテスト。「ユニバーサルスクリーニングテスト(UST)」という用語は、前記スクリーニングテストの1つまたは両方を意味する。
「泌尿器」という用語は、尿の身体からの分泌・排除に関与する器官および管を意味する。
ここで使用される「コントロールレベル」という用語は、所定の基準値(例えば、文献の公表値)と、コントロール対象(例えば、同年齢および同性の健常対象)からの同様に処理されたサンプルで実験的に決定されたレベルとを含む。本発明は、同一患者に対して定期的に行うことが可能なスクリーニングテストについて記載しているので、同一の個人からの以前のデータを「コントロールレベル」として使用することが可能である。
・現在までに開発されたすべてのスクリーニングテストのリスト;
・これらのテストで網羅されるすべての病変のリスト;
・使用された(および使用を仮定された)miRNAのリスト;
・すべてのスクリーニングテストに使用されるDセットのリスト;
・スクリーニングテストのタイプとDセット‐miRNAの関係;
・対応するDセットに使用される各miRNAの定数を含む表。
このデータベースは、新たな研究データが検証されたときは修正・拡張される。
「Iベース」という用語は、対象および関連情報のリスト、スクリーニングテストの履歴、生データ、処理結果などの、個人に関するスクリーニングテストの実際のデータを含むデータベースを意味する。
「反復」という用語がアルゴリズムの記述で使用される。それは、循環して実行されるプログラムループの本体を意味する。
本発明を、以下の例により記載・実証する。しかしながら、本明細書におけるこれらおよび他の例の使用は、単に例示であり、本発明や例示する用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は、ここに記載する特定の好ましい実施態様のいずれにも限定されるものではない。実際、本発明は多様に修正・変更できることは、本明細書から当業者には自明であり、そのような変更は本発明の要旨を逸脱しない範囲で可能である。従って、本発明は、添付の請求の範囲が主張する均等物の全範囲とともに、請求の範囲の用語によってのみ限定されるものである。
多数のmiRNA単離用キットが市販されており、例えばmiRNeasyキット(キアゲン社)、MirVanaRNA単離キット(Ambion/ABI社)、miRACLE(アジレント社)、ハイピュアmiRNA単離キット(ロシュ社)、miRNA精製キット(ノルゲン・バイオテック社)がある。更に、トリゾール(インビトロゲン社)の使用に基づいた社内技術も一般に使用されている。トリゾール除タンパク法の後、RNAをイソプロピルアルコールで析出させるか、またはさらにシリカカラムで精製する。いくつかの実験では、精製したRNAを、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼ(キアゲン社、ABI社、インビトロゲン社、その他)で処理する。異なる方法で得たmiRNA調製物は、RT−PCR法を使用して比較する。
最初に、有望なmiRNAバイオマーカー(表1)を、様々な器官や組織での濃縮に関する文献データに基づいて選択した(例えば、Huaetal., BMC Genomics 2009, 10:214; Liang et al., BMC Genomics. 2007, 8:166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129:1401-1414; Lee et al., RNA. 2008, 14:35-42; http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/; http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/を参照)。その後、同一器官系の数種類の器官に共通のmiRNAを、それぞれの系の有望なバイオマーカーとして選択した(表2の2番目のカラム)。その系の1つの器官だけに濃縮され他の器官に濃縮されていないmiRNAを、より精確に病変の位置を突き止めるために有望なバイオマーカーとして特定した(表2の3番目のカラム)。ノーマライズのために、例えばath−mir−159aなどのスパイクした合成非ヒトmiRNAやmiR−16、miR−30e−3pなどの偏在性miRNAの他に、標的組織以外の多数の組織に発現しているmiRNAを選択した。例えば、miR−10bおよびmiR−141は脳バイオマーカーのノーマライズに使用可能であり、呼吸器系バイオマーカーにはmiR−409−3pが使用できる。分析する組織や分析する器官および系に濃縮されている他の有望なノーマライザーは実験的に選択した。
これらのすべてのバイオマーカーは、以下の例8のKベースに対応するDセットとして含まれるべきである。
