KR101849801B1 - 함질소 지환식 골격을 갖는 일본쇄 핵산 분자 - Google Patents

함질소 지환식 골격을 갖는 일본쇄 핵산 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 용이하고 효율이 좋은 제조 방법이 가능하고, 유전자의 발현을 억제 가능한 새로운 핵산 분자의 제공을 목적으로 한다. 표적 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 서열을 포함하는 일본쇄 핵산 분자로서, 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)을 포함하고, 상기 영역(Xc)과 상기 영역(Xc) 사이에, 상기 링커 영역(Lx)이 연결되며, 상기 영역(Xc)이, 상기 영역(X)과 상보적이고, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중 적어도 한쪽이, 상기 발현 억제 서열을 포함하며, 상기 링커 영역(Lx)이, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 분자로 한다. 이 일본쇄 핵산 분자에 의하면, 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

Description

함질소 지환식 골격을 갖는 일본쇄 핵산 분자{SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID MOLECULE HAVING NITROGEN-CONTAINING ALICYCLIC SKELETON}
본 발명은 유전자 발현을 억제하는 일본쇄 핵산 분자에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 함질소 지환식 골격을 갖는 일본쇄 핵산 분자, 그것을 포함하는 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.
유전자의 발현을 억제하는 기술로서, 예컨대, RNA 간섭(RNAi)이 알려져 있다(비특허문헌 1). RNA 간섭에 의한 유전자의 발현 억제는, 예컨대, 짧은 이본쇄의 RNA 분자를 세포 등에 투여함으로써, 실시되는 것이 일반적이다. 상기 이본쇄의 RNA 분자는, 통상, siRNA(small interfering RNA)로 불린다. 이 외에, 환형의 RNA 분자로서, 분자 내 어닐링에 의해, 부분적으로 이중쇄를 형성한 RNA 분자에 의해서도, 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것이 보고되어 있다(특허문헌 1). 그러나, 이들 방법에서는, 유전자의 발현 억제를 유도하는 RNA 분자는, 이하와 같은 문제가 있다.
우선, 상기 siRNA를 제조하는 경우, 센스쇄 및 안티센스쇄를 따로따로 합성한 뒤에, 마지막에 이들 쇄를 하이브리다이즈하는 공정이 필요하다. 이 때문에, 제조 효율이 나쁘다고 하는 문제가 있다. 또한, 상기 siRNA를 세포에 투여할 때, 일본쇄 RNA로의 해리를 억제한 상태로, 세포에 투여할 필요가 있기 때문에, 그 취급 조건의 설정에도 수고를 요한다. 다음에, 환형의 RNA 분자의 경우, 그 합성이 곤란하다고 하는 문제가 있다.
또한, 이들 RNA 분자는, 기본적으로 뉴클레오티드 잔기로 구성되어 있다. 그리고, 상기 RNA 분자에, 어떠한 기능이나 표지를 부여하는 경우, 예컨대, 뉴클레오티드 잔기의 구성 요소인, 염기, 당 잔기 또는 인산기에 수식을 실시할 수밖에 없는 것이 현재 상황이다. 이 때문에, RNA 간섭을 이용한 의약품 등의 개발에 있어서, 유전자 발현의 억제 기능을 유지한 상태에서, 추가적인 기능이나 표지를 부여하기 위한 개변이, 매우 곤란하다.
[비특허문헌]
비특허문헌 1: Fire 등, Nature, 1998 Feb 19; 391(6669): 806-11
[특허문헌]
특허문헌 1: 미국 공개 공보 2004-058886
그래서, 본 발명은 용이하고 효율이 좋은 제조 방법이 가능하고, 유전자의 발현을 억제 가능한 새로운 핵산 분자의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 핵산 분자는, 표적 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 서열을 포함하는 일본쇄 핵산 분자로서, 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)을 포함하고, 상기 영역(X)과 상기 영역(Xc) 사이에, 상기 링커 영역(Lx)이 연결되며, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중 적어도 한쪽이, 상기 발현 억제 서열을 포함하고, 상기 링커 영역(Lx)이, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물로서, 상기 본 발명의 일본쇄 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은, 약학적 조성물로서, 상기 본 발명의 일본쇄 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발현 억제 방법은, 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 본 발명의 일본쇄 핵산 분자를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 질환의 치료 방법은, 상기 본 발명의 일본쇄 핵산 분자를, 환자에게 투여하는 공정을 포함하고, 상기 일본쇄 핵산 분자가, 상기 발현 억제 서열로서, 상기 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일본쇄 핵산 분자는, 유전자의 발현 억제가 가능하고, 또한, 환형이 아니기 때문에, 그 합성이 용이하며, 또한, 일본쇄이기 때문에, 이본쇄의 어닐링 공정이 없어, 효율적으로 제조 가능하다. 또한, 상기 링커 영역이 상기 비뉴클레오티드 잔기를 포함하기 때문에, 예컨대, 종래와 같은 뉴클레오티드 잔기의 개변에 한정되지 않고, 예컨대, 상기 링커 영역에 있어서의 수식 등의 개변도 가능해진다.
또한, 본 발명의 일본쇄 핵산 분자의 구조가, 유전자의 발현을 억제 가능한 것을 발견한 것은, 본 발명자가 처음이다. 본 발명의 일본쇄 핵산 분자의 유전자의 발현 억제 효과는, RNA 간섭과 동일한 현상에 의한 것으로 추측되지만, 본 발명에 있어서의 유전자 발현 억제는, RNA 간섭에 제한 및 한정되지 않는다.
도 1은 본 발명의 일본쇄 핵산 분자의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일본쇄 핵산 분자의 그 외의 예를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일본쇄 핵산 분자의 그 외의 예를 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 있어서의 안정성을 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 있어서의 ssRNA에 대한 다이서 단백질의 반응성을 나타내는 전기 영동의 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 있어서의 A549 세포의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 있어서의 293 세포의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 있어서의 HCT116 세포의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 있어서의 HCT116 세포의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 있어서의 TGF-β1 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 있어서의 각 투여군에 있어서의 단위 중량의 폐당의 TGF-β1 유전자 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 14(A)는 본 발명의 실시예에 있어서의 각 투여군의 BALF 샘플 중의 TNF-α량을 나타내는 그래프이고, 도 14(B)는 본 발명의 실시예에 있어서의 각 투여군의 BALF 샘플 중의 IFN-β량을 나타내는 그래프이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 있어서의 리보뉴클레아제 내성을 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 16은 본 발명의 실시예에 있어서의 S7 뉴클레아제 내성을 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 17은 참고예에서 사용한 ssRNA를 나타내는 도면이다.
도 18은 참고예에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 19는 참고예에 있어서의 TGF-β1 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 20은 참고예에 있어서의 LAMA 유전자의 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 21은 참고예에 있어서의 LMNA 유전자의 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 22는 참고예에서 사용한 ssRNA를 나타내는 도면이다.
도 23은 참고예에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
본 명세서에서 사용하는 용어는, 특별히 언급하지 않는 한, 해당 기술 분야에서 통상 이용되는 의미로 이용할 수 있다.
1. ssPN 분자
본 발명의 일본쇄 핵산 분자는, 전술한 바와 같이, 표적 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 서열을 포함하는 일본쇄 핵산 분자로서, 영역(X), 링커 영역(Lx) 및 영역(Xc)을 포함하고, 상기 영역(X)과 상기 영역(Xc) 사이에, 상기 링커 영역(Lx)이 연결되며, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중 적어도 한쪽이, 상기 발현 억제 서열을 포함하고, 상기 링커 영역(Lx)이, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 「표적 유전자의 발현 억제」는, 예컨대, 상기 표적 유전자의 발현을 저해하는 것을 의미한다. 상기 억제의 메커니즘은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 다운레귤레이션 또는 사일런싱이어도 좋다. 상기 표적 유전자의 발현 억제는, 예컨대, 상기 표적 유전자로부터의 전사 산물의 생성량의 감소, 상기 전사 산물의 활성의 감소, 상기 표적 유전자로부터의 번역 산물의 생성량의 감소, 또는 상기 번역 산물의 활성의 감소 등에 의해 확인할 수 있다. 상기 단백질은, 예컨대, 성숙 단백질, 또는, 프로세싱 혹은 번역 후 수식을 받기 전의 전구체 단백질 등을 들 수 있다.
