CN102388149A

CN102388149A - 检测败血症的方法

Info

Publication number: CN102388149A
Application number: CN2010800143880A
Authority: CN
Inventors: 戴维·比拉诺瓦; 戴维·H·佩尔森; 奥利维耶·德尔富尔; 伯恩哈德·米绍
Original assignee: Cepheid
Current assignee: Cepheid
Priority date: 2009-02-02
Filing date: 2010-02-02
Publication date: 2012-03-21
Also published as: US9493832B2; AU2010207975A1; AU2010207975A2; AU2010207975B2; EP2391738B1; JP5890686B2; US20100227325A1; EP2391738A2; WO2010088668A2; EP2391738A4; JP2012516688A; WO2010088668A3; CA2751213A1

Abstract

提供了来自患者的样品中的败血症的方法。还提供了检测与败血症相关的一种或多种微RNA的表达的变化的方法。还提供了组合物和试剂盒。

Description

检测败血症的方法

本申请要求2009年2月2号提交的美国临时申请No.61/149,277号的优先权，为了任何目的，该临时申请通过引用整体并入本文。

1.背景

败血症是在血液或其他组织中存在与宿主的炎症反应组合的致病微生物或它们的毒素，被称为由感染引起的全身炎症反应综合征(“SIRS”)。免疫响应由一类被称为toll样受体(“TLR”)的蛋白介导，toll样受体识别广泛地由微生物共享但可与宿主分子区别的结构上保守的分子。

一旦微生物已经突破诸如皮肤或肠道的屏障，身体的TLR识别它们并刺激免疫响应。因此，除了由微生物感染本身引起的症状之外，败血症还以由宿主的免疫响应引起的急性炎症的症状为特征。这些后者的症状可以包括发烧和高的白细胞计数或低的白细胞计数和低的体温。SIRS以血液动力学损伤(hemodynamic compromise)和所产生的代谢失调为特征，并可能伴有诸如高的心率、高的呼吸速率和高的体温的症状。免疫响应还造成急性期蛋白的普遍活化，影响补体系统和凝固途径，这然后造成对脉管系统和器官的损伤。各种神经内分泌反调节系统然后也被活化，常常使该问题更复杂。

败血症常常在重症监护病房中用静脉注射液和抗生素和/或抗病毒化合物来治疗。然而，败血症发展迅速，且甚至用直接的和积极的治疗也是一样，重度败血症可以导致器官衰竭和死亡。在美国，估计重度败血症每年引起215,000人死亡，多于急性心肌梗死、中风或肺炎，这可能是由于败血症的诊断延误或误诊。

因此，对在检测败血症中的早期分子标记物存在需求。

2.概述

提供了用于检测受试者中败血症的存在的方法。在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的至少一种靶RNA的水平。在一些实施方案中，至少一种靶RNA(i)能够与具有选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交；或(ii)包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列；或(iii)包含选自SEQID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，方法包括比较样品中的至少一种靶RNA的水平与至少一种靶RNA的正常水平。在一些实施方案中，样品中的至少一种靶RNA的水平大于至少一种靶RNA的正常水平就表明受试者中存在败血症。

还提供了便于检测受试者中败血症的方法。在一些实施方案中，该方法包括检测来自受试者的样品中的至少一种靶RNA的水平。在一些实施方案中，至少一种靶RNA(i)能够与具有选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交；或(ii)包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列；或(iii)包含选自SEQID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，方法包括将检测的结果传送至医师以便确定受试者是否患有败血症。

在一些实施方案中，检测样品中的至少一种靶RNA的水平包括使样品的核酸与与样品中的靶RNA或其补体互补的至少一种多核苷酸杂交。在一些实施方案中，方法还包括检测包含与选自靶RNA、靶RNA的DNA扩增子和靶RNA的补体的至少一种核酸杂交的多核苷酸的至少一种复合物。

在一些实施方案中，用于检测受试者中败血症的存在的方法包括从受试者获得样品和给实验室提供所述样品以便检测样品中的至少一种靶RNA的水平。在一些实施方案中，至少一种靶RNA：(i)能够与具有选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交；或(ii)包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列；或(iii)包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，该方法包括从实验室接收指示样品中的至少一种靶RNA的水平的信息。在一些实施方案中，至少一种靶RNA的水平大于至少一种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。

在一些实施方案中，方法包括检测至少两种、至少三种、至少五种或至少十种靶RNA的水平。在一些实施方案中，检测到至少一种靶RNA的水平大于至少一种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。在一些实施方案中，检测到至少两种靶RNA的水平大于至少两种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。在一些实施方案中，检测到至少三种靶RNA的水平大于至少两种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。在一些实施方案中，检测到至少五种靶RNA的水平大于至少两种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。

在一些实施方案中，方法包括检测以下至少一种靶RNA的水平：(i)不与具有选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交；和(ii)不包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列；和(iii)不包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。

在一些实施方案中，提供了一种合成多核苷酸。在一些实施方案中，合成多核苷酸包括第一区，其中第一区包括与SEQ IDNO：1至67和215至399中的一个的至少8个连续核苷酸的序列相同或互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，第一区与靶RNA的区相同或互补。在一些实施方案中，合成多核苷酸包括与靶RNA的区不相同或不互补的第二区。在一些实施方案中，合成多核苷酸包括可检测标记。在一些实施方案中，合成多核苷酸包括FRET标记。

在一些实施方案中，提供了组合物。在一些实施方案中，组合物包含多种合成多核苷酸。在一些实施方案中，提供了试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括合成多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包括组合物。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种聚合酶和/或dNTP。

下面描述本发明的另外的实施方案和细节。

3.附图简述

图1示出在Agilent Bioanalyser 2100上获得的电泳图谱，以评估在用激动剂Pam3CSK4刺激8h之后，如实施例1中所描述的从人单核细胞系THP-1纯化的总RNA的品质。

4.详细描述

4.1.检测败血症

4.1.1.一般方法

提供了通过测量微RNA物种的水平来检测败血症的方法。在一些实施方案中，升高的微RNA物种水平表示败血症。在一些实施方案中，降低的微RNA物种水平表示败血症。在一些实施方案中，该方法包括检测能够与选自SEQ ID NO：1至86的序列特异性杂交的至少一种靶RNA的异常水平。在一些实施方案中，该方法包括检测包括选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸的至少一种靶RNA的异常水平。在一些实施方案中，该方法包括检测包括与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸互补的序列的至少一种靶RNA的异常水平。在一些实施方案中，以其成熟形式的靶RNA包括少于30种核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA是微RNA。

在本公开内容中，“选自......的序列”包括“选自......的一种序列”和“选自......的一种或多种序列”两者。因此，当使用“选自......的序列”时，应理解，可以选择所列出的序列中的一种或多于一种。

检测到靶RNA的水平大于靶RNA的正常水平就表明从其取样的患者中存在败血症。在一些实施方案中，定量地进行检测。在其他实施方案中，定性地进行检测。在一些实施方案中，检测靶RNA包括形成包含多核苷酸和选自靶RNA、靶RNA的DNA扩增子和靶RNA的补体的核酸的复合物。在一些实施方案中，然后检测复合物的水平并且将其与相同复合物的正常水平进行比较。在一些实施方案中，复合物的水平与样品中的靶RNA的水平相关。

“败血症”是伴随急性炎症反应(全身炎症反应综合征)和与炎症的内源性媒介物释放到血流中相关的全身表现的感染。如果不及时治疗，败血症可以变成重度败血症，重度败血症常常伴随至少一种器官的衰竭或败血性休克，这是伴随对初始液体复苏的响应性较差的器官灌注不足和低血压的重度败血症。全身炎症反应由toll样受体(“TLR”)介导。

“Toll样受体”或“TLR”是脊椎动物和无脊椎动物中一类识别微生物上的可与宿主分子区别且介导免疫细胞响应的特定的结构上保守的分子的蛋白。TLR位于细胞表面上或细胞区室中，且根据它们识别的和刺激它们的分子类型来分类，如表1所示的。

表1

刺激各种TLR导致一种或多种靶RNA的过度表达，如表2所示的。在一些实施方案中，由于刺激识别细菌的TLR的亚类(例如，TLR1、TLR2、TLR4或TLR5)，一种或多种靶RNA被过度表达。在一些实施方案中，由于刺激识别病毒的TLR的亚类(例如，TLR3或TLR7)，一种或多种靶RNA被过度表达。在一些实施方案中，由于刺激识别细菌和病毒两者所共有的分子的TLR的亚类(TLR9)，一种或多种靶RNA被过度表达。在一些实施方案中，由于刺激识别革兰氏阴性菌的TLR的亚类(例如，TLR4a和TLR4b)，一种或多种靶RNA被过度表达。在一些实施方案中，由于刺激识别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两者的TLR的亚类(例如，TLR2a、TLR2b和TLR5)，一种或多种靶RNA被过度表达。在一些实施方案中，由于刺激识别革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和分枝杆菌的TLR的亚类(例如，TLR2a)，一种或多种靶RNA被过度表达。

下面的表2列出已经发现与用各种toll样受体激动剂(配体)刺激的人单核细胞中的靶RNA互补或杂交的86种杂交探针。在受激的THP-1细胞中可以检测出高水平的这些靶RNA，如实施例1中说明的。这些探针中的六十七个与人细胞中被表达的新颖的靶RNA物种互补且杂交。其他十九个探针与已经由其他人提交到miRBase的公知的微RNA互补且杂交(http://microrna.sanger.ac.uk/；参见Griffiths-Jones S.等人(2007)Nucl.Acids Res.36：154-158)：hsa-miR-1227、hsa-miR-125b、hsa-miR-125b、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-155、hsa-miR-16、hsa-miR-195*、hsa-miR-214、hsa-miR-29b、hsa-miR-326、hsa-miR-371-3p、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-374b*、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-526a、hsa-miR-518d-5p、hsa-miR-524-5p、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-579、hsa-miR-885-3p和hsa-miR-99b)。然而，据发明人所知，这些已知的微RNA还没被公开具有用于检测败血症的效用。那些微RNA的序列在表4中示出。可以与表2中列出的某些探针杂交的某些候选微RNA在表11中示出。

下面的表12列出在败血症患者样品中以高水平存在的微RNA。表12中列出的一些微RNA对具有相同的序列。在这样的情况下，该微RNA序列的前体基因位于基因组中的多个位置，所以序列可以来自那些基因中的任一个。当特定的微RNA序列的前体基因存在于基因组中的多个位置时，示出具有相同的等级和相同的序列的多个候选名称(基于前体基因中的每一个)。可以在败血症患者样品中上调那些候选物中的一种或多种。表12中列出的微RNA中的一些是彼此的isomir。当在表12中列出多个isomir时，一种或多于一种以上isomir可以高水平存在于来自患有败血症的患者的样品中。

表14列出以高水平存在于败血症患者样品中的来自miRBase的微RNA。

表16列出以高水平存在于败血症患者样品中的微RNA星型。尽管所列出的星型的成熟微RNA已经被确定且被提交到miRBase，但据发明人所知，表16中的星型中没有一种先前已经被确定或被提交到miRBase。

在一些实施方案中，方法包括用单一探针检测多种isomir。检测到高水平的一种或多种isomir被认为指示败血症。当多个微RNA具有相同的序列但从不同的基因被表达时，在败血症患者中，所述基因中的一种或多种可以被上调。检测到从任一所述基因表达的微RNA被认为指示败血症。

本文为了参考的便利而不是作为限制，在本文所列的表和实施例1中，一些“靶RNA”物种被命名为“微RNA”。在一些实施方案中，靶RNA是能够与表2中所列的杂交探针特异性杂交的单一成熟微RNA。在一些实施方案中，靶RNA是包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列的单一成熟微RNA。在一些实施方案中，靶RNA是包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸的单一成熟微RNA。在一些实施方案中，靶RNA可以包括多种靶RNA，全部能够与单一互补的探针序列特异性杂交(例如，当两种或更多种靶微RNA是isomir时)。在一些实施方案中，如此命名的“微RNA”是能够与相应的杂交探针特异性杂交，使得一种或多种靶RNA不满足成熟微RNA的规范定义的一种或多种RNA物种。在一些实施方案中，靶RNA是mRNA。在一些实施方案中，“靶RNA”是piwi-相互作用的RNA(piRNA)，即，在动物细胞中表达的在尺寸上与微RNA不同(26-31nt)并与牵涉转录基因沉默的Piwi蛋白形成复合物的小型RNA。

成熟人微RNA通常主要由17-27个连续核糖核苷酸组成，且常常是21或22个核苷酸的长度。可以根据本公开内容检测的一些靶微RNA的序列可以在表3、表13、表15和表17中示出的pre-微RNA序列内找到(SEQ ID NO：87至177、400至564、708至862和898至932)。一些公知的微RNA的序列在表4和表14中示出。此外，在一些实施方案中，微RNA包括表11、表12或表16中的序列(SEQID NO：215至399和863至897)的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或至少26个连续核苷酸。

尽管不期望受理论束缚，但哺乳动物微RNA如本文所描述的成熟。编码微RNA的基因被转录，导致产生被称为“pri-微RNA”或“pri-miRNA”的微RNA前体。pri-miRNA可以是包括多个pri-miRNA的多顺反子RNA的一部分。在一些情形中，pri-miRNA形成具有茎和环的发夹，其可以包括错配碱基。pri-miRNA的发夹结构由Drosha识别，Drosha是RNase III核酸内切酶蛋白。Drosha可以识别pri-miRNA中的末端环并将约两个螺旋转角切割成茎以产生被称为“pre-微RNA”或“pre-miRNA”的60-70个核苷酸前体。Drosha可以用RNase III核酸内切酶所特有的交错切口切割pri-miRNA，产生具有5′磷酸盐和约2个核苷酸3′突出端的pre-miRNA茎环。延伸超出Drosha裂解位点的茎的约一个螺旋转角(约10个核苷酸)对有效的加工可以是必不可少的。随后通过Ran-GTP和输出受体Exportin-5将pre-miRNA主动地从核转运到细胞质。

pre-miRNA可以由另一个RNase III核酸内切酶Dicer识别。在一些情形中，Dicer识别pre-miRNA的双链茎。Dicer还可以识别在茎环的碱基处的5′磷酸盐和3′突出端。Dicer可以切割末端环，两个螺旋转角远离茎环的碱基，留下另外的5′磷酸盐和约2个核苷酸3′突出端。可能包括错配的所产生的siRNA样双链体包括成熟微RNA和被称为微RNA*的相似尺寸的片段。微RNA和微RNA*可以源自于pri-miRNA和pre-miRNA的相反的臂。成熟微RNA然后被装载到RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)，即核糖核蛋白复合物。在一些情况下，微RNA*还具有基因沉默或其他活性。

表4

在表2中，对所确定的TLR中的每一个的刺激测量的靶RNA的表达水平被表达为相对于来自健康供体的人单核细胞的总计RNA中测量的表达水平的表达倍数变化(参见实施例1)。

在一些实施方案中，可以测量从患者一次或多次收集的样品中的靶RNA以监控患者中败血症的状态或进展。

在一些实施方案中，待测试的临床样品从表现出全身炎症反应的一种或多种症状的个体获得，症状包括大于38℃或小于36℃的体温、大于90拍/分钟的心率、大于20次呼吸/分钟的呼吸速率(或小于32mm Hg的Paco2)和大于12,000个细胞/μL或小于4000个细胞/μL的白细胞计数或具有大于10％未成熟形式的含量。在一些实施方案中，待测试的临床样品从表现出上述症状中的两种或更多种的个体获得。在一些实施方案中，待测试的临床样品从处于接触败血症的风险中的无症状个体获得，例如是年老的、免疫功能下降的、病危的个体或是目前在医院中的患者或最近已经被允许从医院离开的患者的个体。

在一些实施方案中，本文描述的方法用于人细胞样品中的败血症的早期检测，例如通过常规血液测试获得的那些样品。在一些实施方案中，人细胞样品是人白细胞样品。在一些实施方案中，人细胞样品是人单核细胞样品。虽然为了简单起见，下面的论述是指人单核细胞样品，但技术人员应明白，可用在所公开方法中的人细胞样品可以包括表达TLR的任何人细胞。

因此，在一些实施方案中，本公开内容的方法可用于处于败血症的风险中的个体的常规筛查。在一些实施方案中，本文的方法用于(1)筛查年老的个体，(2)筛查免疫功能下降的个体，(3)筛查病危的个体或(4)筛查为在医院中的患者或最近已经被允许从医院离开的个体。在一些实施方案中，本文的方法用于筛查患有发烧的新生儿(小于90天大的)。

在一些实施方案中，本文描述的方法可以用于确定败血病个体中的潜在感染源以靶向治疗潜在的感染。在一些实施方案中，与TLR2a、TLR2b、TLR4a、TLR4b或TLR5的刺激相关的一种或多种靶RNA的表达水平的增加表明败血病个体中存在细菌感染。在一些实施方案中，与TLR4a或TLR4b的刺激相关的一种或多种靶RNA的表达水平的增加表明败血病个体中存在革兰氏阴性菌感染的感染。在一些实施方案中，与TLR2a、TLR2b或TLR5的刺激相关而不与伴随的TLR4a或TLR4b的刺激相关的一种或多种靶RNA的表达水平的增加表明败血病个体中存在革兰氏阳性菌感染。在一些实施方案中，与TLR2a的刺激相关而不与伴随的TLR4a或TLR4b的刺激相关的一种或多种靶RNA的表达水平的增加表明存在革兰氏阳性菌感染或分枝杆菌感染。在一些实施方案中，与TLR3或TLR7的刺激相关的一种或多种靶RNA的表达水平的增加表明存在病毒感染。在一些实施方案中，与TLR9的刺激相关的一种或多种靶RNA的表达水平的增加表明存在病毒感染和/或细菌感染。在一些实施方案中，以下靶RNA的表达水平的增加表明存在病毒感染和细菌感染两者：(i)与TLR2a、TLR2b、TLR4a、TLR4b或TLR5的刺激相关的一种或多种靶RNA；和(ii)与TLR3或TLR7的刺激相关的一种或多种靶RNA。

在一些实施方案中，本文描述的方法可以用于评估治疗患者中的败血症的效力。在一些实施方案中，确定在治疗期间的不同时间时的靶RNA表达水平，并将其与来自在表现出败血症的任何征兆之前或在开始治疗之前例如通过血试验从患者取样的档案样品的靶RNA表达水平进行比较。理论上，正常血样中的靶RNA表达水平不显示靶RNA表达水平的异常变化。因此，在这些实施方案中，患有败血症的个体的治疗的进展可以通过比较来自当他是健康的时或在开始治疗之前的相同个体的样品来评估。

