CN101962685B

CN101962685B - 一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法

Info

Publication number: CN101962685B
Application number: CN201010539260A
Authority: CN
Inventors: 崔仑标; 葛以跃; 史智扬; 戚宇华; 赵康辰; 单云峰; 周明浩; 汪华
Original assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Current assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority date: 2010-11-11
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-11-11
Also published as: CN101962685A

Abstract

本发明涉及一种检测核糖核酸的方法，尤其是一种检测微小核糖核酸（microRNA）的方法，属于生物技术领域。利用不对称PCR扩增结合液相芯片技术，先在生物样品中加入定量的外源性microRNA，将microRNA进行预扩增及扩增得到扩增产物，并将修饰后的含有microRNA特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，扩增产物与液相芯片杂交后通过液相芯片检测仪检测，通过比较待检测microRNA的荧光信号与外源性microRNA的荧光信号的相对水平达到相对定量检测microRNA的目的，为microRNA的定量检测提供新的途径。

Description

一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法

技术领域

本发明涉及一种检测核糖核酸的方法，尤其是一种检测微小核糖核酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞调亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。最早对于 microRNA 表达的研究是 1993 年由 Harvord 大学 Ambros 课题组报道的，他们在线虫（Caenorhabditis elegans ）体内发现了源于 lin-4 基因的一系列 microRNA 分子。随后，人们采用多种实验方法和生物信息学手段寻找microRNA 分子，至今已经在各种物种中已发现一万多种miRNA，人类已发现七百多种miRNA，随着研究的深入将会有新的miRNA被发现，并对其中一些分子的功能进行了深入研究。然而，这些研究依赖的一个技术关键是如何分离、检测microRNA 分子。特别是各种细胞或组织 microRNA 表达图谱还不清楚的时候，开发和改善检测 microRNA 的技术就显得尤为重要。目前常用的方法是先将 microRNA 分子扩增放大，然后再通过不同的方法来检测。因为 microRNA 的长度太短，与常用的 PCR 引物长度相当，因此用传统的扩增技术进行放大非常困难。一种比较常用的方法是先分离小片段 RNA 分子，然后在每一个分子的两端各加一个连接（核酸）分子（Adaptor），再根据连接分子来设计引物，最后进行 RT-PCR 扩增为下一步检测做好准备。检测 microRNA 的绝对定量或相对定量方法包括real time-PCR、Northern Blot、微阵列芯片（Microarray）、微球等不同的技术。real time-PCR是一种基于荧光染料或MGB探针检测microRNA 的方法，该方法简单快速，但均是专利技术，使用价格昂贵；Northern Blot 是一种在硝酸纤维素膜上利用同位素探针杂交检测microRNA 的方法，该方法程序复杂、耗时费力，虽然其稳定性和可靠性都比较高，但是这两种方法均不能高通量的检测多种microRNA；而 microarray 技术是利用微量点样等方法，将大量基因的寡核苷酸序列有序地固化于支持物表面，然后与待测生物样品中标记的靶分子杂交，再通过特定仪器对杂交信号的强度进行检测、分析，从而判断样品中靶分子数量的一种技术，但该技术灵敏度不如前两种方法，对样品起始量要求较大，一般需要1-10μg的RNA量，而且由于microRNA 碱基数过少，探针碱基序列的选择余地受限，不同microRNA 有不同的最适宜杂交温度，即使在相同的杂交条件下，也会引起很大程度的错配杂交，从而限制了对于相似序列 microRNA 的高效识别。另外，目前microRNA的相对定量检测时常用表达水平较高的内源性microRNA作为参考,如has-mir-16等，但研究发现这些表达水平较高的microRNA,如has-mir-16在各生物组织中及细胞中表达差异也较大，使得microRNA的相对定量检测存在一定困难。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对以上现有技术存在的缺陷，提出一种新的

microarray技术，在微球上嫁接相应microRNA的核酸分子探针，利用流式细胞分离技术，可以改善传统microarray 的错配杂交问题，并可以同时检测近百种microRNA，达到高通量检测的目的。