본 발명의 일본쇄 핵산 분자는, 이하, 본 발명의 「ssPN 분자」라고도 한다. 본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)에 있어서, 표적 유전자의 발현 억제에 사용할 수 있기 때문에, 「표적 유전자의 발현 억제용 ssPN 분자」 또는 「표적 유전자의 발현 억제제」라고도 한다. 또한, 본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, RNA 간섭에 의해, 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에, 「RNA 간섭용 ssNP 분자」, 「RNA 간섭 유도용 ssPN 분자」 또는 「RNA 간섭제 혹은 RNA 간섭 유도제」라고도 한다. 또한, 본 발명은, 예컨대, 인터페론 유도 등의 부작용을 억제할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 그 5' 말단과 3' 말단이 미연결이며, 선형 일본쇄 핵산 분자라고도 할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상기 발현 억제 서열은, 예컨대, 본 발명의 ssPN 분자가, 생체내 또는 시험관내에서 세포 내로 도입된 경우에, 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 나타내는 서열이다. 상기 발현 억제 서열은, 특별히 제한되지 않고, 원하는 표적 유전자의 종류에 따라, 적절하게 설정할 수 있다. 상기 발현 억제 서열은, 예컨대, siRNA에 의한 RNA 간섭에 관여하는 서열을 적절하게 적용할 수 있다. RNA 간섭은, 일반적으로, 긴 이본쇄 RNA(dsRNA)가, 세포 내에 있어서, 다이서(Dicer)에 의해, 3' 말단이 돌출한 19∼21 염기쌍 정도의 이본쇄 RNA(siRNA: small interfering RNA)로 절단되고, 그 한쪽의 일본쇄 RNA가 표적 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA를 분해함으로써, 상기 mRNA의 번역을 억제하는 현상이다. 상기 표적 mRNA에 결합하는 상기 siRNA에 있어서의 일본쇄 RNA의 서열은, 예컨대, 표적 유전자의 종류에 따라 여러가지 종류가 보고되어 있다. 본 발명은, 예컨대, 상기 siRNA의 일본쇄 RNA의 서열을, 상기 발현 억제 서열로서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 표적 유전자에 대한 상기 발현 억제 서열의 서열 정보가 포인트가 아니라, 상기 발현 억제 서열에 따른 상기 표적 유전자의 발현 억제 활성을, 예컨대, 세포 내에서 기능시키기 위한 핵산 분자의 구조에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 예컨대, 출원 시에 있어서 공지로 되어 있는 상기 siRNA의 일본쇄 RNA 서열 외에, 장래적으로 밝혀질 서열에 관해서도, 상기 발현 억제 서열로서 이용할 수 있다.
상기 발현 억제 서열은, 예컨대, 상기 표적 유전자의 소정 영역에 대하여, 90％ 이상의 상보성을 가지고 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 95％이며, 더욱 바람직하게는 98％이고, 특히 바람직하게는 100％이다. 이러한 상보성을 만족시킴으로써, 예컨대, 오프 타겟을 충분히 경감할 수 있다.
구체예로서, 표적 유전자가 GAPDH 유전자인 경우, 상기 발현 억제 서열은, 예컨대, 서열번호 4로 나타내는 19 염기 길이의 서열을 사용할 수 있고, 표적 유전자가 TGF-β1인 경우, 상기 발현 억제 서열은, 예컨대, 서열번호 18로 나타내는 21 염기 길이의 서열을 사용할 수 있으며, 표적 유전자가 LAMA1 유전자인 경우, 상기 발현 억제 서열은, 예컨대, 서열번호 6으로 나타내는 19 염기 길이의 서열을 사용할 수 있고, 표적 유전자가 LMNA 유전자인 경우, 예컨대, 서열번호 30으로 나타내는 19 염기 길이의 서열을 사용할 수 있다.
Figure 112013016609314-pct00001
본 발명의 ssPN 분자에 의한 상기 표적 유전자의 발현의 억제는, 예컨대, RNA 간섭이 생기는 것에 의한 것으로 추측된다. 또한, 본 발명은, 이 메커니즘에 의해 한정되지 않는다. 본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 소위 siRNA와 같이, 두개의 일본쇄 RNA로 이루어지는 dsRNA로서, 세포 등에 도입하는 것이 아니며, 또한, 세포 내에 있어서, 상기 발현 억제 서열의 절출은, 반드시 필수적이지 않다. 이 때문에, 본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, RNA 간섭 유사의 기능을 갖는다고 할 수도 있다.
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)은, 예컨대, 상기 피롤리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 가져도 좋고, 상기 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 가져도 좋으며, 상기 피롤리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조와, 상기 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조의 양방을 가져도 좋다. 본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 생체 내에 있어서의 인터페론 유도 등의 부작용을 억제할 수 있고, 뉴클레아제 내성이 우수하다.
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상기 피롤리딘 골격은, 예컨대, 피롤리딘의 5원환을 구성하는 탄소가, 1개 이상, 치환된 피롤리딘 유도체의 골격이어도 좋고, 치환되는 경우, 예컨대, C-2의 탄소 이외의 탄소 원자인 것이 바람직하다. 상기 탄소는, 예컨대, 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 좋다. 상기 피롤리딘 골격은, 예컨대, 피롤리딘의 5원환 내에, 예컨대, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함하여도 좋다. 상기 피롤리딘 골격에 있어서, 피롤리딘의 5원환을 구성하는 탄소 및 질소는, 예컨대, 수소가 결합하여도 좋고, 후술하는 것 같은 치환기가 결합하여도 좋다. 상기 링커 영역(Lx)은, 예컨대, 상기 피롤리딘 골격 중 어느 하나의 기를 개재하여, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc)과 결합하여도 좋고, 바람직하게는, 상기 5원환 중 어느 1개의 탄소 원자와 질소이며, 바람직하게는, 상기 5원환의 2위의 탄소(C-2)와 질소이다. 상기 피롤리딘 골격으로서는, 예컨대, 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등을 들 수 있다. 상기 프롤린 골격 및 프롤리놀 골격 등은, 예컨대, 생체내 물질 및 그 환원체이기 때문에, 안전성도 우수하다.
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상기 피페리딘 골격은, 예컨대, 피페리딘의 6원환을 구성하는 탄소가, 1개 이상, 치환된 피페리딘 유도체의 골격이어도 좋고, 치환되는 경우, 예컨대, C-2의 탄소 이외의 탄소 원자인 것이 바람직하다. 상기 탄소는, 예컨대, 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 좋다. 상기 피페리딘 골격은, 예컨대, 피페리딘의 6원환 내에, 예컨대, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함하여도 좋다. 상기 피페리딘 골격에 있어서, 피페리딘의 6원환을 구성하는 탄소 및 질소는, 예컨대, 수소기가 결합하여도 좋고, 후술하는 것 같은 치환기가 결합하여도 좋다. 상기 링커 영역(Lx)은, 예컨대, 상기 피페리딘 골격 중 어느 하나의 기를 개재하여, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc)과 결합하여도 좋고, 바람직하게는, 상기 6원환 중 어느 1개의 탄소 원자와 질소이며, 바람직하게는, 상기 6원환의 2위의 탄소(C-2)와 질소이다.
상기 링커 영역은, 예컨대, 상기 비뉴클레오티드 구조로 이루어지는 비뉴클레오티드 잔기만을 포함하여도 좋고, 상기 비뉴클레오티드 구조로 이루어지는 비뉴클레오티드 잔기와, 뉴클레오티드 잔기를 포함하여도 좋다.
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역은, 예컨대, 하기 식 (I)로 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00002
상기 식 (I) 중, 예컨대,
X1 및 X2는, 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH이고;
Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S이며;
R3은, 고리 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이고,
L1은, n개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이며, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 혹은 SRa로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
L1은, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가, 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
단, Y1이, NH, O 또는 S인 경우, Y1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이고, OR1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고;
L2는, m개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이며, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 혹은 SRc로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
L2는, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가, 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
단, Y2가, NH, O 또는 S인 경우, Y2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이고, OR2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고;
Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이며;
l은, 1 또는 2이고;
m은, 0∼30의 범위의 정수이며;
n은, 0∼30의 범위의 정수이고;
고리 A는, 상기 고리 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가, 질소, 산소, 황으로 치환되어도 좋으며,
상기 고리 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함하여도 좋고,
상기 영역(Yc) 및 상기 영역(Y)은, 각각, -OR1- 또는 -OR2-를 개재하여, 상기 링커 영역(Ly)에 결합하며,
여기서, R1 및 R2는, 존재하여도 존재하지 않아도 좋고, 존재하는 경우, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조 (I)이다.
상기 식 (I) 중, X1 및 X2는, 예컨대, 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH이다. 상기 식 (I) 중에 있어서, X1이 H2라고 하는 것은, X1이, X1이 결합하는 탄소 원자와 함께, CH2(메틸렌기)를 형성하는 것을 의미한다. X2에 대해서도 동일하다.
상기 식 (I) 중, Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S이다.
상기 식 (I) 중, 고리 A에 있어서, l은 1 또는 2이다. l=1의 경우, 고리 A는, 5원환이고, 예컨대, 상기 피롤리딘 골격이다. 상기 피롤리딘 골격은, 예컨대, 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등을 들 수 있고, 이들 2가의 구조를 예시할 수 있다. l=2의 경우, 고리 A는 6원환이며, 예컨대, 상기 피페리딘 골격이다. 고리 A는, 고리 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가, 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 좋다. 또한, 고리 A는, 고리 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함하여도 좋다. 고리 A는, 예컨대, L형 및 D형 중 어느 것이어도 좋다.
상기 식 (I) 중, R3은, 고리 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이다. R3이 상기 치환기인 경우, 치환기 R3은, 1이어도 복수여도, 존재하지 않아도 좋고, 복수의 경우, 동일하여도 달라도 좋다.