在一些实施方案中，待测试的样品是体液，例如血、痰、粘液、唾液、尿、精液等。在一些实施方案中，待测试的样品是血样。在一些实施方案中，血样是全血、血浆、血清或血细胞。在一些实施方案中，血样被分离出单核细胞和/或淋巴细胞。可以通过任何方法从全血分离出单核细胞和/或淋巴细胞。在一些实施方案中，可以使用抗体将单核细胞从全血或全血的分馏的或分离的部分分离到例如单核细胞上的细胞表面受体(例如CD 14)。在一些这样的实施方案中，抗体与小珠(例如磁珠)偶联。

在一些实施方案中，待测试的临床样品是新近获得的。在其他实施方案中，样品是新鲜冷冻的试样。

在方法包括检测多于一种靶RNA的表达的实施方案中，可以在相同的测定反应中并行地或同时地检测多种靶RNA的表达水平。在一些实施方案中，在单独的测定反应中并行地或同时地检测表达水平。在一些实施方案中，在不同的时间例如在系列测定反应中检测表达水平。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的至少一种靶RNA的水平，其中检测到至少一种靶RNA的水平大于至少一种靶RNA的正常水平就表明受试者中存在败血症。在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样品中的至少一种靶RNA的水平和比较样品中的至少一种靶RNA的水平与至少一种靶RNA的正常水平，其中样品中的至少一种靶RNA的水平大于至少一种靶RNA的正常水平就表明受试者中存在败血症。

在一些实施方案中，提供了便于诊断受试者中的败血症的方法。这样的方法包括检测来自受试者的样品中的至少一种靶RNA的水平。在一些实施方案中，将关于来自受试者的样品中的至少一种靶RNA的水平的信息传送至医师。如本文所使用的，“医师(medicalpractitioner)”是指诊断和/或治疗患者的个体或实体，例如医院、诊疗所、医生办公室、医生、护士或任一上述实体和个体中的代理。在一些实施方案中，检测至少一种靶RNA的水平在已经从医师或医师代理接收受试者的样品的实验室中进行。实验室通过包括任何方法(本文描述的那些)来进行检测，且然后将结果传送至医师。当结果通过任何方法被提供至医师时，如本文所使用的，结果“被传送”。在一些实施方案中，这样的传送可以是口头的或书面的、可以用电话、亲自、通过电子邮件、通过邮政或其他信使，或可以通过直接地将信息存放入例如可由医师访问的数据库(包括不由医师控制的数据库)中来进行。在一些实施方案中，以电子形式保持信息。在一些实施方案中，信息可以被储存在存储器或其他计算机可读介质，例如RAM、ROM、EEPROM、闪速存储器、计算机芯片、数字视频盘(DVD)、光盘(CD)、硬盘驱动器(HDD)、磁带等。

在一些实施方案中，提供了检测败血症的存在的方法。在一些实施方案中，提供了诊断败血症的方法。在一些实施方案中，该方法包括从受试者获得样品和给实验室提供样品以便检测样品中的至少一种靶RNA水平。在一些实施方案中，该方法还包括从实验室接收表明样品中至少一种靶RNA水平的信息。在一些实施方案中，如果样品中至少一种靶RNA的水平大于至少一种靶RNA的正常水平就存在败血症。如本文所使用的，“实验室”是通过包括本文描述的方法的任何方法检测样品中至少一种靶RNA的水平，并将该水平传送至医师的任何设施。在一些实施方案中，实验室在医师的控制下。在一些实施方案中，实验室不在医师的控制下。

在一些实施方案中，当实验室将至少一种靶RNA的水平传送至医师时，实验室传送表示样品中至少一种靶RNA的水平的数值，提供或没有提供正常水平的数值。在一些实施方案中，实验室通过提供定性值例如“高的”、“升高的”等来传送至少一种靶RNA的水平。

如本文所使用的，当方法涉及检测败血症、确定败血症的存在和/或诊断败血症时，该方法包括进行方法步骤的行为，但对于败血症的存在而言，结果是阴性的。即，检测、确定和诊断败血症包括进行产生阳性或阴性结果的方法的实例(例如，无论靶RNA水平是正常的还是大于正常的)。

如本文所使用的，术语“受试者”意指人。在一些实施方案中，本文描述的方法可以用在来自非人动物的样品上。

基因组中彼此物理邻近的靶RNA的共同的或协调的表达允许在本文的方法中有益地使用这样的染色体邻近的靶RNA。

表3确定能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交的86种靶RNA中的每一种的染色体位置。表13确定能够与包含选自表12中的SEQ ID NO：226至399的序列的核酸特异性杂交的靶RNA的染色体位置。表15确定能够与包含选自表14中的SEQ ID NO：565至707的序列的核酸特异性杂交的靶RNA的染色体位置。表17确定能够与包含选自表16中的SEQ ID NO：863至897的序列的核酸特异性杂交的靶RNA的染色体位置。因此，在一些实施方案中，在本文描述的方法中，代替相应的制成表的靶RNA的表达的测量或除了该测量之外还检测位于表2和表14中的染色体位置的在约1千碱基对(kb)内、在约2kb内、在约5kb内、在约10kb内、在约20kb内、在约30kb内、在约40kb内和甚至在约50kb内的一种或多种靶RNA的表达水平。参见Baskerville，S.和BartelD.P.(2005)RNA 11：241-247。

在一些实施方案中，组合检测能够与包含选自SEQ ID NO：1至67的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA和/或检测包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸的一种或多种靶RNA和/或检测包含与选自SEQ IDNO：1至67的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列的一种或多种靶RNA，本文的方法还包括检测来自人miRNome的至少一种微RNA的表达水平。

在一些实施方案中，至少一种靶RNA能够与包含选自SEQ IDNO：1至86的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，至少一种靶RNA包括与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少一部分互补的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，至少一种靶RNA包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，以其成熟形式的靶RNA包括少于30个核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA是微RNA。

在一些实施方案中，在单一反应中同时检测多于一种靶RNA。在一些实施方案中，在单一反应中同时检测至少2种、至少3种、至少5种或至少10种靶RNA。在一些实施方案中，在单一反应中同时地检测所有的靶RNA。

在一些实施方案中，样品中能够与包含选自表2中的SEQ IDNO：1至86的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明已经从其中采集血液或组织样品的个体中存在败血症。在一些实施方案中，样品中包含与选自表2中的SEQ ID NO：1至86的序列的至少一部分互补的至少15个连续核苷酸的一种或多种靶RNA的表达的增加表明已经从其中采集血液或组织样品的个体中存在败血症。在一些实施方案中，样品中包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸的一种或多种靶RNA的表达的增加表明已经从其中采集血液或组织样品的个体中存在败血症。

在一些实施方案中，能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、35、36、37、41、42、43、44、53、54、55、60、61、63、65、66、68、71、77、80、81、82、83或85的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明存在由病毒感染引起的败血症。

在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84或86的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明存在由细菌感染引起的败血症。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：6、11、13、15、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、56、58、69、71、73、76、84或86的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明存在由革兰氏阴性菌的感染引起的败血症。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：23、30、39、52、57、60、65、67或79的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明存在由革兰氏阳性菌的感染引起的败血症。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74或78的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明存在由革兰氏阳性菌或分枝杆菌的感染引起的败血症。

在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：9、50、51、70、72或75的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明存在由细菌感染和/或病毒感染引起的未甲基化的CpG核酸。

在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、35、36、37、41、42、43、44、53、54、55、60、61、63、65、66、68、71、77、80、81、82、83或85的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明识别病毒衍生的分子的toll样受体的刺激。在一些实施方案中，这些toll样受体选自TLR3和TLR7。

在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84或86的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明识别细菌衍生的分子的toll样受体的刺激。在一些实施方案中，这些toll样受体选自TLR2a、TLR2b、TLR4a、TLR4b和TLR5。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQID NO：6、11、13、15、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、56、58、69、71、73、76、84或86的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明识别源自革兰氏阴性菌的分子的toll样受体的刺激。在一些实施方案中，这些toll样受体选自TLR2a、TLR2b、TLR4a、TLR4b和TLR5。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ IDNO：23、30、39、52、57、60、65、67或79的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明识别源自革兰氏阳性菌的分子的toll样受体的刺激。在一些实施方案中，这些toll样受体选自TLR2a、TLR2b和TLR5。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74或78的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明识别源自革兰氏阳性菌或分枝杆菌的分子的toll样受体例如TLR2a的刺激。

在一些实施方案中，人单核细胞的样品中能够与包含选自表2中的SEQ ID NO：9、50、51、70、72或75的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA的表达的增加表明TLR9的刺激，TLR9识别由细菌感染和/或病毒感染引起的未甲基化的CpG核酸。

在一些实施方案中，人单核细胞的样品中包括选自SEQ ID NO：226至289、565至604和863至868的序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸的一种或多种靶RNA的表达的增加表明败血症。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中包括选自SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644和648的序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸的一种或多种靶RNA的表达的增加表明败血症。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中包括选自SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629和632的序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸的一种或多种靶RNA的表达的增加表明败血症。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中包括选自SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342和352的序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸的一种或多种靶RNA的表达的增加表明败血症。在一些实施方案中，人单核细胞的样品中包括选自SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266和287的序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸的一种或多种靶RNA的表达的增加表明败血症。

4.1.2.示例性的对照

在一些实施方案中，每一种靶RNA的正常水平(“对照”)可以被确定为具有正常人单核细胞或其他参考物质的特征的平均水平或范围，可以将在样品中测量的水平与该平均水平或范围进行比较。正常受试者中的所确定的靶RNA的平均值或范围可以用作用于检测表明败血症的正常水平以上或正常水平以下的靶RNA的基准。在一些实施方案中，靶RNA的正常水平可以使用来自一个或多个个体的含单个或集中的RNA的样品来确定，例如来自健康的个体或来自患有与被诊断为患有败血症综合征的那些相似的临床严重性的疾病(例如，具有匹配的ICU临床的(APACHE II)评分)但没有诊断为败血症综合征的重症监护患者。

在一些实施方案中，确定靶RNA的表达的正常水平包括检测包含与选自靶RNA、靶RNA的DNA扩增子和靶RNA的补体的核酸杂交的探针的复合物。即，在一些实施方案中，表达的正常水平可以通过检测靶RNA的DNA扩增子或靶RNA的补体而不是靶RNA本身来确定。在一些实施方案中，这样的复合物的正常水平被确定并被用作对照。在一些实施方案中，复合物的正常水平与靶RNA的正常水平相互关联。因此，当在本文讨论靶的正常水平时，在一些实施方案中，该水平可以通过检测这样的复合物来确定。

在一些实施方案中，对照包含来自单一个体的细胞的RNA，个体例如健康的个体或患有与被测试败血症的患者相似的临床严重性的疾病(例如，具有匹配的ICU临床的(APACHE II)评分)但没有诊断为败血症综合征的重症监护患者。在一些实施方案中，对照包含来自多个个体的细胞池的RNA。在一些实施方案中，对照包含商购可得到的人RNA，例如，诸如来自CD 14+细胞的总RNA。在一些实施方案中，在测试样品以确定是否处于升高的水平之前，已经预先确定正常水平或正常范围。

在一些实施方案中，靶RNA的正常水平可以从一种或多种连续的细胞系，通常先前被表明具有接近正常人单核细胞中的表达水平的至少一种靶RNA的表达水平的细胞系来确定。

在一些实施方案中，方法包括检测至少一种靶RNA的表达的水平。在一些实施方案中，方法还包括比较至少一种靶RNA的表达的水平与至少一种靶RNA的表达的正常水平。在一些实施方案中，方法还包括比较至少一种靶RNA的表达的水平与至少一种靶RNA的表达的对照水平。在一些实施方案中，至少一种靶RNA的表达的对照水平是正常细胞中的至少一种靶RNA的表达的水平。在一些这样的实施方案中，对照水平可以被称为正常水平。在一些实施方案中，与正常细胞中的至少一种靶RNA的表达的水平相比，至少一种靶RNA的表达的水平更高就表明败血症。在一些实施方案中，与正常细胞中的至少一种靶RNA的表达的水平相比，至少一种靶RNA的表达的水平下降就表明败血症。

在一些实施方案中，将至少一种靶RNA的表达的水平与例如来自患有已确认的败血症综合征病例的患者的表达的参考水平进行比较。在一些这样的实施方案中，至少一种靶RNA的表达的水平与参考样品相似就表明败血症。

在一些实施方案中，至少一种靶RNA的表达的水平比相应的至少一种靶RNA的表达的正常水平大至少约两倍就表明存在败血症。在一些实施方案中，至少一种靶RNA的表达的水平比包括正常细胞的对照样品中的相应的至少一种靶RNA的水平大至少约两倍就表明存在败血症。在各种实施方案中，至少一种靶RNA的表达的水平比包括正常细胞的对照样品中的相应的至少一种靶RNA的表达的水平大至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍就表明存在败血症。在各种实施方案中，至少一种靶RNA的表达的水平比至少一种靶RNA的表达的正常水平大至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍就表明存在败血症。

在一些实施方案中，相对于相应的至少一种靶RNA的表达的正常水平，至少一种靶RNA的表达的水平减少至少约两倍就表明存在败血症。在一些实施方案中，相比于包括正常细胞的对照样品中的相应的至少一种靶RNA的水平，至少一种靶RNA的表达的水平减少至少约两倍就表明存在败血症。在各种实施方案中，相比于包括正常细胞的对照样品中的相应的至少一种靶RNA的表达的水平，至少一种靶RNA的表达的水平减少至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍就表明存在败血症。在各种实施方案中，相比于至少一种靶RNA的表达的正常水平，至少一种靶RNA的表达的水平减少至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍就表明存在败血症。

在一些实施方案中，靶RNA的表达的对照水平与样品中的靶RNA的表达的水平同时地，例如在相同的测定或测定批次中被确定。在一些实施方案中，靶RNA的表达的对照水平与样品中的靶RNA的表达的水平不是同时被确定的。在一些这样的实施方案中，先前已经确定表达的对照水平。

在一些实施方案中，例如，当已知靶RNA在正常细胞中以非常低的水平被表达或根本不被表达时，不将靶RNA的表达的水平与表达的对照水平进行比较。在这样的实施方案中，检测到样品中高的靶RNA水平就表明败血症。

4.1.3.制备RNA的示例性方法

靶RNA可以通过任何适当的方法来制备。总RNA可以通过任何方法分离，包括但不限于Wilkinson，M.(1988)Nucl.AcidsRes.16(22)：10，933；和Wilkinson，M.(1988)Nucl.Acids Res.16(22)：10934中所列的方案；或通过使用商购可得到的试剂盒或试剂分离，例如

试剂(Invitrogen^TM)、总RNA萃取试剂盒(iNtRONBiotechnology)、总RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek Corp.)、RNAqueous^TM(Ambion)、MagMAX^TM(Ambion)、RecoverAll^TM(Ambion)、RNeasy(Qiagen)等。

在一些实施方案中，小RNA被分离或富集。在一些实施方案中，“小RNA”是指长度小于约200个核苷酸(nt)的RNA分子。在一些实施方案中，“小RNA”是指小于约100nt、小于约90nt、小于约80nt、小于约70nt、小于约60nt、小于约50nt或小于约40nt的RNA分子。

小RNA的富集可以通过方法来完成。这样的方法包括但不限于，包括有机萃取，随后使用特异性结合和洗涤溶液将核酸分子吸附在玻璃纤维过滤器上的方法；和使用自旋柱纯化的方法。小RNA的富集可以使用商购可得到的试剂盒来完成，例如mirVana^TM分离试剂盒(Applied Biosystems)、mirPremier^TM微RNA分离试剂盒(Sigma-Aldrich)、PureLink^TM miRNA分离试剂盒(Invitrogen)、miRCURY^TM RNA分离试剂盒(Exiqon)、微RNA纯化试剂盒(NorgenBiotek Corp.)、miRNeasy试剂盒(Qiagen)等。在一些实施方案中，纯化可以通过

(Invitrogen)方法来完成，该方法采用向其中添加氯仿的苯酚/异硫氰酸盐溶液以分离含RNA的水相。随后通过用异丙醇沉淀来从水相回收小RNA。在一些实施方案中，小RNA可以使用色谱方法来纯化，例如使用可从Applied Biosystems得到的flashPAGE^TM Fractionator的凝胶电泳。

在一些实施方案中，将小RNA从其他RNA分子分离出以富集靶RNA，使得小RNA部分(例如，包含长度为200个核苷酸或更少，例如长度小于100个核苷酸，例如长度小于50个核苷酸，例如长度为约10个到约40个核苷酸的RNA分子)是基本上纯的，意味着相对于更大的RNA分子，该小RNA部分是至少约80％、85％、90％、95％纯的或更纯的，但小于100％纯的。可选择地，小RNA的富集可以用倍数富集的方式来表达。在一些实施方案中，相对于RNA分离物的较大RNA或样品中的总RNA的浓度，小RNA被富集约、至少约或至多约5X、10X、20X、30X、40X、50X、60X、70X、80X、90X、100X、110X、120X、130X、140X、150X、160X、170X、180X、190X、200X、210X、220X、230X、240X、250X、260X、270X、280X、290X、300X、310X、320X、330X、340X、350X、360X、370X、380X、390X、400X、410X、420X、430X、440X、450X、460X、470X、480X、490X、500X、600X、700X、800X、900X、1000X、1100X、1200X、1300X、1400X、1500X、1600X、1700X、1800X、1900X，2000X、3000X、4000X、5000X、6000X、7000X、8000X、9000X、10,000X或更多倍，或可从其中导出的任何范围。

在另外其他实施方案中，在RNA未被首先从细胞纯化的样品中测量表达。

在一些实施方案中，在检测靶RNA之前，对RNA进行修饰。在一些实施方案中，修饰的RNA为总RNA。在其他实施方案中，修饰的RNA为已经从总RNA或从细胞溶解产物中纯化的小RNA，例如长度小于200个核苷酸，例如长度小于100个核苷酸，例如长度小于50个核苷酸，例如长度为约10个到约40个核苷酸的RNA。可以在本文描述的方法中使用的RNA修饰包括但不限于，可以用化学方法或酶促方法完成的添加poly-dA或poly-dT尾部，和/或添加小分子，例如生物素。

