JP6492014B2 - 遺伝子発現制御のための人工マッチ型ｍｉＲＮＡおよびその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子発現を抑制する人工マッチ型ｍｉＲＮＡおよびその用途に関する。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子の発現を抑制する核酸分子として知られており、例えば、以下のような生成プロセスを経て、遺伝子がコードするタンパク質の転写を抑制すると報告されている。すなわち、まず、核内において、５’末端にキャップ構造、３’末端にポリ（Ａ）を有するｍｉＲＮＡ転写産物（Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ（Ｄｒｏｓｈａ）により切断され、ｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ループ領域とステム領域とを有するヘアピン構造をとる。このＰｒｅ−ｍｉＲＮＡは、核外に移動した後、細胞質のＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）により分解され、３’末端に１〜４塩基のオーバーハングを有する、二本鎖のｍｉＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）が切り出される。この二本鎖のｍｉＲＮＡのうち、一方の鎖は、ガイド鎖と呼ばれ、他方の鎖は、パッセンジャー鎖と呼ばれ、前記ガイド鎖が、ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）に類似した複合体に結合する。このｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体が、特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することによって、前記ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳が抑制される。
ｍｉＲＮＡは、分化、細胞増殖、アポトーシス等の生命現象やウイルス感染症，ガン等の多くの疾患に深く関わっていることが明らかになってきている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。このことから、特に医療分野における応用が期待されている。特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４のｍｉＲＮＡの標的遺伝子の発現が抑制されることによって、癌の治療が可能になるため、注目されている。
Deiters, 2009, The AAPS Journal, 12, 51-60
Takeshita et al., 2010, Mol. Ther., 18, 181-187
前記ｍｉＲＮＡを応用するにあたっては、例えば、二本鎖の成熟ｍｉＲＮＡを使用する方法等がある。しかし、この方法は、使用に先立って、二本の一本鎖核酸分子をアニーリングする必要があり、また、二本鎖を認識するＴＬＲ３等によって自己免疫を発生する可能性がある。
そこで、本発明は、ｍｉＲＮＡを利用した新たな人工マッチ型ｍｉＲＮＡの提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を介して連結し、
前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むことを特徴とする。
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を介して連結し、
前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むことを特徴とする。
本発明の組成物は、遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。
本発明の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。
本発明の発現抑制方法は、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。
本発明の疾患の治療方法は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記疾患が、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が関与する疾患であることを特徴とする。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
（１）人工マッチ型ｍｉＲＮＡ
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前述のように、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を介して連結し、
前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むことを特徴とする。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前述のように、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を介して連結し、
前記Ｘ領域は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含み、
前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むことを特徴とする。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の標的遺伝子の発現を抑制できる。発現抑制とは、例えば、前記標的遺伝子の翻訳の抑制、すなわち、前記標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制を意味し、より詳細には、前記標的遺伝子のｍＲＮＡからの前記タンパク質の翻訳の抑制を意味する。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、成熟ｍｉＲＮＡのように二本の一本鎖をアニーリングする必要もなく、安価に製造できる。さらに、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、一本鎖の核酸分子であるため、例えば、自己免疫に関与するＴＬＲ３、ＲＩＧ-Ｉ、ＭＤＡ５等に認識されることも回避できる。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおける前記Ｘ領域および前記Ｙ領域の配置関係の概略を、図１に示す。なお、図１は、概略であって、例えば、各領域の長さ、形状等は、制限されない。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、図１に示すように、５’側に前記Ｘ領域が配置され、３’側に前記Ｙ領域が配置され、前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造（図において「Ｐ」で表す）を介して連結している。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含むため、前記Ｘ領域と前記Ｙ領域とは、例えば、分子内アニーリングする。分子内アニーリングとは、例えば、自己アニーリングともいう。