치환기 R3은, 예컨대, 할로겐, OH, OR4, NH2, NHR4, NR4R5, SH, SR4 또는 옥소기(=O) 등이다.
R4 및 R5는, 예컨대, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고, 동일하여도 달라도 좋다. 상기 치환기는, 예컨대, 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 들 수 있다. 이하, 동일하다. 치환기 R3은, 이들 열거하는 치환기여도 좋다.
상기 보호기는, 예컨대, 반응성이 높은 작용기를 불활성으로 변환하는 작용기이고, 공지의 보호기 등을 들 수 있다. 상기 보호기는, 예컨대, 문헌(J.F.W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973)의 기재를 원용할 수 있다. 상기 보호기는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, tert-부틸디메틸실릴기(TBDMS), 비스(2-아세톡시에틸옥시)메틸기(ACE), 트리이소프로필실릴옥시메틸기(TOM), 1-(2-시아노에톡시)에틸기(CEE), 2-시아노에톡시메틸기(CEM) 및 톨릴술포닐에톡시메틸기(TEM), 디메톡시트리틸기(DMTr) 등을 들 수 있다. R3이 OR4인 경우, 상기 보호기는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, TBDMS기, ACE기, TOM기, CEE기, CEM 기 및 TEM기 등을 들 수 있다. 이 외에도, 후술하는 [화학식 5]의 실릴 함유기도 들 수 있다. 이하, 동일하다.
상기 식 (I) 중, L1은, n개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, 예컨대, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 혹은 SRa로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 또는, L1은, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄여도 좋다. 상기 폴리에테르쇄는, 예컨대, 폴리에틸렌글리콜이다. 또한, Y1이, NH, O 또는 S인 경우, Y1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이고, OR1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다. 즉, 예컨대, Y1이 O인 경우, 그 산소 원자와 L1의 산소 원자는 인접하지 않고, OR1의 산소 원자와 L1의 산소 원자는 인접하지 않는다.
상기 식 (I) 중, L2는, m개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, 예컨대, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 혹은 SRc로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 또는, L2는, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄여도 좋다. 또한, Y2가, NH, O 또는 S인 경우, Y2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이고, OR2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다. 즉, 예컨대, Y2가 O인 경우, 그 산소 원자와 L2의 산소 원자는 인접하지 않고, OR2의 산소 원자와 L2의 산소 원자는 인접하지 않는다.
L1의 n 및 L2의 m은, 특별히 제한되지 않고, 각각, 하한은, 예컨대, 0이며, 상한도, 특별히 제한되지 않는다. n 및 m은, 예컨대, 상기 링커 영역(Lx)의 원하는 길이에 따라, 적절하게 설정할 수 있다. n 및 m은, 예컨대, 제조 비용 및 수율 등의 점에서, 각각, 0∼30이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0∼20이며, 더욱 바람직하게는 0∼15이다. n과 m은, 동일하여도 좋고(n=m), 달라도 좋다. n+m은, 예컨대, 0∼30이고, 바람직하게는 0∼20이며, 보다 바람직하게는 0∼15이다.
Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 예컨대, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이다. 상기 치환기 및 상기 보호기는, 예컨대, 전술과 동일하다.
상기 식 (I)에 있어서, 수소 원자는, 예컨대, 각각 독립적으로, Cl, Br, F 및 I 등의 할로겐으로 치환되어도 좋다.
상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X)은, 예컨대, 각각, -OR1- 또는 -OR2-를 개재하여, 상기 링커 영역(Lx)에 결합한다. 여기서, R1 및 R2는, 존재하여도 존재하지 않아도 좋다. R1 및 R2가 존재하는 경우, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 식 (I)의 구조이다. R1 및/또는 R2가 상기 뉴클레오티드 잔기인 경우, 상기 링커 영역(Lx)은, 예컨대, 뉴클레오티드 잔기 R1 및/또는 R2를 제외한 상기 식 (I)의 구조로 이루어지는 상기 비뉴클레오티드 잔기와, 상기 뉴클레오티드 잔기로 형성된다. R1 및/또는 R2가 상기 식 (I)의 구조인 경우, 상기 링커 영역(Xc)은, 예컨대, 상기 식 (I)의 구조로 이루어지는 상기 비뉴클레오티드 잔기가, 2개 이상 연결된 구조가 된다. 상기 식 (I)의 구조는, 예컨대, 1개, 2개, 3개 또는 4개 포함하여도 좋다. 이와 같이, 상기 구조를 복수 포함하는 경우, 상기 (I)의 구조는, 예컨대, 직접 연결되어도 좋고, 상기 뉴클레오티드 잔기를 개재하여 결합하여도 좋다. 한편, R1 및 R2가 존재하지 않는 경우, 상기 링커 영역(Lx)은, 예컨대, 상기 식 (I)의 구조로 이루어지는 상기 비뉴클레오티드 잔기만으로 형성된다.
상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X)과, -OR1- 및 -OR2-의 결합의 조합은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 이하 중 어느 하나의 조건을 들 수 있다.
조건 (1)
상기 영역(Xc)은, -OR2-를 개재하고, 상기 영역(X)은, -OR1-을 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
조건 (2)
상기 영역(Xc)은, -OR1-을 개재하고, 상기 영역(X)은, -OR2-를 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
상기 식 (I)의 구조는, 예컨대, 하기 식 (I-1)∼식 (I-9)를 예시할 수 있고, 하기 식에 있어서, n 및 m은, 상기 식 (I)과 동일하다. 하기 식에 있어서, q는 0∼10의 정수이다.
Figure 112013016609314-pct00003
상기 식 (I-1)∼(I-9)에 있어서, n, m 및 q는, 특별히 제한되지 않고, 전술한 대로이다. 구체예로서, 상기 식 (I-1)에 있어서, n=8, 상기 (I-2)에 있어서, n=3, 상기 식 (I-3)에 있어서, n=4 또는 8, 상기 (I-4)에 있어서, n=7 또는 8, 상기 식 (I-5)에 있어서, n=3 및 m=4, 상기 (I-6)에 있어서, n=8 및 m=4, 상기 식 (I-7)에 있어서, n=8 및 m=4, 상기 (I-8)에 있어서, n=5 및 m=4, 상기 식 (I-9)에 있어서, q=1 및 m=4를 들 수 있다. 상기 식 (I-4)의 일례(n=8)를, 하기 식 (I-4a)로, 상기 식 (I-8)의 일례(n=5, m=4)를, 하기 식 (I-8a)로 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00004
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)은, 상기 영역(X)과 상보적이다. 이 때문에, 본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)이 상기 영역(X)을 향하여 절첩하여, 상기 영역(Xc)과 상기 영역(X)이, 자기 어닐링에 의해, 이중쇄를 형성 가능하다. 본 발명의 ssPN 분자는, 이와 같이, 분자 내에서 이중쇄를 형성 가능하고, 예컨대, 종래의 RNA 간섭에 사용하는 siRNA와 같이, 분리된 2개의 일본쇄 RNA가 어닐링에 의해 이본쇄 RNA를 형성하는 것과는, 분명히 다른 구조이다.
본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 상기 영역(Xc)만이 절첩하여 상기 영역(X)과 이중쇄를 형성하여도 좋고, 또한, 다른 영역에 있어서 새로운 이중쇄를 형성하여도 좋다. 이하, 전자의 ssPN 분자, 즉, 이중쇄 형성이 1개소인 분자를 「제1 ssPN 분자」라고 하고, 후자의 ssPN 분자, 즉, 이중쇄 형성이 2개소인 분자를 「제2 ssPN 분자」라고 한다. 이하에, 상기 제1 ssPN 분자 및 상기 제2 ssPN 분자에 대해서, 예시하지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다.
(1) 제1 ssPN 분자
상기 제1 ssPN 분자는, 예컨대, 상기 영역(X), 상기 영역(Xc) 및 상기 링커 영역(Lx)으로 이루어지는 분자이다.
상기 제1 ssPN 분자는, 예컨대, 5'측으로부터 3'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)을, 상기 순서로 가져도 좋고, 3'측으로부터 5'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(X)을, 상기 순서로 가져도 좋다.
상기 제1 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)은, 상기 영역(X)에 상보적이다. 여기서, 상기 영역(Xc)은, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 대하여 상보적인 서열을 가지고 있으면 좋고, 바람직하게는, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 상보적인 서열을 포함하거나, 또는, 상기 상보적인 서열로 이루어진다. 상기 영역(Xc)은, 상기 영역(X)의 상보적인 상기 전체 영역 또는 상보적인 상기 부분 영역에 대하여, 예컨대, 완전히 상보적이어도 좋고, 1 혹은 수개의 염기가 비상보적이어도 좋지만, 완전히 상보적인 것이 바람직하다. 상기 1 염기 혹은 수개 염기는, 예컨대, 1∼3 염기, 바람직하게는 1 염기 또는 2 염기이다.
상기 제1 ssPN 분자에 있어서, 상기 발현 억제 서열은, 전술한 바와 같이, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X) 중 적어도 한쪽에 포함된다. 상기 제1 ssPN 분자는, 상기 발현 억제 서열을, 예컨대, 1개 가져도 좋고, 2개 이상 가져도 좋다.
