ES2534300T3 - Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN - Google Patents

Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico de miARN sintético que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-10 humana madura para su uso como un medicamento.

Description

imagen1
Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular. Más particularmente, se refiere a
5 procedimientos y composiciones que implican moléculas de ácido nucleico que simulan microARN (miARN) y que inhiben miARN. Se describen procedimientos y composiciones que implican miARN sintéticos y moléculas inhibidoras de miARN. Además, también se describen procedimientos y composiciones para identificar miARN que contribuyen a procesos celulares. Además, la identificación de miARN que contribuyen a procesos celulares proporciona dianas para intervención terapéutica así como análisis de diagnóstico y/o pronóstico.
10 2. Descripción de la técnica relacionada
En 2001, varios grupos usaron un nuevo procedimiento de clonación para aislar e identificar un gran grupo de “microARN” (miARN) de C. elegans, Drosophila y seres humanos (Lagos-Quintana y col., 2001; Lau y col., 2001; Lee y Ambros, 2001). Se han identificado varios cientos de miARN en plantas y animales, incluyendo seres humanos, que no parecen tener ARNip endógenos. Por lo tanto, aunque son similares a los ARNip, los miARN son
15 no obstante distintos.
Los miARN observados hasta la fecha han sido de aproximadamente 21-22 nucleótidos de longitud y surgen de precursores más largos, que se transcriben de genes no codificantes de proteínas. Véase la revisión de Carrington y col. (2003). Los precursores forman estructuras que se pliegan entre sí en regiones autocomplementarias; después se procesan por la nucleasa Dicer en animales o DCL1 en plantas. Las moléculas de miARN interrumpen la
20 traducción mediante formación de pares de bases precisa o imprecisa con sus dianas.
Los miARN parecen estar implicados en la regulación génica. Algunos miARN, incluyendo lin-4 y let-7, inhiben la síntesis proteica uniéndose con regiones no traducidas 3’ parcialmente complementarias (3’ UTR) de ARNm diana. Otros, incluyendo el miARN Scarecrow hallado en plantas, actúan como ARNip y se unen con secuencias de ARNm perfectamente complementarias para destruir el transcrito diana (Grishok y col., 2001).
25 La investigación sobre microARN está aumentando a medida que los científicos comienzan a apreciar el papel general que estas moléculas desempeñan en la regulación de la expresión génica eucariota. Los dos miARN mejor entendidos, lin-4 y let-7, regulan la temporización del desarrollo en C. elegans regulando la traducción de una familia de ARNm clave (revisado en Pasquinelli, 2002). Se han identificado varios cientos de miARN en C. elegans, Drosophila, ratón y seres humanos. Como se esperaría para moléculas que regulan la expresión génica, se ha
30 mostrado que los niveles de miARN varían entre tejidos y estados del desarrollo. Además, un estudio muestra una fuerte correlación entre la expresión reducida de dos miARN y la leucemia linfocítica crónica, proporcionando una posible conexión entre miARN y cáncer (Calin, 2002). Aunque el campo aún es joven, se especula que los miARN podrían ser tan importantes como los factores de transcripción en la regulación de la expresión génica en eucariotas superiores.
35 Hay algunos ejemplos de miARN que desempeñan papeles críticos en la diferenciación celular, desarrollo temprano y procesos celulares como apoptosis y metabolismo de grasas. lin-4 y let-7 regulan ambos el paso de un estado larvario a otro durante el desarrollo de C. elegans (Ambros, 2003). Mir-14 y bantam son miARN de Drosophila que regulan la muerte celular, aparentemente regulando la expresión de genes implicados en la apoptosis (Brennecke y col., 2003, Xu y col., 2003). El miR14 también se ha implicado en el metabolismo de grasas (Xu y col., 2003). Lsy-6 y
40 miR-273 son miARN de C. elegans que regulan la simetría en neuronas quimiosensoriales (Chang y col., 2004). Otro miARN animal que regula la diferenciación celular es miR-181, que guía la diferenciación de células hematopoyéticas (Chen y col., 2004). Estas moléculas representan la serie completa de miARN animales con funciones conocidas. Además, el documento WO03/029459 desvela el miARN miR-10. El entendimiento potenciado de las funciones de miARN revelará sin duda redes reguladoras que contribuyan al desarrollo normal, diferenciación,
45 comunicación inter e intracelular, ciclo celular, angiogénesis, apoptosis y muchos otros procesos celulares. Dados sus papeles importantes en muchas funciones biológicas, es probable que los miARN ofrezcan puntos importantes para intervención terapéutica o análisis de diagnóstico.
Caracterizar las funciones de biomoléculas como miARN implica con frecuencia introducir las moléculas en células o retirar las moléculas de células y medir el resultado. Si la introducción de un miARN en células da como resultado 50 apoptosis, entonces el miARN participa sin duda en una ruta apoptótica. Se han descrito procedimientos para introducir o retirar miARN de células. Dos publicaciones recientes describen moléculas antisentido que pueden usarse para inhibir la actividad de miARN específicos (Meister y col., 2004; Hutvagner y col., 2004). Otra publicación describe el uso de plásmidos que se transcriben por ARN polimerasas endógenas y producen miARN específicos cuando se usan para transfectar células (Zeng y col., 2002). Estos dos conjuntos de reactivos se han usado para
55 evaluar miARN individuales.
Una limitación del sistema de expresión de miARN basado en plásmidos es que las eficacias de transfección para plásmidos tienden a ser muy bajas, expresando solamente aproximadamente el 50 % de las células ARN del plásmido en células que son fáciles de transfectar. Las eficacias de transfección para plásmidos en células primarias son mucho más bajas, expresando menos del 10 % de las células típicamente el ARN deseado. Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones y procedimientos alternativos para introducir moléculas de miARN en células de modo que puedan caracterizarse y estudiarse.
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5 Sumario de la invención
La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico de miARN sintética que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-10 humana madura como un medicamento, incluyendo para su uso en una terapia de un cáncer. También se proporciona un ácido nucleico de miARN sintético bicatenario de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un polinucleótido que tiene una
10 secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de miR-10 madura que comprende los nucleótidos 22-44 de SEC ID Nº: 20 y nucleótidos 27-48 de SEC ID Nº: 21 y un segundo polinucleótido separado cuya secuencia de 5’ a 3’ es entre 60 % y 100 % complementaria del primer polinucleótido para su uso como un medicamento.
También se proporciona el uso de un ácido nucleico de miARN sintético como se ha mencionado anteriormente para
15 reducir o aumentar la viabilidad celular o proliferación celular o para inducir o inhibir la apoptosis, a condición de que se excluyan procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia. Se definen realizaciones adicionales de la invención en las reivindicaciones. La siguiente descripción detallada se refiere a la presente invención en la medida del alcance de las reivindicaciones.
El término “miARN” se usa de acuerdo con su significado habitual y corriente y se refiere a una molécula de
20 microARN hallada en eucariotas que está implicada en la regulación génica basada en ARN. Véase, por ejemplo, Carrington y col., 2003, que se incorpora por la presente por referencia. En general, el término se usará para hacer referencia a la molécula de ARN monocatenaria procesada a partir de un precursor. Se han identificado miARN individuales y se han secuenciado en diferentes organismos, y se les han dado nombres. Se proporcionan en el presente documento nombres de miARN y sus secuencias.
25 La presente invención se refiere, en algunas realizaciones de la invención, a moléculas de ácido nucleico cortas que actúan como miARN o como inhibidores de miARN en una célula. El término “corto” se refiere a una longitud de un único polinucleótido que es de 150 nucleótidos o menos. Las moléculas de ácido nucleico son sintéticas. El término “sintético” significa que la molécula de ácido nucleico está aislada y no es idéntica en su secuencia (la secuencia completa) y/o estructura química a una molécula de ácido nucleico de origen natural, tal como una molécula de
30 miARN precursora endógena. Aunque en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención no tienen una secuencia completa que es idéntica a una secuencia de un ácido nucleico de origen natural, dichas moléculas pueden abarcar toda o parte de una secuencia de origen natural. Se contempla, sin embargo, que puede posteriormente modificarse o alterarse un ácido nucleico sintético administrado a una célula en la célula de modo que su estructura o secuencia sea la misma que la del ácido nucleico no sintético o de origen natural, tal como una
35 secuencia de miARN madura. Por ejemplo, un ácido nucleico sintético puede tener una secuencia que difiere de la secuencia de un miARN precursor, pero esa secuencia puede alterarse una vez en una célula para ser igual que un miARN endógeno, procesado. El término “aislado” significa que las moléculas de ácido nucleico de la invención se separan inicialmente de moléculas de ácido nucleico diferentes (con respecto a secuencia o estructura) y no deseadas de modo que una población de ácidos nucleicos aislados sea al menos aproximadamente 90 %
40 homogénea, y pueden ser al menos aproximadamente 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % homogéneas con respecto a otras moléculas polinucleotídicas. En muchas realizaciones de la invención, un ácido nucleico se aísla en virtud de haberse sintetizado in vitro separado de ácidos nucleicos endógenos en una célula. Se entenderá, sin embargo, que los ácidos nucleicos aislados pueden posteriormente mezclarse o agruparse entre sí.
Por supuesto, se entiende que un “ácido nucleico sintético” de la invención significa que el ácido nucleico no tiene
45 una estructura química o secuencia de un ácido nucleico de origen natural. En consecuencia, se entenderá que la expresión “miARN sintético” se refiere a un “ácido nucleico sintético” que actúa en una célula o en condiciones fisiológicas como un miARN de origen natural.
Se entenderá que la expresión “de origen natural” se refiere a algo hallado en un organismo sin ninguna intervención por una persona; podría referirse a una molécula de origen natural de tipo silvestre o mutante. En algunas 50 realizaciones una molécula de miARN sintética no tiene la secuencia de una molécula de miARN de origen natural. En otras realizaciones, una molécula de miARN sintética puede tener la secuencia de una molécula de miARN de origen natural, pero la estructura química de la molécula, particularmente en la parte no relacionada específicamente con la secuencia precisa (estructura química no de secuencia) difiere de la estructura química de la molécula de miARN de origen natural con esa secuencia. En algunos casos, el miARN sintético tiene una estructura química 55 tanto de secuencia como no de secuencia que no se encuentra en un miARN de origen natural. Además, la secuencia de las moléculas sintéticas identificará qué miARN se proporciona o inhibe eficazmente; el miARN endógeno se denominará “miARN correspondiente”. Las secuencias de miARN correspondientes incluyen, pero sin limitación, las secuencias en SEC ID Nº: 1-593. Además, los ácidos nucleicos sintéticos pueden incluir SEC ID Nº: 594-703 así como cualquier otra secuencia de miARN, secuencia precursora de miARN o cualquier secuencia 60 complementaria de la misma. En algunas realizaciones, la secuencia es o deriva de una secuencia sonda que se ha
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Los miARN sintéticos de la invención son ARN o análogos de ARN en algunas realizaciones de la invención. Los inhibidores de miARN pueden ser ADN o ARN, o análogos de los mismos. Los miARN e inhibidores de miARN se 5 denominan colectivamente “ácidos nucleicos sintéticos”.
En algunas realizaciones, hay un miARN sintético que tiene una longitud de entre 17 y 25 restos. La presente invención se refiere a moléculas de miARN sintéticas que son de, son al menos de, o son como máximo de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,
10 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 o 125 restos de longitud, o cualquier intervalo derivable en el mismo.
En ciertas realizaciones, los miARN sintéticos tienen a) una “región de miARN” cuya secuencia de 5’ a 3’ es idéntica a una secuencia de miARN madura, y b) una “región complementaria” cuya secuencia de 5’ a 3’ es entre 60 % y 100
15 % complementaria de la secuencia de miARN. En ciertas realizaciones, estos miARN sintéticos también están aislados, como se ha definido anteriormente. La expresión “región de miARN” se refiere a una región en el miARN sintético que es al menos 80 % idéntica a la secuencia completa de una secuencia de miARN madura, de origen natural. En ciertas realizaciones, la región de miARN es o es al menos 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 o 100 % idéntica a la secuencia de un miARN de origen natural.
20 La expresión “región complementaria” se refiere a una región de un miARN sintético que es o es al menos 60 % complementaria de la secuencia de miARN madura, de origen natural a la que es idéntica la región de miARN. La región complementaria es o es al menos 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 o 100 % complementaria, o cualquier intervalo derivable del mismo. Con secuencias polinucleotídicas
25 individuales, hay una estructura de bucle en horquilla como resultado del enlace químico entre la región de miARN y la región complementaria. En otras realizaciones, la región complementaria está en una molécula de ácido nucleico diferente que la región de miARN, en cuyo caso la región complementaria está en la cadena complementaria y la región de miARN está en la cadena activa.
En algunas realizaciones de la invención, un miARN sintético contiene uno o más elementos de diseño. Estos
30 elementos de diseño incluyen, pero sin limitación: i) un grupo de reemplazo para el fosfato o hidroxilo del nucleótido en el extremo 5’ de la región complementaria; ii) una o más modificaciones de azúcares en los primeros o últimos 1 a 6 restos de la región complementaria; o iii) no complementariedad entre uno o más nucleótidos en los últimos 1 a 5 restos en el extremo 3’ de la región complementaria y los nucleótidos correspondientes de la región de miARN.
En ciertas realizaciones, un miARN sintético tiene un nucleótido en su extremo 5’ de la región complementaria en el
35 que el grupo fosfato y/o hidroxilo se ha reemplazado con otro grupo químico (denominado “diseño de reemplazo”). En algunos casos, el grupo de fosfato se reemplaza, mientras que en otros, se ha reemplazado el grupo hidroxilo. En realizaciones particulares, el grupo de reemplazo es biotina, un grupo amina, un grupo de alquilamina inferior, un grupo acetilo, 2’O-Me (2’oxígeno-metilo), DMTO (4,4’-dimetoxitritilo con oxígeno), fluoresceína, un tiol, o acridina, aunque se conocen bien otros grupos de reemplazo por los expertos en la materia y también pueden usarse. Este
40 elemento de diseño también puede usarse con un inhibidor de miARN.
Realizaciones adicionales se refieren a un miARN sintético que tiene una o más modificaciones de azúcares en los primeros o últimos 1 a 6 restos de la región complementaria (denominado el “diseño de reemplazo de azúcares”). En ciertos casos, hay una o más modificaciones de azúcares en los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más restos de la región complementaria, o cualquier intervalo derivable del mismo. En casos adicionales, hay una o más modificaciones de 45 azúcares en los 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más restos de la región complementaria, o cualquier intervalo derivable del mismo, tienen una modificación de azúcar. Se entenderá que los términos “primero” y “último” son con respecto al orden de los restos del extremo 5’ al extremo 3’ de la región. En realizaciones particulares, la modificación de azúcares es una modificación de 2’O-Me. En realizaciones adicionales, hay una o más modificaciones de azúcares en los primeros o últimos 2 a 4 restos de la región complementaria o los primeros o últimos 4 a 6 restos de la región complementaria.
50 Este elemento de diseño también puede usarse con un inhibidor de miARN. Por lo tanto, un inhibidor de miARN puede tener este elemento de diseño y/o un grupo de reemplazo en el nucleótido en el extremo 5’, como se ha analizado anteriormente.
En otras realizaciones de la invención, hay un miARN sintético en el que uno o más nucleótidos en los últimos 1 a 5 restos en el extremo 3’ de la región complementaria no son complementarios de los nucleótidos correspondientes de
55 la región de miARN (“no complementariedad”) (denominado el “diseño de no complementariedad”). La no complementariedad puede estar en los últimos 1, 2, 3, 4 y/o 5 restos del miARN complementario. En ciertas realizaciones, hay no complementariedad con al menos 2 nucleótidos en la región complementaria.
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La región de miARN y la región complementaria pueden estar en el mismo polinucleótido o polinucleótidos
5 separados. En casos en los que estén contenidos sobre o en el mismo polinucleótido, la molécula de miARN se considerará un polinucleótido individual. En realizaciones en las que las diferentes regiones estén en polinucleótidos separados, se considerará que el miARN sintético está comprendido por dos polinucleótidos.
Cuando la molécula de ARN es un único polinucleótido, hay una región enlazadora entre la región de miARN y la región complementaria. En algunas realizaciones, el polinucleótido individual es capaz de formar una estructura de
10 bucle en horquilla como resultado del enlace entre la región de miARN y la región complementaria. El enlazador constituye el bucle en horquilla. Se contempla que en algunas realizaciones, la región de engarce es, es al menos, o es como máximo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 restos de longitud, o cualquier intervalo derivable del mismo. En ciertas realizaciones, el engarce es de entre 3 y 30 restos (inclusive) de longitud.
15 Además de tener una región de miARN y una región complementaria, puede haber secuencias flanqueantes también en el extremo 5’ o 3’ de la región. En algunas realizaciones, hay o hay al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleótidos
o más, o cualquier intervalo derivable del mismo, flanqueando uno o ambos extremos de estas regiones.
Los ácidos nucleicos sintéticos analizados anteriormente y en el presente documento pueden usarse en procedimientos de la invención. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los procedimientos implican ácidos nucleicos
20 sintéticos con los diferentes diseños en ellos.
Las características de las células que pueden evaluarse no están limitadas. Incluyen las siguientes características y características asociadas con lo siguiente: proliferación celular, índice mitótico, ciclo celular, apoptosis, motilidad, adhesión, transducción de señal, localización proteica, expresión génica, localización de ARN, división celular, replicación de ADN, modificación postraduccional, diferenciación, desdiferenciación, activación de la transcripción,
25 activación de proteínas, angiogénesis, metabolismo (producción y/o consumo de energía), degradación de proteínas, condensación de cromatina, producción de microtúbulos, replicación de ADN, recombinación y funciones de reparación de ADN. Se contempla que estas características pueden ser relevantes globalmente para la célula (por ejemplo, producción de proteína general reducida) o para especies individuales en la célula (por ejemplo, inducción de una proteína o proteínas específicas).
30 Se contempla que este procedimiento puede aplicarse con respecto a una diversidad de diferentes miARN sintéticos y/o no sintéticos en células separadas o en las mismas. En algunos casos, pueden introducirse los siguientes números de moléculas de miARN sintéticas diferentes en diferentes células: 2, 3 o más. La invención no está limitada por el tipo celular. Se contempla que cualquier célula que exprese miARN o cualquier célula que tenga una característica alterada por un miARN es susceptible para los procedimientos y composiciones de la invención. El uso
35 de dos o más miARN puede combinarse en una única composición farmacéutica como un cóctel o puede proporcionarse para su uso en cualquier procedimiento terapéutico, de diagnóstico o de pronóstico de la invención. En algunas realizaciones de la invención, los procedimientos incluyen ensayar la célula con respecto a la presencia del miARN que se introduce eficazmente por la molécula de miARN sintética o se inhibe por un inhibidor de miARN. En consecuencia, en algunas realizaciones, los procedimientos incluyen una etapa de generar un perfil de miARN
40 para una muestra. La expresión “perfil de miARN” se refiere a un conjunto de datos con respecto al patrón de expresión para una pluralidad de miARN en la muestra; se contempla que el perfil de miARN puede obtenerse usando una matriz de miARN. En algunas realizaciones de la invención, se genera un perfil de miARN por etapas que incluyen: a) marcar miARN en la muestra; b) hibridar el miARN con una matriz de miARN; y c) determinar la hibridación de miARN con la matriz, en las que se genera un perfil de miARN. Véase Solicitud de Patente Provisional
45 de Estados Unidos 60/575.743 y la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos 60/649.584 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 11/141.707.
Adicionalmente, una célula en la que se introduce un miARN sintético o un inhibidor de miARN puede evaluarse o ensayarse posteriormente con respecto a la cantidad de miARN o inhibidor de miARN endógeno o exógeno. Se contempla cualquier tipo celular para su uso con la invención. La célula puede ser de o estar en un mamífero, tal
50 como un mono, caballo, vaca, cerdo, oveja, perro, gato, conejo, ratón, rata o ser humano.
En otros procedimientos de la invención, se incluye una etapa para sintetizar u obtener la molécula de ARN sintética.
En realizaciones adicionales, el ácido nucleico sintético se introduce en la célula por transfección con fosfato cálcico, transfección de lípidos, electroporación, microinyección o inyección. Los ácidos nucleicos sintéticos pueden ser para administración a un sujeto o paciente usando modos de administración que se conocen bien por los expertos en la
55 materia, particularmente para aplicaciones terapéuticas. Se contempla particularmente que un paciente es ser humano o cualquier otro mamífero o animal que tenga miARN.
Los procedimientos incluyen identificar una célula o un paciente que necesite la inducción de esas características celulares. Además, se entenderá que una cantidad de un ácido nucleico sintético que se proporciona a una célula u
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En ciertas realizaciones, los procedimientos incluyen proporcionar o introducir a una célula una molécula de ácido nucleico correspondiente a un miARN maduro en la célula en una cantidad eficaz para conseguir un resultado 5 fisiológico deseado. Dichos procedimientos se desvelan en el presente documento. En estos procedimientos diferentes, el miARN correspondiente implicado en el procedimiento puede ser miR-10a y miR-10b.
En otras realizaciones, los procedimientos implican reducir la viabilidad celular, inducir la apoptosis en una célula, o reducir la proliferación celular, a condición de que se excluyan los procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia, que comprende introducir en o proporcionar a la célula una cantidad eficaz de una 10 molécula de miARN sintética que corresponde a miR-10b. La presente invención también se refiere a un procedimiento para inducir la apoptosis en una célula, a condición de que el procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia se excluyan, que comprende introducir en o proporcionar a la célula una cantidad eficaz de una molécula de miARN sintético miR-10b. La presente invención también se refiere a usar composiciones de miARN que implican miR-10a para su uso en el tratamiento de cáncer, incluyendo cáncer de 15 pulmón, cáncer del cuello uterino, cáncer de próstata, cáncer de piel o leucemia. También se contemplan uno o más miARN humanos adicionales seleccionados del grupo que consiste en let-7, miR-15a, miR-16, miR-17, miR-21, miR22, miR-23, miR-24, miR-26a, miR-29b, miR-30a, miR-96, miR-101, miR-105, miR-106, miR-124, miR-125a, miR126, miR-130, miR130a, miR-133, miR-142, miR-143, miR-144, miR-145, miR-147, miR-181a, miR-182, miR-183, miR-188, miR-189, miR-192, miR-194, miR-195, miR-199a, miR-200b, miR-201, miR-205, miR-219, 206, miR-215,
20 miR-219, miR-223, miR-224, miR-321, miR-328, miR-331, miR-342, miR-219 y miR-346. Se contempla que 1, 2, 3 o más miARN pueden usarse para estas realizaciones. El cáncer incluye, pero sin limitación, cánceres malignos, tumores, cánceres metastásicos, cánceres no resecables, cánceres resistentes a quimioterapia y/o radiación, y cánceres terminales.
Se entenderá que se emplean anotaciones abreviadas de modo que una descripción genérica de un miARN se
25 refiere a cualquiera de los miembros de su familia génica (distinguidos por un número), a no ser que se indique de otro modo. Se entiende por los expertos en la materia que una “familia génica” se refiere a un grupo de genes que tienen la misma secuencia codificante de miARN. Típicamente, se identifican miembros de una familia génica por un número detrás de la designación inicial. Por ejemplo, miR-16-1 y miR-16-2 son miembros de la familia génica de miR-16 y “miR-7” se refiere a miR-7-1, miR-7-2 y miR-7-3. Además, a no ser que se indique de otro modo, una
30 anotación abreviada se refiere a miARN relacionados (distinguidos por una letra). Por lo tanto, “let-7”, por ejemplo, se refiere a let-7a-1, let7-a-2, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1 y let-7f-2. Las excepciones a estas anotaciones abreviadas se identificarán de otro modo.
La presente invención también se refiere a un ácido nucleico de miARN sintético para tratar cáncer de colon que implica introducir en o proporcionar a una célula de cáncer de colon una cantidad eficaz de un miARN sintético
35 correspondiente a miR-10a. Además, se proporciona un ácido nucleico de miARN para su uso en tratamiento de cáncer de tiroides que implica introducir en o proporcionar a una célula de cáncer de tiroides una cantidad eficaz de una molécula de miARN sintético que corresponde a una secuencia de miARN.
La presente invención se refiere a un ácido nucleico de miARN sintético para su uso en el tratamiento de la leucemia
o reducción de la proliferación celular de linfocitos T cancerosos (leucemia).
40 La presente invención también se refiere a un ácido nucleico de miARN para su uso en pacientes a los que se ha diagnosticado que tienen isquemia, los que están en riesgo de isquemia, los que se sospecha que tienen isquemia o pacientes con síntomas de isquemia. En ciertos experimentos, un miARN en el que las cadenas tanto con sentido como antisentido derivan de un único miARN precursor en procedimientos y composiciones de la invención. Estos se designan frecuentemente con un sufijo “P” en el que “5P” indica que el miARN maduro deriva del extremo 5’ del
45 precursor y un “3P” correspondiente indica que deriva del extremo 3’ del precursor, como se describe en la web en sanger.ac.uk/cgi-bin/rfam/miARN. Además, en algunas realizaciones, se evaluó un miARN que no corresponde a un miARN humano conocido. Se contempla que estos miARN no humanos pueden usarse en realizaciones de la invención o que puede existir un miARN humano que sea homólogo del miARN no humano.
La expresión “reducir la viabilidad celular” significa reducir el número de células vivas
50 Pueden usarse en general procedimientos que se refieren a la viabilidad celular y la purificación celular para terapia, diagnóstico, crear líneas celulares con propiedades de investigación interesantes, e inducir la diferenciación. Pueden emplearse miARN que reducen selectivamente la proliferación de células cancerosas como productos terapéuticos ya que pueden suministrarse a células cancerosas y no cancerosas igualmente pero afectará solamente al crecimiento de las células cancerosas. Además, los ácidos nucleicos sintéticos pueden ser para detener o evitar la
55 metástasis o reducir el número de metástasis.
Además, se contempla en particular que una molécula de ácido nucleico que puede procesarse en un miARN maduro cuando está dentro de la célula es un miARN sintético en algunas realizaciones de la invención.
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Se contempla que una cantidad eficaz de un modulador de miARN puede ser para administración. En realizaciones particulares, se confiere un beneficio terapéutico a la materia biológica, en la que un “beneficio terapéutico” se refiere a una mejora en la o las afecciones o los síntomas asociados con una enfermedad o afección o una mejora del pronóstico, duración o estado con respecto a la enfermedad. Se contempla que un beneficio terapéutico incluye,
5 pero sin limitación, una reducción del dolor, una reducción de la morbilidad, una reducción en un síntoma. Por ejemplo, con respecto al cáncer, se contempla que un beneficio terapéutico en cáncer puede ser la inhibición del crecimiento tumoral, prevención de metástasis, reducción del número de metástasis, inhibición de la proliferación de células cancerosas, inhibición de la proliferación de células cancerosas, inducción de muerte celular en células cancerosas, inhibición de la angiogénesis cerca de células cancerosas, inducción de la apoptosis de células cancerosas, reducción del dolor, reducción del riesgo de reaparición, inducción de la quimio o radiosensibilidad en células cancerosas, prolongación de la vida y/o retardo de la muerte directa o indirectamente relacionada con el cáncer.
Además, se contempla que las composiciones de miARN pueden proporcionarse para su uso como parte de una terapia a un paciente, junto con terapias tradicionales o agentes preventivos. Además, se contempla que puede
15 aplicarse cualquier procedimiento analizado en el contexto de la terapia de forma preventiva, particularmente en un paciente que se ha identificado que puede necesitar potencialmente la terapia o tiene riesgo para la afección o enfermedad para la que se necesita la terapia.
Las terapias de cáncer también incluyen una diversidad de terapias de combinación con tratamientos basados tanto en productos químicos como en radiación. Las quimioterapias de combinación incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, bevacizumab, cisplatino (CDDP), carboplatino, inhibidores de EGFR (gefitinib y cetuximab), procarbacina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) ifosfamida, melfalán, clorambucilo, busulfán, nitrosurea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de unión al receptor de estrógenos, taxol, taxotere, gemcitabina, navelbina, inhibidores de farnesil proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina,
25 vinblastina y metotrexato, o cualquier variante análoga o derivada de lo anterior.
En general, pueden proporcionarse inhibidores de miARN para conseguir el efecto opuesto en comparación con cuando se proporcionan moléculas de ácido nucleico correspondientes al miARN maduro. De forma similar, pueden proporcionarse moléculas de ácido nucleico correspondientes al miARN maduro para conseguir el efecto opuesto en comparación con cuando se proporcionan inhibidores del miARN. Por ejemplo, pueden proporcionarse moléculas de miARN que aumentan la proliferación celular a células para aumentar la proliferación o pueden proporcionarse inhibidores de dichas moléculas a células para reducir la proliferación celular. En toda la presente solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la desviación típica del error para el dispositivo
o procedimiento que se emplea para determinar el valor.