本发明的技术原理是：利用不对称PCR扩增结合液相芯片技术，先在生物样品中加入定量的外源性microRNA，将microRNA进行扩增得到扩增产物，并将修饰后的含有microRNA特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，扩增产物与液相芯片杂交后通过液相芯片检测仪检测，通过比较待检测microRNA的荧光信号与外源性microRNA的荧光信号的相对水平达到相对定量检测microRNA的目的。

本发明的技术方案通过以下步骤实现：

步骤一、制备液相芯片，从Sanger MiRBase数据库中选取成熟的microRNA序列作为探针序列,在所述探针序列的5’端加上C12 分子臂和氨基修饰，并将修饰后的探针与不同编码的荧光微球偶联，得到特异性检测微球，即液相芯片；

步骤二、设计引物和探针，在所述成熟的microRNA序列后8位反向互补序列的5’端加上CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG组成反转录引物，剩余序列的5’端加上ACACTCCAGCTGGG组成正向引物，并设计通用正、反向引物，在通用反向引物的5’端第1位及第5位T碱基以生物素标记，在通用正向引物的第3位和第5位碱基进行锁核酸（LNA）修饰；

步骤三、在待检测的RNA中加入外源性人工合成的2种microRNA ，加入量为每50 ng待测RNA各加5 fmol；

步骤四、对待测样品RNA进行反转录反应，得到合成的cDNA；

步骤五、对所述cDNA进行预扩增反应，得到预扩增产物；

步骤六、对所述预扩增产物进行不对称PCR扩增反应，得到待测样品的PCR扩增产物；

步骤七、将所述待测样品的PCR扩增产物与特异性检测微球杂交，得到杂交反应产物；

步骤八、将所述杂交反应产物离心弃上清后，与链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白反应，得到反应产物；

步骤九、用液相芯片检测仪对步骤八中的反应产物进行检测，得到检测结果。

本发明的技术方案通过以下步骤进一步实现：

步骤一中偶联的体积为25 μl，每1×10⁶个荧光微球对应的特异性检测探针加入量为0.04～0.1 nmol。

步骤二中所述通用反向引物序列为TGGTGTCGTGGAGTCG，所述通用正向引物序列为ACACTCCAGCTGGG。

步骤三中所述外源性人工合成microRNA的序列为CAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCAG，GACCUCCAUGUAAACGUACAA。

步骤四中反转录反应体系为10X Reverse Transcription Buffer 2 μl, 25XdNTPs 0.8 μl, 50 U/μL 的MultiScribe^TM Reverse Transcriptase 1 μl，RNAase抑制剂1 U，所述反转录引物5 nM，RNA 50 ng，补水至20 μl，反应条件为16℃ 30 min,60个循环的20℃ 30 s,42℃ 30 s，50℃ 1 s，最后85℃， 5 min灭活反转录酶，得到合成的cDNA。

步骤五中反应体系为Multiplex PCR master mix 12.5 μl，正向引物各50 nM，通用反向引物0.2 μM, 步骤四中合成的cDNA 2 μl，补充水至25 μl，反应条件为95℃ 15min，18个循环的94℃ 15s，60℃ 5s，55℃ 15s，72℃ 15s，最后72℃ 2min。

步骤六中反应体系为Multiplex PCR master mix 10 μl，通用正向引物各0.1 μM，通用反向引物1 μM, 以水1：400稀释步骤五中的预扩增产物2 μl，补充水至20 μl，反应条件为95℃ 15 min，40个循环的94℃ 15 s，60℃ 1 min，最后72℃ 2 min，94℃ 3 min。

步骤七中杂交反应体系是：33 μl的1.5×TMAC、液相芯片2.5～5 μl、待测样品的PCR扩增产物1～10 μl，空白孔以等量TE取代PCR产物，以TE补足反应体积至50 μl，52℃杂交10 min。

步骤八中加入1×TMAC稀释后浓度为4 μg/ml的链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋的白反应，52℃杂交10 min。