후자의 경우, 상기 1의 ssPN 분자는, 예컨대, 동일한 표적 유전자에 대한 동일한 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 좋고, 동일한 표적에 대한 다른 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 좋으며, 다른 표적 유전자에 대한 다른 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 좋다. 상기 제1 ssPN 분자가, 2개 이상의 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 각 발현 억제 서열의 배치 개소는, 특별히 제한되지 않고, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Xc) 중 어느 한 영역이어도 좋고, 다른 영역이어도 좋다. 상기 제1 ssPN 분자가, 다른 표적 유전자에 대한 상기 발현 억제 서열을 2개 이상 갖는 경우, 예컨대, 상기 제1 ssPN 분자에 의해, 2종류 이상의 다른 표적 유전자의 발현을 억제 가능하다.
상기 제1 ssPN 분자의 일례를, 도 1의 모식도에 나타낸다. 도 1(A)는, 일례로서, 상기 ssPN 분자에 대해서, 각 영역의 순서의 개략을 나타내는 모식도이고, 도 1(B)는, 상기 ssPN 분자가, 상기 분자 내에 있어서 이중쇄를 형성하고 있는 상태를 나타내는 모식도이다. 도 1(B)에 나타내는 바와 같이, 상기 ssPN 분자는, 상기 영역(Xc)과 상기 영역(X) 사이에서, 이중쇄가 형성되고, 상기 Lx 영역이, 그 길이에 따라 루프 구조를 취한다. 도 1은, 어디까지나, 상기 영역의 연결 순서 및 이중쇄를 형성하는 각 영역의 위치 관계를 나타내는 것으로, 예컨대, 각 영역의 길이, 상기 링커 영역(Lx)의 형상 등은, 이것에 제한되지 않는다.
상기 제1 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 이하에 각 영역의 길이를 예시하지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 「염기수」는, 예컨대, 「길이」를 의미하며, 「염기 길이」라고 할 수도 있다. 본 발명에 있어서, 염기수의 수치 범위는, 예컨대, 그 범위에 속하는 양의 정수를 전부 개시하는 것으로, 구체예로서, 「1∼4 염기」라고 하는 기재는, 「1, 2, 3, 4 염기」의 모든 개시를 의미한다(이하, 동일).
상기 영역(Xc)은, 예컨대, 상기 영역(X)의 전체 영역에 완전히 상보적이어도 좋다. 이 경우, 상기 영역(Xc)은, 예컨대, 상기 영역(X)의 5' 말단으로부터 3' 말단의 전체 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것을 의미하고, 즉, 상기 영역(Xc)과 상기 영역(X)이, 동일한 염기 길이이며, 또한, 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 모든 염기와 상보적인 것을 의미한다.
또한, 상기 영역(Xc)은, 예컨대, 상기 영역(X)의 부분 영역에 완전히 상보적이어도 좋다. 이 경우, 상기 영역(Xc)은, 예컨대, 상기 영역(X)의 부분 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것을 의미하고, 즉, 상기 영역(Xc)은, 상기 영역(X)보다, 1 염기 이상 짧은 염기 길이의 염기 서열로 이루어지며, 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 상기 부분 영역의 모든 염기와 상보적인 것을 의미한다. 상기 영역(X)의 상기 부분 영역은, 예컨대, 상기 영역(X)에 있어서의, 상기 영역(Xc)측의 말단의 염기(1번째의 염기)로부터 연속하는 염기 서열로 이루어지는 영역인 것이 바람직하다.
상기 제1 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X)와 상기 영역(Xc)의 염기수(Xc)의 관계는, 예컨대, 하기 (3) 또는 (5)의 조건을 만족하고, 전자의 경우, 구체적으로는, 예컨대, 하기 (11)의 조건을 만족한다.
X>Xc···(3)
X-Xc=1∼10, 바람직하게는 1, 2 또는 3,
보다 바람직하게는 1 또는 2 ···(11)
X=Xc···(5)
상기 영역(X) 및/또는 상기 영역(Xc)이 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 영역은, 예컨대, 상기 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역이어도 좋고, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 영역이어도 좋다. 상기 발현 억제 서열의 염기수는, 예컨대, 19∼30 염기이고, 바람직하게는, 19, 20 또는 21 염기이다. 상기 발현 억제 서열을 포함하는 영역은, 예컨대, 상기 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 가져도 좋다. 상기 부가 서열의 염기수는, 예컨대, 1∼31 염기이고, 바람직하게는, 1∼21 염기이며, 보다 바람직하게는, 1∼11 염기이다.
상기 영역(X)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 영역(X)이, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 그 하한은, 예컨대, 19 염기이다. 그 상한은, 예컨대, 50 염기이고, 바람직하게는 30 염기이며, 보다 바람직하게는 25 염기이다. 상기 영역(X)의 염기수의 구체예는, 예컨대, 19 염기∼50 염기이고, 바람직하게는, 19 염기∼30 염기, 보다 바람직하게는 19 염기∼25 염기이다.
상기 영역(Xc)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 그 하한은, 예컨대, 19 염기이고, 바람직하게는 20 염기이며, 보다 바람직하게는 21 염기이다. 그 상한은, 예컨대, 50 염기이고, 보다 바람직하게는 40 염기이며, 더욱 바람직하게는 30 염기이다.
상기 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)의 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커 영역(Lx)은, 예컨대, 상기 영역(X)과 상기 영역(Xc)이 이중쇄를 형성 가능한 길이인 것이 바람직하다. 상기 링커 영역(Lx)이, 상기 비뉴클레오티드 잔기 외에, 상기 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 경우, 상기 링커 영역(Lx)의 염기수는, 그 하한이, 예컨대, 1 염기이고, 바람직하게는 2 염기이며, 보다 바람직하게는 3 염기이고, 그 상한이, 예컨대, 100 염기이며, 바람직하게는 80 염기이고, 보다 바람직하게는 50 염기이다.
상기 제1 ssPN 분자의 전체 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 제1 ssPN 분자에 있어서, 상기 염기수의 합계(전체 길이의 염기수)는, 하한이, 예컨대, 38 염기이고, 바람직하게는 42 염기이며, 보다 바람직하게는 50 염기이고, 더욱 바람직하게는 51 염기이며, 특히 바람직하게는 52 염기이고, 그 상한은, 예컨대, 300 염기이며, 바람직하게는 200 염기이고, 보다 바람직하게는 150 염기이며, 더욱 바람직하게는 100 염기이고, 특히 바람직하게는 80 염기이다. 상기 제1 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)을 제외한 염기수의 합계는, 하한이, 예컨대, 38 염기이고, 바람직하게는 42 염기이며, 보다 바람직하게는 50 염기이고, 더욱 바람직하게는 51 염기이며, 특히 바람직하게는 52 염기이고, 상한이, 예컨대, 300 염기이며, 바람직하게는 200 염기이고, 보다 바람직하게는 150 염기이며, 더욱 바람직하게는 100 염기이고, 특히 바람직하게는 80 염기이다.
(2) 제2 ssPN 분자
상기 제2 ssPN 분자는, 예컨대, 상기 영역(X), 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 영역(Xc) 외에, 추가로, 영역(Y) 및 상기 영역(Y)에 상보적인 영역(Yc)을 갖는 분자이다. 상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(X)과 상기 영역(Y)이 연결되어, 내부 영역(Z)을 형성하고 있다. 또한, 특별히 나타내지 않는 한, 상기 제2 ssPN 분자는, 상기 제1 ssPN 분자의 기재를 원용할 수 있다.
상기 제2 ssPN 분자는, 예컨대, 5'측으로부터 3'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx), 상기 영역(X), 상기 영역(Y) 및 상기 영역(Yc)을, 상기 순서로 가져도 좋다. 이 경우, 상기 영역(Xc)을, 5'측 영역(Xc), 상기 내부 영역(Z) 중의 상기 영역(X)을, 내부 5'측 영역(X), 상기 내부 영역(Z) 중의 상기 영역(Y)을, 내부 3' 영역(Y), 상기 영역(Yc)을, 3'측 영역(Yc)이라고도 한다. 또한, 상기 제2 ssPN 분자는, 예컨대, 3'측으로부터 5'측에 걸쳐, 상기 영역(Xc), 상기 링커 영역(Lx), 상기 영역(X), 상기 영역(Y) 및 상기 영역(Yc)을, 상기 순서로 가져도 좋다. 이 경우, 상기 영역(Xc)을, 3'측 영역(Xc), 상기 내부 영역(Z) 중의 상기 영역(X)을, 내부 3'측 영역(X), 상기 내부 영역(Z) 중의 상기 영역(Y)을, 내부 5' 영역(Y), 상기 영역(Yc)을, 5'측 영역(Yc)이라고도 한다.