在一些实施方案中，一种或多种靶RNA被逆转录。在一些实施方案中，当存在时，当RNA被逆转录时，例如当在逆转录期间poly-dA或poly-dT尾被添加到cDNA时，对RNA进行修饰。在其他实施方案中，在RNA被逆转录之前，对RNA进行修饰。在一些实施方案中，总RNA被逆转录。在其他实施方案中，在RNA被逆转录之前，分离或富集小RNA。

当靶RNA被逆转录时，形成靶RNA的补体。在一些实施方案中，检测靶RNA的补体而不是靶RNA本身(或其DNA拷贝)。因此，当本文所讨论的方法表明检测靶RNA或确定靶RNA的水平时，这样的检测或确定可以代替靶RNA本身或除了靶RNA本身之外在靶RNA的补体上进行。在一些实施方案中，当检测靶RNA的补体而不是靶RNA时，使用与靶RNA的补体互补的探针。在这样的实施方案中，探针包括序列与靶RNA相同的至少一部分，虽然其可以包含胸腺嘧啶脱氧核苷来代替尿嘧啶核苷，和/或包括其他修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，检测一种或多种靶RNA的方法包括扩增与所述靶RNA互补的cDNA。这样的扩增可以通过任何方法来完成。示例性的方法包括但不限于，实时PCR、端点PCR和使用T7聚合酶从退火至cDNA的T7启动子扩增，例如通过在Implen，德国可得到的SenseAmp Plus^TM试剂盒提供的。

在一些实施方案中，当靶RNA或与靶RNA互补的cDNA被扩增时，形成靶RNA的DNA扩增子。DNA扩增子可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，当DNA扩增子是单链的时，DNA扩增子的序列与顺义或反义定向的靶RNA有关。在一些实施方案中，检测靶RNA的DNA扩增子而不是靶RNA本身。因此，当本文所讨论的方法表明检测靶RNA或确定靶RNA的水平时，这样的检测或确定可以代替靶RNA本身或除了靶RNA本身之外在靶RNA的DNA扩增子上进行。在一些实施方案中，当检测靶RNA的DNA扩增子而不是靶RNA时，使用与靶RNA的补体互补的探针。在一些实施方案中，当检测靶RNA的DNA扩增子而不是靶RNA时，使用与靶RNA互补的探针。此外，在一些实施方案中，可以使用多种探针，且一些探针可以与靶RNA互补而一些探针可以与靶RNA的补体互补。

在一些实施方案中，检测一种或多种靶RNA的方法包括如下文所描述的RT-PCR。在一些实施方案中，检测一种或多种靶RNA包括实时监控RT-PCR反应，这可以通过任何方法来完成。这样的方法包括但不限于，使用

分子信标或蝎型探针(即，FRET探针)和使用嵌入染料，例如SYBR green、EvaGreen、噻唑橙、YO-PRO、TO-PRO等。

4.1.4.示例性的分析方法

如上所描述的，提供了用于在来自患者的样品中检测败血症的方法。在一些实施方案中，该方法包括检测能够与包含选自表2中所列的SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交的至少一种靶RNA的表达的水平，样品中的至少一种靶RNA的表达的水平大于对照样品中的至少一种靶RNA的表达的正常水平，对照样品例如来自未被诊断为患有败血症综合征的患者的样品，或正常人单核细胞的样品。在一些实施方案中，方法包括检测包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列的一种或多种靶RNA的水平，样品中的一种或多种靶RNA的水平大于对照样品中的至少一种靶RNA的表达的正常水平。在一些实施方案中，方法包括检测包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸的一种或多种靶RNA的水平，样品中的一种或多种靶RNA的水平大于对照样品中的至少一种靶RNA的表达的正常水平。在一些实施方案中，以其成熟形式的靶RNA包括少于30个核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA是微RNA。

在一些实施方案中，例如上文所描述的那些，该方法还包括检测不与包含选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交且不包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸的人miRNome的至少一种靶RNA的表达的水平，样品中的至少一种靶RNA的表达水平大于对照样品中的至少一种靶RNA的表达的正常水平。如本文所使用的，术语“人miRNome”是指人细胞中的所有的微RNA基因和由其产生的成熟微RNA。

能够允许特异的和可定量的(或可半定量的)检测所期望的至少一种靶RNA的任何分析程序可以用在本文提供的方法中。这样的分析程序包括但不限于，实施例1中所列的微阵列方法、实施例2中所列的微珠方法和本领域技术人员已知的方法。

在一些实施方案中，检测靶RNA包括形成复合物，该复合物包含与靶RNA或与其补体互补的多核苷酸，和选自靶RNA、靶RNA的DNA扩增子和靶RNA的补体的核酸。因此，在一些实施方案中，多核苷酸与靶RNA形成复合物。在一些实施方案中，多核苷酸与靶RNA的补体形成复合物，靶RNA的补体例如已经从靶RNA逆转录的cDNA。在一些实施方案中，多核苷酸与靶RNA的DNA扩增子形成复合物。当双链的DNA扩增子是复合物的一部分时，如本文所使用的，复合物可以包含DNA扩增子中的一条链或两条链。因此，在一些实施方案中，复合物仅包含DNA扩增子的一条链。在一些实施方案中，复合物是三重的并包括多核苷酸和DNA扩增子中的两条链。在一些实施方案中，通过在多核苷酸与靶RNA、靶RNA的补体或靶RNA的DNA扩增子之间杂交形成复合物。在一些实施方案中，多核苷酸是引物或探针。

在一些实施方案中，方法包括检测复合物。在一些实施方案中，在检测的时候，复合物并不必须是缔合的。即，在一些实施方案中，形成复合物，然后以一些方式离解或破坏复合物，以及检测来自复合物的组分。这样的系统的实例是

测定。在一些实施方案中，当多核苷酸是引物时，检测复合物可以包括扩增靶RNA、靶RNA的补体或靶RNA的DNA扩增子。

在一些实施方案中，用于检测本文所述的方法中的至少一种靶RNA的分析方法包括实时定量RT-PCR。参见Chen，C.等人(2005)Nucl.Acids Res.33：e 179和PCT公布No.WO 2007/117256，它们通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，用于检测至少一种靶RNA的分析方法包括在美国公布No.US2009/0123912A1中所描述的方法，该美国公布通过引用以其整体并入本文。在该公布中描述的一种示例性的方法中，延伸引物包括第一部分和第二部分，其中第一部分选择性地与特定的微RNA的3′端部杂交，且第二部分包含通用引物的序列，该延伸引物用于逆转录微RNA以制备cDNA。通用引物以及选择性地与微RNA的5′端部杂交的反向引物然后用于以定量的PCR反应扩增cDNA。

在一些实施方案中，用于检测至少一种靶RNA的分析方法包括使用

探针。在一些实施方案中，用于检测至少一种靶RNA的分析方法包括

测定，例如由Applied Biosystems，Inc销售的

微RNA Assays。在一种示例性的

测定中，从样品分离出总RNA。在一些实施方案中，测定可以用于分析约10ng的总RNA输入样品，例如约9ng的输入样品，例如约8ng的输入样品，例如约7ng的输入样品，例如约6ng的输入样品，例如约5ng的输入样品，例如约4ng的输入样品，例如约3ng的输入样品，例如约2ng的输入样品，和甚至少至约1ng的包含微RNA的输入样品。

测定使用与靶RNA的3′-端部特异性互补的茎-环引物。在一个示例性的

测定中，使茎-环引物与靶RNA杂交，随后逆转录靶RNA模板，导致引物的3′端部的延伸。逆转录的结果是在扩增子的5′端部具有茎-环引物序列和在3′端部具有靶RNA的cDNA的嵌合(DNA)扩增子。靶RNA的定量通过使用通用反向引物的实时RT-PCR来实现，所述通用反向引物具有与在所有的茎-环靶RNA引物、靶RNA特异性正向引物和靶RNA序列特异性

探针的5′端部处的序列互补的序列。

该测定使用荧光共振能量转移(“FRET”)来检测和定量所合成的PCR产物。通常，

探针包括耦合于5′-端部的荧光染料分子和耦合于3′-端部的猝灭剂分子，使得染料和猝灭剂非常接近，允许猝灭剂经由FRET抑制染料的荧光信号。当聚合酶复制结合

探针的嵌合扩增子模板时，聚合酶的5′-核酸酶切割探针，使染料和猝灭剂去耦，使得废除FRET并产生荧光信号。荧光随与被切割的探针的量成比例的每一个RT-PCR循环而增加。

用于RNA检测和/或定量的另外的示例性的方法被描述在例如美国公布No.US 2007/0077570(Lao等人)、PCT公布No.WO2007/025281(Tan等人)、美国公布No.US2007/0054287(Bloch)、PCT公布No.WO2006/0130761(Bloch)和PCT公布No.WO 2007/011903(Lao等人)，为了任何目的，它们通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，实时RT-PCR测定的结果的定量通过由已知浓度的核酸构建标准曲线和然后外插未知浓度的靶RNA的定量信息来进行。在一些实施方案中，用于产生标准曲线的核酸是已知浓度的RNA(例如，微RNA)。在一些实施方案中，用于产生标准曲线的核酸是纯化的双链质粒DNA或体外生成的单链DNA。

在一些实施方案中，当靶核酸和内源性参照的扩增效率是近似相等的时，定量通过比较Ct(循环阈值，例如，荧光信号上升到背景以上所需要的PCR循环的数量)方法来完成。Ct值与样品中核酸靶的量成反比。在一些实施方案中，可以将感兴趣的靶RNA的Ct值与对照或校准(calibrator)例如来自正常组织的RNA(例如，微RNA)比较。在一些实施方案中，校准和感兴趣的靶RNA样品的Ct值被标准化为适当的内源性的管家基因。

除了

测定之外，可用于检测和定量本文所示的方法中的PCR产物的其他实时RT-PCR化学包括但不限于，分子信标、蝎型探针和嵌入染料，例如SYBR Green、EvaGreen、噻唑橙、YO-PRO、TO-PRO等，它们在下文被讨论。

在一些实施方案中，特异性执行实时RT-PCR检测以检测和量化单一靶RNA的表达。在一些实施方案中，靶RNA选自能够与包含选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交的靶RNA。在一些实施方案中，靶RNA与包含选自SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84和86的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA与包含选自SEQ ID NO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78和79的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中、靶RNA与包含选自SEQ ID NO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69和84的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA与包含选自SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74和78的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA与包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83和85的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA与包含选自SEQ ID NO：9、50、51、70、72和75的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA包含选自以下SEQ ID NO的序列的至少15个连续核苷酸：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644和648。在一些实施方案中，靶RNA包含选自SEQ ID NO：226至289、565至604或863至868的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA包含与选自SEQ IDNO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。在一些实施方案中，以其成熟形式的靶RNA包括少于30个核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA是微RNA。

在各种实施方案中，实时RT-PCR检测用于在单一多重反应中检测至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种靶RNA。在一些实施方案中，至少一种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，至少一种靶RNA包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，至少一种靶RNA包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。在一些实施方案中，以其成熟形式的靶RNA包括少于30个核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA是微RNA。

在一些实施方案中，该方法包括检测至少2种、至少3种、至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种或至少40种靶RNA的多重RT-PCR反应中的表达，其中每种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84和86的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，该方法包括使用单一多重RT-PCR反应检测大于正常表达的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种或至少15种靶RNA，其中每种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78和79的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，该方法包括使用单一多重RT-PCR反应检测大于正常表达的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少12种或至少15种靶RNA，其中每种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69和84的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，该方法包括检测至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种靶RNA的多重RT-PCR反应中的表达，其中每种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74和78的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，该方法包括检测至少2种、至少3种、至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少30种靶RNA的多重RT-PCR反应中的表达，其中每种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83和85的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，该方法包括检测至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种靶RNA的多重RT-PCR反应中的表达，其中每种靶RNA能够与包含选自SEQID NO：9、50、51、70、72和75的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，该方法包括检测至少2种、至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少30种靶RNA的多重RT-PCR反应中的表达，其中每种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644和648的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，该方法包括检测至少2种、至少5种、至少10种、至少15种或至少20种靶RNA的多重RT-PCR反应中的表达，其中每种靶RNA能够与包含选自SEQ IDNO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629和632的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，该方法包括检测至少2种、至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种或至少70种靶RNA的多重RT-PCR反应中的表达，其中每种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：226至289、565至604和863至868的序列的核酸特异性杂交。

在一些多重实施方案中，使用多种探针，例如

探针，每一种对不同的RNA靶是特异性的。在一些实施方案中，每一种靶RNA特异性探针可用光谱方法与在相同的多重反应中使用的其他探针区别开。

在一些实施方案中，实时RT PCR产物的定量使用与双链的DNA产物结合的染料来完成，染料例如SYBR Green、EvaGreen、噻唑橙、YO-PRO、TO-PRO等。在一些实施方案中，测定是来自Qiagen的QuantiTect SYBR Green PCR测定。在该测定中，首先从样品中分离出总RNA。总RNA随后在3′-端部被聚腺苷酸化并使用在5′-端部具有poly-dT的通用引物来逆转录。在一些实施方案中，单一逆转录反应足以测定多种靶RNA。实时RT-PCR然后使用靶RNA特异性引物和miScript通用引物来完成，miScript通用引物包含在5′-端部的poly-dT序列。SYBR Green染料非特异性结合到双链的DNA并且一旦激励就发射光。在一些实施方案中，促进引物高度特异地退火至PCR模板(例如，可在来自Qiagen的QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒中得到)的缓冲条件可以用于避免形成非特异性的DNA双链体和引物二聚体，其将结合SYBR Green且消极地影响定量。因此，当PCR产物累积时，来自SYBR Green的信号增加，允许具体产物的定量。

实时RT-PCR使用本领域可得到的任何RT-PCR仪器来执行。通常，实时RT-PCR数据收集和分析中使用的仪器包括热循环仪、荧光激发和发射收集的光学器件和任选的计算机以及数据采集和分析软件。

在一些实施方案中，在本文描述的方法中使用的分析方法是

(cDNA介导的退火、选择、延伸和连接)测定，例如可从Illumina，Inc.得到的MicroRNA Expression Profiling Assay(参见http://www.illumina.com/downloads/MicroRNAAssayWorkflow.pdf)。在一些实施方案中，通过任何方法从待分析的样品分离出总RNA。另外，在一些实施方案中，通过任何方法从待分析的样品分离出小RNA。总RNA或所分离的小RNA然后可以被聚腺苷酸化(＞18A残基被添加到反应混合物中的RNA的3′端部)。使用生物素-标记的DNA引物逆转录RNA，生物素-标记的DNA引物包括从5′端部到3′端部的包括PCR引物部位的序列和结合到样品RNA的poly-dA尾的poly-dT区。所得到的生物素化的cDNA转录物然后经由生物素-抗生蛋白链菌素相互作用与载体杂交，并与一种或多种靶RNA特异性多核苷酸接触。靶RNA特异性多核苷酸包括从5′-端部到3′-端部的包含PCR引物部位的区、包含地址序列的区和靶RNA特异性序列。

在一些实施方案中，靶RNA特异性序列包括具有同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA特异性序列包括与人miRNome的微RNA的至少一部分互补的探针序列。

在杂交之后，靶RNA特异性多核苷酸被延伸，且然后从固定的cDNA阵列洗脱出延伸的产物。使用荧光标记的通用引物的第二PCR反应产生包含靶RNA特异性序列的荧光标记的DNA。然后将标记的PCR产物与微珠阵列杂交，以用于检测和定量。

在一些实施方案中，用于检测和定量本文描述的方法中的至少一种靶RNA的表达的分析方法是基于珠的流式细胞测定。参见Lu J.等人(2005)Nature 435：834-838，其通过引用以其整体并入本文。基于珠的流式细胞测定的实例是Luminex，Inc.的

技术(参见http；//www.luminexcorp.com/technology/index.html)。在一些实施方案中，从样品分离出总RNA且然后用生物素来标记。然后使标记的RNA与共价地结合到微珠的靶RNA特异性捕获探针(例如，由Luminex，Inc.销售的FlexmiR^TM产品，在http://www.luminexcorp.com/products/assays/index.html)杂交，每一种微珠用具有不同荧光强度的2种染料来标记。使抗生蛋白链菌素结合的报道分子(例如，抗生蛋白链菌素-藻红蛋白，还被称为“SAPE”)连接到所捕获的靶RNA，并使用流式细胞仪来读取每个珠的独特信号。在一些实施方案中，RNA样品(总RNA或富集的小RNA)首先被聚腺苷酸化，且随后使用与样品RNA的poly-dA尾的3′-端部互补且与连接到生物素化的树状聚体的多核苷酸的5′-端部互补的桥接多核苷酸，用生物素化的3DNATM聚体(即，带有结合到其的许多生物素分子的多臂DNA)标记，例如由Marligen Biosciences作为Vantage^TMmicroRNA Labeling试剂盒销售的那些。然后在通过流式细胞仪分析之前，将抗生蛋白链菌素结合的报道分子连接到生物素化的树状聚体。参见http://www.marligen.com/vantage-microRNA-labeling-kit.html。在一些实施方案中，生物素-标记的RNA首先被暴露于SAPE，且RNA/SAPE复合物随后被暴露于连接到DNA树状聚体的抗藻红蛋白抗体，DNA树状聚体可以被结合到多至900个生物素分子。这允许多个SAPE分子通过生物素-抗生蛋白链菌素相互作用结合到生物素化的树状聚体，因此增加了来自测定的信号。

在一些实施方案中，用于检测和定量本文描述的方法中的至少一种靶RNA的表达的分析方法是通过凝胶电泳和用标记的探针(例如，用放射性标记或化学发光标记标记的探针)检测，例如通过RNA印迹法。在一些实施方案中，从样品分离出总RNA，且然后通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来按尺寸分离总RNA。然后将分离的RNA印迹到膜上并与放射性同位素标记的互补的探针杂交。在一些实施方案中，示例性的探针包含如下文所讨论的一种或多种亲和力-增强的核苷酸类似物，例如锁核酸(“LNA”)类似物，其包含双环的糖部分而不是脱氧核糖或核糖。参见，例如，Varallyay，E.等人(2008)NatureProtocols 3(2)：190-196，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，总RNA样品还可以被纯化以富集小RNA。在一些实施方案中，靶RNA可以通过例如以下来扩增：使用与靶RNA的两端互补的长探针(“锁式探针”)进行滚环扩增，连接以使探针成环形，随后使用与作为引物的环形探针杂交的靶RNA进行滚环复制。参见，例如，Jonstrup，S.P.等人(2006)RNA 12：1-6，其通过引用以其整体并入本文。然后，扩增的产物可以使用例如凝胶电泳和RNA印迹法来检测和量化。