El uso de la palabra “un/una” cuando se usa junto con la expresión “que comprende” en las reivindicaciones y/o la
35 memoria descriptiva puede significar “uno/una”, pero también es coherente con el significado de “uno/una o más”, “al menos uno/una” y “uno/una o más de uno/una”.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
FIGURA 1 Visión de conjunto de la expresión y activación de miARN. Se transcriben miARN como parte de moléculas de ARN más largas que pueden ser de hasta mil nucleótidos (Lee, 2002). Los ARN se procesan en el núcleo en ARN en horquilla de 70-100 nucleótidos por la ribonucleasa específica de ARNbc Drosha
45 (Lee 2003) (FIGURA 1). Los ARN en horquilla se transportan al citoplasma y se digieren por una segunda ribonucleasa específica de doble cadena denominada Dicer. El miARN 19-23 unidades resultante se une con un complejo que es similar a o idéntico al Complejo Silenciador Inducido por ARN (RISC) que participa en la interferencia de ARN (Hutvagner, 2002). El miARN monocatenario, unido a complejo, se une con ARNm con secuencias que son significativamente, aunque no completamente, complementarias del miARN. Por un mecanismo que no se entiende completamente, pero que no implica la degradación de ARNm, el ARNm unido no se traduce, dando como resultado la expresión reducida del gen correspondiente. FIGURA 2. Procedimientos para introducir miARN en células. Hay tres procedimientos básicos para introducir miARN en células. En el primero, se introduce un ADN que porta un promotor cadena arriba de una secuencia que codifica un miARN en células en las que se transcribe para producir una molécula de ARN que
55 incluye el miARN maduro. El procesamiento y captación por el complejo proteico para regulación génica inducida por miARN da como resultado la activación del miARN. Este procedimiento adolece de introducción ineficaz de la construcción de ADN en células. En el segundo procedimiento, una molécula de ARNbc de tipo ARNip, una de cuyas cadenas es idéntica a un miARN activo, se introduce en células en las que se capta por el complejo proteico para la activación de miARN. Este procedimiento proporciona un suministro eficaz, pero con frecuencia captación de la molécula de ARN complementaria no pretendida. El tercer procedimiento, descrito en el presente documento, implica modificar la cadena complementaria para favorecer la captación y activación de la cadena activa de la construcción de miARN sintética. FIGURA 3. Captación preferente de cadenas activas en miARN sintéticos de la invención. Vectores indicadores con luciferasa bajo el control de sitios diana para miR-33 o let-7 o las cadenas complementarias
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5 de los ARNip anteriormente mencionados. La cotransfección de miARN sintéticos y vectores indicadores seguido de ensayo de luciferasa 24 horas después de la transfección reveló miARN que se activan después de la transfección. FIGURA 4. Actividad de miARN sintético para diversos miARN. Se prepararon miARN sintéticos con diseño de ARNip y Pre-miR (5’amina) y se transfectaron en células HeLa a una concentración final de 3 y 10 nM. Los miARN sintéticos se cotransfectaron con vectores indicadores que portaban sitios diana para los miARN maduros. La expresión del indicador de luciferasa en células cotransfectadas se midió veinticuatro horas después de la transfección y se expresó en la figura como la expresión de indicador en relación con células cotransfectadas con miARN sintéticos de control negativo. FIGURA 5. Actividad de miARN sintético entre tipos celulares y contra dianas naturales. Se ensayaron
15 miARN sintéticos con respecto a activación de cadena apropiada y especificidad de tipo celular para asegurar que el diseño es robusto. Se cotransfectaron cuatro tipos celulares diferentes con miARN sintético y activación de cadena asociada activa y complementaria. El panel A muestra que diferentes tipos celulares responden de forma similar a miARN sintéticos. Después se transfectaron cuatro miARN sintéticos diferentes en diversos tipos celulares y se midieron los niveles de expresión de dianas naturales de los miARN (Panel B). FIGURA 6. Esquemática para cribado con bibliotecas de miARN sintéticos o inhibidores de miARN. Se distribuyen miARN sintéticos y/o inhibidores de miARN en pocillos de una placa de microtitulación. Se añade reactivo de transfección y después células a cada pocillo. En algún momento después de la transfección, se evalúan las muestras con respecto a un fenotipo. Los miARN que inducen un cambio que es significativo en
25 relación con un control negativo se seleccionan para estudio adicional. FIGURA 7. Criba con respecto a miARN que afectan a la proliferación celular. En placas de 96 pocillos, se transfectaron de forma inversa 8.000 células HeLa con inhibidores de miARN (5 pmoles) por triplicado usando Ambion siPORT Neo-FX. 72 horas después de la transfección, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se permeabilizaron con TritonX 100 al 0,1 % y se tiñeron con yoduro de propidio para observar el número de células totales. Las placas se exploraron usando el Explorador Acumen TTP labtech. La morfología cambia en las células se inhibidas por miR-31. Las células HeLa se transfectaron con Anti-mir31 y las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpo anti-beta actina y DAPI para visualizar cambios de la morfología celular en respuesta a inhibición de la función de micro ARN mir-31. FIGURA 8. Criba con respecto a miARN que afectan a la proliferación celular en células A549. Criba
35 con respecto a miARN implicado en la viabilidad celular en células A549. En placas de 96 pocillos, se transfectaron de forma inversa 8.000 células A549 con inhibidores de miARN (5 pmoles) por triplicado usando Ambion siPORT Neo-FX. 72 horas después de la transfección las células se tripsinizaron y se contaron usando el instrumento de recuento celular Guava. El número de células se representó gráficamente y se normalizó para un inhibidor de huecos. En esta figura, “mir1d” se refiere a mir-1-2. FIGURA 9. Criba con respecto a miARN que afectan a la apoptosis en células HeLa. Efectos de los inhibidores de miARN en la actividad caspasa en HeLa. En placas de 96 pocillos, se transfectaron de forma inversa 8.000 células HeLa con inhibidores de miARN (5 pmoles) por triplicado usando Ambion siPORT Neo-FX. 72 horas después de la transfección las células se analizaron usando ensayo de actividad caspasa y se normalizaron basándose en el ensayo de actividad esterasa. En esta figura, “mirld” se refiere a mir-1-2.
45 FIGURA 10. Expresión de miARN en pacientes con cáncer de pulmón y colon. Los perfiles de expresión de miARN de tumor frente a tejidos adyacentes normales se compararon para pacientes con cáncer de pulmón y colon. Los miARN se proporcionan en filas; los pacientes se presentan en columnas. El color verde en el mapa de calor muestra miARN que se regulan negativamente en la muestra tumoral en relación con la muestra tisular adyacente normal, y el rojo muestra miARN que se regulan positivamente en la muestra tumoral en relación con la muestra tisular adyacente normal.
FIGURA 11. Validación de los resultados de expresión de matrices de miARN en pacientes con cáncerde pulmón. Se analizaron muestras de ARN totales de dos pacientes con cáncer de pulmón con respecto a la expresión de miR-16, miR-21, miR-143, miR-145 y let-7 usando análisis de Northern. Los gráficos muestran la abundancia relativa de cada miARN (relación de tumor:NAT) del análisis de matrices y análisis
55 de phosphoimager de Northern. FIGURA 12. Algunos miARN se expresan diferencialmente en múltiples tipos de cáncer. Se usó análisis de matrices de miARN que comparaban tejidos tumorales y adyacentes normales de pacientes con diversos tipos de cáncer para identificar miARN que se expresan diferencialmente en cáncer. El porcentaje de pacientes que muestran regulación positiva o negativa de un miARN dado se calculó para cada tipo de cáncer. Se presentan los ocho que se expresaban diferencialmente con más frecuencia entre tipos de muestras. FIGURA 13. Se muestran miARN que tienen cambios de expresión mayores de 1,5 veces tanto entre infectados frente a no infectados como entre sensibles frente a insensibles. A la derecha hay un grupo de los resultados de 2 matrices de cada modelo.
65 FIGURA 14. miARN expresados diferencialmente en 3 ratones preacondicionados en relación con ratones no tratados.
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FIGURA 15A-C. miARN sintéticos que reducen la proliferación celular. A. Se evaluaron células BT549 y MCF12A (mama), HeLa (cuello uterino) y 22 Rv1 (próstata) con respecto a proliferación celular. B. Se examinaron células TE354T y TE353SK (piel), BJ (piel) y A549 (pulmón) con respecto a proliferación celular.
C. Se evaluaron células CRL5826 y HTB-57 (pulmón), Jurkats (linfocitos T) y linfocitos T primarios con respecto a proliferación celular. FIGURA 16. miARN sintéticos que aumentan la proliferación celular. Se evaluaron células HeLa (cuello uterino), 22 Rv1 (próstata), TE354T y TE353SK (piel), BJ (piel), A549 (pulmón), Jurkats (linfocitos T), linfocitos T primarios, CRL5826 y HTB-57 (pulmón) con respecto a proliferación celular. FIGURA 17. Inhibidores de miARN que reducen la proliferación celular. Se evaluaron células 22 Rv1 (próstata), TE354T (piel), MCF12a (mama) y A549 (pulmón) con respecto a proliferación celular. FIGURA 18. Inhibidores de miARN que reducen la proliferación celular. Se evaluaron células 22 Rv1 (próstata), TE354T (piel), MCF12a (mama) y A549 (pulmón) con respecto a proliferación celular. FIGURA 19. miARN que afectan a la viabilidad celular. Se evaluaron células Jurkats (linfocitos T), linfocitos T primarios, HeLa (cuello uterino) y A549 (pulmón) con respecto a aumentos y reducciones de la viabilidad celular. FIGURA 20. miARN que afectan a la apoptosis. Se evaluaron células 22 Rv1 (próstata), TE354T (piel), Jurkats (linfocitos T) y HeLa (cuello uterino) con respecto a aumentos y reducciones de la apoptosis. FIGURA 21. miARN que afectan a la viabilidad celular en presencia de un producto terapéutico. Se evaluaron células A549 (pulmón) con respecto a aumentos y reducciones de la viabilidad celular en presencia y ausencia de TRAIL o etopósido. Se evaluaron células HTB-57 y CRL5826 (pulmón) y HeLa (cuello uterino) con respecto a una reducción de la viabilidad celular en ausencia y presencia de etopósido. FIGURA 22. miARN que afectan al ciclo celular. Se evaluaron células BJ (piel) y HeLa (cuello uterino) con respecto a aumentos o reducciones del número de células en ciertas fases del ciclo celular (G1, S, G2/M, replicación de ADN). FIGURA 23. Fenotipos de miARN con secuencias similares. Comparación de secuencias relacionadas y sus efectos en la proliferación celular.
FIGURA 24. Genes asociados con la regulación de hTert y secuencias de miARN que se ha predicho que modulan su expresión.
Descripción de realizaciones ilustrativas
La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos que se refieren a la preparación y caracterización de miARN, así como el uso de miARN para aplicaciones terapéuticas, de pronóstico y de diagnóstico. Para superar el problema con sistemas basados en plásmidos ineficaces previos para introducir miARN en células, los inventores desarrollaron ARN pequeños, parcialmente bicatenarios que pueden suministrarse con alta eficacia a células tanto inmortalizadas como primarias. Los ARN pequeños tienen las mismas actividades funcionales que los miARN expresados de forma endógena. Debido a que los ARN pequeños pueden suministrarse a las células con mucha mayor eficacia que los plásmidos, inducen un fenotipo mucho más fuerte que es más fácil de detectar y cuantificar, haciendo posible identificar muchas de las funciones de los miARN en células.
Los inventores también han creado una biblioteca de las moléculas de ARN bicatenarias, pequeñas, que pueden usarse para introducir miARN en células, así como una biblioteca de moléculas antisentido que inhiben las actividades de miARN conocidos que están presentes en células. Estas bibliotecas se han usado para regular positiva o negativamente de forma secuencial uno o más miARN en células para identificar los miARN que son críticos para procesos celulares como ciclo celular, apoptosis, diferenciación, viabilidad, angiogénesis, metabolismo y otros procesos con potencial terapéutico. También se están identificando y caracterizando miARN que regulan la expresión de genes importantes como p53, MYC y RAS para determinar adicionalmente miARN que podrían proporcionar puntos de intervención importantes para el tratamiento de la enfermedad. Por ejemplo, se ha mostrado que let-7 está implicado en RAS. Véase Johnson y col., 2005. Estos procedimientos de modulación en serie de las actividades de miARN y ensayo con respecto a fenotipos celulares se denominan colectivamente cribado funcional de miARN.
I. Moléculas de miARN
Las moléculas de microARN (“miARN”) son generalmente de 21 a 22 nucleótidos de longitud, aunque se han indicado longitudes de 17 y hasta 25 nucleótidos. Los miARN se procesan cada uno a partir de una molécula de ARN precursora más larga (“miARN precursor”). Los miARN precursores se transcriben de genes no codificantes de proteínas. Los miARN precursores tienen dos regiones de complementariedad que les permiten formar una estructura de tipo tallo-bucle o plegada hacia atrás, que se escinde por una enzima denominada Dicer en animales. Dicer es una nucleasa de tipo ribonucleasa III. El miARN procesado es típicamente una parte del tallo.
El miARN procesado (también denominado “miARN maduro”) se convierte en parte de un complejo grande para regular negativamente un gen diana particular. Los ejemplos de miARN animales incluyen los que forman pares de bases de forma imperfecta con la diana, lo que detiene la traducción (Olsen y col., 1999; Seggerson y col., 2002). También se procesan moléculas de ARNip por Dicer, pero a partir de una molécula de ARN bicatenaria, larga. Los ARNip no se encuentran de forma natural en células animales, pero pueden actuar en dichas células en un complejo
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silenciador inducido por ARN (RISC) para dirigir la escisión específica de secuencia de una diana de ARNm (Denli y col., 2003).
El estudio de moléculas de miARN endógeno se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 60/575.743.
miARN sintéticos
Los miARN están aparentemente activos en la célula cuando el ARN monocatenario maduro se une con un complejo proteico que regula la traducción de ARNm que hibridan con el miARN. La introducción de moléculas de ARN exógeno que afectan a las células de la misma manera que los miARN expresados de forma endógena requiere que se capte una molécula de ARN monocatenaria de la misma secuencia que el miARN maduro endógeno por el complejo proteico que facilita el control de la traducción. Se ha evaluado una diversidad de diseños de moléculas de ARN. Se han identificado tres diseños generales que maximizan la captación del miARN monocatenario deseado por la ruta de miARN. Una molécula de ARN con una secuencia de miARN que tiene al menos uno de los tres diseños se denomina miARN sintético.
Los miARN sintéticos de la invención comprenden, en algunas realizaciones, dos moléculas de ARN en las que un ARN es idéntico a un miARN maduro, de origen natural. La molécula de ARN que es idéntica a un miARN maduro se denomina la cadena activa. La segunda molécula de ARN, denominada cadena complementaria, es al menos parcialmente complementaria de la cadena activa. Las cadenas activa y complementaria se hibridan para crear un ARN bicatenario, denominado miARN sintético, que es similar al precursor de miARN de origen natural que se une con el complejo proteico inmediatamente antes de la activación de miARN en la célula. La maximización de la actividad del miARN sintético requiere la maximización de la captación de la cadena activa y minimización de la captación de la cadena complementaria por el complejo proteico de miARN que regula la expresión génica al nivel de la traducción. Los diseños moleculares que proporcionan actividad de miARN óptima implican modificaciones de la cadena complementaria.
Dos diseños incorporan modificaciones químicas en la cadena complementaria. La primera modificación implica crear un ARN complementario con un grupo químico distinto de un fosfato o hidroxilo en su extremo 5’ terminal. La presencia de la modificación 5’ elimina aparentemente la captación de la cadena complementaria y favorece posteriormente la captación de la cadena activa por el complejo proteico de miARN. La modificación 5’ puede ser cualquiera de una diversidad de moléculas incluyendo NH2, NHCOCH3, biotina y otras.
La segunda estrategia de modificación química que reduce significativamente la captación de la cadena complementaria por la ruta de miARN es incorporar nucleótidos con modificaciones de azúcares en los primeros 2-6 nucleótidos de la cadena complementaria. Debería observarse que las modificaciones de azúcares coherentes con la segunda estrategia de diseño pueden acoplarse con modificaciones 5’ terminales coherentes con la primera estrategia de diseño para potenciar adicionalmente las actividades de miARN sintético.
El tercer diseño de miARN sintético implica incorporar nucleótidos en el extremo 3’ de la cadena complementaria que no son complementarios de la cadena activa. Los híbridos de los ARN activos y complementarios resultantes son muy estables en el extremo 3’ de la cadena activa pero relativamente inestables en el extremo 5’ de la cadena activa. Los estudios con ARNip indican que la estabilidad del híbrido 5’ es un indicador clave de la captación de ARN para el complejo proteico que apoya la interferencia de ARN, que está al menos relacionada con la ruta de miARN en células. Los inventores han descubierto que el uso sensato de los desapareamientos en la cadena de ARN complementaria potencia significativamente la actividad del miARN sintético.
A. Ácidos nucleicos
Se describen moléculas de ácido nucleico que pueden introducir o inhibir miARN en células cultivadas. Los ácidos nucleicos pueden haberse producido en células o in vitro por enzimas purificadas aunque se producen preferentemente por síntesis química. Pueden estar en bruto o purificados. El término “miARN”, a no ser que se indique de otro modo, se refiere al ARN procesado, después de haberse escindido de su precursor. La Tabla 1 indica qué SEC ID Nº corresponde a la secuencia precursora particular de un miARN y qué secuencias dentro de la SEC IN Nº corresponden a la secuencia madura. El nombre del miARN se abrevia con frecuencia y se indica sin el prefijo y se entenderá como tal, dependiendo del contexto. A no ser que se indique de otro modo, los miARN indicados en la solicitud son secuencias humanas identificadas como mir-X o let-X, en las que X es un número y/o letra.
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Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-1-2
SEC ID Nº: 1 53-73
hsa-mir-1-1
SEC ID Nº: 2 46-66
hsa-let-7a-1
SEC ID Nº: 3 6-27
hsa-let-7a-2
SEC ID Nº: 4 5-26
hsa-let-7a-3
SEC ID Nº: 5 4-25
hsa-let-7b
SEC ID Nº: 6 6-27
hsa-let-7c
SEC ID Nº: 7 11-32
hsa-let-7d
SEC ID Nº: 8 8-28
hsa-let-7e
SEC ID Nº: 9 8-28
hsa-let-7f-1
SEC ID Nº: 10 7-28
hsa-let-7f-2
SEC ID Nº: 11 8-29
hsa-mir-7-1
SEC ID Nº: 12 24-44
hsa-mir-7-2
SEC ID Nº: 13 32-52
hsa-mir-7-3
SEC ID Nº: 14 31-51
hsa-let-7g
SEC ID Nº: 15 5-25
hsa-let-7i
SEC ID Nº: 16 6-24
hsa-mir-9-1
SEC ID Nº: 17 16-38 y/o 56-76
hsa-mir-9-2
SEC ID Nº: 18 16-38 y/o 54-74
hsa-mir-9-3
SEC ID Nº: 19 16-38 y/o 56-76
hsa-mir-10a
SEC ID Nº: 20 22-44
hsa-mir-10b
SEC ID Nº: 21 27-48
hsa-mir-15a
SEC ID Nº: 22 14-35
hsa-mir-15b
SEC ID Nº: 23 20-41
hsa-mir-16-1
SEC ID Nº: 24 14-35
hsa-mir-16-2
SEC ID Nº: 25 10-31
hsa-mir-17
SEC ID Nº: 26 14-37 y/o 51-70
hsa-mir-18
SEC ID Nº: 27 6-27
hsa-mir-19a
SEC ID Nº: 28 49-71
hsa-mir-19b-1
SEC ID Nº: 29 54-76
hsa-mir-19b-2
SEC ID Nº: 30 62-84
hsa-mir-20
SEC ID Nº: 31 8-29
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Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-21
SEC ID Nº: 32 8-29
hsa-mir-22
SEC ID Nº: 33 53-74
hsa-mir-23a
SEC ID Nº: 34 45-65
hsa-mir-23b
SEC ID Nº: 35 58-80
hsa-mir-24-1
SEC ID Nº: 36 6-28 y/o 44-65
hsa-mir-24-2
SEC ID Nº: 37 50-71
hsa-mir-25
SEC ID Nº: 38 52-73
hsa-mir-26a-1
SEC ID Nº: 39 10-31
hsa-mir-26b
SEC ID Nº: 40 12-32
hsa-mir-26a-2
SEC ID Nº: 41 14-35
hsa-mir-27a
SEC ID Nº: 42 51-72
hsa-mir-27b
SEC ID Nº: 43 61-80
hsa-mir-28
SEC ID Nº: 44 14-35
hsa-mir-29a
SEC ID Nº: 45 41-62
hsa-mir-29b-1
SEC ID Nº: 46 51-70
hsa-mir-29b-2
SEC ID Nº: 47 52-71
hsa-mir-29c
SEC ID Nº: 48 54-75
hsa-mir-30a
SEC ID Nº: 49 47-68
hsa-mir-30c-2
SEC ID Nº: 50 7-29
hsa-mir-30d
SEC ID Nº: 51 6-27
hsa-mir-30b
SEC ID Nº: 52 17-37
hsa-mir-30c-1
SEC ID Nº: 53 17-39
hsa-mir-30e
SEC ID Nº: 54 2-21
hsa-mir-31
SEC ID Nº: 55 9-29
hsa-mir-32
SEC ID Nº: 56 6-26
hsa-mir-33
SEC ID Nº: 57 6-24
hsa-mir-34a
SEC ID Nº: 58 22-43
hsa-mir-34b
SEC ID Nº: 59 14-35
hsa-mir-34c
SEC ID Nº: 60 13-34
hsa-mir-92-1
SEC ID Nº: 61 48-69
hsa-mir-92-2
SEC ID Nº: 62 48-69
hsa-mir-93
SEC ID Nº: 63 12-33
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Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-95
SEC ID Nº: 64 49-70
hsa-mir-96
SEC ID Nº: 65 9-30
hsa-mir-98
SEC ID Nº: 66 2-23
hsa-mir-99a
SEC ID Nº: 67 13-34
hsa-mir-99b
SEC ID Nº: 68 7-28
hsa-mir-100
SEC ID Nº: 69 13-34
hsa-mir-101-1
SEC ID Nº: 70 47-68
hsa-mir-101-2
SEC ID Nº: 71 49-70
hsa-mir-103-2
SEC ID Nº: 72 48-70
hsa-mir-103-1
SEC ID Nº: 73 48-70
hsa-mir-105-1
SEC ID Nº: 74 13-32
hsa-mir-105-2
SEC ID Nº: 75 13-32
hsa-mir-106a
SEC ID Nº: 76 13-36
hsa-mir-106b
SEC ID Nº: 77 12-32
hsa-mir-107
SEC ID Nº: 78 50-72
hsa-mir-122a
SEC ID Nº: 79 15-37
hsa-mir-124a-1
SEC ID Nº: 80 52-73
hsa-mir-124a-2
SEC ID Nº: 81 61-82
hsa-mir-124a-3
SEC ID Nº: 82 52-73
hsa-mir-125b-1
SEC ID Nº: 83 15-36
hsa-mir-125a
SEC ID Nº: 84 15-37
hsa-mir-125b-2
SEC ID Nº: 85 17-38
hsa-mir-126
SEC ID Nº: 86 15-35 y/o 52-72
hsa-mir-127
SEC ID Nº: 87 57-78
hsa-mir-128a
SEC ID Nº: 88 50-71
hsa-mir-128b
SEC ID Nº: 89 52-73
hsa-mir-129-2
SEC ID Nº: 90 15-35
hsa-mir-130a
SEC ID Nº: 91 55-74
hsa-mir-130b
SEC ID Nº: 92 51-72
hsa-mir-132
SEC ID Nº: 93 59-80
hsa-mir-133a-1
SEC ID Nº: 94 54-75
hsa-mir-133a-2
SEC ID Nº: 95 60-81
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Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-133b
SEC ID Nº: 96 67-87
hsa-mir-134
SEC ID Nº: 97 8-28
hsa-mir-135a-1
SEC ID Nº: 98 17-39
hsa-mir-135a-2
SEC ID Nº: 99 23-45
hsa-mir-135b
SEC ID Nº: 100 16-37
hsa-mir-136
SEC ID Nº: 101 15-37
hsa-mir-137
SEC ID Nº: 102 60-81
hsa-mir-138-2
SEC ID Nº: 103 10-26
hsa-mir-138-1
SEC ID Nº: 104 23-39
hsa-mir-139
SEC ID Nº: 105 7-24
hsa-mir-140
SEC ID Nº: 106 24-44
hsa-mir-141
SEC ID Nº: 107 60-80
hsa-mir-142
SEC ID Nº: 108 16-35 y/o 52-74
hsa-mir-143
SEC ID Nº: 109 61-82
hsa-mir-144
SEC ID Nº: 110 52-73
hsa-mir-145
SEC ID Nº: 111 16-39