本发明所提供的相对定量检测微小核糖核酸（microRNA）的液相芯片检测方法可以用于microRNA的相对定量检测，其优点在于：1.克服了普通PCR和荧光定量PCR在多重检测方面的局限性；2.克服了固相芯片检测结果的可重复性差及敏感性不高的缺陷，本发明中较为关键的预扩增步骤可显著增加样品中低峰度的microRNA检测；3.具有检测种类多，一次反应可同时检测近百个microRNA，对于检测超过100种的microRNA，可将这些microRNA分成几组，分几次检测完成全部所需microRNA的检测；4.反应时间短、整个反应可在4小时内完成；5.本发明只需提取样品中总RNA,无需分离microRNA，简化了样品制备过程，另外，在总RNA中加入定量的外源性人工合成的microRNA作为参考，通过比较其它microRNA与外源性人工合成的microRNA的相对水平，解决了microRNA相对定量检测问题；6.由于杂交反应在液相环境中进行，可以改善传统microarray方法的错配杂交问题，本发明的液相芯片特异性强且检测准确。为microRNA的定量检测提供新的途径。

具体实施方式

实施例

本实施例检测microRNA的液相芯片，是由分别包被有特异性检测探针的荧光微球构成，其中，检测探针序列与miRBase数据库中的成熟的microRNA序列（包括2种人工合成的microRNA序列，其序列与现有Sanger MiRBase数据库中microRNA序列均不同）相同，（实际应用时具有至少一种即可），在5’端加上C12 分子臂和氨基修饰得到特异性检测探针。

步骤一、运用生物信息学知识和相关生物信息学软件检索Sanger MiRBase数据库中所有的microRNA序列信息，取成熟microRNA序列作为探针序列，在探针的5’端加上C12 分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针，将特异性检测探针与荧光微球偶联，成为特异性检测微球，即液相芯片。具体做法是：取200 μl (2.5×10⁶个)羧基化的微球（购自美国Bio-Rad公司），10000 g离心2 min后弃上清，加入2-[N-吗啉代]乙磺酸（MES）（0.1 M, pH=4.5）25 μl，混匀。将特异性检测探针用MES稀释至0.1 mM，取2 μl加至反应体系中，再加入新鲜配置的10 mg/ml 1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）2.5 μl（1.25～2.5 μl），混匀后室温避光孵育30 min，重复加入新鲜配置的EDC一次，再次室温避光孵育30 min，用0.5 ml吐温-20（Tween-20）（0.02% V/V）和0.5 ml十二烷基磺酸钠（SDS）（0.1% W/V）各洗涤一次，最后用200 μl Tris-EDTA（TE）重悬微球，血细胞计数器计数后混合各种微球，用TE稀释每种微球的浓度至2000个/μl，4℃避光保存。

步骤二、运用生物信息学知识和相关生物信息学软件检索Sanger MiRBase数据库中所有的microRNA序列信息，取成熟microRNA序列后8位反向互补序列的在5’端加上CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG组成反转录引物（R），剩余序列在5’端加上ACACTCCAGCTGGG组成正向引物（F），通用反向引物（UR）序列为TGGTGTCGTGGAGTCG，通用反向引物的5’端第1位及第5位T碱基以生物素标记，通用正向引物（UF）序列为ACACTCCAGCTGGG, 5’端第3位和第5位碱基进行锁核酸（LNA）修饰；

步骤三、提取样品中总RNA，将待检测的RNA定量，每50 ng总RNA加入外源性人工合成的2种microRNA各5 fmol，外源性人工合成的microRNA序列为CAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCAG，GACCUCCAUGUAAACGUACAA。

步骤四、反转录反应，反转录反应含10X Reverse Transcription Buffer 2 μl, 25XdNTPs 0.8 μl, MultiScribe^TM Reverse Transcriptase(50 U/μL) 1 μl，RNAase抑制剂1 U，各种反转录引物（R）5 nM，RNA 50 ng，补水至20 μl，反应条件为16℃ 30 min,60个循环的20℃ 30 s,42℃ 30 s，50℃ 1 s，最后85℃ 5 min灭活反转录酶。

步骤五、预扩增反应，反应体系为Multiplex PCR master mix 12.5 μl，正向引物（F）各50 nM，通用反向引物（UR）0.2 μM, 步骤四合成的cDNA 2 μl，补充水至25 μl，反应条件为95℃ 15min，18个循环的94℃ 15 s，60℃ 5 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s，最后72℃ 2 min。