各群20の、健忘性MCI患者、AD患者およびAMCからの血漿サンプルを研究に使用した。RNAを、アスラジェン社の手順によりトリゾール‐シリカ法により2つの200μL分量の血漿サンプルから単離した。TaqMan(登録商標)逆転写キットおよびmiRNA特異的ステムループプライマー(アプライドバイオシステムズ社)を使用してシングル標的qRT−PCRを行った。RTステップを3回行い、2μL血漿相当量が最後のPCRに存在した。
血漿サンプルは、喘息、肺炎、慢性肺塞栓症疾患(COPD)、非小細胞肺がん(NSCLC)などの様々な肺疾患と診断された患者から、各群につき10ずつ得た。登録した喘息患者と肺炎患者は非喫煙者であり、COPDとNSCLCの患者は喫煙者であったので、血漿サンプルは、喫煙者と非喫煙者の2つのコントロール群からも、各群につき10ずつ採取した。RNAは、アスラジェン社の手順によりトリゾール‐シリカ法により2つの200μL分量の血漿サンプルから単離した。TaqMan(登録商標)逆転写キットとmiRNA特異的ステムループプライマー(アプライドバイオシステムズ社)を使用してシングル標的qRT−PCRを行った。RTステップを3回行い、2μL血漿相当量が最後のPCRに存在し、肺に濃縮されたmiR−34b、miR−142−5p、miR−146−5p、miR−155、miR−223、miR−486−5pの濃度と、偏在性かつ胃腸系に濃縮されたmiR−192、miR−409−3pのレベルを測定した。後者は、本質的には偏在性であるが、肺に低発現している。肺に濃縮されたそれぞれのmiRNAの濃度は、miR−409−3p、miR−192に対して、および相互にノーマライズし、ABI社プロトコール(2−ΔCt)に従ってmiRNAの相対量(RQ)に変換し、コントロールから得たmiRNAプロフィールと比較した。
血漿サンプルは、食道がん、胃がん、結腸がん、炎症性病状であるクローン病などのGI系の様々な疾患と診断された患者から、各群10ずつ得た。RNAは、アスラジェン社の手順によりトリゾール‐シリカ法により2つの200μL分量の血漿サンプルから単離した。TaqMan(登録商標)逆転写キットとmiRNA特異的ステムループプライマー(アプライドバイオシステムズ社)を使用してシングル標的qRT−PCRを行った。RTステップを3回行い、2μL血漿相当量が最後のPCRに存在し、GI系の器官に濃縮されたmiR−145、miR−148a、miR−192、miR−194、miR−203、miR−215の濃度および偏在性miR−30e−3pのレベルを測定した。各GI系に濃縮されたmiRNAの濃度は、miR−30e−3pに対して、および相互にノーマライズし、ABI社プロトコール(2−ΔCt)に従ってmiRNAの相対量(RQ)に変換し、コントロールから得たmiRNAプロフィールと比較した。図16A〜Lは、miR−192、miR−194、miR−203、miR−215が効果的なバイオマーカーであり、miR−145、miR−148a、miR−30e−3pが効果的なノーマライザーであることを明白に示している。バイオマーカー/ノーマライザー比は、すべての研究した疾患の患者をコントロールから効果的に区別する。食道や胃に高度に濃縮されたmiR−203は、これらの器官のがんを検出することに特に効果的であり、結腸に高度に濃縮されるmiR−215は、コントロールから結腸がんやクローン病の患者を区別することに最も効果的である。miR−30e−3pに対してノーマライズしたmiR−192とmiR−203の組み合わせは、例8に記載したように計算し、94%の感度、100%の特異度でGI系のすべての病変の患者をコントロールから効果的に区別する(図16M)。すべての腫瘍がステージ1〜2のがんであることが重要であり、すなわち、提案したアプローチは、スクリーニングや早期診断に効果的に使用することが可能である。
1.クローン病対食道がん、胃がん、結腸直腸がん:miR−194/miR−148a;miR−215/miR−30e−3p;miR−215/miR−194;miR−203/miR−148a;miR−192/miR−203;miR−215/miR−203およびmiR−194/miR−192(図17A〜G)。
3.胃がん対結腸直腸がん:miR−203/30e−3p;miR−203/miR−148a;miR−215/miR−203(図18D〜F)。
4.食道がん対結腸直腸がん:miR−192/miR−145;miR192/miR−148a;miR192/miR−30e−3p(図18G〜I)。