hsa-mir-146
SEC ID Nº: 112 21-42
hsa-mir-147
SEC ID Nº: 113 47-66
hsa-mir-148a
SEC ID Nº: 114 44-65
hsa-mir-148b
SEC ID Nº: 115 63-84
hsa-mir-149
SEC ID Nº: 116 15-36
hsa-mir-150
SEC ID Nº: 117 16-37
hsa-mir-151
SEC ID Nº: 118 46-67
hsa-mir-152
SEC ID Nº: 119 54-74
hsa-mir-153-1
SEC ID Nº: 120 54-73
hsa-mir-153-2
SEC ID Nº: 121 53-72
hsa-mir-154
SEC ID Nº: 122 15-36
hsa-mir-155
SEC ID Nº: 123 4-25
hsa-mir-181a
SEC ID Nº: 124 39-61
hsa-mir-181b-1
SEC ID Nº: 125 36-59
hsa-mir-181c
SEC ID Nº: 126 27-48
hsa-mir-181b-2
SEC ID Nº: 127 16-39
imagen12
Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-182
SEC ID Nº: 128 23-44 y/o 67-87
hsa-mir-183
SEC ID Nº: 129 27-49
hsa-mir-184
SEC ID Nº: 130 53-74
hsa-mir-185
SEC ID Nº: 131 15-32
hsa-mir-186
SEC ID Nº: 132 15-37
hsa-mir-187
SEC ID Nº: 133 71-91
hsa-mir-188
SEC ID Nº: 134 15-36
hsa-mir-190
SEC ID Nº: 135 15-36
hsa-mir-191
SEC ID Nº: 136 16-37
hsa-mir-192
SEC ID Nº: 137 24-44
hsa-mir-193
SEC ID Nº: 138 55-75
hsa-mir-194-1
SEC ID Nº: 139 15-36
hsa-mir-194-2
SEC ID Nº: 140 15-36
hsa-mir-195
SEC ID Nº: 141 15-35
hsa-mir-196-1
SEC ID Nº: 142 7-27
hsa-mir-196-2
SEC ID Nº: 143 25-45
hsa-mir-197
SEC ID Nº: 144 48-69
hsa-mir-198
SEC ID Nº: 145 6-24
hsa-mir-199a-1
SEC ID Nº: 146 6-28 y/o 46-67
hsa-mir-199a-2
SEC ID Nº: 147 31-53 y/o 69-90
hsa-mir-199b
SEC ID Nº: 148 26-48
hsa-mir-200b
SEC ID Nº: 149 54-77
hsa-mir-200c
SEC ID Nº: 150 45-66
hsa-mir-200a
SEC ID Nº: 151 54-75
hsa-mir-203
SEC ID Nº: 152 65-86
hsa-mir-204
SEC ID Nº: 153 33-54
hsa-mir-205
SEC ID Nº: 154 34-55
hsa-mir-206
SEC ID Nº: 155 53-74
hsa-mir-208
SEC ID Nº: 156 44-65
hsa-mir-210
SEC ID Nº: 157 66-86
hsa-mir-211
SEC ID Nº: 158 26-47
hsa-mir-212
SEC ID Nº: 159 71-91
imagen13
Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-213
SEC ID Nº: 160 24-46 y/o 64-85
hsa-mir-214
SEC ID Nº: 161 71-91
hsa-mir-215
SEC ID Nº: 162 27-47
hsa-mir-216
SEC ID Nº: 163 19-39
hsa-mir-217
SEC ID Nº: 164 35-58
hsa-mir-218-1
SEC ID Nº: 165 25-45
hsa-mir-218-2
SEC ID Nº: 166 25-45
hsa-mir-219-1
SEC ID Nº: 167 21-41
hsa-mir-219-2
SEC ID Nº: 168 19-39
hsa-mir-220
SEC ID Nº: 169 23-43
hsa-mir-221
SEC ID Nº: 170 65-87
hsa-mir-222
SEC ID Nº: 171 69-92
hsa-mir-223
SEC ID Nº: 172 68-88
hsa-mir-224
SEC ID Nº: 173 8-30
hsa-mir-296
SEC ID Nº: 174 14-34
hsa-mir-299
SEC ID Nº: 175 7-28
hsa-mir-301
SEC ID Nº: 176 51-73
hsa-mir-302
SEC ID Nº: 177 44-66
hsa-mir-320
SEC ID Nº: 178 48-70
hsa-mir-321
SEC ID Nº: 179 10-30
hsa-mir-323
SEC ID Nº: 180 50-71
hsa-mir-324
SEC ID Nº: 181 16-38 y/o 51-72
hsa-mir-326
SEC ID Nº: 182 60-79
hsa-mir-328
SEC ID Nº: 183 48-69
hsa-mir-330
SEC ID Nº: 184 57-79
hsa-mir-331
SEC ID Nº: 185 61-81
hsa-mir-335
SEC ID Nº: 186 16-38
hsa-mir-337
SEC ID Nº: 187 56-78
hsa-mir-338
SEC ID Nº: 188 42-64
hsa-mir-339
SEC ID Nº: 189 15-35
hsa-mir-340
SEC ID Nº: 190 58-80
hsa-mir-342
SEC ID Nº: 191 61-84
imagen14
Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-345
SEC ID Nº: 573 17-37
hsa-mir-346
SEC ID Nº: 574 4-26
hsa-mir-367
SEC ID Nº: 575 44-65
hsa-mir-368
SEC ID Nº: 576 44-65
hsa-mir-369
SEC ID Nº: 577 44-64
hsa-mir-370
SEC ID Nº: 578 48-68
hsa-mir-371
SEC ID Nº: 579 44-64
hsa-mir-372
SEC ID Nº: 580 42-64
hsa-mir-373
SEC ID Nº: 581 44-66
hsa-mir-374
SEC ID Nº: 582 12-33
hsa-mir-375
SEC ID Nº: 677 40-61
hsa-mir-376a
SEC ID Nº: 678 44-64
hsa-mir-377
SEC ID Nº: 679 45-66
hsa-mir-378
SEC ID Nº: 680 5-26 y 44-65
hsa-mir-379
SEC ID Nº: 681 6-24
hsa-mir-380
SEC ID Nº: 682 5-26 y 40-61
hsa-mir-381
SEC ID Nº: 683 49-70
hsa-mir-382
SEC ID Nº: 684 11-32
hsa-mir-383
SEC ID Nº: 685 7-28
hsa-mir-384
SEC ID Nº: 686 57-76
hsa-mir-422a
SEC ID Nº: 687 11-32
hsa-mir-423
SEC ID Nº: 688 53-74
hsa-mir-424
SEC ID Nº: 689 11-32
hsa-mir-425
SEC ID Nº: 690 55-75
hsa-mir-448
SEC ID Nº: 691 71-92
hsa-mir-429
SEC ID Nº: 692 51-72
hsa-mir-449
SEC ID Nº: 693 16-37
hsa-mir-450-1
SEC ID Nº: 694 17-38
hsa-mir-450-2
SEC ID Nº: 704 22-43
hsa-mir-451
SEC ID Nº: 705 17-39
hsa-mir-452
SEC ID Nº: 706 17-38
hsa-mir-453
SEC ID Nº: 707 43-64
imagen15
Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-455
SEC ID Nº: 708 16-37
hsa-mir-483
SEC ID Nº: 709 48-70
hsa-mir-484
SEC ID Nº: 710 2-23
hsa-mir-485
SEC ID Nº: 711 9-30
hsa-mir-486
SEC ID Nº: 712 4-25
hsa-mir-487
SEC ID Nº: 713 49-70
hsa-mir-488
SEC ID Nº: 714 14-34
hsa-mir-489
SEC ID Nº: 715 51-73
hsa-mir-490
SEC ID Nº: 716 76-97
hsa-mir-491
SEC ID Nº: 717 16-38
hsa-mir-492
SEC ID Nº: 718 30-52
hsa-mir-493
SEC ID Nº: 719 16-37
hsa-mir-494
SEC ID Nº: 720 48-71
hsa-mir-495
SEC ID Nº: 721 50-72
hsa-mir-496
SEC ID Nº: 722 61-77
hsa-mir-497
SEC ID Nº: 723 24-44
hsa-mir-498
SEC ID Nº: 724 34-56
hsa-mir-499
SEC ID Nº: 725 33-55
hsa-mir-500
SEC ID Nº: 726 52-73
hsa-mir-501
SEC ID Nº: 727 14-35
hsa-mir-502
SEC ID Nº: 728 1-21
hsa-mir-503
SEC ID Nº: 729 6-28
hsa-mir-504
SEC ID Nº: 730 13-33
hsa-mir-505
SEC ID Nº: 731 52-73
hsa-mir-506
SEC ID Nº: 732 71-91
hsa-mir-507
SEC ID Nº: 733 56-76
hsa-mir-508
SEC ID Nº: 734 61-83
hsa-mir-509
SEC ID Nº: 735 55-77
hsa-mir-510
SEC ID Nº: 736 10-32
hsa-mir-511-1
SEC ID Nº: 737 16-36
hsa-mir-511-2
SEC ID Nº: 738 16-36
hsa-mir-512-1
SEC ID Nº: 739 14-36
imagen16
Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-512-2
SEC ID Nº: 740 20-42
hsa-mir-513-1
SEC ID Nº: 741 37-58
hsa-mir-513-2
SEC ID Nº: 742 36-57
hsa-mir-514-1
SEC ID Nº: 743 39-58
hsa-mir-514-2
SEC ID Nº: 744 39-58
hsa-mir-514-3
SEC ID Nº: 745 39-58
hsa-mir-515-1
SEC ID Nº: 746 14-37
hsa-mir-515-2
SEC ID Nº: 747 14-37
hsa-mir-516-1
SEC ID Nº: 748 61-78
hsa-mir-516-2
SEC ID Nº: 749 61-78
hsa-mir-516-3
SEC ID Nº: 750 15-37
hsa-mir-516-4
SEC ID Nº: 751 15-37
hsa-mir-517a
SEC ID Nº: 752 15-36
hsa-mir-517b
SEC ID Nº: 753 6-27
hsa-mir-517c
SEC ID Nº: 754 20-41
hsa-mir-518a-1
SEC ID Nº: 755 14-34
hsa-mir-518a-2
SEC ID Nº: 756 15-34
hsa-mir-518b
SEC ID Nº: 757 51-72
hsa-mir-518c
SEC ID Nº: 758 24-46
hsa-mir-518d
SEC ID Nº: 759 16-36
hsa-mir-518e
SEC ID Nº: 760 54-75
hsa-mir-518f
SEC ID Nº: 761 16-38
hsa-mir-519a-1
SEC ID Nº: 762 15-38
hsa-mir-519a-2
SEC ID Nº: 763 54-78
hsa-mir-519b
SEC ID Nº: 764 13-36
hsa-mir-519c
SEC ID Nº: 765 16-39
hsa-mir-519d
SEC ID Nº: 766 54-76
hsa-mir-519e
SEC ID Nº: 767 14-35
hsa-mir-520a
SEC ID Nº: 768 15-35
hsa-mir-520b
SEC ID Nº: 769 41-61
hsa-mir-520c
SEC ID Nº: 770 16-36
imagen17
Secuencias de miARN humanas
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
hsa-mir-520d
SEC ID Nº: 771 15-37
hsa-mir-520e
SEC ID Nº: 772 54-74
hsa-mir-520f
SEC ID Nº: 773 55-76
hsa-mir-520g
SEC ID Nº: 774 55-78
hsa-mir-520h
SEC ID Nº: 775 55-76
hsa-mir-521-1
SEC ID Nº: 776 54-75
hsa-mir-521-2
SEC ID Nº: 777 54-75
hsa-mir-522
SEC ID Nº: 778 16-39
hsa-mir-523
SEC ID Nº: 779 16-39
hsa-mir-524
SEC ID Nº: 780 16-37
hsa-mir-525
SEC ID Nº: 781 15-35
hsa-mir-526a-1
SEC ID Nº: 782 15-35
hsa-mir-526a-2
SEC ID Nº: 783 7-27
hsa-mir-526b
SEC ID Nº: 784 14-37
hsa-mir-527
SEC ID Nº: 785 14-34
ambi-mir-7100
SEC ID Nº: 803
mir-526b*
SEC ID Nº: 804
mir-520a*
SEC ID Nº: 805
Tabla 2
Secuencias de miARN de ratón
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
mmu-mir-1-1
SEC ID Nº: 192 49-69
mmu-mir-1-2
SEC ID Nº: 193 47-67
mmu-let-7g
SEC ID Nº: 194 7-27
mmu-let-7i
SEC ID Nº: 195 6-24
mmu-let-7d
SEC ID Nº: 196 16-36 + 70-91
mmu-let-7a-1
SEC ID Nº: 197 13-34
mmu-let-7a-2
SEC ID Nº: 198 17-38
mmu-let-7b
SEC ID Nº: 199 7-28
mmu-let-7c-1
SEC ID Nº: 200 16-37
imagen18
Secuencias de miARN de ratón
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
mmu-let-7c-2
SEC ID Nº: 201 14-35
mmu-let-7e
SEC ID Nº: 202 15-35
mmu-let-7f-1
SEC ID Nº: 203 8-29
mmu-let-7f-2
SEC ID Nº: 204 8-29
mmu-mir-7-1
SEC ID Nº: 205 24-44
mmu-mir-7-2
SEC ID Nº: 206 19-39
mmu-mir-7b
SEC ID Nº: 207 30-50
mmu-mir-9-2
SEC ID Nº: 208 8-30 y/o 46-66
mmu-mir-9-1
SEC ID Nº: 209 16-38 y/o 56-76
mmu-mir-9-3
SEC ID Nº: 210 16-38 y/o 56-76
mmu-mir-10b
SEC ID Nº: 21 7-28
mmu-mir-10a-1
SEC ID Nº: 212 22-44
mmu-mir-10a-2
SEC ID Nº: 213 22-44
mmu-mir-15b
SEC ID Nº: 214 4-25
mmu-mir-15a
SEC ID Nº: 215 15-36
mmu-mir-16-1
SEC ID Nº: 216 16-37
mmu-mir-16-2
SEC ID Nº: 217 17-38
mmu-mir-17
SEC ID Nº: 218 14-37 y/o 51-70
mmu-mir-18
SEC ID Nº: 219 17-38
mmu-mir-19b-2
SEC ID Nº: 220 54-76
mmu-mir-19a
SEC ID Nº: 221 49-71
mmu-mir-19b-1
SEC ID Nº: 222 54-76
mmu-mir-20
SEC ID Nº: 223 27-49
mmu-mir-21
SEC ID Nº: 224 18-39
mmu-mir-22
SEC ID Nº: 225 57-78
mmu-mir-23b
SEC ID Nº: 226 46-68
mmu-mir-23a
SEC ID Nº: 227 46-66
mmu-mir-24-1
SEC ID Nº: 228 6-28 y/o 44-65
mmu-mir-24-2
SEC ID Nº: 229 61-82
mmu-mir-25
SEC ID Nº: 230 52-73
mmu-mir-26a-1
SEC ID Nº: 231 16-37
imagen19
Secuencias de miARN de ratón
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
mmu-mir-26b
SEC ID Nº: 232 15-36
mmu-mir-26a-2
SEC ID Nº: 233 14-35
mmu-mir-27b
SEC ID Nº: 234 49-68
mmu-mir-27a
SEC ID Nº: 235 56-76
mmu-mir-28
SEC ID Nº: 236 14-35
mmu-mir-29b-1
SEC ID Nº: 237 47-68
mmu-mir-29a
SEC ID Nº: 238 53-74
mmu-mir-29c
SEC ID Nº: 239 54-75
mmu-mir-29b-2
SEC ID Nº: 240 52-73
mmu-mir-30a
SEC ID Nº: 241 47-68
mmu-mir-30b
SEC ID Nº: 242 2-22
mmu-mir-30e
SEC ID Nº: 243 2-21
mmu-mir-30c-1
SEC ID Nº: 244 17-39
mmu-mir-30c-2
SEC ID Nº: 245 14-36
mmu-mir-30d
SEC ID Nº: 246 12-33
mmu-mir-31
SEC ID Nº: 247 28-49
mmu-mir-32
SEC ID Nº: 248 6-26
mmu-mir-33
SEC ID Nº: 249 6-24
mmu-mir-34c
SEC ID Nº: 250 13-35
mmu-mir-34b
SEC ID Nº: 251 13-35
mmu-mir-34a
SEC ID Nº: 252 20-42
mmu-mir-92-2
SEC ID Nº: 253 55-75
mmu-mir-92-1
SEC ID Nº: 254 50-70
mmu-mir-93
SEC ID Nº: 255 15-37
mmu-mir-96
SEC ID Nº: 256 24-46
mmu-mir-98
SEC ID Nº: 257 2-23
mmu-mir-99a
SEC ID Nº: 258 6-25
mmu-mir-99b
SEC ID Nº: 259 7-28
mmu-mir-100
SEC ID Nº: 260 13-34
mmu-mir-101
SEC ID Nº: 261 38-57
mmu-mir-101b
SEC ID Nº: 262 61-82
imagen20
Secuencias de miARN de ratón
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
mmu-mir-103-1
SEC ID Nº: 263 52-74
mmu-mir-103-2
SEC ID Nº: 264 52-74
mmu-mir-106a
SEC ID Nº: 265 5-26
mmu-mir-106b
SEC ID Nº: 266 12-32
mmu-mir-107
SEC ID Nº: 267 52-74
mmu-mir-122a
SEC ID Nº: 268 6-28
mmu-mir-124a-3
SEC ID Nº: 269 43-64
mmu-mir-124a-1
SEC ID Nº: 270 52-73
mmu-mir-124a-2
SEC ID Nº: 271 61-82
mmu-mir-125a
SEC ID Nº: 272 6-28
mmu-mir-125b-2
SEC ID Nº: 273 7-28
mmu-mir-125b-1
SEC ID Nº: 274 15-36
mmu-mir-126
SEC ID Nº: 275 9-29 y/o 46-66
mmu-mir-127
SEC ID Nº: 276 43-64
mmu-mir-128a
SEC ID Nº: 277 44-65
mmu-mir-128b
SEC ID Nº: 278 48-69
mmu-mir-129-1
SEC ID Nº: 279 6-27
mmu-mir-129-2
SEC ID Nº: 280 15-36
mmu-mir-130a
SEC ID Nº: 281 42-61
mmu-mir-130b
SEC ID Nº: 282 51-72
mmu-mir-132
SEC ID Nº: 283 42-63
mmu-mir-133a-1
SEC ID Nº: 284 44-65
mmu-mir-133a-2
SEC ID Nº: 285 60-81
mmu-mir-133b
SEC ID Nº: 286 67-87
mmu-mir-134
SEC ID Nº: 287 7-27
mmu-mir-135a-1
SEC ID Nº: 288 17-39
mmu-mir-135b
SEC ID Nº: 289 16-37
mmu-mir-135a-2
SEC ID Nº: 290 23-45
mmu-mir-136
SEC ID Nº: 291 5-27
mmu-mir-137
SEC ID Nº: 292 46-67
mmu-mir-138-2
SEC ID Nº: 293 2-18
imagen21
Secuencias de miARN de ratón
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
mmu-mir-138-1
SEC ID Nº: 294 23-39
mmu-mir-139
SEC ID Nº: 295 7-24
mmu-mir-140
SEC ID Nº: 296 7-27
mmu-mir-141
SEC ID Nº: 297 49-69
mmu-mir-142
SEC ID Nº: 298 4-23 y/o 40-61
mmu-mir-143
SEC ID Nº: 299 40-61
mmu-mir-144
SEC ID Nº: 300 43-64
mmu-mir-145
SEC ID Nº: 301 7-30
mmu-mir-146
SEC ID Nº: 302 6-27
mmu-mir-148a
SEC ID Nº: 303 61-82
mmu-mir-149
SEC ID Nº: 304 4-25
mmu-mir-150
SEC ID Nº: 305 6-27
mmu-mir-151
SEC ID Nº: 306 43-63
mmu-mir-152
SEC ID Nº: 307 47-67
mmu-mir-153
SEC ID Nº: 308 44-63
mmu-mir-154
SEC ID Nº: 309 6-27
mmu-mir-155
SEC ID Nº: 310 4-25
mmu-mir-181a
SEC ID Nº: 311 7-29
mmu-mir-181b-1
SEC ID Nº: 312 12-35
mmu-mir-181c
SEC ID Nº: 313 17-38
mmu-mir-181b-2
SEC ID Nº: 314 16-39
mmu-mir-182
SEC ID Nº: 315 7-28
mmu-mir-183
SEC ID Nº: 316 6-28
mmu-mir-184
SEC ID Nº: 317 45-66
mmu-mir-185
SEC ID Nº: 318 7-24
mmu-mir-186
SEC ID Nº: 319 7-29
mmu-mir-187
SEC ID Nº: 320 40-61
mmu-mir-188
SEC ID Nº: 321 6-27
mmu-mir-190
SEC ID Nº: 322 6-27
mmu-mir-191
SEC ID Nº: 323 7-28
mmu-mir-192
SEC ID Nº: 324 14-31
imagen22
Secuencias de miARN de ratón
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
mmu-mir-193
SEC ID Nº: 325 41-61
mmu-mir-194-1
SEC ID Nº: 326 7-28
mmu-mir-194-2
SEC ID Nº: 327 16-37
mmu-mir-195
SEC ID Nº: 328 1-21
mmu-mir-196-1
SEC ID Nº: 329 24-44
mmu-mir-196-2
SEC ID Nº: 330 16-36
mmu-mir-199a-1
SEC ID Nº: 331 6-28 y/o 45-66
mmu-mir-199a-2
SEC ID Nº: 332 31-53 y/o 69-90
mmu-mir-199b
SEC ID Nº: 333 26-48
mmu-mir-200b
SEC ID Nº: 334 45-67
mmu-mir-200a
SEC ID Nº: 335 54-75
mmu-mir-200c
SEC ID Nº: 336 46-67
mmu-mir-201
SEC ID Nº: 337 6-26
mmu-mir-202
SEC ID Nº: 338 45-66
mmu-mir-203
SEC ID Nº: 339 49-69
mmu-mir-204
SEC ID Nº: 340 6-28
mmu-mir-205
SEC ID Nº: 341 7-28
mmu-mir-206
SEC ID Nº: 342 46-67
mmu-mir-207
SEC ID Nº: 343 52-74
mmu-mir-208
SEC ID Nº: 344 50-71
mmu-mir-210
SEC ID Nº: 345 66-86
mmu-mir-211
SEC ID Nº: 346 26-47
mmu-mir-212
SEC ID Nº: 347 56-76
mmu-mir-213
SEC ID Nº: 348 14-36 y/o 54-75
mmu-mir-214
SEC ID Nº: 349 71-91
mmu-mir-215
SEC ID Nº: 350 30-50
mmu-mir-216
SEC ID Nº: 351 7-27
mmu-mir-217
SEC ID Nº: 352 34-57
mmu-mir-218-2
SEC ID Nº: 353 25-45
mmu-mir-219-1
SEC ID Nº: 354 21-41
mmu-mir-219-2
SEC ID Nº: 355 19-39
imagen23
Secuencias de miARN de ratón
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
mmu-mir-221
SEC ID Nº: 356 60-81
mmu-mir-222
SEC ID Nº: 357 49-71
mmu-mir-223
SEC ID Nº: 358 68-88
mmu-mir-224
SEC ID Nº: 359 8-30
mu-miR-290
SEC ID Nº: 360 15-37
mmu-mir-291
SEC ID Nº: 361 14-35 y/o 50-72
mmu-mir-292
SEC ID Nº: 362 12-33 y/o 51-73
mmu-mir-293
SEC ID Nº: 363 48-69
mmu-mir-294
SEC ID Nº: 364 51-72
mmu-mir-295
SEC ID Nº: 365 43-65
mmu-mir-296
SEC ID Nº: 366 13-33
mmu-mir-297-1
SEC ID Nº: 367 15-35
mmu-mir-297-2
SEC ID Nº: 368 36-56
mmu-mir-298
SEC ID Nº: 369 11-32
mmu-mir-299
SEC ID Nº: 370 7-28
mmu-mir-300
SEC ID Nº: 371 51-72
mmu-mir-301
SEC ID Nº: 372 51-73
mmu-mir-302
SEC ID Nº: 373 44-66
mmu-mir-320
SEC ID Nº: 374 48-70
mmu-mir-321
SEC ID Nº: 375 10-30
mmu-mir-323
SEC ID Nº: 376 50-71
mmu-mir-324
SEC ID Nº: 377 18-40 y/o 53-74
mmu-mir-325
SEC ID Nº: 378 16-38
mmu-mir-326
SEC ID Nº: 379 60-80
mmu-mir-328
SEC ID Nº: 380 61-82
mmu-mir-329
SEC ID Nº: 381 61-82
mmu-mir-330
SEC ID Nº: 382 61-83
mmu-mir-331
SEC ID Nº: 383 61-81
mmu-mir-337
SEC ID Nº: 384 61-83
mmu-mir-338
SEC ID Nº: 385 61-83
mmu-mir-339
SEC ID Nº: 386 16-36
imagen24
Secuencias de miARN de ratón
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
mmu-mir-340
SEC ID Nº: 387 61-83
mmu-mir-341
SEC ID Nº: 388 61-81
mmu-mir-342
SEC ID Nº: 389 61-84
mmu-mir-344
SEC ID Nº: 390 61-83
mmu-mir-345
SEC ID Nº: 391 16-36
mmu-mir-346
SEC ID Nº: 392 16-38
mmu-mir-350
SEC ID Nº: 393 61-84
mmu-mir-351
SEC ID Nº: 583 16-39
mmu-mir-370
SEC ID Nº: 584 48-70
mmu-mir-376a
SEC ID Nº: 585 44-64
mmu-mir-376b
SEC ID Nº: 586 51-72
mmu-mir-380
SEC ID Nº: 587 40-61
mmu-mir-409
SEC ID Nº: 588 47-69
mmu-mir-410
SEC ID Nº: 589 50-71
mmu-mir-411
SEC Nº: 590 56-78
mmu-mir-412
SEC Nº: 591 50-72
mmu-mir-425
SEC ID Nº: 695 54-74
mmu-mir-429
SEC ID Nº: 696 51-72
mmu-mir-448
SEC ID Nº: 697 72-93
mmu-mir-449
SEC ID Nº: 698 16-37
mmu-mir-450
SEC ID Nº: 699 17-38
mmu-mir-451
SEC ID Nº: 786 17-38
mmu-mir-452
SEC ID Nº: 787 17-38
mmu-mir-463
SEC ID Nº: 788 4-24
mmu-mir-464
SEC ID Nº: 789 47-69
mmu-mir-465
SEC ID Nº: 790 5-27
mmu-mir-466
SEC ID Nº: 791 51-73
mmu-mir-467
SEC ID Nº: 792 50-71
mmu-mir-468
SEC ID Nº: 793 53-75
mmu-mir-469
SEC ID Nº: 794 6-31
mmu-mir-470
SEC ID Nº: 795 9-29
imagen25
Secuencias de miARN de ratón
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
mmu-mir-471
SEC ID Nº: 796 7-29
mmu-mir-483
SEC ID Nº: 797 45-67
mmu-mir-484
SEC ID Nº: 798 2-23
mmu-mir-485
SEC ID Nº: 799 9-30
mmu-mir-486
SEC ID Nº: 800 4-25
Tabla 3
Secuencias de miARN de rata
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
rno-let-7d
SEC ID Nº: 394 14-34 y/o 68-89
rno-mir-7-1
SEC ID Nº: 395 19-39 y/o 61-82
rno-let-7a-1
SEC ID Nº: 396 13-34
rno-let-7a-2
SEC ID Nº: 397 17-38
rno-let-7b
SEC ID Nº: 398 7-28
rno-let-7c-1
SEC ID Nº: 399 16-37
rno-let-7c-2
SEC ID Nº: 400 14-35
rno-let-7e
SEC ID Nº: 401 15-35
rno-let-7f-1
SEC ID Nº: 402 8-29
rno-let-7f-2
SEC ID Nº: 403 8-29
rno-let-7i
SEC ID Nº: 404 6-24
rno-mir-7-2
SEC ID Nº: 405 19-39
rno-mir-7b
SEC ID Nº: 406 29-49
rno-mir-9-1
SEC ID Nº: 407 16-38
rno-mir-9-3
SEC ID Nº: 408 16-38
rno-mir-9-2
SEC ID Nº: 409 16-38
mo-mir-10a
SEC ID Nº: 410 22-44
rno-mir-10b
SEC ID Nº: 411 26-47
rno-mir-15b
SEC ID Nº: 412 20-41
rno-mir-16
SEC ID Nº: 413 17-38
rno-mir-17
SEC ID Nº: 414 14-37
rno-mir-18
SEC ID Nº: 415 17-38
imagen26
Secuencias de miARN de rata
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
rno-mir-19b-1
SEC ID Nº: 416 54-76
rno-mir-19b-2
SEC ID Nº: 417 62-84
rno-mir-19a
SEC ID Nº: 418 49-71
rno-mir-20
SEC ID Nº: 419 16-38 y/o 52-72
rno-mir-21
SEC ID Nº: 420 18-39
rno-mir-22
SEC ID Nº: 421 57-78
rno-mir-23a
SEC ID Nº: 422 46-66
rno-mir-23b
SEC ID Nº: 423 58-80
rno-mir-24-1
SEC ID Nº: 424 44-65
rno-mir-24-2
SEC ID Nº: 425 61-82
rno-mir-25
SEC ID Nº: 426 52-73
rno-mir-26a
SEC ID Nº: 427 16-37
rno-mir-26b
SEC ID Nº: 428 15-36
rno-mir-27b
SEC ID Nº: 429 61-80
rno-mir-27a
SEC ID Nº: 430 56-76
rno-mir-28
SEC ID Nº: 431 14-35
rno-mir-29b-2
SEC ID Nº: 432 52-73
rno-mir-29a
SEC ID Nº: 433 53-74
rno-mir-29b-1
SEC ID Nº: 434 51-72
rno-mir-29c
SEC ID Nº: 435 54-75
rno-mir-30c-1
SEC ID Nº: 436 17-39
rno-mir-30e
SEC ID Nº: 437 2-21
rno-mir-30b
SEC ID Nº: 438 16-36
rno-mir-30d
SEC ID Nº: 439 12-33
rno-mir-30a
SEC ID Nº: 440 47-68
rno-mir-30c-2
SEC ID Nº: 441 14-36
rno-mir-31
SEC ID Nº: 442 28-49
rno-mir-32
SEC ID Nº: 443 6-26
rno-mir-33
SEC ID Nº: 444 6-24
rno-mir-34b
SEC ID Nº: 445 13-35
rno-mir-34c
SEC ID Nº: 446 13-35
imagen27
Secuencias de miARN de rata
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
rno-mir-34a
SEC ID Nº: 447 20-42
rno-mir-92-1
SEC ID Nº: 448 48-68
rno-mir-92-2
SEC ID Nº: 449 55-75
rno-mir-93
SEC ID Nº: 450 15-37
rno-mir-96
SEC ID Nº: 451 24-46
rno-mir-98
SEC ID Nº: 452 2-23
rno-mir-99a
SEC ID Nº: 453 13-34
rno-mir-99b
SEC ID Nº: 454 7-28
rno-mir-100
SEC ID Nº: 455 13-34
rno-mir-101b
SEC ID Nº: 456 61-82
rno-mir-101
SEC ID Nº: 457 47-68
rno-mir-103-2
SEC ID Nº: 458 52-74
rno-mir-103-1
SEC ID Nº: 459 52-74
rno-mir-106b
SEC ID Nº: 460 12-32
rno-mir-107
SEC ID Nº: 461 52-74
rno-mir-122a
SEC ID Nº: 462 15-37
rno-mir-124a-3
SEC ID Nº: 463 52-73
rno-mir-124a-1
SEC ID Nº: 464 52-73
rno-mir-124a-2
SEC ID Nº: 465 61-82
rno-mir-125a
SEC ID Nº: 466 15-37
rno-mir-125b-1
SEC ID Nº: 467 15-36
rno-mir-125b-2
SEC ID Nº: 468 17-38
rno-mir-126
SEC ID Nº: 469 9-29 y/o 46-66
rno-mir-127
SEC ID Nº: 470 57-78
rno-mir-128a
SEC ID Nº: 471 50-71
rno-mir-128b
SEC ID Nº: 472 52-73
rno-mir-129-2
SEC ID Nº: 473 19-40 y/o 61-82
rno-mir-129-1
SEC ID Nº: 474 6-27
rno-mir-130a
SEC ID Nº: 475 55-74
rno-mir-130b
SEC ID Nº: 476 51-72
rno-mir-132
SEC ID Nº: 477 59-80
imagen28
Secuencias de miARN de rata
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
rno-mir-133a
SEC ID Nº: 478 53-74
rno-mir-134
SEC ID Nº: 479 8-28
rno-mir-135b
SEC ID Nº: 480 16-37
rno-mir-135a
SEC ID Nº: 481 23-45
rno-mir-136
SEC ID Nº: 482 15-37
rno-mir-137
SEC ID Nº: 483 60-81
rno-mir-138-2
SEC ID Nº: 484 9-25
rno-mir-138-1
SEC ID Nº: 485 23-39
rno-mir-139
SEC ID Nº: 486 7-24
rno-mir-140
SEC ID Nº: 487 23-43 y/o 61-84
rno-mir-141
SEC ID Nº: 488 59-79
rno-mir-142
SEC ID Nº: 489 16-35 y/o 52-74
rno-mir-143
SEC ID Nº: 490 60-81
rno-mir-144
SEC ID Nº: 491 50-71
rno-mir-145
SEC ID Nº: 492 16-39
rno-mir-146
SEC ID Nº: 493 17-38
rno-mir-148b
SEC ID Nº: 494 61-82
rno-mir-150
SEC ID Nº: 495 16-37
rno-mir-151
SEC ID Nº: 496 16-37 y/o 50-71
rno-mir-152
SEC ID Nº: 497 53-73
rno-mir-153
SEC ID Nº: 498 53-72
rno-mir-154
SEC ID Nº: 499 15-36
rno-mir-181c
SEC ID Nº: 500 24-45
mo-mir-181a
SEC ID Nº: 501 39-61
rno-mir-181b-1
SEC ID Nº: 502 36-59
rno-mir-181b-2
SEC ID Nº: 503 15-38
rno-mir-183
SEC ID Nº: 504 27-49
rno-mir-184
SEC ID Nº: 505 47-68
rno-mir-185
SEC ID Nº: 506 14-31
rno-mir-186
SEC ID Nº: 507 15-37
rno-mir-187
SEC ID Nº: 508 66-86
imagen29
Secuencias de miARN de rata
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
rno-mir-190
SEC ID Nº: 509 15-36
rno-mir-191
SEC ID Nº: 510 15-36
rno-mir-192
SEC ID Nº: 511 24-44
rno-mir-193
SEC ID Nº: 512 54-74
rno-mir-194-1
SEC ID Nº: 513 15-36
rno-mir-194-2
SEC ID Nº: 514 15-36
rno-mir-195
SEC ID Nº: 515 15-35
rno-mir-196
SEC ID Nº: 516 25-45
rno-mir-199a
SEC ID Nº: 517 31-53
rno-mir-200c
SEC ID Nº: 518 46-67
rno-mir-200a
SEC ID Nº: 519 54-75
rno-mir-200b
SEC ID Nº: 520 54-77
rno-mir-203
SEC ID Nº: 521 52-73
rno-mir-204
SEC ID Nº: 522 33-54
rno-mir-205
SEC ID Nº: 523 33-54
rno-mir-206
SEC ID Nº: 524 51-72
rno-mir-208
SEC ID Nº: 525 50-71
rno-mir-210
SEC ID Nº: 526 66-86
rno-mir-211
SEC ID Nº: 527 26-47
rno-mir-212
SEC ID Nº: 528 72-92
rno-mir-213
SEC ID Nº: 529 55-76
rno-mir-214
SEC ID Nº: 530 71-91
rno-mir-216
SEC ID Nº: 531 19-39
rno-mir-217
SEC ID Nº: 532 32-55
rno-mir-218-2
SEC ID Nº: 533 25-45
rno-mir-218-1
SEC ID Nº: 534 25-45
rno-mir-219-1
SEC ID Nº: 535 21-41
rno-mir-219-2
SEC ID Nº: 536 19-39
rno-mir-221
SEC ID Nº: 537 65-87
rno-mir-222
SEC ID Nº: 538 62-85
rno-mir-223
SEC ID Nº: 539 68-88
imagen30
Secuencias de miARN de rata
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
rno-mir-290
SEC ID Nº: 540 14-36
rno-mir-291
SEC ID Nº: 541 14-35 y/o 50-72
rno-mir-292
SEC ID Nº: 542 12-33 y/o 51-73
rno-mir-296
SEC ID Nº: 543 13-33
rno-mir-297
SEC ID Nº: 544 26-48
rno-mir-298
SEC ID Nº: 545 11-32
rno-mir-299
SEC ID Nº: 546 7-28
rno-mir-300
SEC ID Nº: 547 51-72
rno-mir-301
SEC ID Nº: 548 61-85
rno-mir-320
SEC ID Nº: 549 48-70
rno-mir-321
SEC ID Nº: 550 10-30
rno-mir-322
SEC ID Nº: 551 61-80
rno-mir-323
SEC ID Nº: 552 50-71
rno-mir-324
SEC ID Nº: 553 16-38 y/o 51-72
rno-mir-325
SEC ID Nº: 554 16-38
rno-mir-326
SEC ID Nº: 555 60-80
rno-mir-328
SEC ID Nº: 556 48-69
mo-mir-329
SEC ID Nº: 557 61-82
rno-mir-330
SEC ID Nº: 558 60-82
rno-mir-331
SEC ID Nº: 559 61-81
rno-mir-333
SEC ID Nº: 560 16-35
rno-mir-336
SEC ID Nº: 561 16-36
rno-mir-337
SEC ID Nº: 562 60-82
rno-mir-338
SEC ID Nº: 563 41-63
rno-mir-339
SEC ID Nº: 564 16-36
rno-mir-341
SEC ID Nº: 565 61-81
rno-mir-342
SEC ID Nº: 566 61-84
rno-mir-344
SEC ID Nº: 567 61-83
rno-mir-345
SEC ID Nº: 568 16-36
rno-mir-346
SEC ID Nº: 569 16-38
rno-mir-349
SEC ID Nº: 570 61-82
5
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20
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30
35
E10183462
31-03-2015
(continuación)
Secuencias de miARN de rata
Nombre del miARN
Precursor Secuencia Procesada en Relación con el Precursor
rno-mir-350
SEC ID Nº: 571 61-84
rno-mir-351
SEC ID Nº: 572 16-39
rno-mir-352
SEC ID Nº: 592 61-81
rno-mir-421
SEC ID Nº: 593 10-30
rno-mir-429
SEC ID Nº: 700 53-74
rno-mir-448
SEC ID Nº: 701 72-93
rno-mir-449
SEC ID Nº: 702 16-37
rno-mir-450
SEC ID Nº: 703 17-38
rno-mir-451
SEC ID Nº: 801 17-38
mo-mir-483
SEC ID Nº: 802 45-67
Se entiende que un miARN deriva de secuencias genómicas o un gen. A este respecto, el término “gen” se usa para simplificar para hacer referencia a la secuencia genómica que codifica el miARN precursor para un miARN dado. Sin embargo, las realizaciones de la invención pueden implicar secuencias genómicas de un miARN que están implicadas en su expresión, tales como un promotor u otras secuencias reguladoras.