在可选择的实施方案中，使标记的探针与溶液中的分离的总RNA杂交，之后，使RNA经受单链RNA的快速的核糖核酸酶消化，例如，探针的未杂交部分或未杂交的靶RNA。在这些实施方案中，核糖核酸酶处理过的样品然后通过SDS-PAGE和通过例如RNA印迹法检测放射性同位素标记的探针来分析。参见由Applied Biosystems，Inc销售的mirVana^TM miRNA Detection Kit。产品说明书在http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php？1552。

在一些实施方案中，用于检测和定量本文描述的方法中的至少一种靶RNA的分析方法是通过与微阵列杂交。参见，例如，Liu，C.G.等人(2004)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 101：9740-9744；Lim，L.P.等人(2005)Nature 433：769-773以及实施例1，每一篇所述文献均通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，使用微阵列检测和定量靶RNA通过表面等离子体共振来完成。参见，例如，Nanotech News(2006)，可在http://nano.cancer.gov/news center/nanotech news 2006-10-30b.asp得到。在这些实施方案中，从待测试的样品中分离出总RNA。任选地，进一步纯化RNA样品以富集小RNA种群。纯化后，RNA样品结合到包含在微阵列上的界定位置处的探针的可寻址微阵列。非限制性的示例性的探针包括包含SEQ ID NO：1至86中所列的序列的探针。示例性的探针还包括但不限于，包括与选自SEQ ID NO：196至399、565至707和868至897的序列的至少15个连续核苷酸互补的区的探针。示例性的探针还包括但不限于，包含选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸的探针。在一些实施方案中，探针包含如下文所讨论的一种或多种亲和力-增强的核苷酸类似物，例如锁核酸(“LNA”)核苷酸类似物。在与微阵列杂交之后，与阵列杂交的RNA首先被聚腺苷酸化，且阵列然后被暴露于具有与它们结合的poly-dT的金颗粒。所结合的靶RNA的量使用表面等离子体共振来定量。

在一些实施方案中，在RNA-引发的基于阵列的克列诺酶(“RAKE”)测定使用微阵列。参见Nelson，P.T.等人(2004)NatureMethods 1(2)：1-7；Nelson，P.T.等人(2006)RNA 12(2)：1-5，每一篇所述文献通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，从样品分离出总RNA。在一些实施方案中，从样品分离出小RNA。RNA样品然后与被固定在可寻址阵列上的5′-端部处的DNA探针杂交。在一些实施方案中，DNA探针包括，从5′-端部到3′-端部的包括对于所有探针是相同的“间隔区”序列的第一区、包括含三个胸腺嘧啶脱氧核苷的核苷的第二区和包括与感兴趣的靶RNA互补的序列的第三区。

示例性的感兴趣的靶RNA包括但不限于，能够与包含选自SEQID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交的靶RNA，包括与选自196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸相同的区的靶RNA，和包括与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的区的靶RNA。靶RNA还包括不与包含选自SEQID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交的以miRNome形式的靶RNA。在一些实施方案中，以其成熟形式的靶RNA包括少于30种核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA是微RNA。

在样品与阵列杂交之后，将样品暴露于外切核酸酶I以消化任何未杂交的探针。然后将DNA聚合酶I的克列诺片段连同生物素化的dATP一起应用，允许杂交靶RNA充当酶的引物且DNA探针作为模板。然后洗涤载玻片并应用抗生蛋白链菌素共轭的荧光团以检测和定量包含来自样品的杂交靶RNA和克列诺延伸的靶RNA的阵列上的斑点。

在一些实施方案中，RNA样品被逆转录。在一些实施方案中，使用生物素/poly-dA随机八聚体引物来逆转录RNA样品。当使用该引物时，RNA模板被消化且含生物素的cDNA被杂交到具有允许特异性检测靶RNA的结合探针的可寻址微阵列。在一些实施方案中，微阵列包括至少一种探针，所述至少一种探针包含同样地存在于选自SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897的序列中或与该序列的区互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸。在cDNA与微阵列杂交之后，将微阵列暴露于抗生蛋白链菌素结合的可检测标记，例如荧光染料，并检测所结合的cDNA。参见Liu C.G.等人(2008)Methods 44：22-30，其通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，在使用结合在微量滴定板孔中的探针的ELISA-样测定中检测和量化靶RNA。参见Mora J.R.和Getts R.C.(2006)BioTechniques 41：420-424，和BioTechniques 41(4)：1-5中的增补材料；Getts等人的美国专利公布No.2006/0094025，每一篇所述文献通过引用以其整体并入本文。在这些实施方案中，富集小RNA的RNA样品被聚腺苷酸化或被逆转录，且cDNA被聚腺苷酸化。使RNA或cDNA与固定在微量滴定板的孔中的探针杂交，其中每种所述探针包括同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列，或诸如人miRNome的靶RNA(或其反向补体)的一种或多种序列的序列，这取决于RNA或cDNA是否与阵列杂交。在一些实施方案中，杂交RNA使用捕获序列来标记，例如用多个生物素分子或用多个辣根过氧化物酶分子标记的DNA树状聚体(例如可从Genisphere，Inc.，http://www.genisphere.com/about_3dna.html得到的那些)，和包含在5′-端部的结合到捕获核酸的poly-dA尾部的poly-dT序列和在3′-端部的与捕获序列的区互补的序列的桥接多核苷酸。如果捕获序列是生物素化的，那么然后将微阵列暴露于抗生蛋白链菌素结合的辣根过氧化物酶。靶RNA的杂交通过添加辣根过氧化物酶底物例如四甲基联苯胺(TMB)和测量溶液在450nM处的吸光度来检测。

在另外其他实施方案中，可寻址微阵列用于使用量子点检测靶RNA。参见Liang，R.Q.等人(2005)Nucl.Acids Res.33(2)：el7，可在http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi？artid＝548377得到，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，从样品分离出总RNA。在一些实施方案中，从样品分离出小RNA。使用生物素-X-酰肼将靶RNA的3′端部生物素化。将生物素化的靶RNA捕获在这样的微阵列上，所述微阵列包括包含同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897中的一个或多个中或与它们中的一个或多个的区互补的序列的固定探针，和/或包括不同于与人miRNome的一个或多个微RNA互补的那些的序列的探针。然后杂交靶RNA用量子点经由生物素-抗生蛋白链菌素结合来标记。共焦激光器使量子点发荧光，且信号可以被量化。在可选择的实施方案中，小RNA可以使用比色测定来检测。在这些实施方案中，小RNA用抗生蛋白链菌素结合的金标记，随后银增强(silver enhancement)。结合到杂交靶RNA的金纳米微粒将银离子催化还原为金属银，金属银然后可以用CCD照相机通过比色方法来检测。

在一些实施方案中，一种或多种靶RNA的检测和定量使用微流控装置和单分子检测来完成。在一些实施方案中，使分离的总RNA样品中的靶RNA与两种探针杂交，一种探针与靶RNA的5′-端部处的核酸互补，而第二探针与靶RNA的3′-端部互补。在一些实施方案中，每一种探针包括一种或多种亲和力-增强的核苷酸类似物，例如LNA核苷酸类似物，且每一种用具有不同荧光发射光谱的不同荧光染料来标记。然后使样品流过微流控毛细管，在微流控毛细管中多个激光器激发荧光探针，使得光子的独特的重合爆裂确定特定的靶RNA，且可以计算光子的特定的独特的重合爆裂的次数以量化样品中靶RNA的量。参见Neely等人的美国专利公布No.2006/0292616，其据此通过引用以其整体并入。在一些可选择的实施方案中，靶RNA特异性探针可以用选自例如荧光团、电子自旋标记等的3种或更多种不同的标记进行标记，且然后与RNA样品例如总RNA或富集小RNA的样品杂交。非限制性的示例性的靶RNA特异性探针包括包含选自SEQ ID NO：1至86的序列的探针。非限制性的示例性的靶RNA特异性探针包括包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列互补的序列的探针。非限制性的示例性的靶RNA特异性探针还包括包含选自SEQID NO：1至86、196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸或选自SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸的补体的探针。

任选地，样品RNA在杂交之前被修饰。然后将靶RNA/探针双链体穿过微流控装置中的通道，所述通道包含记录3种标记的独特的信号的检测器。以该方式，单个分子通过它们独特的信号被检测并被计数。参见Fuchs等人，美国Genomics，Inc.的美国专利No.7,402,422和7,351,538，每篇所述专利通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，一种或多种靶RNA的检测和定量通过基于溶液的测定来完成，例如修饰的Invader测定。参见Allawi H.T.等人(2004)RNA 10：1153-1161，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，修饰的invader测定可以在细胞的未分级的洗涤剂溶解产物上执行。在其他实施方案中，修饰的invader测定可以在从细胞分离出的总RNA上或在富集小RNA的样品上执行。样品中的靶RNA被退火至形成发夹结构的两种探针。第一探针具有在5′端部的发夹结构和在3′-端部的具有与靶RNA的5′-端部的区的序列互补的序列的区。第一探针的3′-端部是“侵入多核苷酸”。第二探针具有从5′端部到3′-端部的与靶RNA不互补的第一“瓣(flap)”区、具有与靶RNA的3′-端部互补的序列的第二区和形成发夹结构的第三区。当两种探针结合到靶RNA靶时，它们在靶RNA模板上产生探针的重叠构型，其由裂解酶识别，将第二探针的瓣释放到溶液中。瓣区然后结合到副反应模板(“SRT”)的3′-端部的互补区。FRET多核苷酸(具有结合到5′-端部的荧光染料和猝灭更近地结合到3′端部的染料的猝灭剂)结合到SRT的5′-端部的互补区，结果是产生瓣的3′-端部和FRET多核苷酸的5′-端部的重叠构型。当染料被释放到溶液中时，裂解酶识别该重叠构型并且切割FRET多核苷酸的5′-端部，产生荧光信号。

4.1.5.示例性的多核苷酸

在一些实施方案中，提供多核苷酸。在一些实施方案中，提供合成多核苷酸。如本文所使用的，合成多核苷酸是指已经用化学方法或酶促方法在体外合成多核苷酸。多核苷酸的化学合成包括但不限于，使用多核苷酸合成器的合成，例如OligoPilot(GE Healthcare)、ABI3900DNA Synthesizer(Applied Biosystems)以及类似物。酶促合成包括但不限于，通过酶促扩增例如PCR产生多核苷酸。

在一些实施方案中，提供了包括选自SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897的序列和与SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897互补的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸还包括具有在SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897中的任一个中不存在的序列或与SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897中的任一个互补的序列的区。在一些实施方案中，提供了包括选自SEQ ID NO：1至67、215至399和863至897的序列和与SEQ ID NO：1至67、215至399和863至897互补的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸还包括具有在SEQ ID NO：1至67、215至399或863至897中的任一个中不存在的序列或与SEQ ID NO：1至67、215至399或863至897中的任一个互补的序列的区。

“区”可以包括特定序列的全长序列或特定序列的全长序列的补体，所述特定序列例如SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897中的任一个，或其可以包括特定序列的子序列或特定序列的子序列的补体，所述特定序列例如SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897中的任一个。在一些实施方案中，这样的子序列可以包括来自特定的SEQ ID NO或其补体的8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或更多个连续核苷酸。

在各种实施方案中，多核苷酸包括少于500个、少于300个、少于200个、少于150个、少于100个、少于75个、少于50个、少于40个或少于30个核苷酸。在各种实施方案中，多核苷酸的长度在8各至200个核苷酸之间、在8个至150个核苷酸之间、在8个至100个核苷酸之间、在8个至75个核苷酸之间、在8个至50个核苷酸之间、在8个至40个核苷酸之间或在8个至30个核苷酸之间。

在一些实施方案中，多核苷酸是引物。在一些实施方案中，引物用可检测的部分来标记。在一些实施方案中，引物未被标记。如本文所使用的，引物是能够与靶RNA特异性杂交或与从靶RNA逆转录的cDNA杂交或与已经从靶RNA或cDNA(共同地被称为“模板”)扩增的扩增子杂交，且在模板、聚合酶以及合适的缓冲剂和试剂的存在下可以被延伸以形成引物延伸产物的多核苷酸。

在一些实施方案中，多核苷酸是探针。在一些实施方案中，探针用可检测的部分来标记。如本文所使用的，可检测的部分包括直接可检测的部分例如荧光染料，和间接可检测的部分例如结合对的成员两者。在一些实施方案中，当可检测的部分是结合对的成员时，可以通过用结合到结合对的第二成员的可检测标记温育探针而使探针是可检测的。在一些实施方案中，探针未被标记，例如当探针是例如在微阵列或珠上的捕获探针时。在一些实施方案中，探针是例如通过聚合酶不可延伸的。在其他实施方案中，探针是可延伸的。

在一些实施方案中，多核苷酸是在一些实施方案中在5′-端部用荧光染料(供体)标记和在3′-端部用猝灭剂(受体)标记的FRET探针，猝灭剂(受体)是当各基团在附近(即，连接到相同的探针)时吸收(即，抑制)来自染料的荧光发射的化学基团。在其他实施方案中，供体和受体不是在FRET探针的端部。因此，在一些实施方案中，供体部分的发射光谱应显著地与受体部分的吸收光谱重叠。

4.1.5.1.示例性的多核苷酸修饰

在一些实施方案中，本文描述的检测至少一种靶RNA的方法采用已经被修饰的一种或多种多核苷酸，例如包括一种或多种亲和力-增强的核苷酸类似物的多核苷酸。可用在本文描述的方法中的修饰的多核苷酸包括用于逆转录的引物、PCR扩增引物和探针。在一些实施方案中，并入亲和力-增强的核苷酸，相比于仅包含脱氧核糖核苷酸的多核苷酸，增加了多核苷酸对其靶核酸的结合亲和力和特异性，并允许使用更短的多核苷酸或具有在多核苷酸和靶核酸之间的互补性的更短的区。

在一些实施方案中，亲和力-增强的核苷酸类似物包括包含一种或多种碱基修饰、糖修饰和/或主链修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，在亲和力-增强的核苷酸类似物中使用的修饰的碱基包括5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、2-氯代-6-氨基嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤。

在一些实施方案中，亲和力-增强的核苷酸类似物包括具有修饰的糖的核苷酸，修饰的糖例如2′-取代的糖，例如2′-O-烷基-核糖、2′-氨基-脱氧核糖、2′-氟-脱氧核糖、2′-氟-阿拉伯糖和2′-O-甲氧基乙基-核糖(2′MOE)。在一些实施方案中，修饰的糖是阿拉伯糖，或d-阿拉伯-己糖醇糖。

在一些实施方案中，亲和力-增强的核苷酸类似物包括主链修饰，例如使用肽核酸(PNA；例如，包括通过氨基酸主链连接在一起的核碱基的低聚物)。其他主链修饰包括硫代磷酸酯键合、磷酸二酯修饰的核酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合、膦酸甲酯、膦酸烷基酯、磷酸酯、硫代膦酸烷基酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯(acetamidate)、羧甲基酯、硫代磷酸甲酯、二硫代磷酸酯、对乙氧基、及其组合。

在一些实施方案中，多核苷酸包括具有修饰的碱基的至少一种亲和力-增强的核苷酸类似物、具有修饰的糖的至少一种核苷酸(其可以是相同的核苷酸)和/或非天然存在的至少一种核苷酸间键合。

在一些实施方案中，亲和力-增强的核苷酸类似物包含锁核酸(“LNA”)糖，其是双环糖。在一些实施方案中，用在本文描述的方法中的多核苷酸包括具有LNA糖的一种或多种核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含由具有LNA糖的核苷酸组成的一个或多个区。在其他实施方案中，多核苷酸包含散布有脱氧核糖核苷酸的具有LNA糖的核苷酸。参见，例如，Frieden，M.等人(2008)Curr.Pharm.Des.14(11)：1138-1142。

4.1.5.2.示例性的引物

在一些实施方案中，提供了引物。在一些实施方案中，引物与靶RNA的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸相同或互补。在一些实施方案中，引物还可以包括与靶RNA不相同或互补的部分或区。在一些实施方案中，引物的与靶RNA相同或互补的区是连续的，使得引物的与靶RNA不相同或互补的任何区不会破坏相同的或互补的区。

在一些实施方案中，引物包括同样地存在于靶RNA中的部分。在一些这样的实施方案中，包括同样地存在于靶RNA中的区的引物能够与已经从RNA逆转录的cDNA或与已经通过靶RNA或cDNA的扩增产生的扩增子选择性杂交。在一些实施方案中，引物与cDNA或扩增子的足够的部分互补，使得其在正被使用的特定测定的条件下与cDNA或扩增子选择性杂交。

如本文所使用的，“选择性杂交”意指多核苷酸例如引物或探针将以比其与相同的样品中存在的在杂交区具有不同核苷酸序列的另一种核酸杂交大至少5倍亲和力与样品中的特定核酸杂交。示例性的杂交条件在实施例1中讨论。在一些实施方案中，多核苷酸将以比其与相同的样品中存在的在杂交区具有不同核苷酸序列的另一种核酸杂交大至少10倍亲和力与样品中的特定核酸杂交。

非限制性的示例性的引物包括包含同样地存在于选自SEQ IDNO：1至86的序列中或与该序列互补的序列的引物。示例性的引物还包括但不限于，包括与选自SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸相同或互补的区的引物。

在一些实施方案中，引物用于逆转录靶RNA，例如，如本文所讨论的。在一些实施方案中，引物用于扩增靶RNA或从其逆转录的cDNA。在一些实施方案中，这样的扩增是定量PCR，例如，如本文所讨论的。在一些实施方案中，引物包括可检测的部分。

4.1.5.3.示例性的探针

在各种实施方案中，检测败血症的存在的方法包括使人样品的核酸与探针杂交。在一些实施方案中，探针包括与靶RNA互补的部分。在一些实施方案中，探针包括同样地存在于靶RNA中的部分。在一些这样的实施方案中，与靶RNA互补的探针与靶RNA的足够的部分互补，使得探针在正被使用的特定测定的条件下与靶RNA选择性杂交。在一些实施方案中，与靶RNA互补的探针与靶RNA的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，与靶RNA互补的探针包括与靶RNA的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸互补的区。即，与靶RNA互补的探针还可以包括与靶RNA不互补的部分或区域。在一些实施方案中，与靶RNA互补的探针的区是连续的，使得探针的与靶RNA不互补的任何区不会破坏互补的区。