例4〜5に記載した患者から得た血漿サンプルから精製したmiRNA調製物を、この研究に使用した。様々なmiRNAの組み合わせが、GI系疾患を有する患者(クローン病、食道がん、胃がん、結腸直腸がん)を呼吸器系疾患を有する患者(喘息、肺炎、COPD、NSCLC)から区別する能力を調べた。肺に濃縮されたmiR−126、miR−146b−5p、miR−155、miR−486−5p、GIに濃縮されたmiR−145、miR−192、miR−203、miR−215を研究に用いた。これらのmiRNAのうちのいくつかの発現(表3)が、様々な器官の病変で調節されなくなることが知られている。さらに、様々な器官の病変学的プロセスに関与するmiR−17−5pおよびmir−31と、例4および5でノーマライザーとして使用されたmiR−30e−3p、miR−409−3pも分析した。RNAは、アスラジェン社の手順によりトリゾール‐シリカ法により2つの200μL分量の血漿サンプルから単離した。シングル標的TaqMan(登録商標)miRNAqRT−PCRアッセイ(アプライドバイオシステムズ社)を、2μL血漿相当量を使用して最終PCRが10μLの反応量で3回行った。各miRNAの濃度は、miR−30e−3p、miR−409−3pに対して、および相互にノーマライズし、ABI社プロトコール(2−ΔCt)に従ってmiRNAの相対量(RQ)に変換し、肺系およびGI系疾患の患者に特徴的なmiRNAプロフィールを比較した。図19A〜Uは、多数のmiRNAペアが肺系およびGI系の疾患を有する患者を効果的に区別することを示した:miR−192/miR−126;miR−155/miR−126;miR−145/miR−126;miR−155/miR−30e−3p;miR−192/miR−30e−3p;miR−155/miR−409−3p;miR−486−5p/miR−17−5p;miR−155/miR−17−5p;miR−192/miR−17−5p;miR−146b−5p/miR−31;miR−155/miR−31;miR−192/miR−31;miR−486−5p/miR−155;miR−192/miR−155;miR−145/miR−155;miR−146b−5p/miR−155;486−5p/miR−203;miR−192/miR−203;miR−145/miR−203;miR−192/miR−215;miR−155/miR−215。
例6で研究したのと同一の血漿サンプルをRNA精製に使用し、同一のmiRNAを分析した。この研究では、様々なmiRNA組み合わせが、炎症性疾患を有する患者(喘息、肺炎、COPD、クローン病)を様々ながんを有する患者(食道がん、胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん)から区別する能力を調べた。図20A〜Fは、数種のmiRNAペアが炎症性疾患を有する患者を様々ながんを有する患者から効果的に区別することを示している:miR−17−5p/miR−155;mir−192/miR−155;miR−215/miR−155;miR192/miR−30e;miR−146b−5p/miR−30e−3p;miR155/miR−30e−3p。炎症疾患をがんから区別するmiRNAペアの数は、呼吸器系の疾患をGI系の疾患から区別するできるmiRNAペアよりも少ない。まず、多数のmiRNAの発現における変化は、両病変タイプで特徴的である。次に、多数の症例で、発癌は比較的顕著な炎症により伴われている。
2つの異なるアプリケーションを、UST開発(研究段階)とその臨床利用(スクリーニングデータ処理)に使用した。両アプリケーションのアルゴリズムには、トレーニング部分と分類部分が含まれるが、それらは大変異なるものである。
以下のアルゴリズムの記述と関連する図において、「バイオマーカー」という用語は、病変診断、より一般的には様々な対象群を区別するため使用されるmiRNAペア、すなわちマーカーとノーマライザーと定義される。「ROC」という用語は、分類に使用される統計手法である受信者動作特性を表す。
提案するアルゴリズムは、下記の簡略化した仮定に基づくものである:
・任意のバイオマーカーの特定の病変への応答は、独立して調査可能であり、特定のDセットに割り当てたバイオマーカーの「最終的な」組み合わせに関連付けるべきではない;
・アルゴリズムは確率的なものであるべきであり、それにより、結果推定がより良いものとなる。
アルゴリズムの2番目の部分である分類は、主に妥当性データ処理に使用される。また、その一部である内部ループは、トレーニングアルゴリズムの最後のステップに使用可能である。一般に、研究段階では、これらの部分、すなわちトレーニング手順および分類手順は反復して使用される、すなわち数回繰り返され、臨床的に許容可能なテスト正確度を達成する。
内部バイオマーカーループを通る反復ステップには以下のものが含まれる:
ノーマライズには、スパイクしたmiRNAに基づいた1つの一般スクリーニングテストノーマライズ(テストに付き1回)、および特定のDセットタイプb)、c)、d)(前記の発明の詳細な説明の欄参照)またはそれらの2つ以上に特異的なノーマライズを含むことができる。各バイオマーカーに使用される特定のノーマライズのバージョンは、Dセットの記述としてKベースに含まれる。このように、1つのバイオマーカーが2つ以上のDセットの一員である場合、それぞれのセットでそれに合うようにノーマライズされるべきである。