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前記分子内アニーリングした領域において、二本鎖が形成されるともいう。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、その５’末端と３’末端とが未連結である、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、両末端の未結合の維持のため、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｘ領域は、前述のように、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を含む。成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列は、例えば、各種データベースに登録されている（例えば、http://www.mirbase.org/等）。したがって、例えば、これらの公知の成熟ｍｉＲＮＡの情報に基づいて、前記Ｘ領域を設定できる。前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖とは、RNA-induced silencing complex（ＲＩＳＣ）のArgonaute（Ａｇｏ）タンパク質に取り込まれ、ターゲットのｍＲＮＡに結合する鎖である。
前記Ｘ領域は、例えば、前記ガイド鎖配列のみからなってもよいし、さらに付加配列を有してもよい。後者の場合、前記Ｘ領域は、例えば、前記ガイド鎖配列と前記付加配列とからなり、前記付加配列は、例えば、前記ガイド鎖配列の３’末端に連結している。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記Ｙ領域は、前記Ｘ領域と前記Ｙ領域とをアライメントした際、前記Ｘ領域と完全に相補な配列を含む。前記Ｙ領域は、例えば、前記Ｘ領域と完全に相補的な配列のみからなってもよいし、前記相補的な配列の他に、さらにオーバーハングを有してもよい。すなわち、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした際に、前記Ｙ領域が、３’末端にオーバーハングを有してもよい。ここで、前記Ｙ領域のオーバーハングとは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域とをアライメントした場合に、前記Ｙ領域が前記Ｘ領域よりも過剰に有する末端の塩基である。オーバーハングの長さ（Ｏ）は、例えば、下記式で表すことができる。
オーバーハングの長さ（Ｏ）＝［Ｙ領域の全長の塩基数（Ｙ）］−［Ｘ領域の全長の塩基数（Ｘ）］
オーバーハングの長さ（Ｏ）＝［Ｙ領域の全長の塩基数（Ｙ）］−［Ｘ領域の全長の塩基数（Ｘ）］
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、各領域の長さは、特に制限されない。以下に、条件を例示するが、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、これらの記載には限定されない。また、本発明において、塩基の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
前記Ｘ領域において、前記ガイド鎖配列の長さは、特に制限されず、例えば、報告されている成熟ｍｉＲＮＡにおけるガイド鎖配列の長さが例示できる。具体例として、下限が、例えば、１９塩基長、２０塩基長であり、上限が、例えば、２５塩基長、２４塩基長であり、範囲が、例えば、１９〜２５塩基長、２０〜２４塩基長である。
前記Ｘ領域が前記付加配列を有する場合、前記付加配列の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、０塩基長、１塩基長、２塩基長であり、上限が、例えば、５塩基長、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、０〜５塩基長、１〜４塩基長、２〜３塩基長である。
前記Ｘ領域の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、１９塩基長、２１塩基長、２３塩基長であり、上限が、例えば、３３塩基長、３０塩基長、２８塩基長、２６塩基長であり、範囲が、例えば、１９〜３３塩基長、１９〜３０塩基長、２１〜２８塩基長、２３〜２６塩基長である。
前記Ｙ領域が前記オーバーハングを有する場合、前記オーバーハングの長さは、特に制限されず、下限が、例えば、０塩基長、１塩基長であり、上限が、例えば、４塩基長、３塩基長であり、範囲が、例えば、０〜４塩基長、１〜３塩基長、２塩基長である。
前記オーバーハングの配列は、特に制限されず、例えば、３’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ等が例示できる。前記オーバーハングは、例えば、ＴＴとすることで、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性を付加できる。
前記Ｙ領域の長さは、特に制限されず、下限が、例えば、１９塩基長、２１塩基長、２３塩基長であり、上限が、例えば、３５塩基長、３２塩基長、３０塩基長、２８塩基長であり、範囲が、例えば、１９〜３５塩基長、２１〜３５塩基長、１９〜３２塩基長、２１〜３０塩基長、２３〜２８塩基長である。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの全長（Ｔ）は、特に制限されず、下限が、例えば、３８塩基長、４２塩基長、４６塩基長であり、上限が、例えば、６２塩基長、５８塩基長、５４塩基長であり、範囲が、例えば、３８〜６２塩基長、４２〜５８塩基長、４６〜５４塩基長である。
前記成熟ｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４としてｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１）の成熟ｍｉＲＮＡでよい。
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１）
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号１）
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖は、例えば、ＡＸＬ、ＭＥＴ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＳＩＲＴ１、ＣＣＮＤ１、ＳＩＲＴ１、ＢＣＬ−２等をターゲットとし、これらの標的遺伝子の発現抑制により、例えば、がん（肺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、乳がん等）等の疾患を予防または治療できる。前記成熟ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａの場合、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡのポリヌクレオチドは、例えば、配列番号５（Ｘ領域）および２４（Ｙ領域）、配列番号１３（Ｘ領域）および２６（Ｙ領域）、配列番号１４（Ｘ領域）および２７（Ｙ領域）、配列番号１５（Ｘ領域）および２８（Ｙ領域）、配列番号１６（Ｘ領域）および２９（Ｙ領域）、配列番号１７（Ｘ領域）および３０（Ｙ領域）、配列番号１８（Ｘ領域）および３１（Ｙ領域）、配列番号１９（Ｘ領域）および３２（Ｙ領域）、配列番号２０（Ｘ領域）および３３（Ｙ領域）、配列番号２１（Ｘ領域）および３４（Ｙ領域）、配列番号２２（Ｘ領域）および３５（Ｙ領域）、ならびに配列番号２３（Ｘ領域）および３６（Ｙ領域）からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列があげられる。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１個もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、具体的には、例えば、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。前記代替物は、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等があげられる。