상기 내부 영역(Z)은, 전술한 바와 같이, 예컨대, 상기 영역(X)과 상기 영역(Y)이 연결되어 있다. 상기 영역(X)과 상기 영역(Y)은, 예컨대, 직접적으로 연결되고, 그 사이에 개재 서열을 가지고 있지 않다. 상기 내부 영역(Z)은, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)과의 서열 관계를 나타내기 위해, 「상기 영역(X)과 상기 영역(Y)이 연결되어 구성된다」라고 정의하는 것으로서, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 영역(X)과 상기 영역(Y)이, 상기 ssPN 분자의 사용에 있어서, 별개의 독립된 영역인 것을 한정하는 것이 아니다. 즉, 예컨대, 상기 내부 영역(Z)이, 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 영역(X)과 상기 영역(Y)에 걸쳐, 상기 발현 억제 서열이 배치되어도 좋다.
상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)은, 상기 영역(X)에 상보적이다. 여기서, 상기 영역(Xc)은, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 대하여 상보적인 서열을 가지고 있으면 좋고, 바람직하게는, 상기 영역(X)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 상보적인 서열을 포함하거나, 또는, 상기 상보적인 서열로 이루어진다. 상기 영역(Xc)은, 상기 영역(X)의 상보적인 상기 전체 영역 또는 상보적인 상기 부분 영역에 대하여, 예컨대, 완전히 상보적이어도 좋고, 1 혹은 수개의 염기가 비상보적이어도 좋지만, 완전히 상보적인 것이 바람직하다. 상기 1 염기 혹은 수개 염기는, 예컨대, 1∼3 염기, 바람직하게는 1 염기 또는 2 염기이다.
상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Yc)은, 상기 영역(Y)에 상보적이다. 여기서, 상기 영역(Yc)은, 상기 영역(Y)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 상보적인 서열을 가지고 있으면 좋고, 바람직하게는, 상기 영역(Y)의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 대하여 상보적인 서열을 포함하거나, 또는, 상기 상보적인 서열로 이루어진다. 상기 영역(Yc)은, 상기 영역(Y)의 상보적인 상기 전체 영역 또는 상보적인 상기 부분 영역에 대하여, 예컨대, 완전히 상보적이어도 좋고, 1 혹은 수개의 염기가 비상보적이어도 좋지만, 완전히 상보적인 것이 바람직하다. 상기 1 염기 혹은 수개 염기는, 예컨대, 1∼3 염기, 바람직하게는 1 염기 또는 2 염기이다.
상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 발현 억제 서열은, 예컨대, 상기 영역(X)과 상기 영역(Y)으로 형성되는 상기 내부 영역(Z) 및 상기 영역(Xc) 중 적어도 하나에 포함되고, 추가로, 상기 영역(Yc)에 포함되어도 좋다. 상기 내부 영역(Z)이 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 예컨대, 상기 영역(X) 및 상기 영역(Y) 중 어느 곳에 상기 발현 억제 서열을 가져도 좋고, 또한, 상기 영역(X)과 상기 영역(Y)에 걸쳐, 상기 발현 억제 서열을 가져도 좋다. 상기 제2 ssPN 분자는, 상기 발현 억제 서열을, 예컨대, 1개 가져도 좋고, 2개 이상 가져도 좋다.
상기 제2 ssPN 분자가, 2개 이상의 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 각 발현 억제 서열의 배치 개소는, 특별히 제한되지 않고, 상기 내부 영역(Z) 및 상기 영역(Xc) 중 어느 한쪽이어도 좋고, 상기 내부 영역(Z) 및 상기 영역(Xc) 중 어느 한쪽과, 또한 그 외의 다른 영역이어도 좋다.
상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Yc)과 상기 영역(Y)은, 예컨대, 직접 연결하여도 좋고, 간접적으로 연결하여도 좋다. 전자의 경우, 직접적인 연결은, 예컨대, 포스포디에스테르 결합에 의한 연결 등을 들 수 있다. 후자의 경우, 예컨대, 상기 영역(Yc)과 상기 영역(Y) 사이에, 링커 영역(Ly)을 가지고, 상기 링커 영역(Ly)을 개재하여, 상기 영역(Yc)과 상기 영역(Y)이 연결되어 있는 형태 등을 들 수 있다.
상기 제2 ssPN 분자가 상기 링커 영역(Ly)을 갖는 경우, 상기 링커 영역(Ly)은, 예컨대, 상기 뉴클레오티드 잔기로 이루어지는 링커여도 좋고, 전술한, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 갖는 링커여도 좋다. 후자의 경우, 상기 링커 영역(Ly)은, 예컨대, 상기 식 (I)로 나타낼 수 있고, 상기 링커 영역(Lx)에 있어서의 상기 식 (I)의 설명을 전부 원용할 수 있다.
상기 영역(Yc) 및 상기 영역(Y)은, 예컨대, 각각, -OR1- 또는 -OR2-를 개재하여, 상기 링커 영역(Ly)에 결합한다. 여기서, R1 및 R2는, 전술한 링커 영역(Lx)과 마찬가지로, 존재하여도 존재하지 않아도 좋다.
상기 영역(Xc) 및 상기 영역(X), 그리고, 상기 영역(Yc) 및 상기 (Y)과, 상기 -OR1- 및 -OR2-의 결합의 조합은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 이하 중 어느 하나의 조건을 들 수 있다.
조건 (1)
상기 영역(Xc)은, -OR2-를 개재하고, 상기 영역(X)은, -OR1-을 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합하고,
상기 영역(Yc)은, -OR1-을 개재하고, 상기 영역(Y)은, -OR2-를 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
조건 (2)
상기 영역(Xc)은, -OR2-를 개재하고, 상기 영역(X)은, -OR1-을 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합하고,
상기 영역(Yc)은, -OR2-를 개재하고, 상기 영역(Y)은, -OR1-을 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
조건 (3)
상기 영역(Xc)은, -OR1-을 개재하고, 상기 영역(X)은, -OR2-를 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합하고,
상기 영역(Yc)은, -OR1-을 개재하고, 상기 영역(Y)은, -OR2-를 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
조건 (4)
상기 영역(Xc)은, -OR1-을 개재하고, 상기 영역(X)은, -OR2-를 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합하고,
상기 영역(Yc)은, -OR2-를 개재하고, 상기 영역(Y)은, -OR1-을 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
상기 제2 ssPN 분자에 대해서, 상기 링커 영역(Ly)을 갖는 ssPN 분자의 일례를, 도 2의 모식도에 나타낸다. 도 2(A)는, 일례로서, 상기 ssPN 분자에 대해서, 5'측으로부터 3'측을 향하여, 각 영역의 순서의 개략을 나타내는 모식도이고, 도 2(B)는, 상기 ssPN 분자가, 상기 분자 내에 있어서 이중쇄를 형성하고 있는 상태를 나타내는 모식도이다. 도 2(B)에 나타내는 바와 같이, 상기 ssPN 분자는, 상기 영역(Xc)과 상기 영역(X) 사이, 상기 영역(Y)과 상기 영역(Yc) 사이에서, 이중쇄가 형성되고, 상기 Lx 영역 및 상기 Ly 영역이, 그 길이에 따라 루프 구조를 취한다. 도 2는, 어디까지나, 각 영역의 연결 순서 및 이중쇄를 형성하는 각 영역의 위치 관계를 나타내는 것으로, 예컨대, 각 영역의 길이, 링커 영역의 형상 등은, 이것에 제한되지 않는다. 또한, 도 2는, 상기 영역(Xc)을 5'측에 나타내었지만, 이것에는 제한되지 않으며, 상기 영역(Xc)이, 3'측에 위치하여도 좋다.
상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc), 상기 영역(X), 상기 영역(Y) 및 상기 영역(Yc)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 각 영역의 길이를 이하에 예시하지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다.
상기 영역(Xc)은, 전술한 바와 같이, 예컨대, 상기 영역(X)의 전체 영역에 상보적이어도 좋다. 이 경우, 상기 영역(Xc)은, 예컨대, 상기 영역(X)과 동일한 염기 길이이고, 상기 영역(X)의 전체 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Xc)은, 보다 바람직하게는, 상기 영역(X)과 동일한 염기 길이이고, 또한, 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 모든 염기와 상보적, 즉, 예컨대, 완전히 상보적이다. 또한, 이것에는 제한되지 않고, 예컨대, 전술한 바와 같이, 1 혹은 수개의 염기가 비상보적이어도 좋다.
또한, 상기 영역(Xc)은, 전술한 바와 같이, 예컨대, 상기 영역(X)의 부분 영역에 상보적이어도 좋다. 이 경우, 상기 영역(Xc)은, 예컨대, 상기 영역(X)의 부분 영역과 동일한 염기 길이이고, 즉, 상기 영역(X)보다, 1 염기 이상 짧은 염기 길이의 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Xc)은, 보다 바람직하게는, 상기 영역(X)의 상기 부분 영역과 동일한 염기 길이이고, 또한, 상기 영역(Xc)의 모든 염기가, 상기 영역(X)의 상기 부분 영역의 모든 염기와 상보적, 즉, 예컨대, 완전히 상보적이다. 상기 영역(X)의 상기 부분 영역은, 예컨대, 상기 영역(X)에 있어서의, 상기 영역(Xc)측의 말단의 염기(1번째의 염기)로부터 연속하는 염기 서열로 이루어지는 영역인 것이 바람직하다.