步骤六、进行不对称PCR扩增，反应体系为Multiplex PCR master mix 10 μl，通用正向引物（UF）各0.1 μM，通用反向引物（UR）1 μM, 步骤五预扩增产物（以水1：400稀释）2 μl，补充水至20 μl，反应条件为95℃ 15min，40个循环的94℃ 15 s，60℃ 1 min，最后72℃ 2 min，94℃ 3 min。

步骤七、取步骤六中待测样品的PCR扩增产物与制得的特异性检测微球杂交，得到杂交反应物，PCR扩增产物与液相芯片的杂交反应体系为50 μl：1.5×氯化四甲铵（TMAC）33 μl，液相芯片5 μl，PCR扩增产物1-10μl，空白孔以等量TE取代PCR扩增产物，用TE补足反应体积至50 μl。杂交反应的条件为：52℃杂交15min；

步骤八、杂交反应产物与链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白（SA-PE）进行反应，取步骤四制得的杂交反应产物10000 g离心2 min后弃上清，加入1×TMAC新鲜稀释的SA-PE (4 μg/ml)共 75 μl，52℃杂交10 min；

步骤九、通过液相芯片检测仪检测，分析数据；首先，通过液相芯片检测仪（Bio-Plex System）直接读取以上实验中偶联特异性探针的微球，重复3次，确定Gate value的值为4000-15000，然后芯片检测仪的参数设置如下：

Events：50；Min Events：0；偶联特异性探针的微球所确定的Gate value：4000-15000。

杂交反应产物与SA-PE反应10min后上机检测。

所述主要溶液的配方如下：

20% Sarkosyl配方：Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine) 50 g,加水至250 ml，过滤后室温储存；

1.5 × TMAC杂交缓冲液配方（250 ml）：5 M TMAC 225 ml，20% Sarkosyl 1.88 ml，1 M Tris-HCl（pH8.0）18.75 ml，0.5 M EDTA（pH 8.0）3.0 ml，水1.37 ml，室温储存；

1 × TMAC杂交缓冲液配方（250 ml）：5 M TMAC 150 ml，20% Sarkosyl 1.25 ml，1 M Tris-HCl（pH8.0）12.5 ml，0.5 M EDTA 2.0 ml，水84.25 ml，室温储存。

检测结果与数据分析：

1：获得各个样本每种microRNA原始荧光值（MFI）；

2：将原始MFI值减去空白孔对应的荧光值得到净MFI；

3：将外源性人工合成的2种microRNA的净MFI取几何均数；

4：将各样本每种microRNA的净MFI除以步骤3得到的几何均数即可得到各个microRNA的相对表达水平。

本实施例中对一例样本中15种microRNA进行检测，并与荧光定量检测方法进行比较，结果如下：可见本发明检测方法一次性检测种类多，且与荧光定量检测方法有较高的一致性。

microRNA名称	空白孔MFI	样本孔MFI	净MFI	相对表达量	荧光定量检测
						外源microRNA－1	23	3100	3077
外源microRNA－2	32	4321	4289
						hsa-let-7b	18	1335	1317	0.36	0.3
hsa-mir-23a	45	3452	3407	0.94	0.95
						hsa-mir-23b	42	7890	7848	2.16	2.26
hsa-mir-10a	13	12211	12198	3.36	3.45
						hsa-mir-92a-1	46	975	929	0.26	0.21
hsa-mir-32	12	3576	3564	0.98	1.05
						hsa-mir-99a	22	9877	9855	2.71	2.7
hsa-mir-122	17	16431	16414	4.52	4.3
						hsa-mir-125b-1	38	1234	1196	0.33	0.39
hsa-mir-192	51	5678	5627	1.55	1.59
						hsa-mir-324	34	557	523	0.14	0.19
hsa-mir-375	23	783	760	0.21	0.3
						hsa-mir-423	41	432	391	0.11	0.16
hsa-mir-342-3p	22	13353	13331	3.67	3.15
						hsa-mir-636	18	6331	6313	1.74	1.45