在一些实施方案中，探针包括同样地存在于靶RNA中的部分。在一些这样的实施方案中，包括同样地存在于靶RNA中的区的探针能够与已经从RNA逆转录的cDNA或与已经通过靶RNA或cDNA的扩增产生的扩增子选择性杂交。在一些实施方案中，探针与cDNA或扩增子的足够的部分互补，使得其在正被使用的特定测定的条件下与cDNA或扩增子选择性杂交。在一些实施方案中，与cDNA或扩增子互补的探针与cDNA或扩增子的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，与靶RNA互补的探针包括与cDNA或扩增子的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸互补的区。即，与cDNA或扩增子互补的探针还可以包括与cDNA或扩增子不互补的部分或区域。在一些实施方案中，探针的与cDNA或扩增子互补的区是连续的，使得探针的与cDNA或扩增子不互补的任何区不会破坏互补的区。

非限制性的示例性的探针包括包含在SEQ ID NO：1至86中所列的序列的探针。非限制性的示例性的探针包括包含同样地存在于选自SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897的序列中或与该序列的区互补的序列的探针。示例性的探针还包括但不限于，包括与选自SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸相同或互补的区的探针。

在一些实施方案中，可检测地量化一种或多种靶RNA的方法包括：(a)分离总RNA；(b)逆转录靶RNA以产生与靶RNA互补的cDNA；(c)扩增来自(b)的cDNA；和(d)使用实时RT-PCR和检测探针检测靶RNA的量。

如上所描述的，在一些实施方案中，实时RT-PCR检测使用FRET探针来执行，FRET探针包括但不限于，

探针、分子信标探针和蝎型探针。在一些实施方案中，实时RT-PCR检测和定量用

探针来执行，

探针即，通常具有共价地结合在DNA的一端的荧光染料和共价地结合在DNA的另一端的猝灭剂分子的线性探针。FRET探针包含与cDNA的区互补的序列，使得当FRET探针与cDNA杂交时，染料荧光被猝灭，且当探针在cDNA的扩增期间被消化时，染料从探针释放并产生荧光信号。在这样的实施方案中，样品中的靶RNA的量与在cDNA扩增期间测量的荧光的量成比例。

探针通常包括具有与靶RNA的区或其互补的从靶RNA模板逆转录的cDNA互补的序列的连续核苷酸的区(即，探针区的序列与待检测的靶RNA互补或同样地存在于待检测的靶RNA中)，使得探针可与所产生的PCR扩增子特异性杂交。在一些实施方案中，探针包括具有与已经从靶RNA模板逆转录的cDNA的区完全互补或同样地存在于该cDNA的区中的序列的至少6个连续核苷酸的区，例如包括具有与从待检测的靶RNA逆转录的cDNA的区互补或同样地存在于该cDNA的区中的序列的至少8个连续核苷酸、至少10个连续核苷酸、至少12个连续核苷酸、至少14个连续核苷酸或至少16个连续核苷酸的区。

在一些实施方案中，具有与

探针序列互补的序列的cDNA的区在cDNA分子的中心处或附近。在一些实施方案中，在具有互补性的区的5′-端部和3′-端部独立地具有cDNA的至少2种核苷酸、至少3种核苷酸、至少4种核苷酸、至少5种核苷酸。

在一些实施方案中，分子信标可以用于检测和定量PCR产物。与

探针一样，分子信标使用FRET经由具有连接到探针的端部的荧光染料和猝灭剂的探针来检测和定量PCR产物。与探针不同，分子信标在PC循环期间保持完整。分子信标探针当自由地在溶液中时形成茎-环结构，由此允许染料和猝灭剂足够接近以引起荧光猝灭。当分子信标与靶杂交时，茎-环结构被废除，使得染料和猝灭剂在空间上是分离的且染料发荧光。分子信标可例如从Gene Link^TM(参见http://www.genelink.com/newsite/products/mbintro.asp)得到。

在一些实施方案中，蝎型探针可以用作序列特异性引物和用于PCR产物检测和定量两者。与分子信标一样，蝎型探针当不与靶核酸杂交时形成茎-环结构。然而，与分子信标不同，蝎型探针实现序列特异性引物和PCR产物检测两者。荧光染料分子连接到蝎型探针的5′-端部，且猝灭剂连接到3′-端部。探针的3′部分与PCR引物的延伸产物互补，且该互补的部分通过不可扩增的部分连接到探针的5′-端部。在蝎型引物被延伸之后，探针的靶特异性序列结合到在延伸的扩增子内的序列补体，因此打开茎-环结构和允许5′-端部上的染料发荧光并产生信号。蝎型探针可从例如Premier Biosoft International (参见http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/Scorpion.html)得到。

在一些实施方案中，可以在FRET探针上使用的标记包括比色标记和荧光标记，例如Alexa Fluor染料、BODIPY染料，例如BODIPYFL；Cascade Blue；Cascade Yellow；香豆素和其衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素、氨基香豆素和羟基香豆素；花菁染料，例如Cy3和Cy5；曙红和赤藓红；荧光素和其衍生物，例如异硫氰酸荧光素；镧系离子的大环螯合物，例如Quantum Dye^TM；Marina Blue；OregonGreen；若丹明染料，例如若丹明红、四甲基若丹明和若丹明6G；TexasRed；荧光能量转移染料，例如噻唑橙-乙锭异源二聚体；以及TOTAB。

染料的具体的实例包括但不限于，上文和以下确定的那些：AlexaFluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、AlexaFluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、AlexaFluor 700和Alexa Fluor 750；胺-反应性BODIPY染料，例如BODIPY493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY650/655、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR和BODIPY-TR；Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、RhodamineGreen、Rhodamine Red、Renographin、ROX、SYPRO、TAMRA、2′，4′，5′，7′-四溴砜荧光素，和TET。

可用于制备在本文描述的方法的一些实施方案中使用的RT-PCR探针的荧光标记的核糖核苷酸的具体实例可从Molecular Probes(Invitrogen)得到，且这些包括，Alexa Fluor 488-5-UTP、荧光黄-12-UTP、BODIPY FL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、四甲基若丹明-6-UTP、Alexa Fluor 546-14-UTP、Texas Red-5-UTP和BODIPYTR-14-UTP。其他荧光核糖核苷酸可从Amersham Biosciences(GEHealthcare)得到，例如Cy3-UTP和Cy5-UTP。

可用于制备在本文描述的方法中使用的RT-PCR探针的荧光标记的脱氧核糖核苷酸的实例包括二硝基苯基(DNP)-1′-dUTP、CascadeBlue-7-dUTP、Alexa Fluor 488-5-dUTP、荧光黄-12-dUTP、OregonGreen 488-5-dUTP、BODIPY FL-14-dUTP、Rhodamine Green-5-dUTP、Alexa Fluor 532-5-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、四甲基若丹明-6-dUTP、Alexa Fluor 546-14-dUTP、Alexa Fluor 568-5-dUTP、TexasRed-12-dUTP、Texas Red-5-dUTP、BODIPY TR-14-dUTP、Alexa Fluor594-5-dUTP、BODIPY 630/650-14-dUTP、BODIPY 650/665-14-dUTP；Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTP。荧光标记的核苷酸是商购可得到的且可以从例如Invitrogen购买。

在一些实施方案中，染料和其他部分例如猝灭剂经由修饰的核苷酸被引入到在本文描述的方法中使用的多核苷酸，例如FRET探针。“修饰的核苷酸”是指已经用化学方法修饰，但仍起到核苷酸的作用的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸具有共价地连接的化学部分，例如染料或猝灭剂，且可以例如经由多核苷酸固相合成而被引入到多核苷酸。在其他实施方案中，修饰的核苷酸包括一种或多种反应性基团，所述一种或多种反应性基团可以在修饰的核苷酸结合到核酸之前、期间或之后与染料或猝灭剂反应。在具体的实施方案中，修饰的核苷酸是胺-修饰的核苷酸，即，已经被修饰为具有反应性胺基团的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括修饰的碱基部分，例如尿嘧啶核苷、腺苷、鸟嘌呤核苷和/或胞嘧啶。在具体的实施方案中，胺-修饰的核苷酸选自5-(3-氨基烯丙基)-UTP；8-[(4-氨基)丁基]-氨基-ATP和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-ATP；N6-(4-氨基)丁基-ATP、N6-(6-氨基)丁基-ATP、N4-[2，2-氧代-双-(乙胺)]-CTP；N6-(6-氨基)己基-ATP；8-[(6-氨基)己基]-氨基-ATP；5-炔丙基氨基-CTP、5-炔丙基氨基-UTP。在一些实施方案中，具有不同的核碱基部分的核苷酸被同样地修饰，例如，5-(3-氨基烯丙基)-GTP代替5-(3-氨基烯丙基)-UTP。许多胺修饰的核苷酸可从例如Applied Biosystems、Sigma、Jena Bioscience和TriLink商购得到。

示例性的可检测的部分还包括但不限于，结合对的成员。在一些这样的实施方案中，结合对的第一成员连接到多核苷酸。结合对的第二成员连接到可检测标记，例如荧光标记。当连接到结合对的第一成员的多核苷酸与连接到可检测标记的结合对的第二成员温育时，结合对的第一成员和第二成员缔合并可以检测多核苷酸。示例性的结合对包括但不限于，生物素和抗生蛋白链菌素、抗体和抗原等。

在一些实施方案中，在单一多重反应中检测多种靶RNA。在一些这样的实施方案中，靶向独特的cDNA的每一种探针当从探针释放时可用光谱方法区别。因此，每一种靶RNA通过独特的荧光信号来检测。

本领域技术人员可以为所选择的测定例如实时RT-PCR测定选择合适的检测方法。所选择的检测方法不必是上文所描述的方法，而可以是任何方法。

4.2.示例性的组合物和试剂盒

在另一个方面，提供了组合物。在一些实施方案中，提供了用在本文描述的方法中的组合物。

在一些实施方案中，组合物包括至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，组合物包括至少一种引物。在一些实施方案中，组合物包括至少一种探针。在一些实施方案中，组合物包括至少一种引物和至少一种探针。

在一些实施方案中，提供了包含至少一种靶RNA特异性引物的组合物。术语“靶RNA特异性引物”包括具有这样的连续核苷酸的区的引物，所述连续核苷酸具有以下序列：(i)同样地存在于SEQ IDNO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中，或(ii)与存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中的连续核苷酸的区的序列互补。

在一些实施方案中，提供了包含至少一种靶RNA特异性探针的组合物。术语“靶RNA特异性探针”包括具有这样的连续核苷酸的区的探针，核苷酸具有具有以下序列：(i)同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中，或(ii)与存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中的连续核苷酸的区的序列互补。

在一些实施方案中，靶RNA特异性引物和探针包括脱氧核糖核苷酸。在其他实施方案中，靶RNA特异性引物和探针包括至少一种核苷酸类似物。非限制性的示例性的核苷酸类似物包括但不限于，本文描述的类似物，包括LNA类似物和肽核酸(PNA)类似物。在一些实施方案中，靶RNA特异性引物和探针包括增加杂交结合能的至少一种核苷酸类似物(例如，上文所讨论的亲和力-增强的核苷酸类似物)。在一些实施方案中，本文描述的组合物中的靶RNA特异性引物或探针结合到样品中的一种靶RNA。在一些实施方案中，单一引物或探针结合到多种靶RNA，例如多种isomir。

在一些实施方案中，组合物中存在对单一靶RNA特异的多于一种引物或探针，引物或探针能够结合到靶RNA的重叠或空间上分离的区域。

即使在下文没有明确地指明，应理解，在本文描述的组合物被设计成与从靶RNA逆转录的cDNA杂交的一些实施方案中，组合物包含具有同样地存在于靶RNA(或其区)中的序列的至少一种靶RNA特异性引物或探针(或其区)。

在一些实施方案中，靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84和86的序列的至少一种探针特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78和79的序列的至少一种核酸探针特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69和84的序列的至少一种核酸探针特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74和78的序列的至少一种核酸探针特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83和85的序列的至少一种核酸探针特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：9、50、51、70、72和75的序列的至少一种核酸探针特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA能够与包含选自SEQID NO：1至86的序列的至少一种探针特异性杂交。在一些实施方案中，靶RNA包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA包含选自SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644和648的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA包含选自SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629和632的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA包含选自SEQ ID NO：226至289、565至604和863至868的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。在一些实施方案中，以其成熟形式的靶RNA包括少于30个核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA是微RNA。

在一些实施方案中，对于至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种靶RNA中的每一种而言，组合物包含多种靶RNA特异性引物和/或探针，所述靶RNA包括具有同样地存在于SEQ ID NO：87至177、400至564、708至862和898至932中的一个中的序列的连续核苷酸的区。在一些实施方案中，所述多个包括对至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种或至少12种靶RNA中的每一种特异的靶RNA特异性引物和/或探针，所述靶RNA包括具有同样地存在于SEQ ID NO：87至177、400至564、708至862和898至932中的一个中的序列的连续核苷酸的区。在一些实施方案中，所述多个包括对至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少75种或至少100种靶RNA中的每一种特异的靶RNA特异性引物和/或探针，靶RNA包括具有同样地存在于SEQ ID NO：87至177、400至564、708至862和898至932中的一个中的序列的连续核苷酸的区。应理解，在一些实施方案中，本文描述的靶RNA包括同样地存在于表3、表13、表15或表17中所列的序列中的序列，除了表3、表13、表15或表17中示出的序列中的胸腺嘧啶(T)碱基被靶RNA中的尿嘧啶(U)碱基替代之外。

在一些实施方案中，组合物是含水的组合物。在一些实施方案中，含水的组合物包含缓冲组分例如磷酸盐、tris、HEPES等，和/或另外的组分，如下文所讨论的。在一些实施方案中，组合物是干燥的，例如冻干的，且适合于通过添加流体来重建。干燥的组合物可以包含缓冲组分和/或另外的组分。

在一些实施方案中，组合物包含一种或多种另外的组分。另外的组分包括但不限于，盐，例如NaCl、KCl和MgCl2；聚合酶，包括热稳定的聚合酶；dNTP；RNase抑制剂；牛血清白蛋白(BSA)以及类似物；还原剂，例如β-巯基乙醇；EDTA以及类似物；等。本领域技术人员可以根据组合物的期望的用途来选择合适的组合物组分。

在一些实施方案中，提供了包含连接到底物的靶RNA特异性探针的可寻址的微阵列组分。

在本文描述的方法中使用的微阵列包括探针共价地或非共价地连接到其上的固体底物。在一些实施方案中，能够与一种或多种靶RNA或cDNA杂交的探针在界定的位置连接到底物(“可寻址的阵列”)。探针可以以各种各样的方式连接到底物，如本领域技术人员将明白的。在一些实施方案中，探针首先被合成且随后连接到底物。在其他实施方案中，在底物上合成探针。在一些实施方案中，使用诸如光聚合和照相平版印刷术的技术，在底物表面上合成探针。

在一些实施方案中，固体底物是被修饰为包含适合于探针的连接或缔合的离散的单个位点且适合于至少一种检测方法的材料。底物的代表性的实例包括玻璃和改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯以及苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonJ等)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性的硅)、碳、金属、无机玻璃和塑料。在一些实施方案中，底物允许光学检测，而不需相当大地发荧光。

在一些实施方案中，底物是平面的。在其他实施方案中，将探针放在管的内部表面上，例如用于流过样品分析以最小化样品体积。在其他实施方案中，探针可以在多孔板的孔中。在另外其他实施方案中，探针可以连接到可寻址的微珠阵列。在另外其他实施方案中，探针可以连接到柔性基材，例如柔性泡沫，包括由特定塑料制成的闭孔泡沫。

底物和探针可以各自用随后连接两者的官能团来衍生化。例如，在一些实施方案中，底物用一种或多种化学官能团来衍生化，化学官能团包括但不限于，氨基、羧基、氧代基团和硫醇基团。在一些实施方案中，探针通过一种或多种官能团直接地连接到底物。在一些实施方案中，探针通过接头(即，使牵涉杂交和检测的探针区域与远离底物表面间隔开的连续核苷酸的区)间接地连接到底物。在一些实施方案中，探针通过5′末端连接到载体。在其他实施方案中，探针通过3′末端来连接。在另外其他实施方案中，探针通过内部的核苷酸连接到底物。在一些实施方案中，探针非共价地连接到载体，例如经由生物素-抗生蛋白链菌素相互作用，其中生物素化的探针和底物表面共价地包覆有抗生蛋白链菌素。

在一些实施方案中，组合物包含具有连接到底物的探针的微阵列，其中探针(或其区)中的至少一个包含同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列。在一些实施方案中，探针中的至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个或至少100个包含同样地存在于SEQ IDNO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列。在一些实施方案中，微阵列包括包含同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性探针，且包含同样地存在于人miRNome的靶RNA中或与人miRNome的靶RNA的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性探针。在一些实施方案中，微阵列包括在微阵列上的唯一一个位置处的每一个靶RNA特异性探针。在一些实施方案中，微阵列包括在微阵列上的多个位置处的至少一种靶RNA特异性探针。

如本文所使用的，术语与靶RNA(或其靶区)“互补的”或“部分互补的”，和探针序列与靶RNA序列的“互补性”的百分数是与靶RNA的序列的反向补体的“同一性”百分数。在确定本文描述的组合物中使用的探针(或其区)与诸如本文所公开的那些的靶RNA之间的“互补性”程度时，“互补性”程度被表达为在探针(或其区)的序列和与其最佳对齐的靶RNA的序列的反向补体之间的同一性百分数。百分数通过对在2个序列之间相同的对齐碱基的数量进行计数，除以探针中的连续核苷酸的总数量，并且乘以100来计算。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有与靶RNA的靶区完全互补的序列的区的至少一种探针。在其他实施方案中，微阵列包括具有这样的区的至少一种探针，所述区具有当相比于靶RNA的最佳对齐的靶区的序列时包括一种或多种碱基错配的序列。

如上所述，如本文所使用的，探针或靶RNA的“区”可以包括来自特定的SEQ ID NO或其补体的8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或更多个连续核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，该区具有与探针或靶RNA相同的长度。在其他实施方案中，该区短于探针或靶RNA的长度。