상기 영역(Yc)은, 전술한 바와 같이, 예컨대, 상기 영역(Y)의 전체 영역에 상보적이어도 좋다. 이 경우, 상기 영역(Yc)은, 예컨대, 상기 영역(Y)과 동일한 염기 길이이고, 상기 영역(Y)의 전체 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Yc)은, 보다 바람직하게는, 상기 영역(Y)과 동일한 염기 길이이고, 또한, 상기 영역(Yc)의 모든 염기가, 상기 영역(Y)의 모든 염기와 상보적, 즉, 예컨대, 완전히 상보적이다. 또한, 이것에는 제한되지 않고, 예컨대, 전술한 바와 같이, 1 혹은 수개의 염기가 비상보적이어도 좋다.
또한, 상기 영역(Yc)은, 전술한 바와 같이, 예컨대, 상기 영역(Y)의 부분 영역에 상보적이어도 좋다. 이 경우, 상기 영역(Yc)은, 예컨대, 상기 영역(Y)의 부분 영역과 동일한 염기 길이이고, 즉, 상기 영역(Y)보다, 1 염기 이상 짧은 염기 길이의 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 영역(Yc)은, 보다 바람직하게는, 상기 영역(Y)의 상기 부분 영역과 동일한 염기 길이이고, 또한, 상기 영역(Yc)의 모든 염기가, 상기 영역(Y)의 상기 부분 영역의 모든 염기와 상보적, 즉, 예컨대, 완전히 상보적이다. 상기 영역(Y)의 상기 부분 영역은, 예컨대, 상기 영역(Y)에 있어서의, 상기 영역(Yc)측의 말단의 염기(1번째의 염기)로부터 연속하는 염기 서열로 이루어지는 영역인 것이 바람직하다.
상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 내부 영역(Z)의 염기수(Z)와, 상기 영역(X)의 염기수(X) 및 상기 영역(Y)의 염기수(Y)의 관계, 상기 내부 영역(Z)의 염기수(Z)와, 상기 영역(X)의 염기수(X) 및 상기 영역(Xc)의 염기수(Xc)의 관계는, 예컨대, 하기 식 (1) 및 (2)의 조건을 만족한다.
Z=X+Y···(1)
Z≥Xc+Yc···(2)
상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X)와 상기 영역(Y)의 염기수(Y)의 관계는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 하기 식 중 어느 하나의 조건을 만족한다.
X=Y···(19)
X<Y···(20)
X>Y···(21)
제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X), 상기 영역(Xc)의 염기수(Xc), 상기 영역(Y)의 염기수(Y) 및 상기 영역(Yc)의 염기수(Yc)의 관계는, 예컨대, 하기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 조건을 만족한다.
(a) 하기 식 (3) 및 (4)의 조건을 만족한다.
X>Xc···(3)
Y=Yc···(4)
(b) 하기 식 (5) 및 (6)의 조건을 만족한다.
X=Xc···(5)
Y>Yc···(6)
(c) 하기 식 (7) 및 (8)의 조건을 만족한다.
X>Xc···(7)
Y>Yc···(8)
(d) 하기 식 (9) 및 (10)의 조건을 만족한다.
X=Xc···(9)
Y=Yc···(10)
상기 (a)∼(d)에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X)와 상기 영역(Xc)의 염기수(Xc)의 차, 상기 영역(Y)의 염기수(Y)와 상기 영역(Yc)의 염기수(Yc)의 차는, 예컨대, 하기 조건을 만족하는 것이 바람직하다.
(a) 하기 식 (11) 및 (12)의 조건을 만족한다.
X-Xc=1∼10, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4,
보다 바람직하게는 1, 2 또는 3 ···(11)
Y-Yc=0···(12)
(b) 하기 식 (13) 및 (14)의 조건을 만족한다.
X-Xc=0···(13)
Y-Yc=1∼10, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4,
보다 바람직하게는 1, 2 또는 3 ···(14)
(c) 하기 식 (15) 및 (16)의 조건을 만족한다.
X-Xc=1∼10, 바람직하게는, 1, 2 또는 3,
보다 바람직하게는 1 또는 2 ···(15)
Y-Yc=1∼10, 바람직하게는, 1, 2 또는 3,
보다 바람직하게는 1 또는 2 ···(16)
(d) 하기 식 (17) 및 (18)의 조건을 만족한다.
X-Xc=0···(17)
Y-Yc=0···(18)
상기 (a)∼(d)의 제2 ssPN 분자에 대해서, 각각의 구조의 일례를, 도 3의 모식도로 나타낸다. 도 3은 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)을 포함하는 ssPN이고, (A)는 상기 (a)의 ssPN 분자, (B)는 상기 (b)의 ssPN 분자, (C)는 상기 (c)의 ssPN 분자, (D)는 상기 (d)의 ssPN 분자의 예이다. 도 3에 있어서, 점선은, 자기 어닐링에 의해 이중쇄를 형성하고 있는 상태를 나타낸다. 도 3의 ssPN 분자는, 상기 영역(X)의 염기수(X)와 상기 영역(Y)의 염기수(Y)를, 상기 식 (20)의 「X<Y」로 나타내었지만, 이것에는 제한되지 않고, 전술한 바와 같이, 상기 식 (19)의 「X=Y」여도, 상기 식 (21)의 「X>Y」여도 좋다. 또한, 도 3은, 어디까지나 상기 영역(X)과 상기 영역(Xc)의 관계, 상기 영역(Y)과 상기 영역(Yc)의 관계를 나타내는 모식도이고, 예컨대, 각 영역의 길이, 형상, 링커 영역(Ly)의 유무 등은, 이것에는 제한되지 않는다.
상기 (a)∼(c)의 ssPN 분자는, 예컨대, 상기 영역(Xc)과 상기 영역(X), 및, 상기 영역(Yc)과 상기 영역(Y)이, 각각 이중쇄를 형성함으로써, 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc) 중 어느 것과도 얼라이먼트하지 않는 염기를 갖는 구조이고, 이중쇄를 형성하지 않는 염기를 갖는 구조라고도 할 수 있다. 상기 내부 영역(Z)에 있어서, 상기 얼라이먼트하지 않는 염기(이중쇄를 형성하지 않는 염기라고도 함)를, 이하, 「프리 염기」라고 한다. 도 3에 있어서, 상기 프리 염기의 영역을, 「F」로 나타낸다. 상기 영역(F)의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 영역(F)의 염기수(F)는, 예컨대, 상기 (a)의 ssPN 분자의 경우, 「X-Xc」의 염기수이고, 상기 (b)의 ssPN 분자의 경우, 「Y-Yc」의 염기수이며, 상기 (c)의 ssPN 분자의 경우, 「X-Xc」의 염기수와 「Y-Yc」의 염기수의 합계수이다.
한편, 상기 (d)의 ssPN 분자는, 예컨대, 상기 내부 영역(Z)의 전체 영역이, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)과 얼라이먼트하는 구조이고, 상기 내부 영역(Z)의 전체 영역이 이중쇄를 형성하는 구조라고도 할 수 있다. 또한, 상기 (d)의 ssPN 분자에 있어서, 상기 영역(Xc)의 5' 말단과 상기 영역(Yc)의 3' 말단은, 미연결이다.
상기 영역(Xc), 상기 영역(Yc), 및 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 상기 프리 염기(F)의 염기수의 합계는, 상기 내부 영역(Z)의 염기수가 된다. 이 때문에, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)의 길이는, 예컨대, 상기 내부 영역(Z)의 길이, 상기 프리 염기의 수 및 그 위치에 따라, 적절하게 결정할 수 있다.
상기 내부 영역(Z)의 염기수는, 예컨대, 19 염기 이상이다. 상기 염기수의 하한은, 예컨대, 19 염기이고, 바람직하게는 20 염기이며, 보다 바람직하게는 21 염기이다. 상기 염기수의 상한은, 예컨대, 50 염기이고, 바람직하게는 40 염기이며, 보다 바람직하게는 30 염기이다. 상기 내부 영역(Z)의 염기수의 구체예는, 예컨대, 19 염기, 20 염기, 21 염기, 22 염기, 23 염기, 24 염기, 25 염기, 26 염기, 27 염기, 28 염기, 29 염기, 또는, 30 염기이다. 상기 내부 영역(Z)이, 상기 발현 억제 서열을 갖는 경우, 예컨대, 이 조건이 바람직하다.
상기 내부 영역(Z)이 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 내부 영역(Z)은, 예컨대, 상기 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역이어도 좋고, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 영역이어도 좋다. 상기 발현 억제 서열의 염기수는, 예컨대, 19∼30 염기이고, 바람직하게는, 19, 20 또는 21 염기이다. 상기 내부 영역(Z)이 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 가져도 좋다. 상기 부가 서열의 염기수는, 예컨대, 1∼31 염기이고, 바람직하게는, 1∼21 염기이며, 보다 바람직하게는, 1∼11 염기이고, 더욱 바람직하게는, 1∼7 염기이다.