El término “recombinante” puede usarse y este se refiere en general a una molécula que se ha manipulado in vitro o que es el producto replicado o expresado de dicha molécula.
La expresión “ácido nucleico” se conoce bien en la técnica. Un “ácido nucleico” como se usa en el presente documento se referirá en general a una molécula (una o más cadenas) de ADN, ARN o un derivado o análogo de la misma, que comprende una base nitrogenada. Una base nitrogenada incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina de origen natural hallada en el ADN (por ejemplo, una adenina “A”, una guanina “G”, una timina “T” o una citosina “C”) o ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo “U” o una C). La expresión “ácido nucleico” abarca los términos “oligonucleótido” y “polinucleótido”, cada uno como un subgénero de la expresión “ácido nucleico”.
El término “miARN” se refiere en general a una molécula monocatenaria, pero en realizaciones específicas, las moléculas implementadas en la invención también abarcarán una región o una cadena adicional que es parcialmente (entre el 10 y el 50 % complementaria a lo largo de la longitud de la cadena), sustancialmente (más del 50 % pero menos del 100 % complementaria a lo largo de la longitud de la cadena) o completamente complementaria de otra región de la misma molécula monocatenaria o de otro ácido nucleico. Por lo tanto, los ácidos nucleicos pueden abarcar una molécula que comprende una o más cadenas complementarias o autocomplementarias o “complemento o complementos” de una secuencia particular que comprende una molécula. Por ejemplo, un miARN precursor puede tener una región autocomplementaria, que es hasta el 100 % complementaria.
Como se usa en el presente documento, se entiende que “hibridación”, “hibrida” o “capaz de hibridar” significa la formación de una molécula bi o tricatenaria o una molécula de naturaleza bi o tricatenaria parcial. El término “atemperar” como se usa en el presente documento es sinónimo de “hibridar”. La expresión “hibridación”, “hibrida o hibridan” o “capaz de hibridar” abarca las expresiones “condición o condiciones rigurosas” o “alta rigurosidad” y las expresiones “baja rigurosidad” o “condición o condiciones de baja rigurosidad”.
Los ácidos nucleicos sintéticos de la invención comprenderán, en algunas realizaciones, la secuencia de miARN de cualquier miARN descrito en SEC ID Nº: 1-805, y/o cualquier secuencia con el complemento del mismo. Se contempla que las secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden tener, tener al menos, o tener como máximo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº: 1-805 (o cualquier intervalo derivable del mismo), o ser un complemento de los mismos. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos son, son al menos o son
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E10183462
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como máximo 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % idénticos o complementarios de la secuencia de miARN de SEC ID Nº: 1-805 o de la secuencia completa de cualquiera de SEC ID Nº: 1-805, o cualquier combinación o intervalo derivable del mismo.
1. Bases nitrogenadas
Como se usa en el presente documento una “base nitrogenada” se refiere a una base heterocíclica, tal como por ejemplo una base nitrogenada de origen natural (es decir, una A, T, G, C o U) hallada en al menos un ácido nucleico de origen natural (es decir, ADN y ARN), y un derivado o derivados de origen natural o no natural y análogos de dicha base nitrogenada. Una base nitrogenada generalmente puede formar uno o más enlaces de hidrógeno (“atemperar” o “hibridar”) con al menos una base nitrogenada de origen natural de tal manera que se pueda sustituir la formación de pares de bases nitrogenadas de origen natural (por ejemplo, el enlace de hidrógeno entre A y T, G y C y A y U).
La base o las bases nitrogenadas “purina” y/o “pirimidina” abarcan bases nitrogenadas de purina y/o pirimidina de origen natural y también derivado o derivados y análogo o análogos de las mismas, incluyendo pero sin limitación, las de una purina o pirimidina sustituida por uno o más de un resto de alquilo, carboxialquilo, amino, hidroxilo, halógeno (es decir, flúor, cloro, bromo o yodo), tiol o alquiltiol. Los restos alquilo preferidos (por ejemplo, alquilo, carboxialquilo, etc.) comprenden de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, a aproximadamente 6 átomos de carbono. Otros ejemplos no limitantes de una purina o pirimidina incluyen una desazapurina, una 2,6-diaminopurina, un 5-fluorouracilo, una xantina, una hipoxantina, una 8-bromoguanina, una 8-cloroguanina, una bromotimina, una 8-aminoguanina, una 8-hidroxiguanina, una 8-metilguanina, una 8-tioguanina, una azaguanina, una 2-aminopurina, una 5-etilcitosina, una 5-metilcitosina, un 5-bromouracilo, un 5-etiluracilo, un 5-yodouracilo, un 5-clorouracilo, un 5-propiluracilo, un tiouracilo, una 2metiladenina, una metiltioadenina, una N,N-dimetiladenina, una azaadenina, una 8-bromoadenina, una 8hidroxiadenina, una 6-hidroxiaminopurina, una 6-tiopurina, una 4-(6-aminohexil/citosina) y similares. Otros ejemplos se conocen bien por los expertos en la materia.
Una base nitrogenada puede estar comprendida en un nucleósido o nucleótido, usando cualquier procedimiento de síntesis químico o natural descrito en el presente documento o conocido por un experto habitual en la materia. Dicha base nitrogenada pueden estar marcada o puede ser parte de una molécula que está marcada y contiene la base nitrogenada.
2. Nucleósidos
Como se usa en el presente documento, un “nucleósido” se refiere a una unidad química individual que comprende una base nitrogenada unida covalentemente con un resto de engarce de base nitrogenada. Un ejemplo no limitante de “restos de engarce de base nitrogenada” es un azúcar que comprende 5 átomos de carbono (es decir, un “azúcar de 5 carbonos”), incluyendo pero sin limitación una desoxirribosa, una ribosa, una arabinosa o un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos. Los ejemplos no limitantes de un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos incluyen una 2’-fluoro-2’-desoxirribosa o un azúcar carbocíclico en el que un carbono sustituye un átomo de oxígeno en el anillo de azúcar.
Se conocen en la técnica diferentes tipos de unión o uniones covalentes de una base nitrogenada con un resto de engarce de base nitrogenada. Como ejemplo no limitante, un nucleósido que comprende una purina (es decir, A o G)
o una base nitrogenada de 7-desazapurina une covalentemente típicamente la posición 9 de una purina o una 7desazapurina con la posición 1’ de un azúcar de 5 carbonos. En otro ejemplo no limitante, un nucleósido que comprende una base nitrogenada de pirimidina (es decir, C, T o U) típicamente une covalentemente una posición 1 de una pirimidina con una posición 1’ de un azúcar de 5 carbonos (Kornberg y Baker, 1992).
3. Nucleótidos
Como se usa en el presente documento, un “nucleótido” se refiere a un nucleósido que comprende además un “resto de cadena principal”. Un resto de cadena principal generalmente une covalentemente un nucleótido con otra molécula que comprende un nucleótido o con otro nucleótido para formar un ácido nucleico. El “resto de cadena principal” en nucleótidos de origen natural típicamente comprende un resto de fósforo, que se une covalentemente con un azúcar de 5 carbonos. La unión del resto de cadena principal sucede típicamente en la posición 3’ o 5’ del azúcar de 5 carbonos. Sin embargo, se conocen en la técnica otros tipos de uniones, particularmente cuando un nucleótido comprende derivados o análogos de un azúcar de 5 carbonos o resto de fósforo de origen natural.
4. Análogos de ácido nucleico
Un ácido nucleico puede comprender, o estar compuesto completamente de, un derivado o análogo de una base nitrogenada, un resto de engarce de base nitrogenada y/o resto de cadena principal que puede estar presente en un ácido nucleico de origen natural. El ARN con análogos de ácido nucleico también puede marcarse de acuerdo con procedimientos de la invención. Como se usa en el presente documento un “derivado” se refiere a una forma alterada o modificada químicamente de una molécula de origen natural, mientras que los términos “mimético” o “análogo” se refieren a una molécula que puede asemejarse o no estructuralmente a una molécula o resto de origen natural, pero posee funciones similares. Como se usa en el presente documento, un “resto” se refiere en general a un componente químico o molecular más pequeño de una estructura química o molecular mayor. Se conocen bien en la técnica análogos o derivados de bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos, y se han descrito (véase por ejemplo, Scheit, 1980, incorporado en el presente documento por referencia).
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5 Los ejemplos no limitantes adicionales de nucleósidos, nucleótidos o ácidos nucleicos que comprenden un azúcar de 5 carbonos y/o derivados o análogos de restos de cadena principal, incluyen los de: Patente de Estados Unidos Nº 5.681.947, que describe oligonucleótidos que comprenden derivados de purina que forma triples hélices con y/o evitan la expresión de ADNbc; Patentes de Estados Unidos 5.652.099 y 5.763.167, que describen ácidos nucleicos que incorporan análogos fluorescentes de nucleósidos hallados en ADN o ARN, particularmente para su uso como
10 sondas de ácidos nucleicos fluorescentes; Patente de Estados Unidos 5.614.617, que describe análogos de oligonucleótidos con sustituciones en anillos de pirimidina que poseen estabilidad de nucleasa potenciada; Patentes de Estados Unidos 5.670.663, 5.872.232 y 5.859.221, que describen análogos de oligonucleótidos con azúcares de 5 carbonos modificados (es decir, restos de 2’-desoxifuranosilo modificados) usados en la detección de ácido nucleico; Patente de Estados Unidos 5.446.137, que describe oligonucleótidos que comprenden al menos un resto
15 de azúcar de 5 carbonos sustituido en la posición 4’ con un sustituyente distinto de hidrógeno que puede usarse en ensayos de hibridación; Patente de Estados Unidos 5.886.165, que describe oligonucleótidos tanto con desoxirribonucleótidos con enlaces internucleotídicos 3’-5’ como con ribonucleótidos con enlaces internucleotídicos 2’-5’; Patente de Estados Unidos 5.714.606, que describe un enlace internucleotídico modificado en el que un oxígeno en la posición 3’ del enlace internucleotídico se reemplaza por un carbono para potenciar la resistencia a
20 nucleasa de los ácidos nucleicos; Patente de Estados Unidos 5.672.697, que describe oligonucleótidos que contienen uno o más enlaces internucleotídicos de 5’ metilenfosfonato que potencian la resistencia a nucleasa; Patente de Estados Unidos 5.466.786 y 5.792.847, que describen el enlace de un resto sustituyente que puede comprender un fármaco o marcador con el carbono 2’ de un oligonucleótido para proporcionar estabilidad de nucleasa potenciada y capacidad para suministrar fármacos o restos de detección; Patente de Estados Unidos
25 5.223.618, que describe análogos de oligonucleótidos con un enlace de cadena principal de 2 o 3 carbonos que unen la posición 4’ y posición 3’ de resto de azúcar de 5 carbonos adyacente para potenciar la captación celular, resistencia a nucleasas e hibridación con ARN diana; Patente de Estados Unidos 5.470.967, que describe oligonucleótidos que comprenden al menos un enlace internucleotídico sulfamato o sulfamida que son útiles como sondas de hibridación de ácido nucleico; Patente de Estados Unidos 5.378.825, 5.777.092, 5.623.070, 5.610.289 y
30 5.602.240, que describen oligonucleótidos con un resto de engarce de tres o cuatro átomos que reemplaza el resto de cadena principal de fosfodiéster usado para mejora de la resistencia a nucleasa, captación celular y regulación de la expresión de ARN; Patente de Estados Unidos 5.858.988, que describe un agente vehículo hidrófobo unido con la posición 2’-O de oligonucleótidos para potenciar su permeabilidad de membrana y estabilidad; Patente de Estados Unidos 5.214.136, que describe oligonucleótidos conjugados con antraquinona en el extremo 5’ terminal que poseen
35 hibridación potenciada con ADN o ARN; estabilidad potenciada frente a nucleasas; Patente de Estados Unidos 5.700.922, que describe quimeras de APN-ADN-APN en las que el ADN comprende nucleótidos 2’-desoxi-eritropentofuranosilo para potenciación de la resistencia a nucleasa, afinidad de unión y capacidad para activar la RNasa H; y Patente de Estados Unidos 5.708.154, que describe ARN unido a un ADN para formar un híbrido de ADN-ARN; Patente de Estados Unidos 5.728.525, que describe el marcaje de análogos de nucleósidos con un marcador
40 fluorescente universal.
Son enseñanzas adicionales para análogos de nucleósidos y análogos de ácido nucleico la Patente de Estados Unidos 5.728.525, que describe análogos de nucleósidos que están marcados en sus extremos; Patente de Estados Unidos 5.637.683, 6.251.666 (sustituciones de L-nucleótidos), y 5.480.980 (nucleótidos 7-desaza-2’desoxiguanosina y análogos de ácido nucleico de los mismos).
45 El uso de otros análogos se contempla específicamente para su uso en el contexto de la presente invención. Dichos análogos pueden usarse en moléculas de ácido nucleico sintéticas de la invención, tanto mediante la molécula como en nucleótidos seleccionados. Incluyen, pero sin limitación, 1) modificaciones de ribosa (tales como 2’F, 2’ NH2, 2’N3, 4’tio o 2’ O-CH3) y 2) modificaciones de fosfato (tales como las halladas en fosforotioatos, metil fosfonatos, y fosforoboratos). Dichos análogos se han creado para conferir estabilidad en ARN reduciendo o eliminando su
50 capacidad para escindirse por ribonucleasas. Cuando estos análogos de nucleótidos están presentes en ARN, pueden tener efectos profundamente positivos en la estabilidad de los ARN en animales. Se contempla que el uso de análogos de nucleótidos puede usarse solo o junto con cualquiera de las modificaciones de diseño de un miARN sintético de cualquier ácido nucleico de la invención.
5. Nucleótidos modificados
55 Tanto los miARN como inhibidores de miARN sintéticos de la invención contemplan específicamente el uso de nucleótidos que se modifican para potenciar sus actividades. Dichos nucleótidos incluyen los que están en el extremo 5’ o 3’ del ARN así como los que están internos dentro de la molécula. Los nucleótidos modificados usados en las cadenas complementarias de miARN sintéticos bloquean el 5’OH o fosfato del ARN o introducen modificaciones de azúcares internos que potencian la captación de la cadena activa del miARN sintético. Las
60 modificaciones para los inhibidores de miARN incluyen modificaciones de azúcares internas que potencian la hibridación así como estabilizan las moléculas en células y modificaciones terminales que estabilizan adicionalmente
imagen32
B. Preparación de ácidos nucleicos
Un ácido nucleico puede realizarse por cualquier técnica conocida por un experto habitual en la materia, tal como
5 por ejemplo, síntesis química, producción enzimática o producción biológica. Aunque podrían producirse miARN sintéticos de acuerdo con la invención usando procedimientos recombinantes, se prefiere producir miARN sintéticos por síntesis química o producción enzimática. De forma similar, los inhibidores de miARN se producen preferentemente por síntesis química o producción enzimática. Puede producirse miARN no sintéticos por varios procedimientos, incluyendo procedimientos que implican tecnología de ADN recombinante.
10 Se realiza síntesis de ácido nucleico de acuerdo con procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Itakura y Riggs (1980). Adicionalmente, la Patente de Estados Unidos 4.704.362, Patente de Estados Unidos 5.221.619 y Patente de Estados Unidos 5.583.013 describen cada una diversos procedimientos para preparar ácidos nucleicos sintéticos. Los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico sintético (por ejemplo, un oligonucleótido sintético), incluyen un ácido nucleico preparado por síntesis química in vitro usando química de fosfotriéster, fosfito o
15 fosforamidita y técnicas de fase sólida tales como se describen en el documento EP 266.032, incorporado en el presente documento por referencia, o mediante intermedios de desoxinucleósido H-fosfonato como se describe en Froehler y col., 1986 y Patente de Estados Unidos Nº de Serie 5.705.629. En los procedimientos de la presente invención, pueden usarse uno o más oligonucleótidos. Se han desvelado diversos mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813,
20 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244.
Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido de forma enzimática incluye uno producido por enzimas en reacciones de amplificación tales como PCR™ (véase por ejemplo, Patente de Estados Unidos 4.683.202 y Patente de Estados Unidos 4.682.195, cada una incorporada en el presente documento por referencia), o la síntesis de un oligonucleótido descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.645.897, incorporado en el presente documento por
25 referencia.
La síntesis de oligonucleótidos se conoce bien por los expertos en la materia. Se han desvelado diversos mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244.
Básicamente, puede conseguirse síntesis química por el procedimiento de diéster, el procedimiento de triéster, el
30 procedimiento de polinucleótidos fosforilasa y por química de fase sólida. Estos procedimientos se analizan en más detalles posteriormente.
Procedimiento de diéster. El procedimiento de diéster fue el primero en desarrollarse hasta un estado utilizable, principalmente por Khorana y colaboradores (Khorana, 1979). La etapa básica es la unión de dos desoxinucleótidos protegidos de forma adecuada para formar un didesoxinucleótido que contiene un enlace fosfodiéster. El
35 procedimiento de diéster está bien establecido y se ha usado para sintetizar moléculas de ADN (Khorana, 1979).
Procedimiento de triéster. La principal diferencia entre los procedimientos de diéster y triéster es la presencia en este último de un grupo protector extra en los átomos de fosfato de los reactivos y productos (Itakura y col., 1975). El grupo protector de fosfato es habitualmente un grupo de clorofenilo, que hace a los nucleótidos e intermedios polinucleotídicos solubles en disolventes orgánicos. Por lo tanto la purificación se realiza en soluciones de
40 cloroformo. Otras mejoras del procedimiento incluyen (i) el acoplamiento en bloque de trímeros y oligómeros mayores, (ii) el uso extensivo de cromatografía líquida de alto rendimiento para la purificación de productos tanto intermedios como finales, y (iii) síntesis de fase sólida.
Procedimiento de polinucleótido fosforilasa. Este es un procedimiento enzimático de síntesis de ADN que puede usarse para sintetizar muchos oligonucleótidos útiles (Gillam y col., 1978; Gillam y col., 1979). En condiciones
45 controladas, la polinucleótido fosforilasa añade predominantemente un único nucleótido a un oligonucleótido corto. La purificación cromatográfica permite obtener el aducto individual deseado. Se requiere al menos un trímero para comenzar el procedimiento, y este cebador debe obtenerse por algún otro procedimiento. El procedimiento de la polinucleótido fosforilasa funciona y tiene la ventaja de que la mayoría de los bioquímicos están familiarizados con los procedimientos implicados.
50 Procedimientos de fase sólida. A partir de la tecnología desarrollada para la síntesis de fase sólida de los polipéptidos, ha sido posible unir el nucleótido inicial con material de soporte sólido y continuar con la adición por etapas de nucleótidos. Todas las etapas de mezcla y lavado se simplifican, y el procedimiento se hace susceptible a automatización. Estas síntesis se llevan a cabo ahora de forma rutinaria usando sintetizadores de ácidos nucleicos automáticos.
55 La química de fosforamidita (Beaucage y Lyer, 1992) se ha convertido de lejos en la química de acoplamiento más ampliamente usada para la síntesis de oligonucleótidos. Como se conoce bien por los expertos en la materia, la síntesis de fosforamidita de oligonucleótidos implica la activación de precursores monoméricos de nucleósido Procedimientos recombinantes. Se conocen bien por los expertos en la materia procedimientos recombinantes
imagen33
5 para producir ácidos nucleicos en una célula. Estos incluyen el uso de vectores, plásmidos, cósmidos y otros vehículos para suministrar un ácido nucleico a una célula, que puede ser la célula diana o simplemente una célula huésped (para producir grandes cantidades de la molécula de ARN deseada). Como alternativa, dichos vehículos pueden usarse en el contexto de un sistema sin células siempre que los reactivos para generar la molécula de ARN estén presentes. Dichos procedimientos incluyen los descritos en Sambrook, 2003, Sambrook, 2001 y Sambrook,
10 1989, que se incorporan por la presente por referencia.
En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que no son sintéticas. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico tiene una estructura química de un ácido nucleico de origen natural y una secuencia de un ácido nucleico de origen natural, tal como la secuencia exacta y completa de un miARN primario monocatenario (véase Lee 2002), un miARN precursor monocatenario o un miARN maduro
15 monocatenario. Además del uso de tecnología recombinante, dichos ácidos nucleicos no sintéticos pueden generarse químicamente, tal como empleando tecnología usada para crear oligonucleótidos.
C. Diseño de miARN sintéticos
Los miARN sintéticos típicamente comprenden dos cadenas, una cadena activa que es idéntica en secuencia al miARN maduro que se estudia y una cadena complementaria que es al menos parcialmente complementaria de la 20 cadena activa. La cadena activa es la molécula biológicamente relevante y debería captarse preferentemente por el complejo en células que modulan la traducción bien mediante degradación de ARNm o bien mediante control de la traducción. La captación preferente de la cadena activa tiene dos resultados importantes: (1) la actividad observada del miARN sintético aumenta drásticamente y (2) se eliminan esencialmente los efectos no pretendidos inducidos por la captación y activación de la cadena complementaria. De acuerdo con la invención, pueden usarse varios
25 diseños de miARN sintético para asegurar la captación preferente de la cadena activa.
Agente de bloqueo 5’. La introducción de un resto estable distinto de fosfato o hidroxilo en el extremo 5’ de la cadena complementaria altera su actividad en la ruta de miARN. Esto asegura que solamente la cadena activa del miARN sintético se usará para regular la traducción en la célula. Las modificaciones 5’ incluyen, pero sin limitación, NH2, biotina, un grupo amina, un grupo alquilamina inferior, un grupo acetilo, 2’O-Me, DMTO, fluoresceína, un tiol o
30 acridina o cualquier otro grupo con este tipo de funcionalidad.
Otras modificaciones de cadena con sentido. La introducción de modificaciones de nucleótidos como 2’-OMe, NH2, biotina, un grupo amina, un grupo alquilamina inferior, un grupo acetilo, DMTO, fluoresceína, un tiol o acridina o cualquier otro grupo con este tipo de funcionalidad en la cadena complementaria del miARN sintético puede eliminar la actividad de la cadena complementaria y potenciar la captación de la cadena activa del miARN.
35 Desapareamientos de bases en la cadena con sentido. Como con ARNip (Schwarz 2003), la estabilidad relativa de los extremos 5’ y 3’ de la cadena activa del miARN sintético determina aparentemente la captación y activación de la activa por la ruta de miARN. La desestabilización del extremo 5’ de la cadena activa del miARN sintético por la colocación estratégica de desapareamientos de bases en el extremo 3’ de la cadena complementaria del miARN sintético potencia la actividad de la cadena activa y elimina esencialmente la actividad de la cadena complementaria.
40 E. Marcadores y etiquetas
Los miARN sintéticos pueden marcarse con un marcador o etiqueta radiactivo, enzimático, colorimétrico u otro para fines de detección o aislamiento. Los ácidos nucleicos pueden marcarse con fluorescencia en algunas realizaciones de la invención. Los marcadores fluorescentes contemplados para su uso como conjugados incluyen, pero sin limitación, Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY
45 TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5, 6-FAM, Fluoresceína Isotiocianato, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Verde de Rodamina, Rojo de Rodamina, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, TET, Tetrametilrodamina y/o Texas Red.
Se contempla que los miARN sintéticos pueden marcarse con dos marcadores diferentes. Además, puede emplearse transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (TERF) en procedimientos de la invención (por
50 ejemplo, Klostermeier y col., 2002; Emptage, 2001; Didenko, 2001).
Están fácilmente disponibles varias técnicas para visualizar o detectar ácidos nucleicos marcados. La referencia de Stanley T. Crooke, 2000 tiene un análisis de dichas técnicas (Capítulo 6) que se incorpora por referencia. Dichas técnicas incluyen microscopia, matrices, fluorometría, cicladores lumínicos u otras máquinas de PCR™ en tiempo real, análisis de FACS, contadores de centelleo, Phosphoimager, contadores Geiger, MRI, CAT, procedimientos de 55 detección basados en anticuerpos (Western, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica), técnicas histoquímicas, HPLC (Griffey y col., 1997, espectroscopia, electroforesis en gel capilar (Cummins y col., 1996), espectroscopia; espectroscopia de masas; técnicas radiológicas; y técnicas de equilibrio de masas. Como alternativa, pueden
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F. Procedimientos de suministro
La presente invención implica en algunas realizaciones suministrar un ácido nucleico a una célula.
5 Las moléculas de ARN pueden codificarse por una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término “vector” se usa para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico vehículo en la que puede insertarse una secuencia de ácido nucleico para introducción en una célula en la que puede replicarse. Una secuencia de ácido nucleico puede ser “exógena”, lo que significa que es ajena a la célula en la que se introduce el vector o que la secuencia es homóloga de una secuencia en la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula
10 huésped en la que la secuencia no se encuentra habitualmente. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus vegetales), y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la materia estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes convencionales, que se describen en Sambrook y col., 1989 y Ausubel y col., 1996. Además de codificar un polipéptido modificado tal como gelonina modificada, un vector puede codificar secuencias polipeptídicas no modificadas tales como una etiqueta o
15 molécula de dirección. Una molécula de dirección es una que dirige el ácido nucleico deseado a un órgano, tejido, célula particular u otra localización en el cuerpo de un sujeto.
La expresión “vector de expresión” se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de transcribirse. Los vectores de expresión pueden contener una diversidad de “secuencias de control”, que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la
20 transcripción y posiblemente traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Además de secuencias de control que gobiernan la transcripción y traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que cumplen otras funciones también y se describen.
Hay varias maneras en las que los vectores de expresión pueden introducirse en células. En ciertas realizaciones de
25 la invención, el vector de expresión comprende un virus o vector modificado por ingeniería genética derivado de un genoma viral. La capacidad de ciertos virus para entrar en células mediante endocitosis mediada por receptor, para integrarse en el genoma de la célula huésped y expresar genes virales de forma estable y eficazmente los hacen candidatos atractivos para transferencia de genes ajenos en células de mamífero (Ridgeway, 1988; Nicolas y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los primeros virus usados como vectores génicos
30 fueron virus de ADN incluyendo los papovavirus (virus de simio 40, virus del papiloma bovino y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986). Estos tienen una capacidad relativamente baja para secuencias de ADN ajenas y tienen un espectro de huéspedes restringido. Además, su potencial oncogénico y efectos citopáticos en células permisivas plantean preocupaciones de seguridad. Pueden alojar solamente hasta 8 kb de material génico ajeno pero pueden introducirse fácilmente en una diversidad
35 de líneas celulares y animales de laboratorio (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986).
Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenarios caracterizados por una capacidad para convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas; también pueden usarse como vectores. Otros vectores virales pueden emplearse como construcciones de expresión en la presente invención. Pueden emplearse vectores derivados de virus tales como virus vaccinia (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y col., 1988), virus
40 adenoasociados (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Hermonat y Muzycska, 1984) y virus del herpes. Ofrecen varias características atractivas para diversas células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y col., 1988; Horwich y col., 1990).