特定の人のバイオマーカーの濃度を、病変を有するまたは有さないの2つの確率に関してマッピングしなくてはならない。マッピング操作は、病変を有するおよび有さない(コントロール)の2つの集団のバイオマーカーデータの処理に基づいて、2つの確率関数を使用する。各確率関数は、コントロール集団では1から0まで、標的病変を有する集団では0から1までの、線形近似曲線である。すべての曲線の記述は、Kベースに保管、検索および更新される。
標的曲線およびコントロール曲線のかなりの部分は重複している。もし実測値がこの重複部分内であるなら、結果をどのように解釈するかの決定をする必要がある。これは、限定することなく、病変を有する確率と有さない確率の比較に基づく;同一人物に関してもし既にデータが集められIベースに保管されているならば、既存のバイオマーカーデータを分析する。
これが、バイオマーカー反復の終了である。
ステップ1.標的確率の計算
ほとんどのケースでは、特定のDセットに含まれるバイオマーカー同士は統計的に独立している、すなわち、特定の濃度値がコントロールまたは標的群に属するかの確率は、Dセットの他のバイオマーカーの値に有意に依存していない。この場合、Dセットを構成するバイオマーカーの確率の加重合計が計算される。デフォルトでは、すべての加重は等しく、例えば3つのバイオマーカーはそれぞれ加重が1/3である。しかしながら、個々の加重は、Dセット内のすべてのバイオマーカーに関してKベースに保管することが可能である。それらは、感度、特異度またはAUC(曲線下面積)などのいくつかのバイオマーカーROCパラメータに基づくことが可能である。任意のDセットのすべてのバイオマーカーの加重の合計は1である。
原則として、結果は、標的病変に対する「陽性」または「陰性」として提示されるべきである。特別のケースでは、パーセントを付けた「未決定」という結果を使用可能である。決定用パラメータは先に定義しKベースに保存しなくてはならない。それらは、スクリーニング全体に共通しているか、標的(器官系/器官/組織)に特異的であり、先のステップ(D−ステップ1)で計算した確率に適用することができる。これらのパラメータは2つの確率(PP−病変確率、PC−コントロール確率)のそれぞれに、あるいはより一般的には2つの差に適用可能である。例:(i)差パラメータが0、すなわちPP>PCは「陽性」を意味し、PP<PCは「陰性」を意味する;(ii)PP−PC?0.25は「陰性」、PP−PC?0.35は「陽性」、その間は「未決定」;(iii)PP>0.6は「陽性」、PC>0.7は「陰性」、他はすべて「未決定」。
結果を表示し、テスト番号、日付/時刻スタンプ、患者識別などの識別データと共にIベースに保存する。
臨床での試験および使用のためのアルゴリズム
研究段階が完了した時点で、KベースにはUSTとそのバージョンのすべての構成要素(バイオマーカー、Dセット、分類用定数)が含まれる。次の段階では、これらのツールを使用したより大規模な臨床試験が行われる。
ここに言及したすべての特許、出願、広報、テスト方法、文献および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全開示を参照によりここに援用するものである。
Claims (10)
- 対象の胃腸(GI)系、呼吸器系および中枢神経系の器官系のいずれかまたはすべてにおける病変の検出を補助する方法であって、該方法は、
a.前記対象から採取した血漿および/または血清サンプル中の、胃腸(GI)系に濃縮されたmiRNAのレベル、呼吸器系に濃縮されたmiRNAのレベル、および中枢神経系に濃縮されたmiRNAのレベルを測定すること、
b.前記の対象から採取した同一血漿および/または血清サンプル中の、ノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること、
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること、
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を、対応するコントロール比と比較すること、および
e.(i)ステップ(c)で計算した、特定の器官系に濃縮されたmiRNAの、それらの各miRNAノーマライザーに対するレベルの比が、前記の対応するコントロール比よりも高い場合、前記対象が該器官系の病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算した、該器官系に濃縮されたmiRNAの、それらの各miRNAノーマライザーに対するレベルの比が、前記の対応するコントロール比よりも高くない場合、前記対象が該器官系の病変を有さないと特定すること
を含み、
ここで、