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110> 江苏省疾病预防控制中心

<120> 一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法

<160> 6

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 反转录引物（R）接头

<222> (1)…(36)

<400> 1

CTCAACTGGT GTCGTGGAGT CGGCAATTCA GTTGAG 36

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 正向引物（F）接头

<222> (1)…(14)

<400> 2

ACACTCCAGC TGGG 14

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 通用反向引物序列为（UR）

<222> (1)…(16)

<400> 3

TGGTGTCGTG GAGTCG 16

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 通用正向引物序列（UF）

<222> (1)…(14)

<400> 4

ACACTCCAGC TGGG 14

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 外源性人工合成的microRNA序列一

<222> (1)…(23)

<400> 5

CAGUCAGUCA GUCAGUCAGU CAG 23

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 外源性人工合成的microRNA序列二

<222> (1)…(21)

<400> 6

GACCUCCAUG UAAACGUACA A 21

Claims

1.一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备液相芯片，从Sanger MiRBase数据库中选取成熟的microRNA序列作为探针序列,在所述探针序列的5′端加上C12 分子臂和氨基修饰，并将修饰后的探针与不同编码的荧光微球偶联，得到特异性检测微球，即液相芯片；

步骤二、设计引物和探针，在所述成熟的microRNA序列后8位反向互补序列的5’端加上CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG组成反转录引物，剩余序列的5’端加上ACACTCCAGCTGGG组成正向引物；并设计通用正、反向引物，在通用反向引物5’端第1位及第5位T碱基以生物素标记，在通用正向引物的第3位和第5位碱基进行锁核酸修饰；所述通用反向引物序列为TGGTGTCGTGGAGTCG，所述通用正向引物序列为ACACTCCAGCTGGG；

步骤三、在待检测的RNA中加入外源性人工合成的2种microRNA ，加入量为每50 ng待测RNA各加5 fmol，所述外源性人工合成的2种microRNA序列为CAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCAG，GACCUCCAUGUAAACGUACAA；

步骤四、对待测样品RNA进行反转录反应，得到合成的cDNA；

步骤五、对所述cDNA进行预扩增反应，得到预扩增产物，预扩增反应所用引物为所述正向引物和所述通用反向引物；

步骤六、对所述预扩增产物进行不对称PCR扩增反应，得到待测样品的PCR扩增产物，不对称PCR扩增反应所用引物为所述通用正向引物和所述通用反向引物；

2.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤一中偶联的体积为25 μl，每1×10⁶个荧光微球对应的特异性检测探针加入量为0.04～0.1 nmol。

3.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤四中反转录反应体系为10X Reverse Transcription Buffer 2 μl, 25XdNTPs 0.8 μl, 50 U/μL 的MultiScribe™ Reverse Transcriptase 1 μl，RNAase抑制剂1 U，所述反转录引物5 nM，RNA 50 ng，补水至20 μl，反应条件为16°C 30 min, 60个循环的 20 °C 30 s, 42°C 30 s， 50°C 1 s，最后85°C， 5 min灭活反转录酶，得到合成的cDNA。

4.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤五中反应体系为Multiplex PCR master mix 12.5 μl，正向引物各50 nM，通用反向引物0.2 μM, 步骤四中合成的cDNA 2 μl，补充水至25 μl，反应条件为95 °C 15 min，18个循环的94 °C 15 s，60 °C 5 s，55 °C 15 s，72°C 15 s，最后72°C 2 min。

5.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤六中反应体系为Multiplex PCR master mix 10 μl，通用正向引物各0.1 μM，通用反向引物1 μM, 以水1：400稀释步骤五中的预扩增产物2 μl，补充水至20 μl，反应条件为95 °C 15 min，40个循环的94 °C 15 s，60 °C 1 min，最后72°C 2 min，94°C 3 min。

6.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤七中杂交反应体系是：33 μl的1.5×TMAC、液相芯片2.5～5 μl、待测样品的PCR扩增产物1～10 μl，空白孔以等量TE取代PCR产物，以TE补足反应体积至50 μl，52 ℃杂交10 min。

7.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤八中加入1×TMAC稀释后浓度为4 μg/ml的链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋的白反应，52℃杂交10 min。