Se cree que otros procedimientos adecuados para suministro de ácidos nucleicos para efectuar la expresión de composiciones de la presente invención incluyen prácticamente cualquier procedimiento por el que puede 45 introducirse un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, incluyendo vectores virales y no virales) en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como se conocería por un experto habitual en la materia. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación, suministro directo de ADN tal como por inyección (Patentes de Estados Unidos Nº 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo microinyección (Harlan y Weintraub, 1985; Patente de Estados 50 Unidos Nº 5.789.215); por electroporación (Patente de Estados Unidos Nº 5.384.253); por precipitación con fosfato cálcico (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe y col., 1990); usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer y col., 1987); por transfección mediada por liposoma (Nicolau y Sene, 1982; Fraley y col., 1979; Nicolau y col., 1987; Wong y col., 1980; Kaneda y col., 1989; Kato y col., 1991); por bombardeo de microproyectiles (Solicitud de PCT Nº WO 94/09699 y 95/06128; Patentes de 55 Estados Unidos Nº 5.610.042; 5.322.783, 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990; Patentes de Estados Unidos Nº 5.302.523 y 5.464.765); por transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de Estados Unidos Nº 5.591.616 y 5.563.055); o por transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh y col., 1993; Patentes de Estados Unidos Nº 4.684.611 y 4.952.500); por captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus y col., 1985). Mediante la aplicación de técnicas
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B. Suministro de miARN sintéticos
Se cree que los procedimientos adecuados para suministro de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención
5 incluyen prácticamente cualquier procedimiento por el que puede introducirse un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, incluyendo vectores virales y no virales) en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como se conocería por un experto habitual en la materia. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación, suministro directo de ácidos nucleicos tal como por inyección (Patente de Estados Unidos 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y
10 5,580,859), incluyendo microinyección (Harland y Weintraub, 1985; Patente de Estados Unidos 5.789.215); por electroporación (Patente de Estados Unidos Nº 5.384.253); por precipitación con fosfato cálcico (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe y col., 1990); usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer y col., 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley y col., 1979; Nicolau y col., 1987; Wong y col., 1980; Kaneda y col., 1989; Kato y col., 1991); por
15 bombardeo de microproyectiles (Publicación de Solicitud de PCT Nº WO 94/09699 y 95/06128; Patentes de Estados Unidos 5.610.042; 5.322.783, 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990; Patentes de Estados Unidos 5.302.523 y 5.464.765); por transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de Estados Unidos 5.591.616 y 5.563.055); o por transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh y col., 1993; Patentes de Estados Unidos 4.684.611 y 4.952.500); por captación de ADN
20 mediada por desecación/inhibición (Potrykus y col., 1985). Mediante la aplicación de técnicas tales como estas, pueden transformarse de forma estable o transitoria un orgánulo u orgánulos, célula o células, tejido o tejidos u organismo u organismos.
Se ha unido una diversidad de compuestos a los extremos de oligonucleótidos para facilitar su transporte a través de membranas celulares. Se ha descubierto que péptidos señal cortos hallados en la TAT de VIH, VP22 de VHS, 25 antennapedia de Drosophila, y otras proteínas permiten la transferencia rápida de biomoléculas a través de membranas (revisado en Schwarze 2000). Estos péptidos señal, denominados Dominios de Transducción de Proteínas (PTD), se han unido a los oligonucleótidos para facilitar su suministro a células cultivadas. Se han conjugado colesteroles con oligonucleótidos para mejorar su captación en células en animales (MacKellar 1992). Los grupos de colesterol terminales interaccionan aparentemente con receptores o lípidos en la superficies de células y
30 facilitan la internalización de los oligonucleótidos modificados. De forma similar, se ha conjugado poli-1-lisina con oligonucleótidos para reducir la carga negativa neta y mejorar la captación en células (Leonetti 1990).
Se han desarrollado una diversidad de compuestos que forman complejo con ácidos nucleicos, los suministran a superficies de células, y facilitan su captación y liberación de endosomas. Entre estos están: (1) una diversidad de lípidos tales como DOTAP (y otro lípido catiónico), DDAB, DHDEAB y DOPE y (2) polímeros no basados en lípidos
35 como polietilenimina, poliamidoamina y dendrímeros de estos y otros polímeros. En algunas de estas realizaciones, se emplea una combinación de lípidos tales como DOTAP y colesterol o un derivado de colesterol (Patente de Estados Unidos 6.770.291). Se ha mostrado que varios de estos reactivos facilitan la captación de ácido nucleico en animales.
Los componentes celulares implicados en la ruta de miARN se están haciendo conocidos. Las proteínas que
40 estabilizan y/o transportan miARN dentro de células podrían potenciar la estabilidad de actividad de miARN debido a que protegerían y guiarían los miARN unidos una vez que están en las células. Las mezclas de proteínas transportadoras de miARN y miARN podrían potenciar la eficacia de productos terapéuticos basados en miARN.
Los ARN son moléculas hidrófilas en virtud de su cadena principal de azúcar y fosfato aniónico. Aunque las bases nitrogenadas son hidrófobas, la hidrofilia domina debido a los enlaces de hidrógeno extensivos resultantes de los 45 restos de fosfato y azúcar. La cadena principal de carácter hidrófilo y aniónica reduce la permeación celular. Se ha mostrado que la conjugación de grupos lipófilos como colesterol (Manoharan, 2002) y derivados de ácido láurico y litocólico con funcionalidad C32 (Lorenz y col., 2004), mejora la captación celular. Además la unión de oligonucleótidos conjugados con esteroides con lipoproteínas diferentes en el torrente sanguíneo, tales como LDL, protege su integridad y domina su biodistribución (Rump y col., 2000). También se ha mostrado que el colesterol 50 unido a moléculas antisentido (Bijsterbosch y col., 2001) y aptámeros (Rusconi y col., 2004) estabiliza oligonucleótidos permitiendo la unión con lipoproteínas. Se ha demostrado que el colesterol potencia la captación y estabilidad en suero de ARNip in vitro (Lorenz y col., 2004) e in vivo (Soutschek y col., 2004). Adicionalmente, varias moléculas pequeñas como SB-435495 (Blackie y col., (2002), Isradipina (Oravcova y col., 1994), amlodipina (Oravcova y col., 1994) y 2,2’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenilo (Borlakoglu y col., 1990) podrían potenciar la captación
55 celular, y mejorar la resistencia a nucleasa promoviendo la asociación con lipoproteínas.
1. Nucleótidos para marcar
Los nucleótidos para marcar no son nucleótidos de origen natural, sino que en su lugar se refieren a nucleótidos preparados que tienen un resto reactivo en ellos. Las funcionalidades reactivas específicas de interés incluyen: amino, sulfihidrilo, sulfoxilo, amino-sulfihidrilo, azido, epóxido, isotiocianato, isocianato, anhídrido, monoclorotriacina,
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diclorotriacina, piridina mono o dihalógeno sustituida, diacina mono o disustituida, maleimida, epóxido, aciridina, sulfonil haluro, haluro ácido, alquil haluro, aril haluro, alquilsulfonato, N-hidroxisuccinimida éster, imido éster, hidracina, azidonitrofenilo, azida, 3-(2-piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehído, yodoacetilo, cianometil éster, pnitrofenil éster, o-nitrofenil éster, hidroxipiridina éster, carbonil imidazol y los otros grupos químicos similares. En 5 algunas realizaciones, la funcionalidad reactiva puede unirse directamente a un nucleótido, o puede unirse con el nucleótido mediante un grupo de enlace. El resto funcional y cualquier engarce no pueden alterar sustancialmente la capacidad del nucleótido para añadir al miARN o para marcar. Los grupos de enlace representativos incluyen grupos de enlace que contienen carbono, que varían típicamente de aproximadamente 2 a 18, habitualmente de aproximadamente 2 a 8 átomos de carbono, en los que los grupos de enlace que contienen carbono pueden incluir o no uno o más heteroátomos, por ejemplo S, O, N etc., y pueden incluir o no uno o más sitios de insaturación. Son de particular interés en muchas realizaciones grupos de enlace alquilo, típicamente grupos de enlace alquilo inferior de 1 a 16, habitualmente de 1 a 4 átomos de carbono, en los que los grupos de enlace pueden incluir uno o más sitios de insaturación. Los nucleótidos funcionalizados (o cebadores) usados en los procedimientos anteriores de generación de diana funcionalizada pueden fabricarse usando protocolos conocidos u obtenidos de proveedores
15 comerciales, por ejemplo, Sigma, Roche, Ambion, y NEN. Pueden prepararse grupos funcionales de acuerdo con modos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo la información representativa hallada en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.404.289; 4.405.711; 4.337.063 y 5.268.486, y Patente Br. Nº 1.529.202.
Se usan nucleótidos modificados con amina en varias realizaciones de la invención. El nucleótido modificado con amina es un nucleótido que tiene un grupo amina reactivo para unión en el marcador. Se contempla que puede modificarse cualquier ribonucleótido (G, A, U o C) o desoxirribonucleótido (G, A, T o C) para marcaje. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, los siguientes ribo y desoxirribonucleótidos modificados: 5-(3-aminoalil)-UTP; 8-[(4amino)butil]-amino-ATP y 8-[(6-amino)butil]-amino-ATP; N6-(4-amino)butil-ATP, N6-(6-amino)butil-ATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-CTP; N6-(6-amino)hexil-ATP; 8-[(6-amino)hexil]-amino-ATP; 5-propargilamino-CTP, 5-propargilamino-UTP; 5-(3-aminoalil)-dUTP; 8-[(4-amino)butil]-amino-dATP y 8-[(6-amino)butil]-amino-dATP; N6-(4-amino)butil-dATP,
25 N6-(6-amino)butil-dATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-dCTP; N6-(6-amino)hexil-dATP; 8-[(6-amino)hexil]-amino-dATP; 5-propargilamino-dCTP y 5-propargilamino-dUTP. Dichos nucleótidos pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Además, un experto en la materia podría preparar otras entidades de nucleótidos con la misma modificación de amina, tales como 5-(3-aminoalil)-CTP, GTP, ATP, dCTP, dGTP, dTTP o dUTP en lugar de un 5-(3-aminoalil)-UTP.
2. Técnicas de marcaje
En algunas realizaciones, se marcan ácidos nucleicos añadiendo catalíticamente al ácido nucleico un nucleótido o nucleótidos ya marcados. Pueden añadirse uno o más nucleótidos marcados a moléculas de miARN. Véase Patente de Estados Unidos 6.723.509.
En otras realizaciones, se añade catalíticamente un nucleótido o nucleótidos no marcados a un miARN, y el
35 nucleótido no marcado se modifica con un resto químico que permite que se marque posteriormente. En realizaciones de la invención, el resto químico es una amina reactiva de modo que el nucleótido sea un nucleótido modificado con amina.
Se conocen bien por los expertos en la materia ejemplos de nucleótidos modificados con amina, estando muchos disponibles en el mercado tales como de Ambion, Sigma, Jena Bioscience y TriLink.
A diferencia del marcaje de ADNc durante su síntesis, el problema para el marcaje de miARN es cómo marcar la molécula ya existente. La presente invención se refiere al uso de una enzima capaz de usar un ribonucleótido o desoxirribonucleótido di o trifosfato como un sustrato para su adición a un miARN, una molécula de ARN pequeña. Además, en realizaciones específicas, implica usar un ribonucleótido di o trifosfato modificado, que se añade al extremo 3’ de un miARN. La fuente de la enzima no es limitante. Los ejemplos de fuentes para las enzimas incluyen
45 levadura, bacterias gram negativas tales como E. coli, Lactococcus lactis y virus de viruela de ovejas.
Las enzimas capaces de añadir dichos nucleótidos incluyen, pero sin limitación, poli(A) polimerasa, transferasa terminal y polinucleótido fosforilasa. En realizaciones específicas de la invención, se contempla que la ligasa no es la enzima usada para añadir el marcador, y en su lugar, se emplea una enzima no ligasa.
La poli(A) polimerasa se ha clonado de varios organismos de plantas a seres humanos. Se ha mostrado que cataliza la adición de tramos homopoliméricos a ARN (Martin y col., RNA, 4(2): 226-30, 1998).
La transferasa terminal cataliza la adición de nucleótidos al extremo 3’ terminal de un ácido nucleico. La polinucleótido fosforilasa puede polimerizar nucleótidos difosfatos sin la necesidad de un cebador.
3. Marcadores
Los marcadores en miARN o sondas de miARN pueden ser colorimétricos (incluyen espectro visible y UV,
55 incluyendo fluorescencia), luminiscentes, enzimáticos o emisores de positrones (incluyendo radiactivos). El marcador puede detectarse directa o indirectamente. Los marcadores radiactivos incluyen 125I, 32P, 33P y 35S. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen fosfatasa alcalina, luciferasa, peroxidasa de rábano rusticano y -galactosidasa.
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Los marcadores también pueden ser proteínas con propiedades luminiscentes, por ejemplo, proteína verde fluorescente y ficoeritrina.
Los marcadores colorimétricos y fluorescentes contemplados para su uso como conjugados incluyen, pero sin limitación, colorantes de Alexa Fluor, colorantes BODIPY, tales como BODIPY FL; Cascade Blue; Cascade Yellow; coumarina y sus derivados, tales como 7-amino-4-metilcoumarina, aminocoumarina e hidroxicoumarina; colorantes de cianina, tales como Cy3 y Cy5; eosinas y eritrosinas; fluoresceína y sus derivados, tales como fluoroesceína isotiocianato; quelados macrocíclicos de iones de lantánidos, tales como Quantum Dye™; Marina Blue; Oregon Green; colorantes de rodamina, tales como rojo de rodamina, tetrametilrodamina y rodamina 6G; Texas Red; colorantes de transferencia de energía fluorescente, tales como heterodímero de naranja de tiazol-etidio; y TOTAB.
Los ejemplos específicos de colorantes incluyen, pero sin limitación, los identificados anteriormente y los siguientes: Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500. Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700 y Alexa Fluor 750; colorantes BODIPY sensibles a amina, tales como BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/655, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR y BODIPY-TR; Cy3, Cy5, 6-FAM, fluoresceína isotiocianato, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Verde de Rodamina, Rojo de Rodamina, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, 2’,4’,5’,7’tetrabromosulfonafluoresceína y TET.
Están disponibles ejemplos específicos de ribonucleótidos marcados con fluorescencia de Molecular Probes y estos incluyen, Alexa Fluor 488-5-UTP, Fluoresceína-12-UTP, BODIPY FL-14-UTP, BODIPY TMR-14-UTP, tetrametilrodamina-6-UTP, Alexa Fluor 546-14-UTP, Texas Red-5-UTP y BODIPY TR-14-UTP. Están disponibles otros ribonucleótidos fluorescentes de Amersham Biosciences, tales como Cy3-UTP y Cy5-UTP.
Los ejemplos de desoxirribonucleótidos marcados con fluorescencia incluyen dinitrofenilo (DNP)-11-dUTP, Cascade Blue-7-dUTP, Alexa Fluor 488-5-dUTP, Fluoresceína-12-dUTP, Oregon Green 488-5-dUTP, BODIPY FL-14-dUTP, Verde de Rodamina-dUTP, Alexa Fluor 532-5-dUTP, BODIPY TMR-14-dUTP, tetrametilrodamina -6-dUTP, Alexa Fluor 546-14-dUTP, Alexa Fluor 568-5-dUTP, Texas Red-12-dUTP, Texas Red-5-dUTP, BODIPY TR-14-dUTP, Alexa Fluor 594-5-dUTP, BODIPY 630/650-14-dUTP, BODIPY 650/665-14-dUTP; Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP, Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTP.
Se contempla que los ácidos nucleicos pueden marcarse con dos marcadores diferentes. Además, puede emplearse transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) en procedimientos de la invención (por ejemplo, Klostermeier y col., 2002; Emptage, 2001; Didenko, 2001, cada una incorporada por referencia).
Como alternativa, el marcador puede no ser detectable por sí mismo, pero ser detectable de forma indirecta o que permita el aislamiento o separación del ácido nucleico diana. Por ejemplo, el marcador puede ser biotina, digoxigenina, cationes polivalentes, grupos quelantes y los otros ligandos, incluyen ligandos para un anticuerpo.
4. Técnicas de visualización
Están fácilmente disponibles varias técnicas para visualizar o detectar ácidos nucleicos marcados. La referencia de Stanley T. Crooke, 2000 tiene un análisis de dichas técnicas (Capítulo 6), que se incorpora por referencia. Dichas técnicas incluyen microscopía, matrices, fluorometría, cicladores lumínicos u otras máquinas de PCR a tiempo real, análisis de FACS, contadores de centelleo, Phosphoimagers, contadores de Geiger, MRI, CAT, procedimientos de detección basados en anticuerpos (Western, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica), técnicas histoquímicas, HPLC (Griffey y col., 1997, espectroscopia, electroforesis en gel capilar (Cummins y col., 1996), espectroscopia, espectroscopia de masas; técnicas radiológicas; y técnicas de equilibrio de masas.
Cuando se emplean dos o más marcadores de colores diferentes, pueden emplearse técnicas de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para caracterizar el ARNbc. Además, un experto habitual en la técnica es bien consciente de modos de visualización, identificación y caracterización de ácidos nucleicos marcados, y en consecuencia, dichos protocolos pueden usarse como parte de la invención. Los ejemplos de herramientas que pueden usarse también incluyen microscopía fluorescente, un Bioanalizador, un lector de placas, Storm (Molecular Dynamics), Explorador de Matrices, FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) o cualquier instrumento que tenga la capacidad de excitar y detectar una molécula fluorescente.
III. Aplicaciones terapéuticas
Los miARN o inhibidores de miARN sintéticos que afectan a rasgos fenotípicos proporcionan puntos de intervención para aplicaciones terapéuticas así como aplicaciones de diagnóstico (cribando con respecto a la presencia o ausencia de un miARN particular). Se contempla específicamente que pueden usarse moléculas de ARN de la presente invención para tratar el cáncer analizado en la sección previa. Además, también puede emplearse cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente con respecto a aspectos terapéuticos de la invención.
En aplicaciones terapéuticas, una cantidad eficaz de los miARN sintéticos de la presente invención es para
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administrar a una célula, que puede estar o no en un animal. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de los miARN o inhibidores de miARN sintéticos de la presente invención es para administrar a un individuo para el tratamiento de cáncer. La expresión “cantidad eficaz” como se usa en el presente documento se define como la cantidad de las moléculas de la presente invención que es necesaria para dar como resultado el cambio fisiológico deseado en la célula o tejido al que se administra. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” como se usa en el presente documento se define como la cantidad de las moléculas de la presente invención que consigue un efecto deseado con respecto al cáncer. Un experto en la materia reconoce fácilmente que en muchos casos las moléculas pueden no proporcionar una cura pero pueden proporcionar un beneficio parcial, tal como alivio o mejora de al menos un síntoma. En algunas realizaciones, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una cantidad de moléculas que proporciona un cambio fisiológico se considera una “cantidad eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz”.
En algunas realizaciones, la molécula tiene una secuencia que corresponde a la secuencia de miARN de ese animal particular, en oposición a de otro animal. Por tanto, en algunas realizaciones, se utiliza una secuencia humana en las moléculas de ARN de la presente invención.
A. Modos de administración y formulaciones
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser para administración a un sujeto solo o en forma de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer. Pueden formularse composiciones farmacéuticas de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o adyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Para administración tópica las proteínas de la invención pueden formularse como soluciones, geles, pomadas, cremas, suspensiones, etc. como se conoce bien en la técnica. Las formulaciones sistémicas incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como las diseñadas para administración transdérmica, transmucosa, inhalación, oral o pulmonar. Para inyección, los ácidos nucleicos de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizadores y/o de dispersión. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico pueden estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua sin pirógenos estéril, antes de su uso. Para administración transmucosa, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera para permear. Dichos penetrantes se conocen en general en la técnica. Para administración oral, los ácidos nucleicos pueden formularse fácilmente combinando las moléculas con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que los ácidos nucleicos de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para ingesta oral por un paciente para tratar. Para formulaciones sólidas orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, los excipientes adecuados incluyen cargas tales como azúcares, por ejemplo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulación; y agentes aglutinantes. Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos tales como alginato sódico. Si se desea, las formas de dosificación sólida pueden recubrirse con azúcares o recubrirse de forma entérica usando técnicas convencionales. Para preparaciones líquidas orales tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, los vehículos, excipientes o diluyentes adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Adicionalmente, pueden añadirse agentes saporíferos, conservantes, agentes colorantes y similares. Para administración bucal, las moléculas pueden tomar la forma de comprimidos, pastillas para chupar, etc., formuladas de manera convencional. Para administración por inhalación, las moléculas para su uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de una pulverización de aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo de los ácidos nucleicos y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Las moléculas de ARN pueden formularse también en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, las moléculas también pueden formularse como una preparación de liberación prolongada. Dichas formulaciones de acción larga pueden administrarse por implantación (por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, las moléculas pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
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Como alternativa, pueden emplearse otros sistemas de suministro farmacéutico. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro que pueden usarse para suministrar ácidos nucleicos de la invención.
Un ácido nucleico de la invención puede administrarse en combinación con un vehículo o lípido para aumentar la captación celular. Por ejemplo, el oligonucleótido puede administrarse en combinación con un lípido catiónico. Los ejemplos de lípidos catiónicos incluyen, pero sin limitación, lipofectina, DOTMA, DOPE y DOTAP. La publicación WO0071096 por ejemplo, describe diferentes formulaciones, tales como una formulación de DOTAP: colesterol o derivado de colesterol que puede usarse eficazmente para terapia génica. Otras divulgaciones también analizan diferentes formulaciones de lípidos o liposómicas incluyendo nanopartículas y procedimientos de administración; estos incluyen, pero sin limitación, Publicación de Patente de Estados Unidos 20030203865, 20020150626, 20030032615 y 20040048787. También se desvelan procedimientos usados para formar partículas en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.844.107, 5.877.302, 6.008.336, 6.077.835, 5.972.901, 6.200.801 y 5.972.900.
Los ácidos nucleicos también pueden administrarse en combinación con una amina catiónica tal como poli(L-lisina). También pueden conjugarse ácidos nucleicos con un resto químico, tal como transferrina y colesterilos. Además, los oligonucleótidos pueden dirigirse a ciertos orgánulos uniendo grupos químicos específicos con el oligonucleótido. Por ejemplo, la unión del oligonucleótido con una matriz adecuada de restos de manosa dirigirá el oligonucleótido al hígado.
Adicionalmente, las moléculas pueden suministrarse usando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diversos materiales de liberación sostenida y se conocen bien por los expertos en la materia. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar las moléculas durante varias semanas hasta 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica de las moléculas quiméricas, pueden emplearse estrategias adicionales para la estabilización de moléculas.
Pueden incluirse ácidos nucleicos en cualquiera de las formulaciones anteriormente descritas como los ácidos libres
o bases o como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables son las sales que conservan sustancialmente la actividad biológica de las bases libres y que se preparan por reacción con ácidos inorgánicos. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros próticos que son las formas de base libre correspondientes.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de una o más moléculas de miARN sintéticas o inhibidores de miARN disueltos o dispersos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las frases “farmacéutico o farmacológicamente aceptable” se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o de otro modo desafortunada cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un polipéptido quimérico o principio activo adicional se conocerá por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación, como se ejemplifica en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para la administración animal (por ejemplo, humana), se entenderá que las preparaciones pueden necesitar cumplir patrones de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según se requiera por la Oficina de la FDA de Patrones Biológicos.
Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores farmacológicos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de disgregación, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saporíferos, colorantes, materiales similares y combinaciones de los mismos, como se conocerá por un experto habitual en la materia (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional es compatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
Las moléculas quiméricas pueden comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si van administrarse en forma sólida, líquida o de aerosol, y si es necesario que sea estéril para vías de administración tales como inyección. La presente invención puede administrarse por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intra-arterial, por vía intraperitoneal, por vía intralesional, por vía intracraneal, por vía intra-articular, por vía intraprostática, por vía intrapleural, por vía intratraqueal, por vía intranasal, por vía intravítrea, por vía intravaginal, por vía intrarrectal, por vía tópica, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, por vía subconjuntiva, por vía intravesicular, por vía mucosa, por vía intrapericárdica, por vía intraumbilical, por vía intraocular, por vía oral, por vía tópica, por vía local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada que baña las células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro procedimiento o cualquier combinación de los anteriores como se conocerá por un experto habitual en la materia (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Printing Company, 1990).
La cantidad de dosificación real de una composición de la presente invención para administración a un paciente
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animal puede determinarse por factores físicos y fisiológicos tales como peso corporal, gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que se trate, intervenciones terapéuticas previas o simultáneas, idiopatía del paciente y la vía de administración. El practicante responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración del principio o los principios activos en una composición y la o las dosis apropiadas para el sujeto individual.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1 % de un compuesto activo. En otras realizaciones, el compuesto activo puede comprender entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente el 25 % y aproximadamente el 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable del mismo. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 1 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración y cualquier intervalo derivable del mismo. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, puede administrarse un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, etc, basándose en los números descritos anteriormente.
En cualquier caso, la composición puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Adicionalmente, la prevención de la acción de microorganismos puede producirse por conservantes tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, incluyendo pero sin limitación parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.
Las moléculas pueden formularse en una composición en una forma de base libre, neutra o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos, por ejemplo, las formadas con los grupos amilo libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína.
En realizaciones en las que la composición está en una forma líquida, un vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que comprende pero sin limitación, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo, triglicéridos, aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina; mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido por dispersión en vehículos tales como, por ejemplo, poliol líquido o lípidos; mediante el uso de tensioactivos tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de los mismos de dichos procedimientos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como por ejemplo, azúcares, cloruro sódico o combinaciones de los mismos.
En otras realizaciones, se pueden usar colirios, soluciones nasales o pulverizaciones, aerosoles o inhalantes en la presente invención. Dichas composiciones se diseñan en general para que sean compatibles con el tipo de tejido diana. En un ejemplo no limitante, las soluciones nasales son habitualmente soluciones acuosas diseñadas para administrarse a los conductos nasales en gotas o pulverizaciones. Se preparan soluciones nasales de forma que sean similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de modo que se mantenga la acción ciliar normal. Por lo tanto, en realizaciones preferidas las soluciones nasales acuosas habitualmente son isotónicas o ligeramente tamponadas para mantener un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5. Además, pueden incluirse en la formulación conservantes antimicrobianos, similares a los usados en preparaciones oftálmicas, fármacos o estabilizadores farmacológicos apropiados, si se requieren. Por ejemplo, se conocen diversas preparaciones nasales comerciales e incluyen fármacos tales como antibióticos o antihistamínicos.
En ciertas realizaciones, las moléculas se preparan para administración por vías tales como la ingestión oral. En estas realizaciones, la composición sólida puede comprender, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas (por ejemplo, cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda), formulaciones de liberación sostenida, composiciones bucales, trociscos, elixires, suspensiones, jarabes, obleas o combinaciones de los mismos. Pueden incorporarse composiciones orales directamente con el alimento de la dieta. Los vehículos preferidos para administración oral comprenden diluyentes inertes, vehículos comestibles asimilables o combinaciones de los mismos. En otros aspectos de la invención, la composición oral puede prepararse como un jarabe o elixir. Un jarabe o elixir puede comprender, por ejemplo, al menos un agente activo, un agente edulcorante, un conservante, un agente saporífero, un colorante, un conservante o combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones preferidas una composición oral puede comprender uno o más aglutinantes, excipientes,
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agentes de disgregación, lubricantes, agentes saporíferos y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, la composición puede comprender uno o más de los siguientes: un aglutinante, tal como, por ejemplo, goma de tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz, gelatina o combinaciones de los mismos; un excipiente, tal como, por ejemplo, fosfato dicálcico, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio o combinaciones de los mismos; un agente disgregante, tal como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico o combinaciones de los mismos; un lubricante, tal como, por ejemplo, estearato de magnesio; un agente edulcorante, tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de los mismos; un agente saporífero, tal como, por ejemplo, menta piperita, aceite de gauteria, saporífero de cereza, saporífero de naranja, etc.; o combinaciones de los anteriores. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, vehículos tales como un vehículo líquido. Pueden estar presentes diversos otros materiales como revestimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras, o cápsulas pueden estar revestidos con goma laca, azúcar o ambos.
La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación con endotoxinas debería mantenerse mínimamente a un nivel seguro, por ejemplo, menor de 0,5 ng/mg de proteína.
En realizaciones particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable puede producirse por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
También puede emplearse cualquier realización analizada anteriormente con respecto al suministro o transporte a células con respecto a implementar el suministro de compuestos medicinales analizados en esta sección.
B. Dosificaciones eficaces
Las moléculas de la invención se usarán en general en una cantidad eficaz para conseguir el fin pretendido. Para su uso para tratar o prevenir el cáncer, las moléculas de la invención, o composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad eficaz para aliviar o prevenir los síntomas, o prolongar la supervivencia del paciente que se trate. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para administración sistémica, una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI50 como se determina en el cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar con más precisión dosis útiles en seres humanos.
Las dosificaciones iniciales también pueden estimarse a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que se conocen bien en este campo. Un experto habitual en la materia podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos basándose en datos animales.
La cantidad e intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma de las moléculas que son suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones a pacientes habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg/día, preferentemente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Pueden conseguirse niveles en suero terapéuticamente eficaces administrando múltiples dosis cada día.
En casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de las proteínas puede no estar relacionada con la concentración en plasma. Un experto en la materia será capaz de optimizar las dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación indebida.
La cantidad de moléculas administradas dependerá, por supuesto, del sujeto que se trate, del peso del sujeto, la gravedad de la afección, el modo de administración y el criterio del médico que la receta.
La terapia puede repetirse intermitentemente mientras los síntomas sean detectables o incluso cuando no sean detectables. La terapia puede proporcionarse sola o en combinación con otros fármacos o tratamiento (incluyendo cirugía).
C. Toxicidad
Preferentemente, una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas descritas en el presente documento proporcionará beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial.