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡにおいて、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記非ヌクレオチド構造に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記非ヌクレオチド構造に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記非ヌクレオチド構造の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記非ヌクレオチド構造に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記非ヌクレオチド構造は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
前記Ｘ領域および前記Ｙ領域と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記Ｘ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記Ｘ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（１）
前記Ｘ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記Ｘ領域は、−ＯＲ１−を介して、前記Ｙ領域は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記式（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記式（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記式（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−８ａ）に示す。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡが、例えば、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を有する場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記疾患は、特に制限されず、例えば、目的の疾患に応じて前記発現抑制配列を適宜設定できる。前記疾患としては、例えば、がん（乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん）があげられる。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを投与すればよい。
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの合成方法は、特に制限されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
（２）組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の前記成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖配列を選択すればよい。
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを投与すればよい。
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
本発明の組成物は、例えば、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡのみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
本発明の組成物において、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを効率よくデリバリーすることができる。
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。
（３）発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の発現抑制方法において、前記標的遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、成熟ｍｉＲＮＡによる発現抑制があげられる。
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを単独で投与してもよいし、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
（４）治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記疾患が、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が関与する疾患であることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、患者に投与する工程を含み、前記疾患が、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が関与する疾患であることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
（５）人工マッチ型ｍｉＲＮＡの使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの使用である。
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡの使用である。
本発明の一本鎖核酸は、疾患の治療に使用するための一本鎖核酸であって、前記一本鎖核酸は、前記本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡであり、前記疾患が、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４の成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が関与する疾患であることを特徴とする。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