在一些实施方案中，微阵列包括具有同样地存在于SEQ ID NO：1至68、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少10个、至少11个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸的区的至少一种探针。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于SEQ IDNO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84或86中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包括至少一种、至少两种、至少三种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种或至少40种探针，每一种探针包括具有同样地存在于SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84和86中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，微阵列还包括另外的探针，该另外的探针不具有带有同样地存在于SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84或86中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于SEQ IDNO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78或79中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包括至少一种、至少两种、至少三种、至少五种、至少八种、至少10种、至少12种或至少15种探针，每一种探针包括具有同样地存在于SEQ ID NO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78和79中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，微阵列还包括另外的探针，该另外的探针不具有带有同样地存在于SEQ ID NO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78和79中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于SEQ IDNO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69或84中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包括至少一种、至少两种、至少三种、至少五种、至少八种、至少10种、至少12种或至少15种探针，每一种探针包括具有同样地存在于SEQ ID NO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69或84中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，微阵列还包括另外的探针，该另外的探针不具有带有同样地存在于SEQ ID NO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69或84中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于SEQ IDNO：8、14、59、62、63、64、74或78中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种探针，每一种探针包括具有同样地存在于SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74或78中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，微阵列还包括另外的探针，该另外的探针不具有带有同样地存在于SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74或78中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于SEQ IDNO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83或85中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少十种、至少15种、至少20种、至少25种或至少30种探针，每一种探针包括具有同样地存在于SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83或85中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，微阵列还包括另外的探针，该另外的探针不具有带有同样地存在于SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83或85中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于SEQ IDNO：9、50、51、70、72或75中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种探针，每一种探针包括具有同样地存在于SEQ ID NO：9、50、51、70、72或75中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，微阵列还包括另外的探针，该另外的探针不具有带有同样地存在于SEQ ID NO：9、50、51、70、72或75中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于SEQ IDNO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644或648中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包括至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少30种探针，每一种探针包括具有同样地存在于SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644或648中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，微阵列还包括另外的探针，该另外的探针不具有带有同样地存在于SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644或648中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于SEQ IDNO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629或632中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包括至少两种、至少五种、至少10种、至少15种或至少20种探针，每一种探针包括具有同样地存在于SEQID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629或632中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，微阵列还包括另外的探针，该另外的探针不具有带有同样地存在于SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629或632中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于SEQ IDNO：226至289、565至604或863至868中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包括至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种或至少70种探针，每一种探针包括具有同样地存在于SEQ ID NO：226至289、565至604或863至868中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，微阵列还包括另外的探针，该另外的探针不具有带有同样地存在于SEQ ID NO：226至289、565至604或863至868中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，微阵列包括具有带有与包括人miRNome(即，已经由他人添加到miRBase的公知的微RNA(http://microrna.sanger.ac.uk/在微阵列被制造时)的相当大部分例如人miRNome的至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的靶RNA互补的序列的区的探针。在一些实施方案中，微阵列包括具有带有同样地存在于包括人miRNome的相当大部分例如人miRNome的至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的靶RNA中的序列的区的探针。

在一些实施方案中，提供了包括连接到微珠的探针的组分，微珠例如由Luminex销售的那些，它们中的每一种用不同强度的红色和红外线的荧光团内部地染色以产生对于每一种珠的独特信号。在一些实施方案中，可用于进行本文描述的方法的组合物包括多种微珠，每一种具有独特的光谱信号。将每一种独特地标记的微珠连接到独特的靶RNA特异性探针，使得来自珠中的染料的独特的光谱信号与特定的探针序列相关。非限制性的示例性的探针序列包括SEQ ID NO：1至86。非限制性的示例性的探针序列还包括包含同样地存在于选自SEQID NO：1至86、196至399、565至707和863至897的序列或与该序列互补的区的探针。在一些实施方案中，探针序列包括同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个连续核苷酸。

在一些实施方案中，独特地标记的微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在其他实施方案中，独特地标记的微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有当相比于选自SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897的大部分相似的序列和与SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707和863至897互补的序列时包含一种或多种碱基错配的序列的区。

在一些实施方案中，提供了包含多种独特地标记的微珠的组合物，其中至少一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有具有同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少10个、至少11个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，独特地标记的微珠中的至少一种具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84或86中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少五种、至少8种、至少十种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种或至少40种独特地标记的微珠，每一种独特地标记的微珠具有与其连接的独特的靶RNA特异性探针，该独特的靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84或86中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该至少一种独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84或86中的任一个中或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，其中至少一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQID NO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78或79中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少五种、至少八种、至少10种、至少12种、至少15种或至少18种独特地标记的微珠，每一种独特地标记的微珠具有与其连接的独特的靶RNA特异性探针，该独特的靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78或79中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该至少一种独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQ IDNO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78或79中的任一个中或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，其中至少一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQID NO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69或84中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少五种、至少八种、至少10种、至少12种、至少15种或至少18种独特地标记的微珠，每一种独特地标记的微珠具有与其连接的独特的靶RNA特异性探针，该独特的靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69或84中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该至少一种独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQ IDNO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69或84中的任一个中或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，其中至少一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQID NO：8、14、59、62、63、64、74或78中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种独特地标记的微珠，每一种独特地标记的微珠具有与其连接的独特的靶RNA特异性探针，该独特的靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74或78中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该至少一种独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74或78中的任一个中或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，其中至少一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83或85中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少五种、至少8种、至少十种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种或至少35种独特地标记的微珠，每一种独特地标记的微珠具有与其连接的独特的靶RNA特异性探针，该独特的靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83或85中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该至少一种独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83或85中的任一个中或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，其中至少一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQID NO：9、50、51、70、72或75中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种独特地标记的微珠，每一种独特地标记的微珠具有与其连接的独特的靶RNA特异性探针，该独特的靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：9、50、51、70、72或75中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该至少一种独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQ ID NO：9、50、51、70、72或75中的任一个中或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，其中至少一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644或648中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少30种独特地标记的微珠，每一种独特地标记的微珠具有与其连接的独特的靶RNA特异性探针，该独特的靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644或648中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该至少一种独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644或648中的任一个中或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，其中至少一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629或632中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少五种、至少10种、至少15种或至少20种独特地标记的微珠，每一种独特地标记的微珠具有与其连接的独特的靶RNA特异性探针，该独特的靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629或632中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该至少一种独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629或632中的任一个中或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，其中至少一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQID NO：226至289、565至604或863至868中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种或至少70种独特地标记的微珠，每一种独特地标记的微珠具有与其连接的独特的靶RNA特异性探针，该独特的靶RNA特异性探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：226至289、565至604或863至868中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该至少一种独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQ ID NO：226至289、565至604或863至868中的任一个中或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，其中所述多种包括具有与其连接的探针的至少一种微珠，所述探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，所述多种包括至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少75种或至少100种微珠，每一种微珠具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区。在一些实施方案中，组合物包含至少一种独特地标记的微珠，该独特地标记的微珠具有与其连接的靶RNA特异性探针，该靶RNA特异性探针具有带有不存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的任一个或与它们中的任一个的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含：多种独特地标记的微珠，独特地标记的微珠中的至少一种具有与其连接的探针，该探针具有带有同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的区；和具有与其连接的探针的至少一种第二珠，该探针具有带有同样地存在于来自人miRNome的靶RNA或与人miRNome的靶RNA的区互补的序列的区。

在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，独特地标记的微珠中的每一种具有与其连接的独特的探针，该独特的探针具有与包括人miRNome的相当大部分例如人miRNome的至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的靶RNA互补的区。在一些实施方案中，组合物包含多种独特地标记的微珠，该独特地标记的微珠具有与其连接的独特的探针，该独特的探针具有带有同样地存在于包括人miRNome的相当大部分例如人miRNome的至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的靶RNA中的序列的区。

在一些实施方案中，提供了包含用于检测至少一种靶RNA的至少一种多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，多核苷酸用作逆转录反应的引物。在一些实施方案中，多核苷酸用作扩增的引物。在一些实施方案中，多核苷酸用作RT-PCR的引物。在一些实施方案中，多核苷酸用作用于检测至少一种靶RNA的探针。在一些实施方案中，多核苷酸被可检测地标记。在一些实施方案中，多核苷酸是FRET探针。在一些实施方案中，多核苷酸是

探针、分子信标或蝎型探针。

在一些实施方案中，组合物包含具有同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少75种或至少100种FRET探针，每一种FRET探针具有同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。在一些实施方案中，FRET探针用供体/受体对来标记，使得当探针在PCR反应期间被消化时，其产生与特异性靶RNA相关的独特的荧光发射。在一些实施方案中，当组合物包含多种FRET探针时，每一种探针用不同的供体/受体对来标记，使得当探针在PCR反应期间被消化时，每一种探针产生与特异性探针序列和/或靶RNA相关的独特的荧光发射。在一些实施方案中，FRET探针的序列与靶RNA的靶区互补。在其他实施方案中，当相比于靶RNA的最佳对齐的靶区的序列时，FRET探针具有包括一种或多种碱基错配的序列。

在一些实施方案中，组合物包含由至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种或至少25种核苷酸组成的FRET探针，其中序列的至少一部分同样地存在于SEQ IDNO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补。在一些实施方案中，FRET探针的至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种或至少25种核苷酸同样地存在于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个中或与它们中的一个的区互补。在一些实施方案中，当相比于SEQ ID NO：1至86、196至399、565至707或863至897中的一个的序列或补体时，FRET探针具有带有一个、两个或三个碱基错配的序列。

在一些实施方案中，组合物包含包括同样地存在于SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84或86中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少五种、至少8种、至少十种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种或至少40种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针，每一种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针包括同样地存在于SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84或86中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。

在一些实施方案中，组合物包含包括同样地存在于SEQ ID NO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78或79中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少五种、至少八种、至少10种、至少12种、至少15种或至少18种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针，每一种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针包括同样地存在于SEQ IDNO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78或79中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。

在一些实施方案中，组合物包含包括同样地存在于SEQ ID NO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69或84中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少五种、至少八种、至少10种、至少12种、至少15种或至少18种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针，每一种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针包括同样地存在于SEQ IDNO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69或84中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。

在一些实施方案中，组合物包含包括同样地存在于SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74或78中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针，每一种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针包括同样地存在于SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74或78中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。

在一些实施方案中，组合物包含包括同样地存在于SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83或85中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少五种、至少8种、至少十种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种或至少35种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针，每一种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针包括同样地存在于SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83或85中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。

在一些实施方案中，组合物包含包括同样地存在于SEQ ID NO：9、50、51、70、72或75中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针，每一种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针包括同样地存在于SEQ ID NO：9、50、51、70、72或75中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。

在一些实施方案中，组合物包含包括同样地存在于SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644或648中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少30种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针，每一种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针包括同样地存在于SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644或648中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。

在一些实施方案中，组合物包含包括同样地存在于SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629或632中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少五种、至少10种、至少15种或至少20种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针，每一种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针包括同样地存在于SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629或632中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。

在一些实施方案中，组合物包含包括同样地存在于SEQ ID NO：226至289、565至604或863至868中的一个中或与它们中的一个的区互补的序列的至少一种靶RNA特异性FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种或至少70种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针，每一种独特地标记的靶RNA特异性FRET探针包括同样地存在于SEQ IDNO：226至289、565至604或863至868中的不同的一个中或与它们中的不同的一个的区互补的序列。

在一些实施方案中，试剂盒包括上文所讨论的多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包括上文所讨论的至少一种引物和/或探针。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种聚合酶，例如热稳定的聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒包括dNTP。在一些实施方案中，用于本文描述的实时RT-PCR方法的试剂盒包括一种或多种靶RNA特异性FRET探针和/或用于靶RNA的逆转录的一种或多种引物和/或用于靶RNA或由其逆转录的cDNA的扩增的一种或多种引物。

在一些实施方案中，引物和/或探针中的一种或多种是“线性的”。“线性的”引物是指为单链分子且通常不包括例如至少3、4或5个连续核苷酸的短区的多核苷酸，所述短区与相同的多核苷酸内的另一个区互补，使得引物形成内部的双链体。在一些实施方案中，用于逆转录的引物包括在3′-端部具有与在靶RNA的5′-端部的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或更多个连续核苷酸的区互补的序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或更多个连续核苷酸的区。

在一些实施方案中，试剂盒包括用于扩增由靶RNA逆转录的cDNA的一对或多对线性引物(“正向引物”和“反向引物”)。因此，在一些实施方案中，第一引物包括具有与在靶RNA的5′-端部的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续核苷酸的区的序列相同的序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续核苷酸的区。此外，在一些实施方案中，第二引物包括具有与在靶RNA的3′-端部的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续核苷酸的区的序列互补的序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续核苷酸的区。在一些实施方案中，试剂盒包括用于扩增由靶RNA逆转录的cDNA的至少第一组引物，该靶RNA能够与包括同样地存在于SEQ ID NO：1至86中的一个中的序列的核酸和/或从包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸的靶RNA逆转录的cDNA特异性杂交。

在一些实施方案中，试剂盒包括至少两组、至少五组、至少10组、至少15组、至少20组、至少25组、至少30组、至少40组、至少50组、至少60组、至少75组或至少100组引物，每一组引物用于扩增由不同的靶RNA逆转录的cDNA，该不同的靶RNA能够与选自SEQ ID NO：1至86的序列和/或从包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸的靶RNA逆转录的cDNA特异性杂交。在一些实施方案中，试剂盒包括能够扩增从样品中的靶RNA逆转录的多于一种cDNA的至少一组引物。

在一些实施方案中，用于本文描述的组合物中的探针和/或引物包括脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，用于本文描述的组合物中的探针和/或引物包括脱氧核糖核苷酸和一种或多种核苷酸类似物，例如上文描述的LNA类似物或其他双链体稳定的核苷酸类似物。在一些实施方案中，用于本文描述的组合物中的探针和/或引物包括所有的核苷酸类似物。在一些实施方案中，探针和/或引物包括在互补性的区中的一种或多种双链体稳定的核苷酸类似物，例如LNA类似物。

在一些实施方案中，本文描述的组合物还包含探针，且在RT-PCR的情况下包含引物，该引物对用于标准化靶RNA的量的一种或多种管家基因特异。这样的探针(和引物)包括对选自U6 snRNA、RNU44、RNU48、U47、7SL scRNA、Ul snRNA、5.8S rRNA和U87scaRNA的管家基因的一种或多种产物特异的那些。

在一些实施方案中，用于本文描述的实时RT-PCR方法中的试剂盒还包括用于逆转录和扩增反应的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包括酶例如逆转录酶，和热稳定的DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于逆转录和扩增的脱氧核苷三磷酸(dNTP)。在另外的实施方案中，试剂盒包括被优化用于探针和引物的特异性杂交的缓冲剂。

4.2.1.RNA水平的示例性标准化

在一些实施方案中，靶RNA表达水平的定量需要进行假定：每细胞大约总RNA和在样品制备期间样品损失的程度。为了校正在不同样品之间或在不同条件下制备的样品之间的差异，在一些实施方案中，靶RNA的量被标准化为至少一种内源性管家基因的表达。

用作本文描述的方法中的参考基因的适当的基因包括在正常样品和来自败血症患者的样品之间或在不同的细胞系之间或在不同的生长和样品制备条件下关于其的产物的量不会变化的那些。在一些实施方案中，可用作本文描述的方法中的标准化对照的内源性管家基因包括但不限于，U6snRNA、RNU44、RNU48、U47、7SL scRNA、Ul snRNA、5.8S rRNA和U87scaRNA。在典型的实施方案中，用于标准化所测量的微RNA的量的至少一种内源性管家基因选自U6snRNA、RNU44、RNU48、U47、7SL scRNA、Ul snRNA、5.8S rRNA和U87scaRNA。在一些实施方案中，一种管家基因被用于标准化。在一些实施方案中，多于一种管家基因被用于标准化。

4.2.2.示例性的定性方法

在一些实施方案中，方法包括检测从人样品产生的靶RNA谱相比于正常靶RNA谱(在一些示例性的实施方案中，对照样品的靶RNA谱)的定性变化。表达谱中的一些定性变化表明来自受试者的样品中存在败血症。术语“靶RNA谱”是指关于同一样品中的多种靶RNA的同时表达的一组数据。

在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少10种、至少12种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种或至少40种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84和86的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少10种、至少11种、至少12种、至少15种或至少18种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：8、14、23、30、39、52、57、59、60、62、63、64、65、67、74、76、78和79的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少10种、至少11种、至少12种、至少15种或至少18种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：6、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、69和84的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74和78的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少10种、至少12种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种或至少35种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、37、41、42、43、44、53、54、55、61、66、68、77、80、81、82、83和85的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种靶RNA能够与包含选自SEQID NO：9、50、51、70、72和75的序列的核酸特异性杂交。

在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种或至少75种靶RNA能够与包含选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少75种或至少100种靶RNA包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种或至少25种靶RNA包含选自SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644和648的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种或至少25种靶RNA包含具有选自SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629和632的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种或至少70种靶RNA包含选自SEQ ID NO：226至289、565至604和863至868的序列的至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，多种靶RNA中的至少一种、至少两种、至少五种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种或至少75种靶RNA包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。在一些实施方案中，以其成熟形式的靶RNA包括少于30种核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA是微RNA。

用于制备靶RNA表达谱的定性的表达数据使用包括本文提供的分析方法的任何合适的分析方法来获得。

在一些实施方案中，例如，同时表达数据使用例如如上所描述的微阵列来获得。因此，除了用于如上所描述的特异性靶RNA的定量表达水平测定之外，可以采用包括具有与miRNome的相当大部分互补的序列的探针的微阵列来进行靶RNA基因表达谱分析，以分析靶RNA表达图案。

在一些实施方案中，不同的靶RNA信号与用于败血症的公认的标记物相关。在一些实施方案中，不同的靶RNA信号与用于由细菌感染引起的败血症例如用于由革兰氏阳性菌感染引起的败血症、由革兰氏阴性菌感染引起的败血症或由分枝杆菌感染引起的败血症的公认的标记物相关。在一些实施方案中，不同的靶RNA信号与用于由病毒感染引起的败血症的公认的标记物相关。在一些实施方案中，不同的靶RNA信号与用于由多重感染引起，例如由细菌和病毒共感染引起或由多于一种病毒或多于一种菌株共感染引起的败血症的公认的标记物相关。在一些实施方案中，不同的靶RNA信号直接地与败血症的严重性水平相关。

在一些实施方案中，根据表达谱分析方法，来自怀疑患有败血症的受试者的样品的总RNA被定量地逆转录以提供与样品中的RNA互补的一组标记的寡核苷酸。然后使寡核苷酸与包括靶RNA特异性探针的微阵列杂交以提供样品的杂交谱。结果是表示样品中的靶RNA的表达图案的样品的杂交谱。杂交谱包括来自从样品逆转录的寡核苷酸与微阵列中的靶RNA特异性探针的结合的信号。在一些实施方案中，谱被记录为结合的存在或不存在(信号对零信号)。在一些实施方案中，所记录的谱包括来自每一种杂交的信号强度。将该谱与从正常即非脓毒性样品或在一些实施方案中对照样品生成的杂交谱进行比较。信号的改变表明受试者中存在败血症。