La toxicidad de las moléculas descritas en el presente documento puede determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) o la DL100 (la dosis letal para el 100 % de la población). La relación de
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dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Se prefieren proteínas que muestran índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación que no es tóxico para su uso en seres humanos. La dosificación de las proteínas descritas en el presente documento queda preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación pueden seleccionarse por el médico individual a la vista de la condición del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl y col., 1975, En: The Pharmacological Basis of Therapeutics, C.1, p.1).
D. Grupos colgantes
Un “grupo colgante” puede estar unido o conjugado con el ácido nucleico. Los grupos colgantes pueden aumentar la capacidad celular del ácido nucleico. Los grupos colgantes pueden estar unidos a cualquier parte del ácido nucleico pero se unen habitualmente al extremo o los extremos de la cadena oligonucleotídica. Los ejemplos de grupos colgantes, incluyen, pero sin limitación; derivados de acridina (es decir, 2-metoxi-6-cloro-9-aminoacridina); reticulantes tales como derivados de psoraleno, azidofenacilo, proflavina y azidoproflavina; endonucleasas artificiales; complejos metálicos tales como EDTA-Fe(II), o-fenantrolina-Cu(I), y porfirina-Fe(II); restos alquilantes; nucleasas tales como nucleasa amino-1-hexanolestafilocócica y fosfatasa alcalina; transferasas terminales; abzimas; restos de colesterilo; vehículos lipófilos, conjugados peptídicos; alcoholes de cadena larga; ésteres de fosfato; amino; grupos mercapto; marcadores radiactivos; marcadores no radiactivos tales como colorantes; y polilisina u otras poliaminas. En un ejemplo, el ácido nucleico está conjugado con un carbohidrato, carbohidrato sulfatado o glucano.
Ejemplos
A no ser que se designe de otro modo, los números de catálogo se refieren a productos disponibles por ese número de Ambion, Inc.
Ejemplo 1:
Ensayo para medir la actividad de miARN precursores (indicador)
Se creó una serie de vectores indicadores de luciferasa para medir las actividades de miARN sintéticos en células. Los vectores indicadores se basaron en plásmidos que se habían usado para controlar la actividad de miARN endógenos (artículo de Tuschl). Brevemente, se creó un vector de expresión de mamífero con el gen de luciferasa bajo el control del promotor temprano del CMV. Cadena abajo de la secuencia codificante de luciferasa, en la 3’ UTR del gen, se añadieron secuencias complementarias de miR-1-2, miR-10, miR-124, miR-19a y miR-130 maduros. Los vectores indicadores se cotransfectaron a células HeLa junto con miARN sintéticos diseñados para introducir uno de los cinco miARN enumerados anteriormente. Las transfecciones implicaron mezclar 200 ng de vector indicador con 0,3, 1 y 3 pmoles de cada miARN sintético correspondiente. La mezcla de indicador/miARN se mezcló con 0,3 l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se incubó durante 5-15 minutos. Se añadieron aproximadamente 8.000 células a cada complejo de miARN/indicador/reactivo de transfección en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Se cultivaron células HeLa en D-MEM (GIBCO) complementado con suero bovino fetal al 10 % (GIBCO) a 37 ºC y CO2 al 5 %. 24-48 h después de la transfección, las células se recogieron y se ensayaron usando el ensayo de Luciferasa como se ha descrito por el fabricante (Promega). El nivel de la expresión de luciferasa en las poblaciones celulares se comparó con células transfectadas con el mismo indicador pero un miARN sintético con una secuencia que no corresponde al vector. Este miARN no de dirección se denominó el miARN de control negativo.
El análisis final de los diseños de miARN sintético implicó medir la actividad de las cadenas tanto activa como complementaria de los miARN sintéticos de los inventores. Para estos estudios, se crearon vectores indicadores con secuencias 3’ UTR de luciferasa que incluían regiones complementarias de las cadenas tanto activa como complementaria de los diseños de miARN let-7b y miARN-33 sintéticos de los inventores. Cuando se cotransfectaron con miARN sintético con mal funcionamiento, los indicadores con una secuencia a la que se dirige la cadena complementaria muestran expresión de luciferasa reducida debido a que la cadena complementaria de los miARN sintéticos están entrando en la ruta del miARN además de o incluso en lugar de la cadena activa que se desea. Para estos experimentos, los protocolos de co-transfección y análisis indicador son idénticos a los que se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 2:
Ensayo para medir la actividad de miARN precursores (gen endógeno)
Aunque las construcciones indicadoras de luciferasa eran extremadamente valiosas en la evaluación de los diseños de miARN sintético, fue importante verificar los hallazgos de las construcciones indicadoras midiendo los efectos de los miARN sintéticos en dianas de genes endógenos. Para estos estudios, la expresión de RAS y MYC en células transfectadas con miARN de let-7 se seleccionó para el control. Tanto RAS como MYC se regulan negativamente por los diversos miembros de la familia de let-7 en seres humanos y C. elegans. Usando un sistema de micromatriz específico para miARN, los inventores han descubierto que las células HepG2 expresan niveles indetectables de let7. Para ensayar las actividades de los diversos diseños de los inventores de sus miARN sintéticos, se crearon miARN let-7 sintéticos y se usaron para transfectar células HepG2 en placas de 24 pocillos usando siPORT NeoFX (Ambion) de acuerdo con las sugerencias del fabricante. Tres días después de la transfección, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se tiñeron con DAPI para localizar núcleos celulares y se tiñeron con anticuerpos
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5 conjugados con FITC específicos para MYC o RAS (US Biological) de acuerdo con las sugerencias del fabricante. La reducción relativa de la expresión de proteína diana en células transfectadas con let-7 sintético se determinó comparando la intensidad de tinción de MYC y RAS para células transfectadas con un miARN de control negativo usando software MetaMorph.
Para asegurar que los resultados de los ensayos de let-7 de los inventores podrían verificarse por interacciones de
10 miARN adicionales que se observan de forma natural en células, se crearon ensayos para dos miARN adicionales con dianas verificadas. En el primero, se desarrolló un ensayo de PCR™ en tiempo real para medir el nivel del ARNm de HOXB8 en células transfectadas con miR-196 sintético. Se ha mostrado que miR-196 induce la degradación del ARNm de HOXB8 en células. Cuando se transfecta a células cultivadas usando siPORT NeoFX de acuerdo con las instrucciones del fabricante, los diseños de miARN sintético miR-196 eficaces reducen los niveles
15 del ARNm del HOXB8.
Para controlar la eficacia de los miARN miR-1-2 sintéticos, se creó un vector indicador en el que se colocó la 3’UTR del gen G6PD inmediatamente cadena abajo de la región codificante de luciferasa. Se ha aplicado una interacción entre miR-1-2 y la 3’UTR de G6PD (Lewis, 2003). Se co-transfectaron diseños de miR-1-2 sintéticos con el vector indicador y se ensayaron como se ha descrito en el Ejemplo 1.
20 Ejemplo 3:
Eficacia de miARN parcialmente complementarios
Se compararon tres diseños de secuencia generales con respecto a actividad de miARN. El primero, denominado el “diseño de miARN” presentó una cadena activa idéntica al miARN maduro hallado en animales y una cadena complementaria que fue idéntica a la secuencia en horquilla que se predice que existe en células durante el 25 procesamiento del miARN antes de la activación del miARN (véase posteriormente). El segundo diseño, denominado el “diseño de desapareamiento”, fue un híbrido de la misma cadena activa que antes con una cadena complementaria con un dinucleótido, saliente 3’ y dos desapareamientos en los cinco nucleótidos finales que precedían al saliente 3’ (véase posteriormente). El tercer diseño, denominado el “diseño de ARNip”, comprendía la misma cadena activa que anteriormente hibridada con un segundo ARN que era completamente complementario
30 excepto que dejaba salientes 3’ di-nucleótidos en uno de los extremos de la molécula bicatenaria (dos polinucleótidos) (véase posteriormente). Los ejemplos posteriores implican o corresponden a miARN humanos.
miR-1-2
secuencia de miR-1-2 madura -UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (53-73 de SEC ID Nº: 1) diseño de miARN = CAUACUUCUUUAUAUGCCCAUA (SEC ID Nº: 594) +
35 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (SEC ID Nº: 595) diseño de desapareamiento = CAUACUUCUUUACAUUCUGTT (SEC ID Nº: 596) + UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (SEC ID Nº: 597) diseño de ARNip = CAUACUUCUUUACAUUCCATT (SEC ID Nº: 598) + UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (SEC ID Nº: 599)
40 mir-124a-1
secuencia de miR-124 madura -UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (52-73 de SEC ID Nº: 80) diseño de miARN = GUGUUCACAGCGGACCUUGAUU (SEC ID Nº: 600) + UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEC ID Nº: 601) diseño de desapareamiento = GCAUUCACCGCGUGCCUUGGTT (SEC ID Nº: 602) +
45 UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEC ID Nº: 603) diseño de ARNip = GCAUUCACCGCGUGCCUUAATT (SEC ID Nº: 604) + UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEC ID Nº: 605)
miR-130a
secuencia de miR-130 madura -CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (55-74 de SEC ID Nº: 91)
50 diseño de miARN = UCUUUUCACAUUGUGCUAC (SEC ID Nº: 606) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC ID Nº: 607) diseño de desapareamiento = UAUUUUAACAUUGCACUGTT (SEC ID Nº: 608) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC ID Nº: 609) diseño de ARNip = CCUUUUAACAUUGCACUGTT (SEC ID Nº: 610) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC
55 ID Nº: 611)
5
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miR-19a
secuencia de miR-19a madura -UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA (49-71 de SEC ID Nº: 28) diseño de miARN = AGUUUUGCAUAGUUGCACUA (SEC ID Nº: 612) + UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA
(SEC ID Nº: 613) diseño de desapareamiento = UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA
ACAUUUGCAUAGAUUUGCACATT (SEC ID Nº: 614) +
(SEC ID Nº: 615) diseño de ARNip = AGUUUUGCAUAGAUUUGCACATT (SEC ID Nº: UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA (SEC ID Nº: 617)
616)+
mmu-miR-10a-1 (ratón)
secuencia de miR-10 madura -UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (22-44 de SEC ID Nº: 212)
diseño de miARN = CAAAUUCGUAUCUAGGGGAAUA (SEC ID Nº: 618) + UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (SEC ID Nº: 619) diseño de desapareamiento = AGAAUUCGGAUCUACAGGGUATT (SEC ID Nº: 620) + UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (SEC ID Nº: 621) diseño de ARNip = CAAAUUCGGAUCUACAGGGUATT (SEC ID Nº: 622) + UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (SEC ID Nº: 623)
miR-33
secuencia de miR-33 madura -GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (6-24 de SEC ID Nº: 57) miARN = AUGUUUCCACAGUGCAUCA (SEC ID Nº: 624) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº: 625) diseño de desapareamiento = GUCCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº: 626) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº: 627) diseño de ARNip = AUGCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº: 628) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº:629)
let-7b
secuencia de let-7b madura -UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (6-27 de SEC ID Nº: 6) diseño de miARN = CUAUACAACCUACUGCCUUCC (SEC ID Nº: 630) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº: 631) diseño de desapareamiento = CCACACAACCUACUAUCUUATT (SEC ID Nº: 632) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº: 633) diseño de ARNip = CCACACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº: 634) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº: 635)
miR-196-2
secuencia de miR-196 madura -UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGG (7-27 de SEC ID Nº: 143) diseño de ARNip = AACAACAUGAAACUACCUATT (SEC ID Nº: 636) + UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGG (SEC ID Nº: 637) diseño de miARN = CAAAUUCGUAUCUAGGGGAAUA (SEC ID Nº: 638) + UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGG (SEC ID Nº: 639) diseño de desapareamiento = AAUAACAUGAAACUACCUATT (SEC ID Nº: 640) + UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGG (SEC ID Nº: 641)
Los miARN sintéticos variados miR-1-2, mmu-miR-10a-1, miR-19a, miR-124a-1 y miR-130a se ensayaron con respecto a su capacidad para reducir la expresión del gen indicador en vectores con sitios diana de miARN apropiados usando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. Los tres diseños fueron capaces de forma similar de regular negativamente los vectores indicadores apropiados.
Para evaluar si hubo diferencias entre los diversos diseños de miARN en su capacidad para afectar a la expresión de genes endógenos, se transfectaron las siguientes células: células HepG2 con tres diseños de los miARN sintéticos let-7, A549 con tres diseños de los miARN sintéticos miR-196, y HeLa con el vector indicador de G6PD y tres diseños del miARN sintéticos miR-1-2. Como con los vectores indicadores, los tres diseños de miARN sintéticos demostraron ser capaces de reducir la expresión de los genes diana, aunque es notable que el diseño de ARNip rindió peor.
Como una comparación final de los tres diseños de miARN sintéticos, se co-transfectaron miARN sintéticos con vectores indicadores que incluían sitios diana para las cadenas complementarias de los miARN sintéticos de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. En este ensayo, resultó evidente que el diseño de ARNip afectaba significativamente a los vectores indicadores, lo que indicaba que estaba entrando la cadena errónea del miARN en la ruta de miARN (FIG. 3). Debido a que la cadena complementaria podría influir en la expresión de genes que no son dianas naturales del miARN que se estudia, el diseño de ARNip es inapropiado para miARN sintéticos
imagen38
Ejemplo 4:
Eficacia de miARN sintéticos modificados químicamente en su extremo 5
Aunque el diseño del ARNip demostró ser problemático porque mostraba una alta tasa de captación de cadena
5 complementaria por la ruta del miARN, tenía la ventaja de que era fácil de hibridar y fácil de suministrar a las células. Por estas razones, se exploraron maneras de superar los problemas con la captación de cadena complementaria. Se usó el diseño de ARNip para ensayar los efectos de modificaciones químicas de los extremos 5’ de los miARN sintéticos. Para estos estudios, se sintetizaron varias cadenas complementarias diferentes con extremos 5’ únicos. Una presentaba cuatro nucleótidos de desoxirribosa en el extremo 5’; una era una combinación de cuatro
10 nucleótidos de desoxirribosa en el extremo 5’ y un 5’NH2; una tenía un 5’NH2; una tenía un 5’NHCOCH3 (véase posteriormente).
miR-33
secuencia de miR-33 madura -GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (6-24 de SEC ID Nº: 57) diseño de ARNip = AUGCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº: 642) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID
15 Nº: 643) diseño de amino 5’ = (NH2)AUGCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº: 644) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº: 645) diseño de acetilo 5’ = (CH3OCNH)AUGCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº: 646) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº: 647)
20 diseño de ADN 5’ = dAdUdGdCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº: 648) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº: 649) diseño de ADN de amino 5’ = (NH2)dAdUdGdCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº: 650) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº: 651)
let-7b
25 secuencia de let-7b madura -UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (6-27 de SEC ID Nº: 6) diseño de ARNip = CCACACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº: 652) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº: 653) diseño de amino 5’ = NH2CCACACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº: 654) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº: 655)
30 diseño de ADN 5’ = dCdCdAdCACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº: 656) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº: 657) diseño de ADN de amino 5’ = NH2dCdCdAdCACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº: 658) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº: 659)
miR-1-2
35 secuencia de miR-1-2 madura -UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (53-73 de SEC ID Nº: 1) diseño de ARNip = CAUACUUCUUUACAUUCCATT (SEC ID Nº: 660) + UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (SEC ID Nº: 661) diseño de amino 5’ = NH2CAUACUUCUUUACAUUCCATT (SEC ID Nº: 662) + UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (SEC ID Nº: 663)
40 miR-124a-1
secuencia de miR-124 madura -UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (52-73 de SEC ID Nº: 80) diseño de ARNip = GCAUUCACCGCGUGCCUUAATT (SEC ID Nº: 664) + UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEC ID Nº: 665) diseño de amino 5’ = NH2GCAUUCACCGCGUGCCUUAATT (SEC ID Nº: 666) +
45 UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEC ID Nº: 667)
miR-130a
secuencia de miR-130 madura -CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (55-74 de SEC ID Nº: 91) diseño de ARNip = CCUUUUAACAUUGCACUGTT (SEC ID Nº: 668) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC ID Nº: 669)
50 diseño de amino 5’ = NH2 CCUUUUAACAUUGCACUGTT (SEC ID Nº: 670) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC ID Nº: 671)
miR-10a-I
secuencia de miR-10 madura -UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (22-44 of SEC ID Nº: 212) diseño de ARNip = CAAAUUCGGAUCUACAGGGUATT (SEC ID Nº: 672) +
imagen39
UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (SEC ID Nº: 673) diseño de amino 5’ = NH2CAAAUUCGGAUCUACAGGGUATT (SEC ID Nº: 674) + UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (SEC ID Nº: 675)
Los miARN sintéticos miR-33 y let-7b se co-transfectaron en células HeLa y HepG2, respectivamente, con vectores
5 indicadores que portaban sitios diana para las cadenas activa y complementaria de miR-33 y let-7b como se describe en el Ejemplo 1. La expresión de luciferasa de los vectores indicadores específicos de cadena activa y complementaria se midió de acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega). Como se muestra en la Figura 3, los diseños de miARN sintético con el 5’NH2 y 5’NHCOCH3 proporcionaron actividad de cadena activa mayor y actividad de cadena complementaria significativamente reducida a los miARN sintéticos, no modificados. Esto es ideal para
10 miARN sintéticos ya que los efectos vistos después de la transfección serán específicos de la actividad de la cadena activa del miARN sintético. Además, la alta eficacia de los diseños modificados en 5’ permitirá usar menores concentraciones para transfecciones y reducir la toxicidad que se observa con frecuencia cuando se transfectan células con cantidades mayor de ácido nucleico.
Para confirmar que la modificación amino 5’ es superior al diseño de ARNip convencional para un amplio conjunto
15 de miARN sintéticos, se midió la eficacia de ambos diseños de miARN sintéticos en células co-transfectadas con vectores indicadores con sitios diana de miARN. Como se ve en la FIG. 4, el 5’ NH2 es reproduciblemente superior al diseño de ARNip no modificado.
Ejemplo 5:
Criba de biblioteca de miARN sintética con respecto a miARN que influyen en la proliferación celular
20 Una característica del cáncer es la proliferación celular descontrolada; se usan habitualmente ensayos de proliferación celular por investigadores para estudiar la influencia de genes en la oncogénesis. Se usó un ensayo de proliferación celular junto con la biblioteca de inhibidores de miARN para identificar miARN que influyen en la proliferación celular.
Los inventores transfectaron células HeLa por triplicado con quince miARN sintéticos diferentes usando siPORT
25 NeoFX (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (FIG. 6). Se analizaron células HeLa transfectadas usando AlamarBlue (BioSource International, Inc., CA) a intervalos de 24 horas. El AlamarBlue es un compuesto que, cuando se reduce por metabolismo celular, cambia de un color azul no fluorescente a una forma roja fluorescente que se cuantifica fácilmente. La cantidad de AlamarBlue reducida es directamente proporcional al número de células proporcionando un procedimiento rápido para evaluar la proliferación celular. Para realizar el
30 ensayo, se añadió el reactivo de AlamarBlue al medio de cultivo tisular a una concentración final del 10 %. La mezcla se incubó durante 3-6 h en condiciones de cultivo después de lo cual se cuantificó la fluorescencia usando un Spectra Max™ GeminiXS™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las células transfectadas con miR-124 y miR106 sintéticos mostraron proliferación significativamente menor que las muestras transfectadas con control negativo, así como muestras transfectadas con los otros miARN sintéticos.
35 Ejemplo 6:
Criba de biblioteca inhibidora de miARN con respecto a miARN que influyen en la proliferación celular
Una característica del cáncer es la proliferación celular descontrolada. Se usan habitualmente ensayos de proliferación celular por los investigadores para estudiar la influencia de los genes en la oncogénesis. Se usó un ensayo de proliferación celular junto con la biblioteca de inhibidores de miARN de los inventores para identificar
40 miARN que influyen en la proliferación celular.
Se transfectaron células con una biblioteca de más de 90 inhibidores de miARN para identificar miARN que están implicados en el crecimiento celular. Se transfectaron células HeLa (8000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos) por triplicado con 5 pmoles de inhibidores de miARN usando siPORT™ NeoFX™ (Ambion). Los medios se cambiaron 24 h después de la transfección. 72 horas después de la transfección, se fijaron células con 45 paraformaldehído al 4 %, se permeabilizaron con TritonX 100 0,1 % y se tiñeron con yoduro de propidio para ver el número de células total. Las placas se exploraron usando el TTP labtech Acumen Explorer. Se representó el número de células en relación con células transfectadas con un inhibidor de miARN de control negativo (FIG. 7). Las barras horizontales rojas separan la variación normal en la proliferación celular (variación del 20 %). Insertos: Se usaron inhibidores de miARN específicos que aumentaron la proliferación celular (flecha izquierda) o no afectaron a la
50 proliferación celular (flecha derecha) en un segundo ciclo de criba. Las células HeLa se transfectaron con estos inhibidores de miARN y las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpo anti-b-actina y DAPI para visualizar los cambios de morfología celular en respuesta a la función de miARN específica. Las células transfectadas con el inhibidor de miARN que aumentaron la proliferación celular muestran alteración notable en la morfología celular (inserto izquierdo) frente a morfología normal (inserto derecho).
55 Se identificó un grupo de nueve inhibidores de miARN que provocaban enfermedades significativas (miR 31, 150, 187, 125a, 190, 191, 193, 204 y 218) en el crecimiento celular y otros inhibidores de miARN que provocaban un aumento significativo (miR 24 y miR 21) en el crecimiento celular después de transfección en células HeLa (Tabla 4).
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La inhibición de miARN-31 también provocó una morfología celular definida. Se eligió un punto de corte relativo del 20 % y por debajo del 100 % como genes que se consideraban cambiados de forma significativa. Estos resultados demuestran la capacidad de miARN humanos individuales para regular importantes procesos celulares. Además, la diversidad de los efectos observados demuestra la complejidad potencial de resultados celulares de la regulación mediada por miARN de la expresión génica.
Tabla 4. MiARN que afectan a la proliferación celular
miARN Impacto relativo en la proliferación celular
miR-31 Regulación positiva miR-150 Regulación positiva miR-187 Regulación positiva miR-125a Regulación positiva miR-190 Regulación positiva miR-191 Regulación positiva miR-193 Regulación positiva miR-204 Regulación positiva miR-218 Regulación positiva miR-21 Regulación negativa miR-24 Regulación negativa
Ejemplo 7
Criba de biblioteca de miARN sintético con respecto a miARN que influyen en la apoptosis
Muchas enfermedades incluyendo el cáncer se caracterizan por una incapacidad para instituir muerte celular programada, o apoptosis. Se usó un ensayo de actividad caspasa 3/7 junto con una biblioteca de miARN sintéticos para identificar miARN que están implicados en la regulación de la apoptosis.
Se usó una biblioteca de dieciocho miARN sintéticos para transfectar células A549 (8000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos) por triplicado usando siPORT™ NeoFX™ (Ambion). El medio se cambió después de 24 h y las células se inspeccionaron visualmente bajo un microscopio para inspeccionar cualitativamente la muerte celular 72 horas después de la transfección. Las células se midieron con respecto a apoptosis midiendo la actividad caspasa 3 de la siguiente manera: 1) Las células se lavaron una vez con PBS y se congelaron a -80 ºC. 2) Las células se lisaron añadieron 40 l de tampón de lisis frío (HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 40 mM, NP40 0,5 %, EDTA 0,5 mM) a los pocillos y se incubaron durante 20 min a 4 ºC. 3) Añadir 160 l de tampón ICE (HEPES 50 mM pH 7,4, CHAPS 0,1 %, EDTA 0,1 mM, sacarosa 10 %) + DTT 5 mM que contenía sustrato DEVDafc 20 M. 4) Medir el aumento de fluorescencia en una hora a 400 ex, 505 em.
Las células transfectadas con miARN sintéticos miR-1-2 y miR-33 mostraron actividad caspasa 3/7 reducida y las células transfectadas con miR-20 mostraron niveles muchos más altos de apoptosis. Estos tres miARN probablemente regulen genes que estén implicados en el control de la apoptosis.
Ejemplo 8
Criba con respecto a miARN que influye en la viabilidad celular
También se usaron inhibidores de miARN para identificar miARN que influyen en la viabilidad celular. Se usó una biblioteca de más de 90 inhibidores de miARN para transfectar células A549 (8000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos) por triplicado usando siPORT™ NeoFX™ (Ambion). El medio se cambió después de 24 h y las células se inspeccionaron visualmente en un microscopio para inspeccionar cualitativamente la muerte celular 72 horas después de la transfección. Las células se tripsinizaron y se tiñeron con Reactivo ViaCount Flex, que distingue entre células viables y no viables basándose en la permeabilidad de los colorantes de unión a ADN en el reactivo. Las células se analizaron usando el Guava PCA-96 (Personal Cell Analysis).
Veintiún inhibidores de miARN indujeron una relación significativamente diferente de células vivas y muertas que el inhibidor de miARN de control negativo (FIG. 8). Doce redujeron la viabilidad celular y nueve aumentaron la viabilidad celular (Tabla 5). Resulta interesante que hubo poco solapamiento en los miARN que afectaban a la viabilidad celular en células A549 y los que afectaban a la proliferación celular en células HeLa, lo que sugiere que diferentes células responden de forma diferente a tener actividades de miARN reducidas o la viabilidad celular y la proliferación celular no se ven afectadas por las mismas rutas celulares.
Tabla 5. MiARn que afectan a la viabilidad celular
miARN Impacto relativo en la viabilidad celular
miR-7 Reducción
miR-19a Reducción miR-23 Reducción miR-24 Reducción
imagen40
miARN Impacto relativo en la viabilidad celular
miR-27a Reducción miR-31 Reducción miR-32 Reducción miR-134 Reducción miR-140 Reducción miR-150 Reducción miR-192 Reducción miR-193 Reducción miR-107 Aumento miR-133 Aumento miR-137 Aumento miR-152 Aumento miR-155 Aumento
miR-181a Aumento miR-191 Aumento miR-203 Aumento miR-215 Aumento
Ejemplo 9:
Criba con respecto a miARN que influyen en la apoptosis
5 La apoptosis es un proceso celular natural que ayuda a controlar el cáncer induciendo muerte en células con potencial oncogénico. Muchos oncogenes actúan alterando la inducción de la apoptosis. Para identificar los miARN que participan en la apoptosis, se usó un ensayo de apoptosis con la biblioteca de inhibidores de miARN.
Usando una biblioteca de más de 90 inhibidores de miARN, se cribó con respecto a miARN que afecten a la apoptosis. Se transfectaron células HeLa (8000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos) por triplicado con 10 inhibidores de miARN (5 pmoles) usando siPORT™ NeoFX™ (Ambion). El medio se cambió 24 h después de la transfección y las células procesadas 72 horas después de la transfección. Las células se midieron con respecto a apoptosis midiendo la actividad caspasa 3 de la siguiente manera: 1) Las células se lavaron una vez con PBS y se congelaron a -80 ºC. 2) Las células se lisaron añadieron 40 l de tampón de lisis frío (HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 40 mM, NP40 0,5 %, EDTA 0,5 mM) a los pocillos y se incubó durante 20 min a 4 ºC. 3) Añadir 160 l de tampón
15 ICE (HEPES 50 mM pH 7,4, CHAPS 0,1 %, EDTA 0,1 mM, sacarosa al 10 %) + DTT 5 mM que contenía sustrato DEVDafc 20 M. 4) Medir el aumento de fluorescencia en una hora a 400 ex, 505 em.
También se analizaron muestras con respecto al número de células usando un ensayo de esterasa general para normalizar los resultados de caspasa 3. Se diluyó el sustrato de FDA (fluoresceína diacetato 0,4 mg/ml (FDA) en acetonitrilo) 1:19 en tampón de dilución (TrisCl 40 mM pH 7,5, NaCl 20 mM, NP-40 0,5 %, concentración final de
20 0,02 mg/ml). Se añadieron 40 l de tampón (TrisCl 40 mM pH 7,5, NP-40 0,5 %,) a cada pocillo de muestra. Las muestras se incubaron 10 min en hielo. Se añadieron 160  
Se presentan datos de cribado normalizados en la FIG. 9. Los miARN que afectan a la apoptosis se enumeran en la 25 Tabla 6.
Tabla 6. MiARN que afectan a la apoptosis
miARN Impacto Relativo en la Proliferación Celular
miR-31 Reducción miR-214 Reducción miR-7 Aumento miR-1-2 Aumento miR-148 Aumento miR-195 Aumento miR-196 Aumento
miR-199a Aumento miR-204 Aumento miR-210 Aumento miR-211 Aumento miR-212 Aumento miR-215 Aumento miR-216 Aumento
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miARN Impacto Relativo en la Proliferación Celular
miR-218 Aumento miR-296 Aumento miR-321 Aumento
Ejemplo 10
Análisis de expresión usando ARN sintéticos
Además de usar ensayos fenotípicos para identificar miARN que influyen en los procesos celulares generales o rutas
5 celulares, pueden usarse colecciones de miARN sintéticos y/o inhibidores de miARN para identificar miARN que regulan directamente la expresión de un gen. Se creó un plásmido que tenía un gen de luciferasa inmediatamente cadena arriba de la 3’ UTR del gen de G6PD. Se co-transfectaron células A549 con el vector indicador y dieciocho miARN sintéticos diferentes. 24 horas después de la transfección, se midió la actividad luciferasa en las diversas poblaciones celulares. Resulta interesante que el miR-1-2 redujo significativamente la expresión del gen de
10 luciferasa/G6PD, lo que indica que esta familia de miARN regula la expresión del gen de G6PD. Pueden usarse experimentos similares para identificar miARN que regula la expresión de genes importantes tales como p53, BRCA1 y BRCA2, RAS, MYC, BCL-2, y otros.
Ejemplo 11:
Expresión diferencial de miARN oncogénicos y regulación del cáncer
15 Como se ha observado en ejemplos previos, se han identificado varios miARN que se expresan diferencialmente entre muestras de tejido tumoral y adyacente normal de los mismos pacientes de cáncer. Resulta interesante que hay un solapamiento significativo en los miARN que se expresan diferencialmente entre diferentes cánceres, lo que sugiere que hay un conjunto central de miARN que influyen en procesos celulares que cuando se alteran, conducen a cáncer. A continuación se describen experimentos dirigidos a desarrollar una conexión entre la desregulación de
20 miARN y el cáncer.