ステップ(a)で測定されたGI系に濃縮されたmiRNAが、miR−192、miR−203、miR−215、またはmiR−194から選択され、ステップ(b)のノーマライザーmiRNAが、miR−30e−3p、miR−145またはmiR148aから選択され;
ステップ(a)で測定された呼吸器系に濃縮されたmiRNAが、miR−486−5p、miR−34b、またはmiR−192から選択され、ステップ(b)のノーマライザーmiRNAが、miR−142−5p、miR−146b−5p、miR−155、miR−223、またはmiR−409−3pから選択され;および
ステップ(a)で測定された中枢神経系に濃縮されたmiRNAが、miR−128、miR−132、miR−874、miR−134、miR−323−3p、miR−382、miR−7、またはmiR−125bから選択され、ステップ(b)のノーマライザーmiRNAが、miR−9、miR−181a、miR−491−5p、miR−141、miR−127またはmiR−370から選択される、前記方法。 - ステップ(a)で測定された中枢神経系に濃縮されたmiRNAが、miR−128、miR−132、またはmiR−874から選択され、ステップ(b)のノーマライザーmiRNAが、miR−9、miR−181a、miR−491−5p、またはmiR−141から選択されるか、あるいは、ステップ(a)で測定された中枢神経系に濃縮されたmiRNAが、miR−134、miR−323−3p、またはmiR−382から選択され、ステップ(b)のノーマライザーmiRNAが、miR−127またはmiR−370から選択される、
請求項1に記載の方法。 - 病変が、がんまたは炎症であるかどうかを特定することを更に含む、請求項1に記載の方法であって、該方法は、
a.前記対象から採取した血漿および/または血清サンプル中の、がんと関連する少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること、
b.前記の対象から採取した同一血漿および/または血清サンプル中の、炎症と関連する少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること、
c.前記の対象から採取した同一血漿および/または血清サンプル中の、罹患した器官系に濃縮された少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること、
d.前記の対象から採取した同一血漿および/または血清サンプル中の少なくとも1つのノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること、
e.ステップ(a)、(b)、(c)および(d)で測定したmiRNAのレベルのペアとなる比を計算すること、
f.ステップ(e)で計算したmiRNAのレベルの比を、がんおよび炎症に特徴的な対応する所定の比と比較すること、および
g.(i)ステップ(e)で計算したmiRNAのレベルの比が、がんに特徴的な所定範囲内である場合、前記病変ががんであると特定すること、または(ii)ステップ(e)で計算したmiRNAのレベルの比が、炎症に特徴的な所定範囲内である場合、前記病変が炎症であると特定すること
を含み、
ここで、
がんまたは炎症と関連するmiRNAが、表Aに記載のmiRNAから選択される
- (1)病変が、肺に関するものであり、かつmiRNAペアが、表Bに記載のものから選択されるか、
(2)病変が、胃腸(GI)系に関するものであり、かつmiRNAペアが、表Cに記載のものから選択されるか、
(3)病変が、呼吸器系または胃腸(GI)系に関するものであり、かつmiRNAペアが、表Dに記載のものから選択される、
- 病変が、呼吸器系または胃腸(GI)系であるかどうかを特定することを更に含み、
ここで、
ステップ(f)は、(i)ステップ(e)で計算したmiRNAのレベルの比が、呼吸器系に関する病変に特徴的な所定範囲内である場合、前記病変が呼吸器系に関すると特定すること、または(ii)ステップ(e)で計算したmiRNAのレベルの比が、胃腸(GI)系に関する病変に特徴的な所定範囲内である場合、前記病変が胃腸(GI)系に関すると特定すること、および
ここで、miRNAのペアが、表Eに記載のものから選択される、
- 対象の器官系の病変の検出を補助する方法であって、該方法は、
a.前記対象から採取した血漿および/または血清サンプル中の、様々な器官系に濃縮されたmiRNAのレベルを測定すること、
b.前記の対象から採取した同一血漿および/または血清サンプル中の、ノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること、
c.ステップ(a)および(b)で測定したmiRNAのレベルの比を計算すること、
d.ステップ(c)で計算したmiRNAのレベルの比を、対応するコントロール比と比較すること、