4.3.示例性的另外的靶RNA

在一些实施方案中，组合检测能够与包含选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交的一种或多种靶RNA和/或检测包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸的一种或多种靶RNA和/或检测包含与选自SEQ IDNO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列的一种或多种靶RNA，本文的方法还包括检测与败血症相关的至少一种其他标记物的表达的水平。

在一些实施方案中，本文描述的方法还包括检测败血症相关的具有非规范发夹的小RNA的改变的表达。

在可选择的实施方案中，本文描述的方法还包括检测染色体共存体(codependent)，即，人基因组中倾向于被一起调节的彼此群集在附近的靶RNA。因此，在另外的实施方案中，该方法包括检测一种或多种靶微RNA的表达，每一种靶微RNA位于表2中的pre-微RNA序列的染色体位置至多50,000bp染色体内。

以下的实施例仅仅为了阐明的目的，且无论如何不具有限制性的意思。

5.实施例

5.1实施例1：来自单核细胞的微RNA

使用微阵列分析，证明了不同的微RNA响应于用病原体模拟物(激动剂)刺激而在单核细胞中被过度表达。

细胞系

从单核细胞细胞系THP-1(ATCC第TIB-202号)制备总RNA，THP-1是人外周血源的急性单核细胞性白血病细胞系。

单核细胞的刺激

THP-1细胞和来自健康供体的集中的人单核细胞两者用下面表5中所列的不同的Toll样受体(TLR)激动剂刺激。

表5

从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(Manassas，VA)获得THP-1细胞。使THP-1细胞在包含5％CO2的湿润的培养箱中在37℃在补充有10％FBS、1x非必需氨基酸、100单位/ml青霉素、100单位/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI介质1640中生长至250万每毫升的浓度。使用CD14阳性磁性微珠正选择(根据制造厂商的方案，Miltenyi Biotec)，从健康供体的全血(St Guy′s医院，UK)分离出人单核细胞。被分离的单核细胞然后在6孔板中用RPMI 1640介质培养至250万每毫升的浓度并在包含5％CO2的湿润的培养箱中在37℃下培养。

为了分析miRNA表达，将细胞用表5中上方示出的刺激物处理8h或24h。根据制造厂建议和出版物：Taganov，K.等人PNAS，103(33)，第12481-6页来选择浓度。

通过使用标准方案(Invitrogen)来分离总RNA。收获来自两个汇合的75cm²烧瓶的细胞(＝约10⁷个细胞)。根据制造厂商的方案使用

试剂，Invitrogen(Carlsbad，CA)制备总RNA。将所有的RNA样品在不含RNase的水中稀释并储存在-80℃(-112°F)。

RNA品质通过计算OD 260/280比率来评估。如使用AgilentBioanalyser 2100所评估的，所有的RNA样品的品质是高的，如通过图1中示出的在用激动剂Pam3CSK4刺激8h之后获得的来自人单核细胞系THP-1的总RNA的电泳图谱例示的。也获得来自其他细胞样品的总RNA的相似的电泳图谱。

微RNA纯化

微RNA纯化使用Flash PAGE Fractionator(Ambion)来执行。Ambion凝胶纯化方案富集包括微RNA的小于40核苷酸(nt)长的小RNA。简要地，使用Flash PAGE Fractionator将总RNA样品装载到预制凝胶上。小于40nt的总RNA部分(“微RNA部分”)在凝胶迁移之后被回收并被重新悬浮在不含核酸酶的水中。

微阵列分析

探针设计和点样

用于微阵列制备的寡核苷酸探针具有构型5′-NH₂-(C)₆-(间隔区)-(低聚物探针序列)-3′。5′-氨基允许化学品结合到阵列载体上。每一个还包括如下文所示的15nt的相同的间隔区序列，以防止寡核苷酸探针与阵列载体的非特异性相互作用：

5′氨基C6-TTGTAATACGACTCA-寡探针序列。表2中给出的(SEQ IDNO：933)探针序列省略接头。

按照Eurofins MWG Operon(Ebersberg，德国)根据标准方案来合成探针。Nexterion(Schott)微阵列载玻片用作微阵列的载体。

用于点样的寡核苷酸探针浓度是25μmol。使用Schott的设置有阵列玻璃载体的Nexterion点样缓冲液将探针点样，一式两份，且添加1％SDS(十二烷基硫酸钠)以允许更大的斑点尺寸(例如100-150微米，相比于没有SDS时为70-100微米)。所使用的点样机是配备有Stealth SMP3销(Telechem)的QArray mini(Genetix)。在一个系列的斑点沉积之后，将点样针用60mM NaOH洗涤5次，然后点样下一个系列的探针。每一个载玻片设计有32块经点样的探针，且每一个块是20×20平方的经点样的探针。将每一种探针点样，一式两份。将经点样的载玻片储存在4℃下，直到使用。

微RNA标记

微RNA部分的标记从出版的由the European Molecular BiologyGroup在EMBL(Heidelburg，德国)开发的方案(Castoldi等人，“Asensitive array for microRNA expression profiling(miChip)based onlocked nucleic acids(LNA)(基于锁核酸(LNA)的微RNA表达谱分析(miChip)的敏感阵列)”RNA 2006May；12(5)：913-20。Epub 2006年3月15日，通过引用以其整体并入本文)改编。简要地，将微RNA部分在4℃下用包含在用不含Rnase的水稀释至1X的Ambion缓冲剂中的10μM的染料标记的四核苷酸(5′-rUrUrUrU-Cy5-3′)(或可选择地，5′-rUrUrUrU-Cy3-3′)(Biospring，德国)、8％聚乙二醇(PEG)、2mM腺苷三磷酸(ATP)和T4RNA连接酶(0.7U/μl)的混合物温育6小时。标记反应通过在65℃加热混合物15分钟来进行。该程序将poly-U染料标记的尾部连接到所有微RNA的3′端部。标记的样品在杂交之前被储存在4℃。

阵列杂交

使用Discovery杂交站(Ventana，Tucson，AZ)使标记的微RNA部分与经点样的阵列杂交。简要地，将1％BSA、2X SSC和0.2％SDS的2mL混合物在42℃用芯片温育30min。然后，将芯片用EZ Prep缓冲剂(Ventana)洗涤一次且然后用Ribowash(Ventana)洗涤三次。接着，将20μl标记的微RNA混合物和180μl ChipHybeReagent(Ventana)添加到阵列中。将阵列在37℃加热6分钟，然后在42℃温育8小时，之后，停止加热。将芯片用Ribowash(Ventana)洗涤一次且然后在37℃加热2分钟。将芯片用Ribowash(Ventana)再次洗涤且添加一滴CheapClean(Ventana)，并在37℃温育2分钟。将芯片用Ribowash(Ventana)洗涤两次。将芯片储存干燥过夜。第二天，根据Ventana的Discovery杂交站的使用说明，进行最后的洗涤。将载玻片用2X SSC+0.2X SDS缓冲剂洗涤两次然后用0.1X SSC洗涤一次以上。将所有的载玻片使用来自Arrayit的高速离心机(TeleChemInternational，Sunnyvale，CA)在室温下干燥且在扫描之前保持在黑暗中。

作为ChipHybe Reagent溶液(溶液1)的替代物，以下溶液可以用于阵列杂交(溶液2)以形成探针：靶RNA杂化物，这是通过混合2份1.5X TMAC杂交溶液与1份(v∶v)样品以使最终的组分浓度为3MTMAC、0.10％Sarkosyl、50mM Tris和4mM EDTA，以及在阵列上在42℃温育8h进行的：

表6：1.5X TMAC杂交溶液

*TMAC是四甲基氯化铵

阵列图像采集

使用Axon^TM扫描仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)和它们的Genepix^TM软件来扫描阵列。图像以tif格式来格式化，由16位/像素(1600*1600)的图像色深度界定。在这样的设置，像素可以采取0到65,535范围内的强度值。展示最大强度值的像素是“饱和的”并被指派65,535的值。将阵列扫描的分辨率设置在10μm/像素。对于使用不同的荧光染料(例如，Cy5和Cy3)的杂交实验，将光电倍增管(PMT)调节到较高的强度斑点(Cy3在比Cy5低的PMT设置值下被扫描)。

阵列图像分析

激光扫描仪的PMT将载玻片的每一个给定的“点”的所捕获的荧光强度数字化并将数值储存为对应于该点的像素。然后分析主要由这些像素组成的照片。

图像分析的第一任务是使用被称为分割的过程来检测斑点位置。斑点被分割为具有可修改的或固定的半径的圆。为了可靠地分割和量化，斑点直径需要大于5-6种像素。在分割之前，提供给出斑点的大概位置的索引网格。分割本身检测网格圆附近的斑点界限。简要地，Genepix软件将一个圆指派给阵列上的每一个斑点(分割)。分割必须以稍微灵活的方式来进行，这是由于点样缺陷和/或载体变形，因为斑点几乎不在完美矩形的网格上。

在通过软件分割之后，对圆手工修饰并调整到斑点上，直到清楚地确定阵列上的所有斑点。在该阶段，如果阵列呈现高的背景噪声，阻止了真实的斑点与背景区分开，则拒绝该阵列进行进一步分析。

图像分析的第二任务是量化斑点和将数据输出到结果文件。只要斑点位于图像上，这是相对容易和明确的任务。最经常用来量化斑点强度的统计学方法是属于斑点的像素的平均值或中值。在存在离群像素时，中值方法比平均值更可靠。然而，在实践中，使用平均值或中值获得的结果存在很少差异。

阵列数据分析

所有的阵列数据使用R bioconductor程序包(Bioconductor：opensoftware development for computational biology and bioinformatics(Bioconductor：用于计算生物学和生物信息学的开放式软件开发)，Genome Biol.2004；5(10)：R80.Epub 2004年9月15日，其通过引用以其整体并入本文)来分析。

通过比较内部对照的斑点强度，首先测试阵列数据的品质。(表7和表8)一种内部对照(SEQ ID NO：178)被用作标记对照(在标记之前将该合成的RNA添加到纯化的微RNA部分)，且7种其他内部对照(SEQ ID NO：179-185)用于数据的标准化(在杂交之前将这些合成的RNA对照以每一种520fmol/阵列添加到总RNA部分中)。

表7

添加到总RNA或微RNA部分的内部对照

CGCGCGUCGCUUUAUCUACUGU	SEQ ID NO：178；CTL30_COMP
		UUAUCGUUCGAUAAGUCGCGUU	SEQ ID NO：179；CTL11_COMP
GAAGUUACUAUGUAGGCAACCU	SEQ ID NO：180；CTL23_COMP
		CGCGGGACUAAUUGUUACCGGG	SEQ ID NO：181；CTL26_COMP
UCGCGUCGAACUCCGCAACCGA	SEQ ID NO：182；CTL29_COMP
		ACCGAACGCCGUACCCAUCGGG	SEQ ID NO：183；CTL31_COMP
CCAGGGUAACGACUCUCGUGUC	SEQ ID NO：184；CTL36_COMP
		GCGUACCGACGCGUAGACGGAC	SEQ ID NO：185；CTL13_COMP

表8

微阵列实验中用于对照序列的杂交的探针

序列(5’-3’)	序列识别编号
		TTGTAATACGACTCAACAGTAGATAAAGCGACGCGCG	SEQ ID NO：186；CTL30
TTGTAATACGACTCAAACGCGACTTATCGAACGATAA	SEQ ID NO：187；CTL11
		TTGTAATACGACTCAAGGTTGCCTACATAGTAACTTC	SEQ ID NO：188；CTL23
TTGTAATACGACTCACCCGGTAACAATTAGTCCCGCG	SEQ ID NO：189；CTL26
		TTGTAATACGACTCATCGGTTGCGGAGTTCGACGCGA	SEQ ID NO：190；CTL29
TTGTAATACGACTCACCCGATGGGTACGGCGTTCGGT	SEQ ID NO：191；CTL31
		TTGTAATACGACTCAGACACGAGAGTCGTTACCCTCG	SEQ ID NO：192；CTL36
TTGTAATACGACTCACCCGGTAACAATTAGACCCGCG	SEQ ID NO：193；CTL26_MUT
		TTGTAATACGACTCAGTCCGTCTACGCGTCGGTACGC	SEQ ID NO：194；CTL13
TTGTAATACGACTCAGGCCGTCTACGCGTCGGTACGC	SEQ ID NO：195；CTL13_MUT

斑点强度高于平均值局部背景强度与1.5倍其标准偏差之和的所有序列被分类为经表达的微RNA。需要满足以下准则才能认为阵列强度数据对进一步分析是有效的：

1.杂交对照的特异性必须在接受准则内(例如，CTL26对其相应的单一碱基突变体CTL26MUT，或CTL13对其相应的单一碱基突变体CTL13MUT。

2.阳性对照的平行测定的信号强度接近相等

3.在基于每一块的阳性对照的中值块信号强度之间接近相等

4.在基于所有被检测的序列的中值阵列信号之间接近相等

5.纯化和标记对照(CTL30)的信号强度。

数据的统计学标准化通过计算Log2比率来进行，其中Log2比率等于双份斑点的平均强度信号/块的所有阳性对照的中值强度。每块被进行标准化以避免所有的阵列块的非同源标记。已经表明该逐块标准化比使用载玻片的全部标准化更有效。所获得的值是Log2值。

将来自THP-1细胞系的样品中的每一种寡核苷酸探针的斑点的强度与来自正常人单核细胞的样品中的每一种寡核苷酸探针的斑点的强度进行比较，得到每一种微RNA的相对表达的评估。

表达倍数变化相应于2(Log2比率)。Log2比率是在被比较的两种条件之间的比率，或log2(X细胞系/X正常)，其与(log2X细胞系-log2X正常)相同，其中X是测量的强度值。在没有来自“正常”条件的信号的情况下，实验中最低的所测量的强度值被用作计算倍数变化表达值的基线。小于零的倍数变化值相应于(1/倍数变化)倍数的下调。

数据被在表2中制成表，且包括响应于用一种或多种TLR激动剂的刺激而在单核细胞中被过度表达的所有微RNA。

5.2实施例2：来自Luminex平台上受激的单核细胞的微RNA的分析

Luminex技术(Luminex Corp.，Austin，TX)是基于对探针标记的珠的液相杂交，随后流式细胞仪检测具有不同比率的荧光染料的珠。具有高达100种不同的染料比率的珠是可得到的，使得能够同时地询问单一样品的高达100种分析物。

单核细胞样品

使用CD14阳性磁性微珠正选择(根据制造厂商的方案，MiltenyiBiotec)，从健康供体的全血分离出人单核细胞。被分离的单核细胞然后在包含5％CO²的湿润的培养箱中在37℃下在6孔板中用RPMI1640介质培养至250万每毫升的浓度。

单核细胞的刺激

为了分析miRNA表达，将细胞用表5中上方示出的刺激物处理8h或24h(实施例1)。

从单核细胞样品分离总RNA

对于用于刺激单核细胞的每一种激动剂，收获来自两个汇合的75cm²烧瓶的细胞(＝约10⁷个细胞)。根据制造厂商的方案使用

探针与Luminex珠的耦合

在分子生物学等级水中以0.1nmol/μL的浓度制备每一种5′-氨基-修饰的探针(具有结构5′氨基C6-探针序列，即，类似于实施例1中的结构，但没有接头序列)的等分试样。根据制造厂商的方案(Luminex珠耦合方案)使用碳二亚胺化学将探针耦合到珠。将探针耦合的珠储存在4℃。

用于Luminex分析的总RNA制剂

将8fmol的7种内部对照(用于阵列对照的相同的合成RNA)中的每一种添加到从患者样品分离出的总RNA部分。对于每一种样品，并行测定三份。对于每一份，使用250ng的总RNA。在与Luminex珠杂交之前，用小牛肠磷酸酶(CIP；Invitrogen)处理总RNA制剂以便防止形成树状聚体，树状聚体由单一RNA分子的环化或者与另一个RNA分子的拼接产生。用CIP进行预处理是根据制造厂商的方案，且移除5′-磷酸盐基团。

珠标记和杂交

在CIP处理之后，使用Vantage microRNA Labelling Kit(Marligen)用生物素标记总RNA部分。使用Marligen方案，将所标记的部分与Luminex珠杂交。简要地，将多核苷酸珠与Marligen杂交溶液(1.5×TMAC)以及所标记的总RNA混合。在暗处在60℃下执行杂交1小时。在杂交之后，使用Luminex标准6X SSPET洗涤缓冲剂(磷酸钠、氯化钠、EDTA、Triton X-100，pH 7.4)洗涤珠。

珠杂交的检测

使用抗生蛋白链菌素藻红蛋白(SAPE)(Europa Bioproducts，Cambridge，UK)来进行Luminex珠的检测。根据Luminex方案将SAPE添加到洗涤过的珠。然后使用以较好分辨率的高增益设定值的Luminex IS-200仪器来读取珠。

数据采集和分析

Luminex IS-200读取反应混合物中的每一种染料比率的至少25颗珠。每一种染料比率珠对应于特定的探针序列，且返回作为所有被读取的珠的平均值的强度值。使用合成的RNA对照或可选择地使用被表达的寡核苷酸的平均值来标准化平均荧光强度(MFI)数据，并且，使用Bioplex软件(Bio-Rad，Hercules，CA)和R bioconductor程序包(Bioconductor：open software development for computational biologyand bioinformatics(Bioconductor：用于计算生物学和生物信息学的开放式软件开发)，Genome Biol.2004；5(10)：R80.Epub 2004年9月15日)来计算在正常样品和受激样品或患病样品之间的倍率变化。

表9列出在与珠杂交之前可以被添加到总RNA的示例性的内部对照RNA。表10示出耦合到对照珠的相应的探针序列。

表9

被添加到总RNA部分的内部对照

CGCGCGUCGCUUUAUCUACUGU	SEQ ID NO：178；CTL30_COMP
		UUAUCGUUCGAUAAGUCGCGUU	SEQ ID NO：179；CTL11_COMP
GAAGUUACUAUGCAGGCAACCU	SEQ ID NO：180；CTL23_COMP
		CGCGGGACUAAUUGUUACCGGG	SEQ ID NO：181；CTL26_COMP
UCGCGUCGAACUCCGCAACCGA	SEQ ID NO：182；CTL29_COMP
		ACCGAACGCCGUACCCAUCGGG	SEQ ID NO：183；CTL31_COMP
CGAGGGUAACGACUCUCGUGUC	SEQ ID NO：184；CTL36_COMP
		GCGUACCGACGCGUAGACGGAC	SEQ ID NO：185；CTL13_COMP
CGCGAUAAACGCCGGAUGGACC	SEQ ID NO：944；CTL26_COMP
		UCGAGCGACUCCCGUAAUUUAA	SEQ ID NO：945；CTL35_COMP