Expresión de miARN en el cáncer de pulmón
Se analizaron veintidós muestras de tumor y tejido adyacente normal (TAN) de pacientes con cáncer de pulmón usando el sistema de matriz de miARN descrito anteriormente. Las matrices se analizaron y se comparó la expresión relativa de cada miARN entre el tumor y los tejidos adyacentes normales de cada paciente. Los diversos miARN se
25 agruparon basándose en su expresión relativa en tumores entre diferentes pacientes (FIG. 14). Se expresaron seis miARN (miR-126, 30a, 143, 145, 188 y 331) a niveles significativamente menores en los tumores de más del 70 % de los pacientes. Se expresaron dos miARN (miR-21 y 200b) a niveles significativamente mayores en los tumores de más del 70 % de los pacientes. La expresión diferencial de varios de estos miARN se verificó por análisis de Northern (FIG. 15).
30 Expresión de miARN en cáncer de colon
Se analizaron veinticinco muestras de tumor y TAN de pacientes de cáncer de colon usando el procedimiento de matrices de miARN de los inventores. Como las comparaciones de cáncer de pulmón, los diversos miARN se agruparon basándose en su expresión relativa en tumores entre los diferentes pacientes de cáncer de colon (FIG. 14). Se expresaron cinco miARN (miR-143, 145, 195, 130a y miR-331) a niveles significativamente menores en los
35 tumores de más del 70 % de los pacientes. Se expresaron cinco miARN (miR-223, 21, 31, 17 y 106) a niveles significativamente mayores en los tumores de más del 70 % de los pacientes.
miARN como marcadores de cáncer
Es interesante que ocho miARN diferentes se expresaban diferencialmente entre las muestras tumorales y adyacentes normales para la mayoría de las muestras de paciente de pulmón y colon que se analizaron (FIG. 16).
40 También se descubrió que estos mismos miARN se expresaban diferencialmente en los pacientes con cáncer de mama, timo, vejiga, pancreático y de próstata que se analizaron, lo que sugiere que estos miARN podrían controlar procesos celulares que cuando se alteran conducen a cáncer.
miARN como reguladores de la expresión oncogénica
Para abordar si los miARN específicos podrían participar en cáncer mediante la desregulación de oncogenes, se
45 exploraron las regiones no traducidas 3’ (UTR) de 150 oncogenes bien conocidos con respecto a secuencias con homología significativa con los miARN identificados en el análisis de micromatrices de los inventores. Se seleccionaron sitios diana potenciales basándose en dos criterios:
(1) Complementariedad perfecta entre las posiciones 2-9 del miARN y el oncogén. Esta secuencia central de
miARN se ha identificado como crítica para las actividades de los miARN y los sitios diana de miARN conocidos 50 tienen esencialmente 100 % de complementariedad en este sitio (Doench y col. 2004).
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(2) Tm general de la interacción de miARN/ARNm. Además de la secuencia central, se ha mostrado que la estabilidad de unión general entre miARN y ARNm es un indicador importante de la actividad de miARN (Doench y col., 2004).
Como se ve en la Tabla 8, se han identificado sitios de diana potenciales en las 3’UTR de oncogenes conocidos para todos los miARN que se observó que se expresaban diferencialmente de forma rutinaria en muestras tumorales. Resulta interesante que KRAS2, MYCL1 y CBL tienen múltiples sitios de unión a miARN predichos que podrían proporcionar la unión de miARN cooperativa que se ha implicado como un factor importante en la regulación de miARN (Doench y col. 20003); Zeng y col., 2003). Muchos de los genes enumerados en la Tabla 8 se vuelven oncogénicos cuando se sobreexpresan, por lo tanto es concebible que la expresión reducida de un miARN podría conducir a la regulación positiva de uno o más oncogenes y posteriormente conducir a oncogénesis.
Tabla 8: miARN relacionado con cáncer y sus dianas oncogénicas potenciales
miARN
Diana génica predicha
let-7
RAS
let-7
C-MYC
miR-21 homólogo de mutS 2 (MSH2)
miR-21 homólogo de oncogén viral de sarcoma v-ski (aviar) (SKI) miR-143 región de grupo de punto de rotura (BCR) miR-143 secuencia transformante derivada de línea celular MCF.2 (MCF2) miR-143 supresor de tumor de von Hippel-Lindau (VHL) miR-143 homólogo de oncogén viral de sarcoma de rata de Kirsten 2 v-Ki-ras2 (KRAS2) miR-143 homólogo de oncogén viral de sarcoma de rata de Kirsten 2 v-Ki-ras2 (KRAS2) miR-143 secuencia transformante retroviral ecotrópica (murina) Cas-Br-M (CBL) miR-143 secuencia transformante retroviral ecotrópica (murina) Cas-Br-M (CBL) miR-145 oncogén relacionado con virus de mielocitomatosis v-myc (MYCN) miR-145 receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2) miR-145 secuencia transformante retroviral ecotrópica (murina) Cas-Br-M (CBL) miR-188 homólogo de oncogén viral de mielocitomatosis v-myc 1 (MYCL1)
miR-200b cadherina 13 (CDH13)
miR-200b homólogo del oncogén viral del sarcoma felino de Hardy-Zuckerman 4 v-kit (KIT)
miR-219 homólogo de oncogén viral de mielocitomatosis v-myc 1 (MYCL1)
miR-219 CLL de linfocitos B/linfoma 2 (BCL2)
miR-219 cadherina 1, tipo 1, cadherina E (epitelial) (CDH1)
miR-331 oncogén vav 1 (VAV1)
miR-331 receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGFR1)
miR-331 antagonistas de BCL2/killer 1 (BAK1)
miR-331 receptor de ácido retinoico, alfa (RARA)
miR-331 homólogo del oncogén viral de sarcoma v-src (Schmidt-Ruppin A-2) (SRC)
Ejemplo 12
Medición del efecto de los miARN en la expresión oncogénica
Puede realizarse confirmación de predicciones de sitio diana de miARN de diversas maneras. En Drosophila y C. elegans, se han aplicado enfoques genéticos en los que se realizan mutaciones en el miARN y el sitio o sitios diana de miARN potenciales y se muestra que dan como resultado fenotipos similares (Ha y col., 1996; Vella y col., 2004). En células de mamífero, en las que los enfoques genéticos son bastante más difíciles, se han usado construcciones indicadoras para mostrar que las 3’ UTR de genes diana potenciales se regulan en células a niveles que son desproporcionados con respecto a controles de vectores indicadores que contienen mutaciones en los sitios de unión a miARN potenciales (Lewis y col. 2003). Además, se han usado vectores y oligonucleótidos para introducir o inhibir miARN en células para determinar los efectos en los niveles endógenos de genes diana potenciales (Lewis y col., 2003; Kiriakidou y col. 2004). Este último enfoque se ha realizado para validar las predicciones de sitios diana de miARN.
Se han desarrollado miARN sintéticos e inhibidores de miARN que pueden transfectarse a células de mamífero para introducir miARN en células o inhibir la actividad de miARN en células, respectivamente. Véase documento USSN 60/627.171. Se usaron un miARN sintético y un inhibidor de miARN correspondiente a let-7b para determinar si las predicciones del sitio diana eran correctas. En estos experimentos, se transfectaron células cultivadas que expresaban niveles indetectables del miARN con el miARN sintético usando Agente de Transfección siPORT™ NeoFX™ (Ambion). Se usaron ensayos de inmunofluorescencia para RAS y C-MYC en las células transfectadas. Las proteínas de ambos oncogenes se expresaron a casi tres veces menores niveles en células transfectadas con el miARN sintético que células transfectadas con miARN de Control Negativo (Ambion). En un experimento recíproco, se transfectaron células que expresaban de forma natural altos niveles del miARN con el inhibidor de miARN let-7. Como se esperaba, las proteínas de ambos oncogenes fueron mayores en células transfectadas con el inhibidor de miARN que en células transfectadas con el inhibidor de Control Negativo (Ambion). Estos resultados son coherentes
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con el modelo de que el miARN regula la expresión de los dos oncogenes. Estos datos sugieren que la desregulación de un miARN clave podría participar en la progresión del cáncer no consiguiendo regular la expresión de uno o más oncogenes.
Ejemplo 13:
cribados de biblioteca de miARN sintéticos con respecto a miARN que influyen en la proliferación celular y viabilidad celular en diversos tipos celulares
Una característica del cáncer es la proliferación celular descontrolada; se usan habitualmente ensayos de proliferación celular por investigadores para estudiar la influencia de los genes en la oncogénesis. Se usó un ensayo de proliferación celular junto con la biblioteca de inhibidores de miARN para identificar miARN que influyen en la proliferación celular.
Se transfectaron células HeLa (cáncer de ovario humano) y A549 (cáncer de pulmón humano) por triplicado con 150 miARN sintéticos usando siPORT NeoFX (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los 150 son los siguientes: let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7g, miR-1, miR-7, miR-9, miR-10a, miR-10b, miR-15a, miR-16, miR-18, miR-19a, miR-17-3p, miR-20, miR-21, miR-22, miR-23a, miR-23b, miR-24, miR-25, miR-26a, miR-27a, miR-28, miR29a, miR-31, miR-32, miR-30a-3p, miR-34a, miR-92, miR-95, miR-96, miR-98, miR-99a, miR-100, miR-101, miR103, miR-105, miR-107, miR-108, miR-122, miR-124, miR-125a, miR-125b, miR-126, miR-128, miR-129, miR-132, miR-133A, miR-133B, miR-134, miR-135, miR-136, miR-137, miR-139, miR-140, miR-141, miR-142, miR-143, miR144, miR-145, miR-146, miR-147, miR-148, miR-149, miR-150, miR-151, miR-152, miR-153, miR-155, miR-181a, miR-182, miR-183, miR-184, miR-186, miR-187, miR-188, miR-190, miR-191, miR-192, miR-193, miR-194, miR-195, miR-196, miR-197, miR-198, miR-199, miR-201, miR-203, miR-204, miR-205, miR-206, miR-207, miR-208, miR-210, miR-211, miR-212, miR-214, miR-215, miR-216, miR-217, miR-218, miR-219, miR-220, miR-221, miR-223, miR-224, miR-299, miR-301, miR-302, miR-320, miR-322, miR-323, miR-325, miR-324-3p, miR-328, miR-330, miR-331, miR335, miR-337, miR-338, miR-339, miR-340, miR-345, miR-346, miR-367, miR-368, miR-369, miR-370, miR-371, miR-372, miR-373, miR-374, mumiR-290, mu-miR-291, mu-miR-292-3p, mu-miR-293, mu-miR-294, mu-miR-295, mu-miR-297, mu-miR-298, mu-miR-329, mu-miR-341, mu-miR-344, mu-miR-351, mu-miR-376b, mu-miR-380-3p, mu-miR-409, mu-miR-411, mu-miR-412.
Los miARN sintéticos fueron moléculas de ácido nucleico bicatenarias compuestos de una cadena activa y una cadena complementaria. La cadena activa contenía una secuencia que era idéntica al miARN maduro correspondiente. La cadena complementaria contenía una secuencia que era 100 % complementaria de la región relevante de la secuencia de miARN madura, pero que 1) carecía de dos nucleótidos en su extremo 3’ que eran complementarios de la secuencia de miARN madura (en el extremo 5’ de la cadena activa) y 2) tenía un saliente dinucleotídico en su extremo 5’ con respecto a la cadena activa. En otras palabras, las dos cadenas eran completamente complementarias de la secuencia de la otra excepto que cada cadena tiene un saliente 5’ dinucleotídico con respecto a la otra cadena. Se usó el mismo tipo de miARN sintéticos para el siguiente ejemplo o los siguientes ejemplos también. Se describe posteriormente cualquier excepción. Los miARN indicados en las tablas identifican el miARN que corresponde a la secuencia sintética proporcionada.
Se sometieron a electroporación células Jurkat (célula de leucemia humana) y linfocitos T humanos primarios con el mismo conjunto de miARN sintéticos usando siPorter-96 (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las células se analizaron con respecto a células viables y no viables 72 horas después de la transfección usando el PCA-96 (Guava) con el Ensayo Viacount. El número de células viables es el número de células vivas en un pocillo en el momento del ensayo. Los números proporcionados en las tablas posteriores son iguales al número medio de células viables en pocillos transfectados con un miARN particular dividido por el número de células viables en pocillos transfectados con miARN sintéticos de control negativo multiplicado por 100 para proporcionar el % de Viabilidad Celular de células transfectadas con miARN en relación con células transfectadas con control negativo.
Se asignó significación basándose en los valores medios de las muestras transfectadas con control negativo. Los miARN que eran significativamente diferentes de los controles negativos se clasificaron como “significativos” basándose en que estuvieran al menos dos desviaciones típicas por encima o por debajo de los datos de control negativo.
La secuencia de miARN-325 es 5’-ccuaguagguguccaguaagugu-3’.
TABLA 9 miARN que reducen significativamente la viabilidad celular de células HeLA
% de viabilidad
Desv. típica
miR-345
75 5,9
miR-346
77,8 8,2
miR-193
79,6 14,7
miR-206
79,6 6,5
miR-337
80,8 3,1
56
imagen42
(continuación)
miARN que reducen significativamente la viabilidad celularde células HeLA
mmu-miR-293
% de viabilidad 82,6 Desv. típica 1,7
miR-299
84,0 4,0
mmu-miR-329
84,5 4,5
mmu-miR-409
86 2,8
mmu-miR-292-3p
86,2 2,8
miR-210
86,4 5,1
mmu-miR-344
86,4 5,3
mmu-miR-298
86,7 4,2
miR-208
87,4 4,5
miR-197
87,6 7,5
miR-217
87,9 3,5
miR-1
88,2 9,0
miR-124
88,8 4,2
TABLA 10
miARN que reducen significativamente el número de células viablesde células HeLA
Células Totales Desv. típica Let-7b 16,2 8,1 Let-7g 22,7 8,2 Let-7c 24,1 7,2 miR-124 24,5 3,4 Let-7a 25,4 1,2 Let-7d 37,3 2,3 miR-337 37,5 16,9 miR-1 38,7 2,2 miR-299 38,9 4,2 miR-34a 40,5 13,3 mmu-miR-292 41,2 8,3 miR-122 41,2 6,5 miR-346 41,9 4,3 miR-101 43,4 6,4 miR-210 47,1 8,4 miR-147 47,7 8,2 miR-98 50,6 2,6 miR-345 51,8 6,8 miR-92 52,4 6,8 miR-96 53,2 0,9 miR-7 54,0 5,3 miR-133b 55,9 3,1 miR-206 56,0 12,4 mmu-miR-297 56,0 5,7 miR-19a 57,2 20,6 mmu-miR-344 57,5 14,1 miR-205 58,9 18,7 miR-208 60,5 11,1

TABLA 11 miARN que aumentan significativamente el número de célulasviables de células HeLA
miR-32
Células Totales 142,9 Desv. típica 25,4
mu-miR-290
143,5 17,6
miR-212
143,5 10,4
miR-92
144,7 16,8
miR-323
147,3 25,9
miR-145
148,1 22,2
miR-324
148,2 9,0
miR-198
152,1 67,8
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(continuación)
miARN que aumentan significativamente el número de célulasviables de células HeLA
miR-27a
Células Totales 156,2 Desv. típica 13,4
miR-369
158,4 27,3
miR-31
159,3 16,1
miR-335
161,7 20,8
mmu-miR-351
162,3 6,9
miR-370
164,3 4,5
miR-325
169,6 19,8
miR-331
172,5 24,0
miR-139
181,3 11,2
TABLA 12
miARN que reducen significativamente la viabilidad celular decélulas A549
miR-193
% de Viabilidad 92,4 Desv. típica 2,5
miR-224
92,5 1,4
miR-96
92,6 0,1
miR-346
93,9 1,6
mmu-miR-293
94,9 0,7
miR-34a
95 0,2
miR-216
95,1 1,0
mmu-miR-380
95,2 0,8
miR-182
95,6 0,8
miR-301
95,6 1,0
mmu-miR-344
95,8 0,2
mmu-miR-409
95,8 0,6
miR-369
95,9 0,7
TABLA13
miARN que reducen significativamente el número de células viablesen células A549
miR-124
Número de células 44,3 Desv. típica 2,2
miR-16
52,9 1,3
miR-337
54,7 7,0
miR-195
59,3 6,7
miR-34a
60,8 2,1
miR-15a
60,9 3,7
miR-28
61,3 0,8
Let-7g
61,9 0,8
mmu-miR-292
62,2 2,3
mmu-miR-344
62,6 9,1
miR-7
62,9 4,6
miR-193
63,7 3,3
miR-137
63,9 1,3
miR-147
64,8 0,5
miR-29a
67,0 3,8
miR-129
67,2 3,3
miR-22
67,5 3,4
miR-126
68,0 2,6
miR-345
69,2 7,4
miR-192
69,5 5,9
Let-7b
70,2 2,2
Let-7d
70,5 2,7
miR-346
70,9 7,1
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en A549
Células totales
Desv. Típica
miR-373
110,4 7,9
miR-25
111,8 6,0
mmu-miR-294
112,1 5,9
miR-32
120,8 4,3
miR-92
122,4 4,0
TABLA 15
miARN que reducen significativamente el número de células viables de Células Jurkat
% de Viabilidad
Desv. Típica
let-7a
20,54 0,70
miR-10b
35,98 2,92
let-7b
48,79 5,08
miR-17-3p
61,55 15,63
miR-30a-3p
64,36 26,60
miR-34a
65,45 20,44
miR-122
65,63 17,80
miR-29a
66,44 7,14
miR-101
67,44 29,56
miR-133a
71,51 17,82
miR-19a
71,77 23,79
miR-32
75,59 11,69
miR-1
75,74 12,92
miR-132
76,32 16,22
miR-28
77,07 16,58
miR-20
77,60 15,23
miR-134
78,96 1,75
TABLA 16
miARN que aumentan significativamente la viabilidad celular en célulasJurkat
miR-181-a
Células totales 122,77 Desv. Típica 22,40
miR-9
124,63 9,98
miR-141
126,08 24,03
miR-98
126,24 11,90
miR-10a
126,86 8,93
miR-125b
128,71 3,50
miR-126
130,69 18,20
miR-100
130,77 14,60
miR-23b
132,18 3,50
miR-140
135,73 4,08
miR-155
142,57 22,40
miR-15a
143,01 11,29
miR-129
146,94 9,92
miR-25
150,25 17,85
miR-143
158,74 1,86
miR-26a
166,09 13,65
TABLA 17
miARN que reducen significativamente la viabilidad celular en linfocitos T primarios % de Viabilidad Desv. Típica
miR-184 61,04 12,16 miR-145 68,98 11,23 miR-186 69,64 6,99 miR-139 69,85 0,29 miR-134 71,90 22,42
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(continuación)
miARN que reducen significativamente la viabilidad celular en linfocitos T primarios
% de Viabilidad
Desv. Típica
miR-190
75,59 2,43
miR-144
77,13 4,18
miR-183
77,71 2,86
miR-147
78,09 0,33
miR-140
78,70 5,81
miR-155
79,26 10,68
TABLA 18
miARN que aumentan significativamente la viabilidad celular de linfocitos T primarios % de Viabilidad Desv. Típica
miR-126 120,81 40,08 miR-10b 121,28 18,86 miR-17 122,46 3,71 miR-10a 124,11 9,46 miR-20 124,75 13,60 let-7c 124,81 4,00 miR-125a 125,66 5,13 miR-15a 129,07 10,96 let-7b 130,11 13,48 let-7a 130,88 16,16 miR-18 131,73 1,75
Es interesante observar que los miARN que afectan a un tipo celular con frecuencia no afectan a otros tipos celulares. Esto se debe probablemente al hecho de que los procesos celulares que están activos varían entre diferentes tipos celulares. Esto puede ser de importancia vital cuando se considera el potencial de los productos terapéuticos basados en miARN. Las células anómalas (enfermas) son diferentes de células normales debido al hecho de que están activos diferentes procesos celulares en los dos tipos celulares. La identificación de miARN que tienen efectos diferenciales en células normales y anómalas sería ideal ya que podrían suministrarse globalmente y esperarse que tuvieran un efecto solamente en células enfermas. Cuando se compararon los datos de viabilidad celular para las células de leucemia (linfocitos T cancerosos) y linfocitos T primarios, se observó que let-7a, let-7ab y miR-10b redujeron todos significativamente el porcentaje de células viables en las células de leucemia no teniendo al mismo tiempo esencialmente ningún efecto en los linfocitos T normales correspondientes. Estos miARN son candidatos para fármacos de leucemia.
Ejemplo 14:
Criba con respecto a miARN que influyen en la apoptosis
La apoptosis es un proceso celular natural que ayuda a combatir el cáncer induciendo muerte en células con potencial oncogénico. Muchos oncogenes actúan alterando la inducción de la apoptosis. Para identificar miARN que participan en la apoptosis se usó un ensayo de la apoptosis con la biblioteca de inhibidores de miARN.
Se transfectaron células HeLa (8000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos) por triplicado con más de 150 miARN sintéticos (descrito anteriormente) (3 pmoles) usando Ambion siPORT™ NeoFX™. El medio se cambió 24 h después de la transfección y las células se procesaron 72 horas después de la transfección. Las células se midieron con respecto a apoptosis midiendo la actividad caspasa 3 de la siguiente manera: 1) Las células se lavaron una vez con PBS y se congelaron a -80 ºC. 2) Las células se lisaron añadieron 40 l de tampón de lisis frío (HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 40 mM, NP40 0,5 %, EDTA 0,5 mM) a los pocillos y se incubaron durante 20 min a 4 ºC. 3) Añadir 160 l de tampón ICE (HEPES 50 mM pH 7,4, CHAPS 0,1 %, EDTA 0,1 mM, sacarosa 10 %) + DTT 5 mM que contenía sustrato DEVDafc 20 M. 4) Medir el aumento de fluorescencia en una hora a 400 ex, 505 em.
También se analizaron muestras con respecto al número de células usando un ensayo de esterasa general para normalizar los resultados de caspasa 3. Se diluyó el sustrato de FDA (fluoresceína diacetato 0,4 mg/ml (FDA) en acetonitrilo) 1:19 en tampón de dilución (TrisCl 40 mM pH 7,5, NaCl 20 mM, NP-40 0,5 %, concentración final de 0,02 mg/ml). Se añadieron 40 l de tampón (TrisCl 40 mM pH 7,5, NP-40 0,5 %,) a cada pocillo de muestra. Las muestras se incubaron 10 min en hielo. Se añadieron 160 l de sustrato de FDA diluido a cada pocillo. Se midió la fluorescencia durante 30 min a 37 grados (ex = 488, em = 529). La pendiente del aumento de fluorescencia a lo largo del tiempo está en función del número de células en la placa.
Se enumeran miARN que afectan a la apoptosis en la tabla posterior. Estos miARN regulan aparentemente rutas que conducen a la apoptosis. La desregulación de estos miARN podría inducir que las células experimentaran
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apoptosis o podría evitar que las células experimentaran apoptosis. La introducción o inhibición de estos miARN en células cancerosas (u otra enfermedad) que han superado rutas de señalización apoptótica o células de Parkinson (u otra enfermedad) que han inducido la apoptosis de forma prematura podrían usarse para tratar las enfermedades.
TABLA 20 miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células apoptóticas
Cambio relativo en células apoptóticas Desv. Típica
miR-338 773,46 69,82 miR-27a 607,24 150,08 miR-128 594,42 260,06 miR-23a 473,44 208,82 miR-324 442,99 101,03 miR-22 439,13 62,59
miR-181a 409,97 65,14 mmu-miR-293 403,86 53,41 mmu-miR-412 402,27 42,04
miR-196 378,13 28,15 miR-31 373,90 61,39 Let-7d 369,10 88,94 miR-23b 360,68 81,97
mu-miR-290 354,90 46,63 miR-217 347,38 56,49 miR-199 345,75 67,55
miR-24 317,43 62,85 miR-214 312,25 7,38 miR-198 303,24 44,25

TABLA 21 miARN que reducen significativamente el porcentaje de
células apoptóticas Cambio relativo en células apoptóticas
Desv. Típica
miR-105
39,97 8,91
miR-34a
37,75 8,41
miR-96
31,89 13,40
mmu-miR-292
30,72 4,27
miR-126
28,71 4,24
miR-137
12,69 11,80
miR-101
7,50 6,91
Ejemplo 15:
Cribas de bibliotecas de miARN sintéticos con respecto a miARN que influyen en el ciclo celular
El cuerpo humano adulto consiste en aproximadamente 50-100 billones de células. Cada día, varios miles de millones de estas células se dividen en dos para reemplazar los miles de millones de células que mueren y se retiran. En el transcurso de un tiempo de vida medio, esto suma un número astronómico de divisiones celulares, la mayoría de las cuales suceden perfectamente bien. Se producen, no obstante, errores, y si no se corrigen pueden conducir a cáncer. El crecimiento y división celular se controla normalmente por un sistema intrincado de comprobaciones y equilibrios. Sin embargo, ocasionalmente una célula comenzará a proliferar sin control, dividiéndose una y otra vez y desafiando todas las restricciones normales en su crecimiento. Este es el comienzo de las formas más comunes de cáncer.
Las 4.000 células BJ/pocillo se transfectaron por triplicado con 46 miARN sintéticos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Let-7a
Let-7a
miR-1
miR-1
miR-105
miR-125a
miR-128
miR-142
miR-145
miR-146
miR-147
imagen43
miR-150 miR-15a miR-16 miR-186
5 miR-187 miR-188 miR-191 miR-195 miR-20
10 miR-206 miR-21 miR-211 miR-223 miR-224
15 miR-26a miR-320 miR-324-3p miR-325 miR-335
20 miR-337 miR-338 miR-345 miR-371 miR-373
25 miR-92 mmu-miR-201 mmu-miR-207 mmu-miR-290 mmu-miR-291-3p
30 mmu-miR-294 mmu-miR-295 mmu-miR-297 mmu-miR-322 mmu-miR-376b
35 mmu-miR-409
24 horas después de la transfección, la mitad de las células BJ de cada pocillo se retiraron a medio nuevo. 72 h después de la transfección se fijaron con paraformaldehído al 4 % a una concentración final de 2 %. Las células fijadas se tiñeron con yoduro de propidio (TTP LabTech protocol) y se evaluaron usando el explorador celular TTP LabTech. El yoduro de propidio tiñe el ADN y el contenido de AND relativo en una célula corresponde a su posición
40 en el ciclo celular. El explorador celular midió la tinción de yoduro de propidio en cada célula y asignó su posición en el ciclo celular. El porcentaje de células en cada estadio del ciclo celular se calculó y se comparó con células transfectadas con miARN sintéticos de control negativo. El cambio relativo en células en cada estadio se calculó para cada miARN que se usó. Los miARN sintéticos que indujeron un cambio significativo hacia o en dirección opuesta a un estadio específico del ciclo celular se enumeran posteriormente. Estos representan miARN que regulan
45 puntos claves en el ciclo celular y ofrecen puntos de intervención clave para el desarrollo terapéutico relacionado con el cáncer.
TABLA 23 miARN que reducen significativamente el porcentaje de células BJ en fase G1 del ciclo celular
miARN % de Dif. en células en G1 Desv. Típica
miR-miR-21 54,4 4,2 miR-miR-20 63,6 9,3 miR-miR-1 65,3 9,5 miR-miR-206 66,8 9,0 miR-miR-373 72,6 5,7 miR-miR-26a 78,0 4,0
TABLA 24 miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células BJ en fase G1 del ciclo celular
miARN % de Dif. en células en G1 Desv. Típica
rno-miR-miR-325 121,7 5,3 mmu-409 123,2 13,7 miR-miR-324 123,7 4,9
imagen44
(continuación)
miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células BJen fase G1 del ciclo celular
miARN miR-miR-195
% de Dif. en células en G1 125,1 Desv. Típica 2,5
mmu-376b
126,5 3,1
miR-miR-142
127,0 13,0
miR-miR-371
128,9 2,8
let-7a
131,5 4,5
miR-miR-146
141,5 7,7
miR-miR-128
143,0 2,4
TABLA 25
miARN que reducen significativamente el porcentaje de células BJen fase S del ciclo celular
miARN miR-miR-128
% de Dif. en células en S 55,5 Desv. Típica 3,8
let-7a
57,6 8,7
miR-miR-142
59,5 24,7
miR-miR-146
63,5 16,8
mmu-297
65,0 14,1
miR-miR-337
65,3 11,3
miR-miR-195
65,6 0,1
mmu-376b
69,1 11,6
miR-miR-324
72,2 9,4
miR-miR-187
72,3 10,9
miR-miR-186
72,8 6,1
TABLA 26
miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células BJen fase S del ciclo celular
miARN % de Dif. en células en S Desv. Típica
miR-miR-92 132,0 14,7 miR-miR-15a 134,8 13,9 miR-miR-191 135,9 29,1 miR-miR-26a 136,0 7,6 miR-miR-20 139,7 17,6 mmu-290 141,0 11,7 let-7a 141,1 19,9 miR-miR-345 143,3 45,8 miR-miR-16 150,1 24,8 miR-miR-224 150,6 9,8
TABLA 26 miARN que reducen significativamente el porcentaje de células BJen fase G2/M del ciclo celular
miARN % de Dif. en células en G/2M Desv. Típica
miR-miR-147 51,2 6,1 miR-miR-371 52,8 2,7 miR-miR-146 57,2 5,3 miR-miR-195 58,9 4,4 miR-miR-128 65,4 2,7 miR-miR-15a 67,4 13,7 let-7a 69,1 2,8
TABLA 27 miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células BJen fase G2/M del ciclo celular
miARN % de Dif. en células en G2/M Desv. Típica
miR-miR-26a 130,2 5,8 miR-miR-187 132,0 4,3 miR-miR-145 136,8 13,7 miR-miR-373 137,9 5,2 miR-miR-20 143,0 10,6 miR-miR-21 160,3 7,1
imagen45
miARN % de Dif. en células con >2X ADN Desv. Típica
miR-miR-20 157,9 23,4 miR-miR-1 161,9 13,6 miR-miR-345 176,1 17,4 miR-miR-373 177,9 32,7 miR-miR-337 195,0 52,1 miR-miR-21 209,4 45,7
Ejemplo 16:
Criba de biblioteca de miARN sintéticos con respecto a miARN que influyen en la proliferación celular
5 Se usaron ensayos de proliferación celular junto con la biblioteca de miARN sintéticos de los inventores para identificar miARN que influyen en la proliferación celular en una amplia serie de células, incluyendo las de tejidos de pulmón, mama, próstata, piel, cuello uterino, linfocitos T y prepucio.