상기 영역(Xc)의 염기수는, 예컨대, 1∼29 염기이고, 바람직하게는 1∼11 염기이며, 바람직하게는 1∼7 염기이고, 보다 바람직하게는 1∼4 염기이며, 더욱 바람직하게는 1 염기, 2 염기, 3 염기이다. 상기 내부 영역(Z) 또는 상기 영역(Yc)이 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 예컨대, 이러한 염기수가 바람직하다. 구체예로서, 상기 내부 영역(Z)의 염기수가, 19∼30 염기(예컨대, 19 염기)인 경우, 상기 영역(Xc)의 염기수는, 예컨대, 1∼11 염기이고, 바람직하게는 1∼7 염기이며, 보다 바람직하게는 1∼4 염기이고, 더욱 바람직하게는 1 염기, 2 염기, 3 염기이다.
상기 영역(Xc)이 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 영역(Xc)은, 예컨대, 상기 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역이어도 좋고, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 영역이어도 좋다. 상기 발현 억제 서열의 길이는, 예컨대, 전술한 대로이다. 상기 영역(Xc)이 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 가져도 좋다. 상기 부가 서열의 염기수는, 예컨대, 1∼11 염기이고, 바람직하게는, 1∼7 염기이다.
상기 영역(Yc)의 염기수는, 예컨대, 1∼29 염기이고, 바람직하게는 1∼11 염기이며, 바람직하게는 1∼7 염기이고, 보다 바람직하게는 1∼4 염기이며, 더욱 바람직하게는 1 염기, 2 염기, 3 염기이다. 상기 내부 영역(Z) 또는 상기 영역(Xc)이 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 예컨대, 이러한 염기수가 바람직하다. 구체예로서, 상기 내부 영역(Z)의 염기수가, 19∼30 염기(예컨대, 19 염기)인 경우, 상기 영역(Yc)의 염기수는, 예컨대, 1∼11 염기이고, 바람직하게는 1∼7 염기이며, 보다 바람직하게는 1 염기, 2 염기, 3 염기 또는 4 염기이고, 더욱 바람직하게는 1 염기, 2 염기, 3 염기이다.
상기 영역(Yc)이 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 영역(Yc)은, 예컨대, 상기 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역이어도 좋고, 상기 발현 억제 서열을 포함하는 영역이어도 좋다. 상기 발현 억제 서열의 길이는, 예컨대, 전술한 대로이다. 상기 영역(Yc)이 상기 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상기 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 가져도 좋다. 상기 부가 서열의 염기수는, 예컨대, 1∼11 염기이고, 바람직하게는, 1∼7 염기이다.
전술한 바와 같이, 상기 내부 영역(Z), 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)의 염기수는, 예컨대, 상기 식 (2)의 「Z≥Xc+Yc」로 나타낼 수 있다. 구체예로서, 「Xc+Yc」의 염기수는, 예컨대, 상기 내부 영역(Z)과 동일하거나, 또는, 상기 내부 영역(Z)보다 작다. 후자의 경우, 「Z-(Xc+Yc)」는, 예컨대, 1∼10, 바람직하게는 1∼4, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3이다. 상기 「Z-(Xc+Yc)」는, 예컨대, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 프리 영역(F)의 염기수(F)에 상당한다.
상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx) 및 상기 링커 영역(Ly)의 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커 영역(Lx)은, 전술한 대로이다. 상기 링커 영역(Ly)의 구성 단위가 염기를 포함하는 경우, 상기 링커 영역(Ly)의 염기수는, 그 하한이, 예컨대, 1 염기이고, 바람직하게는 2 염기이며, 보다 바람직하게는 3 염기이고, 그 상한이, 예컨대, 100 염기이며, 바람직하게는 80 염기이고, 보다 바람직하게는 50 염기이다. 상기 각 링커 영역의 염기수는, 구체예로서, 예컨대, 1∼50 염기, 1∼30 염기, 1∼20 염기, 1∼10 염기, 1∼7 염기, 1∼4 염기 등을 예시할 수 있지만, 이것에는 제한되지 않는다.
상기 링커 영역(Ly)은, 예컨대, 상기 링커 영역(Lx)과 동일하여도 좋고, 달라도 좋다.
상기 제2 ssPN 분자의 전체 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 염기수의 합계(전체 길이의 염기수)는, 하한이, 예컨대, 38 염기이고, 바람직하게는 42 염기이며, 보다 바람직하게는 50 염기이고, 더욱 바람직하게는 51 염기이며, 특히 바람직하게는 52 염기이고, 그 상한은, 예컨대, 300 염기이며, 바람직하게는 200 염기이고, 보다 바람직하게는 150 염기이며, 더욱 바람직하게는 100 염기이고, 특히 바람직하게는 80 염기이다. 상기 제2 ssPN 분자에 있어서, 상기 링커 영역(Lx) 및 링커 영역(Ly)을 제외한 염기수의 합계는, 하한이, 예컨대, 38 염기이고, 바람직하게는 42 염기이며, 보다 바람직하게는 50 염기이고, 더욱 바람직하게는 51 염기이며, 특히 바람직하게는 52 염기이고, 상한이, 예컨대, 300 염기이며, 바람직하게는 200 염기이고, 보다 바람직하게는 150 염기이며, 더욱 바람직하게는 100 염기이고, 특히 바람직하게는 80 염기이다.
본 발명의 ssPN 분자는, 전술한 바와 같이, 상기 링커 영역(Lx)이, 상기 비뉴클레오티드 구조를 가지고 있으면 좋고, 그 외의 구성 단위는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 구성 단위는, 예컨대, 뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 리보뉴클레오티드 잔기 및 데옥시리보뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 수식되어 있지 않은 비수식 뉴클레오티드 잔기 및 수식된 수식 뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 상기 수식 뉴클레오티드 잔기를 포함함으로써, 뉴클레아제 내성을 향상시켜, 안정성을 향상 가능하다. 또한, 본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 상기 뉴클레오티드 잔기 외에, 추가로, 비뉴클레오티드 잔기를 포함하여도 좋다.
상기 영역(Xc), 상기 영역(X), 상기 영역(Y) 및 상기 영역(Yc)의 구성 단위는, 각각, 상기 뉴클레오티드 잔기가 바람직하다. 상기 각 영역은, 예컨대, 하기 (1)∼(3)의 잔기로 구성된다.
(1) 비수식 뉴클레오티드 잔기
(2) 수식 뉴클레오티드 잔기
(3) 비수식 뉴클레오티드 잔기 및 수식 뉴클레오티드 잔기
상기 링커 영역(Lx)은, 예컨대, 상기 비뉴클레오티드 잔기만으로 구성되어도 좋고, 상기 비뉴클레오티드와 상기 뉴클레오티드 잔기로 구성되어도 좋다. 상기 링커 영역(Lx)은, 예컨대, 하기 (4)∼(7)의 잔기로 구성된다.
(4) 비뉴클레오티드 잔기
(5) 비뉴클레오티드 잔기 및 비수식 뉴클레오티드 잔기
(6) 비뉴클레오티드 잔기 및 수식 뉴클레오티드 잔기
(7) 비뉴클레오티드 잔기, 비수식 뉴클레오티드 잔기 및 수식 뉴클레오티드 잔기
상기 링커 영역(Ly)의 구성 단위는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 전술한 바와 같이, 상기 뉴클레오티드 잔기 및 상기 비뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 링커 영역은, 예컨대, 상기 뉴클레오티드 잔기만으로 구성되어도 좋고, 상기 비뉴클레오티드 잔기만으로 구성되어도 좋으며, 상기 뉴클레오티드 잔기와 상기 비뉴클레오티드 잔기로 구성되어도 좋다. 상기 링커 영역은, 예컨대, 하기 (1)∼(7)의 잔기로 구성된다.
(1) 비수식 뉴클레오티드 잔기
(2) 수식 뉴클레오티드 잔기
(3) 비수식 뉴클레오티드 잔기 및 수식 뉴클레오티드 잔기
(4) 비뉴클레오티드 잔기
(5) 비뉴클레오티드 잔기 및 비수식 뉴클레오티드 잔기
(6) 비뉴클레오티드 잔기 및 수식 뉴클레오티드 잔기
(7) 비뉴클레오티드 잔기, 비수식 뉴클레오티드 잔기 및 수식 뉴클레오티드 잔기
본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 상기 링커 영역(Lx)을 제외하고, 상기 뉴클레오티드 잔기만으로 구성되는 분자, 상기 뉴클레오티드 잔기 외에 상기 비뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자 등을 들 수 있다. 본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상기 뉴클레오티드 잔기는, 전술한 바와 같이, 예컨대, 상기 비수식 뉴클레오티드 잔기여도 좋고, 상기 수식 뉴클레오티드 잔기여도 좋으며, 상기 비수식 뉴클레오티드 잔기 및 상기 수식 뉴클레오티드 잔기의 양방이어도 좋다. 상기 ssPN 분자가, 상기 비수식 뉴클레오티드 잔기와 상기 수식 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 경우, 상기 수식 뉴클레오티드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 「1 혹은 수개」이고, 구체적으로는, 예컨대, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개이다. 본 발명의 ssPN 분자가, 상기 비뉴클레오티드 잔기를 포함하는 경우, 상기 비뉴클레오티드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 「1 혹은 수개」이고, 구체적으로는, 예컨대, 1 또는 2개이다.