成熟ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖に基づいて、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを合成し、Ｈ１２９９細胞の増殖の抑制を確認した。
成熟ｍｉＲ−３４ａのガイド鎖に基づいて、本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡを合成し、Ｈ１２９９細胞の増殖の抑制を確認した。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号１）およびパッセンジャー鎖（配列番号２）からなるヒト成熟ｍｉＲ−３４ａを合成した。また、ネガティブコントロールとして、前記ガイド鎖の塩基組成をスクランブルにしたガイド鎖スクランブル（配列番号３）とそれに対するパッセンジャー鎖（配列番号４）とからなる成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブルを合成した。
ポジティブコントロールのｍｉＲＮＡとして、以下に示すガイド鎖（配列番号１）およびパッセンジャー鎖（配列番号２）からなるヒト成熟ｍｉＲ−３４ａを合成した。また、ネガティブコントロールとして、前記ガイド鎖の塩基組成をスクランブルにしたガイド鎖スクランブル（配列番号３）とそれに対するパッセンジャー鎖（配列番号４）とからなる成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブルを合成した。
実施例の人工マッチ型ｍｉＲＮＡとして、前記ガイド鎖（配列番号１）と付加配列とからなるＸ領域と、前記Ｘ領域に完全に相補的な配列とオーバーハングとからなるＹ領域とが、下記式のプロリン誘導体の非ヌクレオチド構造（配列において［P］で表す）を介して連結しているマッチ型ｍｉＲ−３４ａを合成した。下記配列において、下線部が、前記ガイド鎖に対応する。前記マッチ型ｍｉＲＮＡにおける前記非ヌクレオチド構造は、下記式で表され、前記マッチ型ｍｉＲＮＡの合成において、Ｌ−プロリンジアミドアミダイト（ＷＯ２０１２／０１７９１９参照）を使用することにより導入した。また、人工マッチ型ｍｉＲＮＡに対するネガティブコントロールとして、前記ガイド鎖の塩基組成をスクランブルにしたガイド鎖とそれに対応するパッセンジャー鎖とからなるマッチ型ｍｉＲ−３４ａスクランブルを合成した。
これらのｍｉＲＮＡの配列及び構造を、以下に示す。下記において、下線部で示す配列が、ガイド鎖に相当する。
成熟ｍｉＲ−３４ａ
ガイド鎖（配列番号１）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’
パッセンジャー鎖（配列番号２）
5’-CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU-3’
成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブル
ガイド鎖（配列番号３）
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUG-3’
パッセンジャー鎖（配列番号４）
5’-CAACCGACCCGAUAACGAUACA-3’
マッチ型ｍｉＲ−３４ａ（Ｘ領域は配列番号５、Ｙ領域は配列番号２４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-［P］-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCAUA-3’
マッチ型ｍｉＲ−３４ａスクランブル（Ｘ領域は配列番号６、Ｙ領域は配列番号２５）
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUGUCC-［P］-GGACAACCGACCCGAUAACGAUACAUA-3’
成熟ｍｉＲ−３４ａ
ガイド鎖（配列番号１）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’
パッセンジャー鎖（配列番号２）
5’-CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU-3’
成熟ｍｉＲ−３４ａスクランブル
ガイド鎖（配列番号３）
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUG-3’
パッセンジャー鎖（配列番号４）
5’-CAACCGACCCGAUAACGAUACA-3’
マッチ型ｍｉＲ−３４ａ（Ｘ領域は配列番号５、Ｙ領域は配列番号２４）
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-［P］-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCAUA-3’
マッチ型ｍｉＲ−３４ａスクランブル（Ｘ領域は配列番号６、Ｙ領域は配列番号２５）
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUGUCC-［P］-GGACAACCGACCCGAUAACGAUACAUA-3’
（２）肺がん由来細胞に対する人工マッチ型ｍｉＲＮＡの影響
前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、ヒト非小細胞性肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１２９９）に導入し、前記細胞への影響を確認した。
前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、ヒト非小細胞性肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１２９９）に導入し、前記細胞への影響を確認した。
（２−１）トランスフェクション
前記ｍｉＲＮＡを、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）で溶解し、１００μｍｏｌ／ＬのｍｉＲＮＡ溶液を調製した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
前記ｍｉＲＮＡを、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）で溶解し、１００μｍｏｌ／ＬのｍｉＲＮＡ溶液を調製した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、５００μＬずつ、１×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記ｍｉＲＮＡをトランスフェクション試薬ＲＮＡｉ ＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。トランスフェクションは、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定した。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、（Ｃ）は、前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて４９μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ｍｉＲＮＡの最終濃度は、１００ｎｍｏｌ／Ｌとした。トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を３日間培養した。そして、前記３日間の培養後、培養細胞について、以下に示す確認を行った。