Se transfectaron células de cuello uterino (HeLa), pulmón (A549, CRL-5826 y HTB-57), mama (MCF12A y BT549), próstata (22Rv1), linfocitos T (Jurkat y normales primarios) y piel (TE354T, TE353SK, y BJ) por triplicado con cada 10 uno de los más de 150 miARN sintéticos en la biblioteca de los inventores. Con las excepciones de Jurkat y linfocitos T primarios, cada tipo celular se transfectó con 5 picomoles de cada uno de los miARN en la biblioteca de miARN sintéticos usando siPORT™ y NeoFX™ (Ambion) a una densidad de siembra de aproximadamente 8000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos. Los Jurkats y linfocitos T primarios se mezclaron a una tasa de aproximadamente 50.000 células/pocillo con 500 picomoles de cada uno de los miARN sintéticos. El medio se
15 cambió 24 h después de la transfección. 72 horas después de la transfección, se estimó el número de células por uno de tres procedimientos:
(1) Se añadió AlamarBlue a cada pocillo y las placas de 96 pocillos se analizaron usando un lector de placas. El AlamarBlue es un sustrato para una enzima metabólica en células y el producto de reacción es fluorescente. La fluorescencia de cada pocillo se correlaciona con el número total de células en cada pocillo.
20 (2) Se añadió Reactivo ViaCount Flex (Guava), un colorante que fluoresce cuando interacciona con el ADN, a cada pocillo y se cuantificó la fluorescencia usando el Guava PCA-96 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
(3) Se añadió yoduro de propidio, un colorante que fluoresce cuando interacciona con el ADN, a cada pocillo y se
estimó el número total de células contando sitios únicos de ADN teñido usando el Explorador Celular TTP 25 LabTech de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se evaluó la influencia de cada miARN en la proliferación celular dividiendo la lectura del número de células de cada pocillo por la lectura de número de células medio para pocillos transfectados con un miARN de control negativo (CN).
Se presentan en la FIG. 15A-C miARN sintéticos que redujeron significativamente la proliferación de los diversos
30 tipos celulares que se analizaron. Estos miARN representan moléculas que podrían usarse para terapia, diagnóstico, crear líneas celulares con propiedades de investigación interesantes, e inducir diferenciación.
Aproximadamente el 10 % de los miARN redujeron significativamente la proliferación celular para al menos cuatro tipos celulares diferentes. Estos miARN (presentados en orden de clasificación en la tabla posterior) se proporcionan posteriormente y pueden implementarse en procedimientos y composiciones de la invención.
35
Tabla 29 miARN comunes y de proliferación miARN nº de positivos
miR-124 7 miR-16 6 miR-101 6 miR-126 6 miR-147 6 miR-15a 5
64
imagen46
miARN nº de positivos
miR-96 5 miR-105 5 miR-142 5 miR-215 5 miR-346 4 miR-206 4 miR-192 4 miR-194 4
Entre las células que se usaron en las cribas de biblioteca de miARN sintéticos se emparejan pares de células cancerosas y no cancerosas, de mama, piel y linfocitos T. Resulta interesante que muchos miARN sintéticos 5 afectaron de forma diferencial a la proliferación en los pares celulares (véase tabla posterior).
Tabla 30
Mama Cáncer No Cáncer
miARN % CN % Desv. Típ. % CN % Desv. Típ miR-201 79 14 103 17 miR-192 81 3 95 17
miR-92 85 11 104 24
Piel Cáncer Normal
pre-MIR % de CN % Desv. Típ % de CN % Desv. Típ miR-154 51 5 93 10 miR-195 58 3 87 5
mu-miR-376b 65 3 99 8 miR-201 67 8 106 4 miR-26a 69 12 97 17 miR-193 69 4 105 10
Linfocitos T Leucemia Normal
% CN % Desv. Típ % CN % Desv. Típ let-7a 21 1 137 15 let-7b 50 5 136 13
miR-101 69 30 95 5 miR-10b 37 3 115 18 miR-122 67 18 104 18 miR-17-3p 63 16 116 4 miR-29a 68 7 111 8 miR-30a-3p 66 27 97 18 miR-34a 67 21 100 1
Se presentan en la FIG. 16 miARN sintéticos que aumenta significativamente la proliferación de los diversos tipos celulares que se analizaron.
Ejemplo 17:
10 Cribas de biblioteca de inhibidores de miARN identifican miARN que influyen en la proliferación celular
Se usó ensayo de proliferación celular junto con la biblioteca de miARN sintéticos de los inventores para identificar miARN que influyen en la proliferación celular en una amplia serie de células, incluyendo las de tejidos de pulmón, mama, próstata, piel, cuello uterino, linfocitos T y prepucio.
imagen47
Se transfectaron células de mama (MCF12A), próstata (22Rv1), pulmón (A549), y piel (TE354T) por triplicado con cada uno de los más de 150 inhibidores de miARN de la biblioteca de los inventores. Cada tipo celular se transfectó con 10 picomoles de cada uno de los inhibidores de miARN en la biblioteca usando siPORT™ y NeoFX™ (Ambion) a una densidad de siembre de aproximadamente 8000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos. 72 h después de la transfección, se estimó el número de células por uno de tres procedimientos:
(1)
Se añadió AlamarBlue a cada pocillo y se analizaron las placas de 96 pocillos usando un lector de placas. El AlamarBlue es un sustrato para una enzima metabólica en células y el producto de reacción es fluorescente. La fluorescencia en cada pocillo se correlaciona con el número total de células en cada pocillo.
(2)
Se añadió Reactivo ViaCount Flex (Guava), un colorante que fluoresce cuando interacciona con ADN, a cada pocillo y se cuantificó la fluorescencia usando el Guava PCA-96 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
(3)
Se añadió yoduro de propidio, un colorante que fluoresce cuando interacciona con ADN, a cada pocillo y se estimó el número total de células en el pocillo contando sitios únicos de ADN teñido usando el Explorador Celular TTP LabTech de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La influencia de cada miARN en la proliferación celular se evaluó dividiendo la lectura del número de células de cada pocillo por la lectura de número de células medio para pocillos transfectados con un miARN de control negativo (CN).
Se presentan en la FIG. 17 miARN cuya inhibición redujo significativamente la proliferación de los diversos tipos celulares que se analizaron. Estos miARN representan moléculas que podrían usarse para terapia, diagnóstico, crear líneas celulares con propiedades de investigación interesantes e inducir diferenciación.
Se presentan en la FIG. 18 inhibidores de miARN que aumentan significativamente la proliferación de los diversos tipos celulares que se analizaron. Estos miARN representan moléculas que podrían usarse para terapia, diagnóstico, crear líneas celulares con propiedades de investigación interesantes e inducir diferenciación.
Ejemplo 18:
Criba de biblioteca de miARN sintéticos con respecto a miARN que influyen en la viabilidad celular
La base para la mayoría de enfermedades humanas es la subversión de una o más células para que actúen de maneras distintas a lo que hacen normalmente. Por ejemplo, el cáncer se inicia con la inmortalización y transformación de una única célula que después se divide repetidas veces para formar un tumor. Se usan habitualmente compuestos que reducen la viabilidad de las células enfermas para tratar pacientes con cáncer y otras enfermedades.
Se transfectaron cuello uterino (HeLa), pulmón (A549) y linfocitos T (Jurkat y normal primario) por triplicado con cada uno de los más de 150 miARN sintéticos de la biblioteca de los inventores. Con las excepciones de Jurkat y linfocitos T primarios, cada tipo celular se transfectó con 5 picomoles de cada uno de los miARN en la biblioteca de miARN sintéticos usando siPORT™ y NeoFX™ (Ambion) a una densidad de siembra de aproximadamente 8000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos. Las Jurkats y linfocitos T primarios se mezclaron a una tasa de aproximadamente 50.000 células/pocillo con 500 picomoles de cada uno de los miARN sintéticos. Para las células HeLa y A549, el medio se cambió 24 h después de la transfección. 72 horas después de la transfección, se estimó el número de células por uno de dos procedimientos:
(1)
Reactivo ViaCount Flex (Guava), que incluye un colorante que solamente puede entrar en células muertas y que fluoresce cuando interacciona con el ADN, a cada pocillo y se cuantificó la fluorescencia usando el Guava PCA-96 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El porcentaje de células viables se midió dividiendo el número de células no muertas y no apoptóticas en la muestra por el número total de células en el pocillo y multiplicando por 100.
(2)
Se añadió a cada pocillo yoduro de propidio, un colorante que fluoresce cuando interacciona con el ADN. Cada célula se analizó usando el Explorador Celular TTP LabTech de acuerdo con las instrucciones del fabricante para detectar células con patrones de tinción coherentes con la muerte celular o la apoptosis. El porcentaje de células viables se midió dividiendo el número de células no muertas y no apoptóticas en la muestra por el número total de células en el pocillo y multiplicando por 100.
Se presentan en la FIG. 19 miARN sintéticos que reducen o aumentan significativamente la viabilidad en los diversos tipos celulares que se analizaron. Una comparación de la viabilidad de Jurkat y linfocitos T primarios, que representan las formas normales y leucémicas de linfocitos T, let-7, miR-10, miR-101, miR-17-3p, miR-19 y miR-34a redujeron gravemente la viabilidad de las células de leucemia sin afectar a los linfocitos T normales.
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Ejemplo 19
Criba de biblioteca de miARN sintéticos con respecto a miARN que influyen en la apoptosis
Para identificar miARN que participan en la apoptosis, se usó un ensayo de apoptosis con la biblioteca de inhibidores de miARN.
Se transfectaron 8000 células de cuello uterino (HeLa) próstata (22Rv1), linfocitos T (Jurkat) y piel (TE354T) por triplicado con cada uno de los más de 150 miARN sintéticos de la biblioteca de los inventores usando siPORT™ NeoFX™ (Ambion). El medio se cambió después de 24 h y las células se inspeccionaron visualmente con un microscopio para inspeccionar cualitativamente la muerte celular 72 horas después de la transfección. Las células se midieron con respecto a apoptosis midiendo la actividad caspasa 3 de la siguiente manera: 1) Las células se lavaron una vez con PBS y se congelaron a -80 ºC. 2) Las células se lisaron añadieron 40 l de tampón de lisis frío (HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 40 mM, NP40 0,5 %, EDTA 0,5 mM) a los pocillos y se incubaron durante 20 min a 4 ºC. 3) Añadir 160 l de tampón ICE (HEPES 50 mM pH 7,4, CHAPS 0,1 %, EDTA 0,1 mM, sacarosa al 10 %) + DTT 5 mM que contenía sustrato DEVDafc 20  l de tampón (TrisCl 40 mM pH 7,5, NP-40 0,5 %,) a cada pocillo de muestra. Las muestras se incubaron 10 min en hielo. Se añadieron 160 l de sustrato de FDA diluido a cada pocillo. La fluorescencia se midió durante 30 min a 37 grados (ex = 488, em = 529). La pendiente del aumento de fluorescencia a lo largo del tiempo está en función del número de células en la placa.
Se evaluó la influencia de cada miARN en la apoptosis dividiendo la lectura de caspasa 3 de cada pocillo por la lectura de caspasa 3 media para pocillos transfectados con un miARN de control negativo (CN).
Como se ve en la FIG. 20, muchos miARN diferentes fueron capaces de aumentar o reducir la apoptosis en los cuatro tipos celulares que se analizaron. Varios miARN (miR-126, miR-26a, miR-1, miR-149 y let-7g) afectaron a la apoptosis en múltiples tipos celulares lo que sugiere que regulan la apoptosis mediante genes que son comunes en múltiples tipos celulares.
Ejemplo 20
Criba de biblioteca de miARN sintéticos con respecto a miARN que inducen la transformación
La transformación es necesaria para la formación de tumores ya que supera la respuesta natural de la célula para detener la división cuando se sitúa en un ambiente muy poblado. Para identificar miARN que participan en la transformación, se usó un ensayo de transformación que presentaba NIH3T3 con la biblioteca de miARN sintéticos. Se usan células NIH3T3 en ensayos de transformación ya que carecen de la capacidad para formar colonias cuando se siembran en placas de agar blando. La modulación de los procesos celulares que inhiben la transformación puede detectarse fácilmente porque inducen que las células NIH3T3 comiencen a formar colonias cuando se siembran en placas de agar blando.
Se transfectaron aproximadamente 8000 células NIH 3T3 por duplicado con cada uno de los más de 150 miARN sintéticos en la biblioteca de los inventores usando siPORT™ NeoFX™ (Ambion). El medio se cambió después de 24 h y las células se transfirieron a placas de 24 pocillos que contenían agar blando. El agar blando limita la movilidad y asegura que las células hermanas deban permanecer en contacto después de la división celular. El contacto cercano con otras células típicamente induce que las células NIH 3T3 paren de dividirse. El número total de células en cada pocillo se midió tomando una lectura de absorbancia a 495 nm. La lectura de absorbancia para cada pocillo se dividió por la lectura de absorbancia media para células transfectadas con miARN de control negativo y se multiplicó por 100 para obtener el porcentaje de cambio en transformación. Una criba inicial reveló miR-10, miR-23, miR-24, miR-198, miR-192 y miR-199 como miARN que aumentaba la transformación en relación con células transfectadas con control negativo. Una repetición del experimento con los candidatos iniciales produjo los siguientes aciertos como se muestra a continuación:
Tabla 31 miARN % CN % DT 198 103 2,07 192 108 5,7 199 113 5,59
imagen49
MiARN que afectan a la eficacia de los compuestos terapéuticos
Se han ensayado muchos compuestos en ensayos clínicos con respecto a su capacidad para afectar de forma positiva al resultado de pacientes. En algunos casos, estos compuestos cumplen los criterios establecidos por la FDA y se convierten en productos terapéuticos. Desafortunadamente, muy pocos productos terapéuticos son 100 % eficaces. La potenciación de las actividades de compuestos terapéuticos proporciona una oportunidad significativa dentro de la industria médica. Los dos procedimientos más habituales que se usan para potenciar los productos terapéuticos son modificar la estructura química de los compuestos o usar múltiples compuestos terapéuticos simultáneamente. Se evaluó si sería beneficioso introducir miARN antes de añadir compuestos que se sabe que reducen significativamente la viabilidad de células cancerosas. Uno de los compuestos antineoplásicos que se introdujo fue TRAIL, un compuesto que se une al menos con dos receptores diferentes y activa la ruta de la apoptosis para inducir muerte celular principalmente en células cancerosas. El segundo compuesto que se ensayó en combinación con miARN sintéticos fue el etopósido, un inhibidor de topoisomerasa II que activa la ruta de la apoptosis de células cancerosas y normales de forma similar reduciendo la reparación del daño de ADN dentro de las células.
Se transfectaron aproximadamente 8000 células de cuello uterino (HeLa) y pulmón (A549, HTB-57 y CRL-5826) por triplicado con miARN sintéticos de la biblioteca de los inventores usando siPORT™ NeoFX™ (Ambion). El medio se cambió después de 24 h y se introdujeron etopósido y TRAIL a una concentración final de aproximadamente 25 M después de 48 horas. Las células se inspeccionaron visualmente con un microscopio para inspeccionar cualitativamente la muerte celular 64 horas después de la transfección.
Las células tratadas con etopósido se midieron con respecto a apoptosis midiendo la actividad caspasa 3 de la siguiente manera: 1) Las células se lavaron una vez con PBS y se congelaron a -80 ºC. 2) Las células se lisaron añadieron 40 l de tampón de lisis frío (HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 40 mM, NP40 0,5 %, EDTA 0,5 mM) a los pocillos y se incubaron durante 20 min a 4 ºC. 3) Añadir 160 l de tampón ICE (HEPES 50 mM pH 7,4, CHAPS 0,1 %, EDTA 0,1 mM, sacarosa al 10 %) + DTT 5 mM que contenía sustrato DEVDafc 20 M. 4) Medir el aumento de fluorescencia en una hora a 400 ex, 505 em. Las muestras también se analizaron con respecto al número de células usando un ensayo de esterasa general para normalizar los resultados de caspasa 3. Se diluyó sustrato de FDA (fluoresceína diacetato 0,4 mg/ml (FDA) en acetonitrilo) 1:19 en tampón de dilución (TrisCl 40 mM pH 7,5, NaCl 20 mM, NP-40 0,5 %, concentración final 0,02 mg/ml). Se añadieron 40 l de tampón (TrisCl 40 mM pH 7,5, NP-40 0,5 %,) a cada pocillo de muestra. Las muestras se incubaron 10 min en hielo. Se añadieron 160 l de sustrato de FDA diluido a cada pocillo. La fluorescencia se midió durante 30 min a 37 grados (ex = 488, em = 529). La pendiente del aumento de fluorescencia a lo largo del tiempo está en función del número de células en la placa.
Las células tratadas con TRAIL se evaluaron con respecto a viabilidad celular añadiendo AlamarBlue a cada pocillo y analizando la fluorescencia usando el lector de placas. El AlamarBlue es un sustrato para una enzima metabólica en células y el producto de reacción es fluorescente. La fluorescencia en cada pocillo se correlaciona con el número total de células en cada pocillo.
El efecto de cada miARN en los tratamientos se midió dividiendo la lectura de caspasa 3 o AlamarBlue de las células transfectadas con miARN y tratadas con TRAIL o etopósido con las mismas lecturas con respecto a células que se transfectaron solamente con los miARN. El cambio en la actividad de caspasa 3 o tinción de AlamarBlue para cada miARN se dividió después por las diferencias observadas para dos miARN de control negativo y se multiplicó por 100 para calcular el efecto relativo inducido por la combinación de cada miARN y el compuesto terapéutico. Estos valores se enumeran como % CN en la Figura G.
Como se muestra en la FIG. 21, varios miARN aumentaron significativamente la capacidad de los dos compuestos terapéuticos para inducir muerte celular en las células cancerosas que se trataron. Resulta interesante que miR-2923p, miR-132, miR-124 y miR-28 funcionaron todos extremadamente bien en combinación tanto con TRAIL como con etopósido.
Ejemplo 22:
Criba de biblioteca de miARN sintéticos con respecto a miARN que afectan al ciclo celular
El cuerpo humano adulto consiste en aproximadamente 50-100 billones células. Cada día, varios miles de millones de estas células se dividen en dos para reemplazar los miles de millones de células que mueren y se eliminan. En el transcurso de un tiempo de vida medio, esto suma un número astronómico de divisiones celulares, la mayoría de las cuales suceden perfectamente bien. Se producen, sin embargo, errores, y si no se corrigen pueden conducir a cáncer. El crecimiento y división celular se controlan normalmente por un sistema intrincado de comprobaciones y equilibrios. No obstante, ocasionalmente una célula comenzará a proliferar sin control, dividiéndose una y otra vez y desafiando todas las restricciones normales en su crecimiento. Este es el comienzo de las formas más comunes de cáncer.
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Aproximadamente 8000 células de cuello uterino (HeLa) y 4000 de piel (BJ) por pocillo se transfectaron por triplicado con cada uno de los más de 150 miARN sintéticos en la biblioteca de los inventores. Se transfectaron células HeLA usando siPORT™ NeoFX™ (Ambion) y se transfectaron células BJ usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 24 horas después de la transfección, la mitad de las células de cada pocillo se retiraron a medio nuevo. 72 h después de la transfección, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % a una concentración final de 2 %. Las células fijadas se tiñeron con yoduro de propidio (protocolo de TTP LabTech) y se evaluaron usando el explorador celular TTP LabTech. El yoduro de propidio tiñe ADN y el contenido de ADN relativo de una célula corresponde a su posición en el ciclo celular. El explorador celular midió la tinción con yoduro de propidio en cada célula y asignó su posición en el ciclo celular. El porcentaje de células en cada estadio del ciclo celular se calculó y se comparó con células transfectadas con miARN sintéticos de control negativo. El cambio relativo en células en cada estadio se calculó para cada miARN que se usó. Los miARN sintéticos que indujeron un desplazamiento significativo hacia o en sentido contrario a un estadio específico del ciclo celular se enumeran posteriormente. Estos representan miARN que regulan puntos clave en el ciclo celular y ofrecen puntos de intervención clave para el desarrollo terapéutico relacionado con cáncer.
Como se ve en la FIG. 22, muchos miARN diferentes alteraron significativamente el porcentaje de células en los diversos estadios del ciclo celular en los dos tipos celulares que se analizaron.
Ejemplo 23:
Criba de biblioteca de miARN sintéticos con respecto a miARN que influyen en la expresión de hTert
La telomerasa es un complejo de proteínas y ARN que mantiene los extremos de cromosomas agregando telómeros. Con raras excepciones, las células diferenciadas de forma terminal carecen de telomerasa activa. Una de las excepciones es las células cancerosas. Más del 90 % de las muestras de cáncer humano tienen telomerasa activa (revisado en Dong y col., 2005). El gen hTert codifica el dominio catalítico de la telomerasa. La expresión de hTert se correlaciona con la actividad telomerasa en células haciéndolo un buen sustituto para la actividad telomerasa. Los inventores han desarrollado y usado un ensayo basado en RT-PCR para controlar la expresión de ARNm de hTert en células negativas para telomerasa para identificar miARN que participan en la regulación de la telomerasa. Los miARN que regulan la actividad telomerasa representan puntos de intervención para terapias de cáncer.
Las células BJ son fibroblastos de prepucio normales que carecen de ARNm de hTert y actividad telomerasa. Las células BJ se tripsinizaron y se diluyeron a 13.000 células/ml en medio de crecimiento normal. Se diluyeron 0,3 l de agente lipofectamine 2000 en 40 l de OPTIMEM y se incubaron durante cinco minutos. El reactivo de transfección diluido se añadió a los pocillos de placas de 96 pocillos que contenían 151 miARN sintéticos así como dos miARN sintéticos de control negativo diferentes. Cada pocillo albergaba un miARN sintético diferente. Los miARN sintéticos y agentes de transfección se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y después se añadieron 200 l
(2.600 células) sobre el complejo de lípido/miARN. Las células se colocaron en un incubador y el ARN se aisló 72 horas después. El ARN se aisló de las células en cada pocillo usando el protocolo convencional del kit de Aislamiento de ARN Total RNAqueous™-MagMAX96 (Cat nº 1830) (lisado de células en pocillos). Se realizó transcripción inversa usando la reacción RETROscript añadiendo 11 l de ARN total (20-100 ng/l) a 1 l de decámeros aleatorios y se incubó en un baño de agua a 70 ºC durante 3 minutos, después se colocó en hielo. A continuación 8 l del cóctel que contenía 3,8 l de agua sin Nuc, 2,0 l de tampón de Transcripción Inversa 10X, 2,0 l de dNTP 2,5 mM, Proteína Inhibidora de RNasa (40 U/l), 0,1 l de MMLV-RT (100 U/l) y se incubó a 42 ºC durante 1 hora, después 92 ºC durante 10 minutos.
Se ensamblaron reacciones de PCR en tiempo real para cuantificar el ARNm de hTert y ARNr 18S en cada una de las muestras. Se colocaron agua sin nucleasa, tampón de PCR Completo 10X/SYBR, MgCl2 25 mM, dNTP 2,5 mM, ROX 50X, cebadores específicos de 18S o hTert (mezcla dir e inv 3 M), ADNc de las diversas muestras y Super taq polimerasa en un tubo de PCR. La reacción se calentó a 95 ºC durante 5 minutos y después se sometió a 40 ciclos de 95 ºC durante 15 segundos, 60 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 30 segundos. Los productos de amplificación se controlaron usando el ABI 7600 (Applied Biosystems). Las células BJ habitualmente no consiguen producir productos de amplificación con los cebadores de hTert. Las muestras transfectadas por miARN que produjeron un producto de PCR de hTert también se analizaron con respecto a niveles de ARNr 18S para asegurar que no había significativamente más células en las muestras que las que podrían haber contribuido a la cantidad de hTert en las muestras.
El ARNm de hTert se detectó en transfecciones por duplicado de cada uno de los miARN enumerados posteriormente. Estos miARN afectan supuestamente a rutas que regulan la expresión del gen de hTert. La sobreexpresión de cualquiera de estos miARN podría contribuir al cáncer activando la telomerasa. La regulación de las actividades de estos miARN en células cancerosas podría limitar su transformación y superar la oncogénesis.
imagen51
Tabla 33
Activadores de miARN de hTert
miARN Expresión de hTert Log(2)
miR-147 3,14 miR-195 4,25 miR-21 1,55 miR-24 4,68 miR-26a 4,35 miR-301 4,14 miR-368 5,30 miR-371 2,43
La criba de actividad telomerasa se repitió usando una serie de ARNip que se dirigen a quinasas, fosfatasas, GPCR, factores de transcripción y otros genes variados. La dirección a los genes posteriores con ARNip dio como resultado aumento de la expresión de hTert. Resulta interesante que se ha predicho que muchos de estos genes son dianas para los miARN que los inventores han descubierto que son reguladores de hTert (véase tabla posterior).
Tabla 34
Activadores del gen de hTert
Gen Expresión de hTert Log(2)
ACOX1 3,44 AKT1 1,80 APAF1 3,40 COX-5B 2,78 COX6 2,28 COX7B 3,95 CPOX 4,66 DUOX2 3,80 GPX1 1,85 GPX2 2,56 GPX4 3,17 LPO 3,37 MAPK1 3,07 MAPK4 3,61 MTCO1 1,58 NOX3 2,30 NOX5 2,54 PAOX 1,72 PPOX 2,09
PRKCA 2,24 PRKCD 4,39 TNFRSF6 2,25
Ejemplo 24:
10 Efecto de la secuencia primaria de miARN en la función
Parece que muchos miARN están muy estrechamente relacionados con otros basándose en sus secuencias primarias. Por ejemplo, let-7a es un miembro de la familia génica de let-7, que incluye 7 genes únicos dentro del genoma humano. Los genes let-7 codifican miARN que varían tan poco como un único nucleótido y tanto como cuatro nucleótidos. En las bibliotecas de miARN sintéticos e inhibidores de miARN de los inventores, hay cinco 15 miARN de let-7 humano diferentes. Estos miARN se han usado en muchos tipos celulares diferentes en cribas diseñadas para identificar miARN implicados en una diversidad de procesos celulares diferentes. En muchas de las cribas, los diversos miARN de let-7 generan fenotipos similares. La FIG. 23 proporciona dos ejemplos en los que todos los miembros de la familia let-7 producen respuestas similares. Por el contrario, hay algunas cribas en las que
imagen52
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Claims (17)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1.
    Una molécula de ácido nucleico de miARN sintético que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-10 humana madura para su uso como un medicamento.
  2. 2.
    Molécula de ácido nucleico de miARN sintético como se define en la reivindicación 1 para su uso en una terapia de un cáncer.
  3. 3.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 definido además como una molécula de ácido nucleico de entre 17 y 125 restos de longitud, que comprende:
     una región de miARN cuya secuencia de 5’ a 3’ es al menos 80 % idéntica a un miARN maduro de miR-10, y  una región complementaria cuya secuencia de 5’ a 3’ es entre 60 % y 100 % complementaria de la región de miARN.
  4. 4.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5’ a 3’ es al menos 85 % idéntica a una secuencia de miR-10 madura.
  5. 5.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5’ a 3’ es al menos 90 % idéntica a una secuencia de miR-10 madura.
  6. 6.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5’ a 3’ es idéntica a una secuencia de miR-10 madura.
  7. 7.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha secuencia de miR-10 es una secuencia de mir-10b
    o miR-10a.
  8. 8.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ácido nucleico está comprendido por dos polinucleótidos separados.
  9. 9.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ácido nucleico es una molécula en horquilla.
  10. 10.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, para administración a una célula o un paciente que tiene la célula identificada como que necesita una terapia de un cáncer.
  11. 11.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10 para su uso en una terapia para tratar cáncer de colon, cáncer de tiroides o leucemia.
  12. 12.
    Un ácido nucleico de miARN sintético bicatenario de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un primer polinucleótido que tiene una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de miR-10 madura que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 22-44 de SEC ID Nº: 20 y nucleótidos 27-48 de SEC ID Nº: 21, y un segundo polinucleótido separado cuya secuencia de 5’ a 3’ es entre 60 % y 100 % complementaria del primer polinucleótido para su uso como un medicamento.
  13. 13.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico es como se define adicionalmente en una cualquiera de las reinvidicaciones 2 a 7.
  14. 14.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13 que comprende además uno o más de los siguientes:
    i) un grupo de reemplazo para fosfato o hidroxilo del nucleótido en el extremo 5’ de la cadena complementaria de la molécula de ARN; ii) una o más modificaciones de azúcares en los primeros o últimos 1 a 7 restos de la región complementaria; o iii) no complementariedad entre uno o más nucleótidos en los últimos 1 a 5 restos en el extremo 3’ de la región complementaria y los nucleótidos correspondientes de la región de miARN.
  15. 15.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, que comprende i) al menos un nucleótido modificado que bloquea el 5’ OH o fosfato en el extremo 5’, en el que la al menos una modificación de nucleótido es una modificación de NH2, biotina, un grupo amina, un grupo de alquilamina
    211
    imagen2
    inferior, un grupo acetilo o 2’oxígeno-metilo(2’O-Me) o ii) al menos una modificación de ribosa seleccionada de 2’F, 2’ NH2, 2’N3, 4’tio o 2’ O-CH3.
  16. 16.
    Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 que es un polinucleótido bicatenario.
  17. 17.
    Uso de un ácido nucleico de miARN sintético como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para reducir o aumentar la viabilidad celular, o la proliferación celular, o inducir la apoptosis, con la condición de que los procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia estén excluidos.
    212
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