e.(i)ステップ(c)で計算した、特定の器官系に濃縮されたmiRNAの、それらの各miRNAノーマライザーに対するレベルの比が、前記の対応するコントロール比よりも高い場合、前記対象が該器官系の病変を有すると特定すること、または(ii)ステップ(c)で計算した、該器官系に濃縮されたmiRNAの、それらの各miRNAノーマライザーに対するレベルの比が、前記の対応するコントロール比よりも高くない場合、前記対象が該器官系の病変を有さないと特定すること、
ここで、器官系は胃腸(GI)系であり、ステップ(a)で測定されたGI系に濃縮されたmiRNAが、miR−192、miR−203、miR−215、またはmiR−194から選択され、ステップ(b)のノーマライザーmiRNAが、miR−30e−3p、miR−145またはmiR148aから選択され;または、
器官系は呼吸器系であり、ステップ(a)で測定された呼吸器系に濃縮されたmiRNAが、miR−486−5p、miR−34b、またはmiR−192から選択され、ステップ(b)のノーマライザーmiRNAが、miR−142−5p、miR−146b−5p、miR−155、miR−223、またはmiR−409−3pから選択され;または
器官系は中枢神経系であり、ステップ(a)で測定された中枢神経系に濃縮されたmiRNAが、miR−128、miR−132、miR−874、miR−134、miR−323−3p、miR−382、miR−7、またはmiR−125bから選択され、ステップ(b)のノーマライザーmiRNAが、miR−9、miR−181a、miR−491−5p、miR−141、miR−127またはmiR−370から選択され、
およびさらに
f.病変が、がんまたは炎症であるかどうかを特定すること
を含み、該方法は、
(1).前記対象から採取した血漿および/または血清サンプル中の、がんと関連する少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること、
(2).前記の対象から採取した同一血漿および/または血清サンプル中の、炎症と関連する少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること、
(3).前記の対象から採取した同一血漿および/または血清サンプル中の、罹患した器官系または器官に濃縮された少なくとも1つのmiRNAのレベルを測定すること、
(4).前記の対象から採取した同一血漿および/または血清サンプル中の少なくとも1つのノーマライザーmiRNAのレベルを測定すること、
(5).ステップ(1)、(2)、(3)および(4)で測定したmiRNAのレベルのペアとなる比を計算すること、
(6).ステップ(5)で計算したmiRNAのレベルの比を、がんおよび炎症に特徴的な対応する所定の比と比較すること、および
(7).(i)ステップ(5)で計算したmiRNAのレベルの比が、がんに特徴的な所定範囲内である場合、前記病変ががんであると特定すること、または(ii)ステップ(5)で計算したmiRNAのレベルの比が、炎症に特徴的な所定範囲内である場合、前記病変が炎症であると特定すること
を含み、
ここで、
がんまたは炎症と関連するmiRNAが、表Fに記載のmiRNAから選択される、
- ノーマライザーmiRNAが、偏在性miRNA、多くの器官に発現するが器官系に低発現したmiRNAおよび該器官系に濃縮され、試験的に選択されたmiRNAからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- miRNAペアが、以下の表GおよびHに記載のものから選択される、
- 病変が、呼吸器系または胃腸(GI)系に関するものであり、かつmiRNAペアが、表Iに記載のものから選択される、
- (1)器官系が、胃腸(GI)系であり、かつmiRNA/ノーマライザーのペアが、miR−215/miR−145、miR−215/miR−30e−3p、miR−215/miR−148a、miR−203/miR−145、miR−203/miR−30e−3p、miR−203/miR−148a、miR−192/miR−145、miR−192/miR−30e−3p、miR−192/miR−148a、miR−194/miR−145、miR−194/miR−30e−3pおよびmiR−194/miR−148aから選択されるか;または
(2)器官系が、呼吸器系であり、かつmiRNA/ノーマライザーのペアが、miR−486−5p/miR−146b−5p、miR−486−5p/miR−409−3p、miR−486−5p/miR−223、miR−34b/miR146b−5p、miR−34b/miR−409−3p、miR−34b/miR−223、miR−192/miR−146b−5p、miR−192/miR−409−3pおよびmiR−192/miR−223から選択される、請求項6または7のいずれか一項に記載の方法。
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