（２−２）細胞数のカウント
培養後の培養細胞について、ウェルあたりの細胞数をカウントした。この結果を、図２に示す。図２は、ウェルあたりの細胞数を示すグラフである。図２において、「Normal」は、未処理の細胞、「Mock」は、トランスフェクション試薬のみを導入した細胞、「Scramble」は、ネガティブコントロールのｍｉＲ−３４ａスクランブル、「miR-34a」は、ポジティブコントロールの成熟ｍｉＲ−３４ａ、「Scramble match」は、ネガティブコントロールのマッチ型ｍｉＲ−３４ａスクランブル、「miR-34a match」は、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａの結果を示す（以下、同様）。図２に示すように、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは最も細胞数を減少できた。
培養後の培養細胞について、ウェルあたりの細胞数をカウントした。この結果を、図２に示す。図２は、ウェルあたりの細胞数を示すグラフである。図２において、「Normal」は、未処理の細胞、「Mock」は、トランスフェクション試薬のみを導入した細胞、「Scramble」は、ネガティブコントロールのｍｉＲ−３４ａスクランブル、「miR-34a」は、ポジティブコントロールの成熟ｍｉＲ−３４ａ、「Scramble match」は、ネガティブコントロールのマッチ型ｍｉＲ−３４ａスクランブル、「miR-34a match」は、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａの結果を示す（以下、同様）。図２に示すように、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは最も細胞数を減少できた。
（２−３）ＭＴＴアッセイ
培養後の培養細胞について、市販の試薬キット（商品名 Cell Count Reagent SF、ナカライテスク社）を用いてＭＴＴアッセイを行い、細胞増殖を評価した。細胞増殖の評価は、Ｎｏｒｍａｌ（無処置）の結果を１として、相対値により表した。この結果を、図３に示す。図３は、細胞増殖の相対値を示すグラフである。図３に示すように、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは最も細胞数を減少できた。
培養後の培養細胞について、市販の試薬キット（商品名 Cell Count Reagent SF、ナカライテスク社）を用いてＭＴＴアッセイを行い、細胞増殖を評価した。細胞増殖の評価は、Ｎｏｒｍａｌ（無処置）の結果を１として、相対値により表した。この結果を、図３に示す。図３は、細胞増殖の相対値を示すグラフである。図３に示すように、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは最も細胞数を減少できた。
（２−４）アポトーシス
培養後の培養細胞について、市販の試薬キット（商品名Annexin V:PE Apoptosis Detection Kit、BD Biosciences社）を用いてアポトーシスの検出を行った。この結果を、図４に示す。図４は、早期アポトーシス（％）と後期アポトーシス（％）とを示すグラフである。図４に示すように、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは最もアポトーシスを亢進できた。
培養後の培養細胞について、市販の試薬キット（商品名Annexin V:PE Apoptosis Detection Kit、BD Biosciences社）を用いてアポトーシスの検出を行った。この結果を、図４に示す。図４は、早期アポトーシス（％）と後期アポトーシス（％）とを示すグラフである。図４に示すように、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは最もアポトーシスを亢進できた。
（２−５）ｍＲＮＡの発現抑制
培養後の培養細胞について、ＩＳＯＧＥＮ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、ニッポンジーン）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。
培養後の培養細胞について、ＩＳＯＧＥＮ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、ニッポンジーン）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。
次に、逆転写酵素（商品名Ｍ−ＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行い、ＡＸＬ ｃＤＮＡの量およびＭＥＴ ｃＤＮＡの量を測定した。また、ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを内部コントロールとし、そのｃＤＮＡの量をあわせて測定した。
前記定量ＰＣＲは、試薬として、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、サーモサイクラーとしてＭＸ３０００Ｐ（商品名、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、解析機器としてＭｘＰｒｏ（商品名、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＡＸＬ ｃＤＮＡ、前記ＭＥＴ ｃＤＮＡおよび前記ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡの増幅には、それぞれ、下記プライマーセットを使用した。反応液の全量は２５μＬとして、それぞれ３回測定した。
AXL プライマーセット
5’-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3’ （配列番号７）
5’-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3’ （配列番号８）
MET プライマーセット
5’-CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3’ （配列番号９）
5’-TGTCCAACAAAGTCCCATGA-3’ （配列番号１０）
GAPDH プライマーセット
5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’ （配列番号１１）
5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ （配列番号１２）
5’-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3’ （配列番号７）
5’-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3’ （配列番号８）
MET プライマーセット
5’-CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3’ （配列番号９）
5’-TGTCCAACAAAGTCCCATGA-3’ （配列番号１０）
GAPDH プライマーセット
5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’ （配列番号１１）
5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ （配列番号１２）