表10

Luminex实验中用于对照序列的杂交的探针

序列(5’-3’)	序列识别编号
		ACAGTAGATAAAGCGACGCGCG	SEQ ID NO：934；CTL30b
AACGCGACTTATCGAACGATAA	SEQ ID NO：935；CTL11b
		AGGTTGCCTACATAGTAACTTC	SEQ ID NO：936；CTL23b
CCCGGTAACAATTAGTCCCGCG	SEQ ID NO：937；CTL26b
		TCGGTTGCGGAGTTCGACGCGA	SEQ ID NO：938；CTL29b
CCCGATGGGTACGGCGTTCGGT	SEQ ID NO：939；CTL31b
		GACACGAGAGTCGTTACCCTCG	SEQ ID NO：940；CTL36b
CCCGGTAACAATTAGACCCGCG	SEQ ID NO：941；CTL26b_MUT
		GTCCGTCTACGCGTCGGTACGC	SEQ ID NO：942；CTL13b
GGCCGTCTACGCGTCGGTACGC	SEQ ID NO：943；CTL13b_MUT
		GGTCCATCCGGCGTTTATCGCG	SEQ ID NO：946；CTL28
TTAAATTACGGGAGTCGCTCGA	SEQ ID NO：947；CTL35

分析

耦合珠的强度高于50MFI的所有序列被分类为经表达的微RNA。必须满足以下准则才能认为耦合珠强度数据对进一步分析是有效的：

1.阳性对照的平行测定的信号强度接近相等；

2.在基于每一个孔的阳性对照的中值孔信号强度之间接近相等；

3.在基于所有被检测的序列的中值孔信号之间接近相等。

数据的统计学标准化通过计算Log2比率来进行，其中Log2比率等于相同的珠(每一个都耦合于相同的寡序列)的50份平行测定的平均信号强度除以一个孔中的所有阳性对照的中值强度。每个孔被进行标准化以便避免板的所有孔的非同源标记。已经表明该逐孔标准化比使用板的全部标准化更有效。所获得的值是Log2值。

将来自健康供体的在不激活细胞的PMI介质中生长的单核细胞的样品中每一个耦合珠的珠强度与体外刺激(用TLR激动剂刺激或者在激活细胞的PMA介质中生长)的单核细胞中每一个耦合珠的珠强度进行比较，得到每一种微RNA的相对表达的评估。

表达倍数变化相应于2(Log2比率)。Log2比率是在被比较的两种条件之间的比率，或log2(X细胞系/X正常)，其与(log2X细胞系-log2X正常)相同，其中X是测量的强度值。在没有来自“正常”条件的信号的情况下，实验中最低的所测量的强度值被用作计算倍数变化表达值的基线。小于零的倍数变化值相应于(1/倍数变化)倍数的下调。上调或下调的两倍变化被认为是显著的。

5.3实施例3：确定微RNA的生物信息学分析

为了确定用例如表2中示出的探针检测的微RNA，使用探针序列来分析小RNA测序(smRNAeq)数据集以便确定由那些序列检测的经表达的微RNA。该分析确定了带有精确端部的11个序列，端部对应于11个臂。在表11中示出那些11个候选微RNA序列。

表11：对应于探针的微RNA候选序列

臂名称	微RNA候选序列5′-＞3′	SEQ ID
			4214-R	CCCCTGCAGAGCTCACA	215
6511-R	AATAGATATTATGTTTTA	216
			7997-L	TAGTGTAACGGAAATGTTTACA	217
6433-L	AAGGCTGAGCAGCAGAGGCAGCAAGAGC	218
			3995-L	TGGCCTGACGTGAGGAGG	219
6192-L	TGGGTGGGTGGTTTTTT	220
			6998-L	TTCTCCACTGTGCTGCTACC	221
9654-L	AGCTATGCTCACTCTCAA	222
			4504-L	AAATCAATAAATAATCAG	223
5230-L	TGTGTTGGGTGACCCTGG	224
			4440-L	GCCCAGTGCTCTGAATGTCAAA	225

5.4实施例5：确定与败血症相关的微RNA的序列测定分析

来自败血症患者的总RNA用于制备smRNAeq数据集。简要地，5μg的总RNA被用于在Solexa GA II(Illumina)上使用由生产商提供的标准库和测序方案的小RNA测序。

然后将微RNA在败血症smRNAeq数据集中出现的次数与相同的微RNA在77个非败血症患者smRNAeq数据集中的每一个中出现的次数进行比较。当败血症smRNAeq数据集包含特定微RNA的最高数量的计数时，它被指派为等级1。当败血症smRNAeq数据集包含特定微RNA的第二最高数量的计数时，它被指派为等级2，等等。保留等级在1和5之间的所有候选。表12中示出对应于165个不同臂的总计175种候选微RNA序列，以及被指派给每一序列的等级。当微RNA具有多个isomir时，将所有isomir的所有计数的和用于比较。此外，当特定微RNA序列的前体基因存在于基因组中的多个位置时，示出具有相同等级和相同序列的两种候选名称。在败血症患者样品中，那些候选物中的任一种或两种可以以增加的水平存在。

表12：败血症smRNAeq数据集中以较高数量存在的新颖的微 RNA

表13示出在表12中列出的微RNA的预测的微RNA前体序列。

执行相似的分析以确定相比于77个非败血症患者smRNAeq数据集在败血症患者样品中处于增加的水平的miRBase(人版本14.0)中的微RNA。再次，微RNA被分级为从1到5，这取决于败血症患者smRNAeq数据集是否包含最高数量的计数的特定微RNA、第二最高数量的计数的特定微RNA等等。

表14：来自在败血症smRNAeq数据集中以较高数量存在的miRBase的微RNA

表15中示出在表14中列出的微RNA的微RNA前体序列。

最终，相似的分析确定在败血症smRNAeq数据集中以增加的水平存在的miRBase(人版本14.0)中的新颖的星型微RNA。尽管前体和成熟微RNA是在miRBase中，但该分析中确定的新颖的星型微RNA不在miRBase中。再次，微RNA被分级为从1到5，这取决于败血症患者smRNAeq数据集是否包含最高数量的计数的特定微RNA、第二最高数量的计数的特定微RNA等等。结果在表16中示出。

表16：败血症smRNAeq数据集中上调的新颖的星型微RNA

表17中示出在表16中列出的微RNA的微RNA前体序列。

5.6实施例6：来自smRNAeq数据集的微RNA计数比率的分析

表18示出对于败血症计数/其他数据集平均计数的比率为2或更高的每一种新颖的微RNA，败血症smRNAeq数据集中的计数的数量与来自所有其他smRNAeq数据集的计数的平均数量的比率。

表18：具有比其他数据集中的平均计数高至少2倍的计数的新颖的微RNA

微RNA 13446-R、13642-R、13661-R、13677-L、13694-L、13719-L、13729-L、14086-L、14093-L、14111-L、14113-L、14177-L、14371-R、14482-R、6415-R、13640-L、14085-L和14556-R(SEQ ID NO分别为：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342和352)在败血症smRNAeq数据集中具有比其他数据集中的平均计数大至少5倍的计数。在那些中，微RNA 13446-R、13642-R、13677-L、14086-L、14093-L、14177-L和6415-R(SEQ ID NO分别为：231、236、242、260、261、266和287)在败血症smRNAeq数据集中具有比其他数据集中的平均计数大至少10倍的计数。

表19示出对于来自miRBase的败血症计数/其他数据集平均计数的比率为2或更高的每一种微RNA，败血症smRNAeq数据集的计数的数量与来自所有其他smRNAeq数据集的计数的平均数量的比率。

表19：具有比其他数据集中的平均计数高至少2倍的计数的微 RNA

微RNA miR-140-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-144*、miR-144、miR-1537、miR-15a、miR-16-1*、miR-185*、miR-2115*、miR-223、miR-223*、miR-451、miR-548f、miR-618、miR-627、miR-148a*、miR-450b-5p、miR-503、miR-140-3p、miR-146a、miR-146b-5p、miR-17*、miR-199b-5p、miR-29b-2*、miR-425*、miR-454*、miR-542-3p和miR-598(SEQ ID NO分别为：566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644和648)在败血症smRNAeq数据集中具有比其他数据集中的平均计数大至少5倍的计数。在那些中，微RNA miR-140-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-144*、miR-144、miR-15a、miR-223、miR-223*、miR-451、miR-618、miR-627、miR-148a*、miR-140-3p、miR-146b-5p和miR-17*(SEQ ID NO分别为：566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629和632)在败血症smRNAeq数据集中具有比其他数据集中的平均计数大至少10倍的计数。

在本申请中引用的所有的出版物、专利、专利申请和其他文件据此为了所有目的通过引用以其整体并入，如同单独地表明每一个单个出版物、专利、专利申请或其他文件为了所有目的通过引用并入。

尽管已经阐明和描述了各种具体的实施方案，但应明白，可以做出变化而不偏离本发明的精神和范围。

Claims

1.一种用于检测受试者中败血症的存在的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的至少一种靶RNA的水平，其中所述至少一种靶RNA：

(i)能够与具有选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交；或

(ii)包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列；或

(iii)包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸；

其中所述样品中的至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明所述受试者中存在败血症。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括比较所述样品中的至少一种靶RNA的水平与所述至少一种靶RNA的正常水平。

3.一种便于检测受试者中败血症的方法，包括：

(a)检测来自所述受试者的样品中的至少一种靶RNA的水平，其中所述至少一种靶RNA：

(iii)包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸；和

(b)将所述检测的结果传送至医师以便确定所述受试者是否患有败血症。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测样品中的至少一种靶RNA的水平包括：

(a)使所述样品的核酸与与所述样品中的靶RNA或其补体互补的至少一种多核苷酸杂交；和

(b)检测包含与选自所述靶RNA、所述靶RNA的DNA扩增子和所述靶RNA的补体的至少一种核酸杂交的多核苷酸的至少一种复合物。

5.一种用于检测受试者中败血症的存在的方法，包括：

(a)从所述受试者获得样品，

(b)给实验室提供所述样品以便检测所述样品中的至少一种靶RNA的水平，其中所述至少一种靶RNA：

(c)从所述实验室接收指示所述样品中的所述至少一种靶RNA的水平的信息；

其中至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括从所述样品分离核酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸包括已与DNA分离的RNA。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以其成熟形式的至少一种靶RNA包含少于30个核苷酸。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA是微RNA。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测至少两种靶RNA的水平，其中所述靶RNA中的至少两种：

(iii)包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸；且其中所述至少两种靶RNA是不同的。

11.根据权利要求10所述的方法，其中检测到至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。

12.根据权利要求10所述的方法，其中检测到至少两种靶RNA的水平大于所述至少两种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。

13.根据权利要求10所述的方法，其中检测至少三种靶RNA的水平，其中所述靶RNA中的至少三种：

(iii)包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸；且其中所述至少三种靶RNA是不同的。

14.根据权利要求13所述的方法，其中检测到至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。

15.根据权利要求13所述的方法，其中检测到至少两种靶RNA的水平大于所述至少两种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。

16.根据权利要求13所述的方法，其中检测到至少三种靶RNA的水平大于所述至少三种靶RNA的正常水平就表明存在败血症。

17.根据权利要求10所述的方法，其中检测至少五种靶RNA的水平。

18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中检测以下至少一种靶RNA的水平：

(i)不与具有选自SEQ ID NO：1至86的序列的核酸特异性杂交；或

(ii)不包含与选自SEQ ID NO：1至86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列；和

(iii)不包含选自SEQ ID NO：196至399、565至707和863至897的序列的至少15个连续核苷酸。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

(a)能够与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、35、36、37、41、42、43、44、53、54、55、60、61、63、65、66、68、71、77、80、81、82、83和85的序列特异性杂交；或

(b)包含与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、10、12、16、18、22、24、25、26、28、30、31、32、35、36、37、41、42、43、44、53、54、55、60、61、63、65、66、68、71、77、80、81、82、83和85的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。

20.根据权利要求19所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明存在由病毒感染引起的败血症。

21.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

(a)能够与选自SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84和86的序列特异性杂交；或

(b)包含与选自SEQ ID NO：6、8、11、13、14、15、17、19、20、21、23、27、29、30、33、34、35、38、39、45、46、47、48、49、52、56、57、58、59、60、62、63、64、65、67、69、71、73、74、76、78、79、84和86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。

22.根据权利要求21所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明存在由细菌感染引起的败血症。

23.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

(a)能够与选自SEQ ID NO：6、11、13、15、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、56、58、69、71、73、76、84和86的序列特异性杂交；或

(b)包含与选自SEQ ID NO：6、11、13、15、17、19、20、21、27、29、33、34、35、38、45、46、47、48、49、56、58、69、71、73、76、84和86的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。

24.根据权利要求23所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明存在由革兰氏阴性菌的感染引起的败血症。

25.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

(a)能够与选自SEQ ID NO：23、30、39、52、57、60、65、67和79的序列特异性杂交；或

(b)包含与选自SEQ ID NO：23、30、39、52、57、60、65、67和79的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。

26.根据权利要求25所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明存在由革兰氏阳性菌的感染引起的败血症。

27.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

(a)能够与选自SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74和78的序列特异性杂交；或

(b)包含与选自SEQ ID NO：8、14、59、62、63、64、74和78的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。

28.根据权利要求27所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明存在由革兰氏阳性菌或分枝杆菌的感染引起的败血症。

29.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

(a)能够与选自SEQ ID NO：9、50、51、70、72和75的序列特异性杂交；或

(b)包含与选自SEQ ID NO：9、50、51、70、72和75的序列的至少15个连续核苷酸互补的序列。

30.根据权利要求29所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明存在由细菌感染、病毒感染或两者引起的未甲基化的CpG核酸。

31.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

32.根据权利要求31所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明识别病毒衍生的分子的至少一种toll样受体的刺激。

33.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

34.根据权利要求33所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明识别细菌衍生的分子的至少一种toll样受体的刺激。

35.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

36.根据权利要求35所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明识别革兰氏阳性菌衍生的分子的至少一种toll样受体的刺激。

37.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

38.根据权利要求37所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明识别革兰氏阳性菌衍生的分子的至少一种toll样受体的刺激。

39.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

40.根据权利要求39所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明识别革兰氏阳性菌衍生的分子、分枝杆菌衍生的分子或两者的至少一种toll样受体的刺激。

41.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA：

42.根据权利要求41所述的方法，其中检测到所述至少一种靶RNA的水平大于所述至少一种靶RNA的正常水平就表明识别由细菌感染、病毒感染或两者引起的未甲基化的CpG核酸的至少一种toll样受体的刺激。

43.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA包含选自SEQ ID NO：226至289、565至604和863至868的序列的至少15个连续核苷酸。

44.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA包含选自SEQ ID NO：231、236、237、242、245、253、260、261、262、263、266、269、275、287、303、342、352、566、567、568、571、570、573、574、575、577、579、580、581、588、591、598、601、608、612、613、624、626、629、632、635、637、641、642、644和648的序列的至少15个连续核苷酸。

45.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中至少一种靶RNA包含选自SEQ ID NO：231、236、242、260、261、266、287、566、567、568、571、570、574、580、581、588、598、601、608、624、626、629和632的序列的至少15个连续核苷酸。

46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中来自所述受试者的所述样品是血样。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述样品是单核细胞。

48.一种包括第一区的合成多核苷酸，其中所述第一区包括与SEQ ID NO：1至67和215至399中的一个的至少8个连续核苷酸的序列相同或互补的至少8个连续核苷酸的序列。

49.根据权利要求48所述的合成多核苷酸，其中所述第一区包括与SEQ ID NO：1至67和215至399中的一个的至少9个连续核苷酸的序列相同或互补的至少9个连续核苷酸的序列。

50.根据权利要求48所述的合成多核苷酸，其中所述第一区包括与SEQ ID NO：1至67和215至399中的一个的至少10个连续核苷酸的序列相同或互补的至少10个连续核苷酸的序列。

51.根据权利要求48所述的合成多核苷酸，其中所述第一区包括与具有SEQ ID NO：1至67和215至399中的一个的至少12个连续核苷酸的序列相同或互补的至少12个连续核苷酸的序列。

52.根据权利要求48至51中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述多核苷酸包括可检测标记。

53.根据权利要求52所述的合成多核苷酸，其中所述可检测标记是FRET标记。

54.根据权利要求48至53中任一项所述的合成多核苷酸，其中所述第一区与靶RNA的区相同或互补。

55.根据权利要求54所述的合成多核苷酸，其中所述多核苷酸还包括与所述靶RNA的区不相同或不互补的第二区。

56.一种组合物，包含多种合成多核苷酸，其中至少一种多核苷酸包括第一区，所述第一区包括与SEQ ID NO：1至67和215至399中的一个或多个的至少8个连续核苷酸的序列相同或互补的至少8个连续核苷酸的序列。

57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述多种合成多核苷酸中的至少两种多核苷酸包括第一区，所述第一区包括与具有SEQID NO：1至67和215至399中的一个或多个的至少9个连续核苷酸的序列相同或互补的至少9个连续核苷酸的序列，且其中所述至少两种多核苷酸的第一区是不同的。

58.根据权利要求56所述的组合物，其中所述多种合成多核苷酸中的至少三种多核苷酸包括第一区，所述第一区包括与具有SEQID NO：1至67和215至399中的一个或多个的至少10个连续核苷酸的序列相同或互补的至少10个连续核苷酸的序列，且其中所述至少三种多核苷酸的第一区是不同的。

59.根据权利要求56所述的组合物，其中所述多种合成多核苷酸中的至少五种多核苷酸包括第一区，所述第一区包括与SEQ IDNO：1至67和215至399中的一个或多个的至少12个连续核苷酸的序列相同或互补的至少12个连续核苷酸的序列，且其中所述至少五种多核苷酸的所述第一区是不同的。

60.一种试剂盒，包括权利要求48至55中任一项所述的合成多核苷酸。

61.一种试剂盒，包括权利要求56至59中任一项所述的组合物。

62.根据权利要求60或权利要求61所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括至少一种聚合酶。

63.根据权利要求60至62中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括dNTP。