そして、ｍｉＲＮＡ未添加のコントールにおけるＡＸＬ ｍＲＮＡまたはＭＥＴ ｍＲＮＡを１とした場合における、各トランスフェクション細胞でのＡＸＬ ｍＲＮＡおよびＭＥＴ ｍＲＮＡの相対値を算出した。これらの結果を、図５に示す。図５（Ａ）は、ＡＸＬ ｍＲＮＡの結果、図５（Ｂ）は、ＭＥＴ ｍＲＮＡの結果である。
図５に示すように、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは、ポジティブコントロールの成熟ｍｉＲ−３４ａと同程度に、ＡＸＬ ｍＲＮＡの量が減少した。また、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは最もＭＥＴ ｍＲＮＡの量が減少した。このため、前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡにより、ＡＸＬ ｍＲＮＡおよびＭＥＴ ｍＲＮＡがそれぞれコードするタンパク質の転写も、抑制されているといえる。
これらの結果から、実施例のマッチ型ｍｉＲ−３４ａは、ＡＸＬ ｍＲＮＡおよびＭＥＴ ｍＲＮＡ等の発現を抑制し、Ｈ１２９９細胞の増殖の抑制およびアポトーシスの亢進を可能とすることがわかった。
前記人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、二本鎖の成熟ｍｉＲ−３４ａとは異なり、一本鎖の核酸分子であるため、使用時に各一本鎖をアニーリングする必要がなく、また、自然免疫に関与するＴＬＲ３等に認識されることも回避できる。
（実施例２）
実施例１のマッチ型ｍｉＲ−３４ａについて、Ｘ領域の付加配列およびＹ領域のオーバーハングの短縮化を行った。
実施例１のマッチ型ｍｉＲ−３４ａについて、Ｘ領域の付加配列およびＹ領域のオーバーハングの短縮化を行った。
（１）ｍｉＲＮＡの合成
以下に示すように、マッチ型ｍｉＲ−３４ａは、Ｘ領域の３’側に四角で囲んだ３塩基長の付加配列（Ｊ）を有し、Ｙ領域の５’側に四角で囲んだ２塩基長のオーバーハング（Ｏ）を有している。そこで、前記付加配列を３’側から１塩基ずつ欠失させ且つそれに対応するＹ領域側の配列を５’側から１塩基ずつ欠失させた分子、オーバーハングを３’側から１塩基ずつ欠失させた分子、および、前記付加配列とオーバーハングとを１塩基ずつ欠失させた分子を合成し、前記実施例１と同様にして、ＡＸＬ ｍＲＮＡおよびＭＥＴ ｍＲＮＡの発現抑制を確認した。下記配列において、［Ｐ］の５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、その他が、前記付加配列であり、［Ｐ］の３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、四角で囲んだ領域がオーバーハングである。
以下に示すように、マッチ型ｍｉＲ−３４ａは、Ｘ領域の３’側に四角で囲んだ３塩基長の付加配列（Ｊ）を有し、Ｙ領域の５’側に四角で囲んだ２塩基長のオーバーハング（Ｏ）を有している。そこで、前記付加配列を３’側から１塩基ずつ欠失させ且つそれに対応するＹ領域側の配列を５’側から１塩基ずつ欠失させた分子、オーバーハングを３’側から１塩基ずつ欠失させた分子、および、前記付加配列とオーバーハングとを１塩基ずつ欠失させた分子を合成し、前記実施例１と同様にして、ＡＸＬ ｍＲＮＡおよびＭＥＴ ｍＲＮＡの発現抑制を確認した。下記配列において、［Ｐ］の５’側領域がＸ領域であり、前記Ｘ領域において、下線部は前記ガイド鎖配列であり、その他が、前記付加配列であり、［Ｐ］の３’側領域がＹ領域であり、前記Ｙ領域において、四角で囲んだ領域がオーバーハングである。
これらの結果を、図６および図７に示す。図６は、ＡＸＬ ｍＲＮＡの結果であり、図７は、ＭＥＴ ｍＲＮＡの結果である。図６および図７に示すように、前記Ｘ領域における付加配列および前記Ｙ領域におけるオーバーハングを短縮させても、発現抑制の効果は維持された。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡによれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。本発明の人工マッチ型ｍｉＲＮＡは、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
本出願は、日本で出願された特願２０１３−２７３０３４（出願日：２０１３年１２月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
本出願は、日本で出願された特願２０１３−２７３０３４（出願日：２０１３年１２月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (6)
- 標的遺伝子の発現抑制剤であって、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、下記式
で表わされる非ヌクレオチド構造を介して連結し、
前記Ｘ領域は、配列番号５で表される塩基配列からなり、
前記Ｙ領域は、配列番号２４で表される塩基配列からなり、
前記標的遺伝子は、ＡＸＬ、ＭＥＴ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＳＩＲＴ１、ＣＣＮＤ１、ＳＩＲＴ１およびＢＣＬ−２からなる群より選択される遺伝子である、
人工マッチ型ｍｉＲＮＡを含有する、発現抑制剤。 - 細胞、組織または器官に投与される、請求項１に記載の発現抑制剤。
- ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与される、請求項１または２に記載の発現抑制剤。
- 非ヒト動物に投与される、請求項１または２に発現抑制剤。
- 非ヒト動物のがんの治療方法であって、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、下記式
で表わされる非ヌクレオチド構造を介して連結し、
前記Ｘ領域は、配列番号５で表される塩基配列からなり、
前記Ｙ領域は、配列番号２４で表される塩基配列からなることを特徴とする人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、対象に投与する工程を含み、
前記がんが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４aの成熟ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が関与するがんであることを特徴とする、治療方法。 - 標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
Ｘ領域とＹ領域とを有する一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域の３’末端と前記Ｙ領域の５’末端とが、下記式
で表わされる非ヌクレオチド構造を介して連結し、
前記Ｘ領域は、配列番号５で表される塩基配列からなり、
前記Ｙ領域は、配列番号２４で表される塩基配列からなり、
前記標的遺伝子は、ＡＸＬ、ＭＥＴ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＳＩＲＴ１、ＣＣＮＤ１、ＳＩＲＴ１およびＢＣＬ−２からなる群より選択される遺伝子である、
人工マッチ型ｍｉＲＮＡを、対象にｉｎ ｖｉｔｒｏで投与することを含む、方法。
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