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상기 뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 리보뉴클레오티드 잔기가 바람직하다. 이 경우, 본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 「ssRNA 분자」, 또는 「P-ssRNA 분자」라고도 한다. 상기 ssRNA 분자는, 예컨대, 상기 링커 영역(Lx)을 제외하고, 상기 리보뉴클레오티드 잔기만으로 구성되는 분자, 상기 리보뉴클레오티드 잔기 외에 상기 비뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자 등을 들 수 있다. 상기 ssRNA 분자에 있어서, 상기 리보뉴클레오티드 잔기는, 전술한 바와 같이, 예컨대, 상기 비수식 리보뉴클레오티드 잔기만이어도 좋고, 상기 수식 리보뉴클레오티드 잔기만이어도 좋으며, 상기 비수식 리보뉴클레오티드 잔기 및 상기 수식 리보뉴클레오티드 잔기의 양방을 포함하여도 좋다.
상기 ssRNA 분자가, 예컨대, 상기 비수식 리보뉴클레오티드 잔기 외에 상기 수식 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 경우, 상기 수식 리보뉴클레오티드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 「1 혹은 수개」이며, 구체적으로는, 예컨대, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개이다. 상기 비수식 리보뉴클레오티드 잔기에 대한 상기 수식 리보뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 리보스 잔기가 데옥시리보스 잔기로 치환된 상기 데옥시리보뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 ssRNA 분자가, 예컨대, 상기 비수식 리보뉴클레오티드 잔기 외에 상기 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 경우, 상기 데옥시리보뉴클레오티드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 「1 혹은 수개」이며, 구체적으로는, 예컨대, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개이다.
본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 표지 물질을 포함하고, 상기 표지 물질로 표지화되어도 좋다. 상기 표지 물질은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 형광 물질, 색소, 동위체 등을 들 수 있다. 상기 표지 물질은, 예컨대, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 색소, Cy5 색소 등의 형광단을 들 수 있고, 상기 색소는, 예컨대, Alexa488 등의 Alexa 색소 등을 들 수 있다. 상기 동위체는, 예컨대, 안정 동위체 및 방사성 동위체를 들 수 있고, 바람직하게는 안정 동위체이다. 상기 안정 동위체는, 예컨대, 피폭의 위험성이 적고, 전용 시설도 불필요하기 때문에 취급성이 우수하며, 또한, 비용도 저감할 수 있다. 또한, 상기 안정 동위체는, 예컨대, 표지한 화합물의 물성 변화가 없고, 트레이서로서의 성질도 우수하다. 상기 안정 동위체는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 2H, 13C, 15N, 17O, 18O, 33S, 34S 및 36S 등을 들 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 전술한 바와 같이, 예컨대, 상기 비뉴클레오티드 구조에 상기 표지 물질을 도입하는 것이 바람직하고, 상기 링커 영역(Lx)의 상기 비뉴클레오티드 잔기에 상기 표지 물질을 도입하는 것이 바람직하다. 상기 비뉴클레오티드 잔기에의 표지 물질의 도입은, 예컨대, 간편 또한 저렴하게 행할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 전술한 바와 같이, 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 유전자가 원인으로 되는 질환의 치료제로서 사용할 수 있다. 상기 발현 억제 서열로서, 상기 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 포함하는 상기 ssPN 분자이면, 예컨대, 상기 표적 유전자의 발현 억제에 의해, 상기 질환을 치료할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「치료」는, 예컨대, 상기 질환의 예방, 질환의 개선, 예후의 개선의 의미를 포함하고, 어느 것이어도 좋다.
본 발명의 ssPN 분자의 사용 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 상기 표적 유전자를 갖는 투여 대상에, 상기 ssPN 분자를 투여하면 좋다.
상기 투여 대상은, 예컨대, 세포, 조직 또는 기관 등을 들 수 있다. 상기 투여 대상은, 예컨대, 인간, 인간을 제외한 비인간 포유류 등의 비인간 동물 등을 들 수 있다. 상기 투여는, 예컨대, 생체내여도 시험관내여도 좋다. 상기 세포는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, HeLa 세포, 293 세포, NIH3T3 세포, COS 세포 등의 각종 배양 세포, ES 세포, 조혈 줄기 세포 등의 줄기 세포, 초대 배양 세포 등의 생체로부터 단리한 세포 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 상기 표적 유전자는, 특별히 제한되지 않고, 원하는 유전자를 설정할 수 있으며, 상기 유전자에 따라, 상기 발현 억제 서열을 적절하게 설계하면 좋다.
본 발명의 ssPN 분자의 구체예를 이하에 나타내지만, 본 발명은 이것에는 조금도 제한되지 않는다. 상기 ssPN 분자의 염기 서열은, 예컨대, 서열번호 3, 11, 14∼17 및 23의 염기 서열을 예시할 수 있고, 또한, 상기 염기 서열에 있어서, 예컨대, 1 혹은 수개의 결실, 치환 및/또는 부가된 염기 서열이어도 좋다. 상기 표적 유전자가 GAPDH 유전자인 경우, 예컨대, 서열번호 3 및 11의 염기 서열을 들 수 있고, 표적 유전자가 TGF-β1인 경우, 예컨대, 서열번호 14∼17 및 23의 염기 서열을 들 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자의 용도에 관해서는, 후술하는 본 발명의 조성물, 발현 억제 방법 및 치료 방법 등의 기재를 원용할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 전술한 바와 같이 표적 유전자의 발현을 억제 가능하기 때문에, 예컨대, 의약품, 진단약 및 농약, 및, 농약, 의학, 생명 과학 등의 연구 툴로서 유용하다.
본 발명에 있어서, 「알킬」은, 예컨대, 직쇄형 또는 분지형의 알킬기를 포함한다. 상기 알킬의 탄소수는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 1∼30이며, 바람직하게는, 1∼6 또는 1∼4이다. 상기 알킬기는, 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「알케닐」은, 예컨대, 직쇄형 또는 분지형의 알케닐을 포함한다. 상기 알케닐은, 상기 알킬에 있어서, 1개 또는 복수의 이중 결합을 갖는 것 등을 들 수 있다. 상기 알케닐의 탄소수는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 상기 알킬과 동일하며, 바람직하게는 2∼8이다. 상기 알케닐은, 예컨대, 비닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 1,3-부타디에닐, 3-메틸-2-부테닐 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「알키닐」은, 예컨대, 직쇄형 또는 분지형의 알키닐을 포함한다. 상기 알키닐은, 상기 알킬에 있어서, 1개 또는 복수의 삼중 결합을 갖는 것 등을 들 수 있다. 상기 알키닐의 탄소수는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 상기 알킬과 동일하며, 바람직하게는 2∼8이다. 상기 알키닐은, 예컨대, 에티닐, 프로피닐, 부티닐 등을 들 수 있다. 상기 알키닐은, 예컨대, 추가로, 1개 또는 복수의 이중 결합을 가져도 좋다.
본 발명에 있어서, 「아릴」은, 예컨대, 단환 방향족 탄화수소기 및 다환 방향족 탄화수소기를 포함한다. 상기 단환 방향족 탄화수소기는, 예컨대, 페닐 등을 들 수 있다. 상기 다환 방향족 탄화수소기는, 예컨대, 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안톨릴, 2-안톨릴, 9-안톨릴, 1-페난트릴, 2-페난트릴, 3-페난트릴, 4-페난트릴, 9-페난트릴 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 예컨대, 페닐, 1-나프틸 및 2-나프틸 등의 나프틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「헤테로아릴」은, 예컨대, 단환 방향족 복소환식기 및 축합 방향족 복소환식기를 포함한다. 상기 헤테로아릴은, 예컨대, 푸릴(예: 2-푸릴, 3-푸릴), 티에닐(예: 2-티에닐, 3-티에닐), 피롤릴(예: 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴), 이미다졸릴(예: 1-이미다졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴), 피라졸릴(예: 1-피라졸릴, 3-피라졸릴, 4-피라졸릴), 트리아졸릴(예: 1,2,4-트리아졸-1-일, 1,2,4-트리아졸-3-일, 1,2,4-트리아졸-4-일), 테트라졸릴(예: 1-테트라졸릴, 2-테트라졸릴, 5-테트라졸릴), 옥사졸릴(예: 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴), 이소옥사졸릴(예: 3-이소옥사졸릴, 4-이소옥사졸릴, 5-이소옥사졸릴), 티아졸릴(예: 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴), 티아디아졸릴, 이소티아졸릴(예: 3-이소티아졸릴, 4-이소티아졸릴, 5-이소티아졸릴), 피리딜(예: 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜), 피리다지닐(예: 3-피리다지닐, 4-피리다지닐), 피리미디닐(예: 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐), 푸라자닐(예: 3-푸라자닐), 피라지닐(예: 2-피라지닐), 옥사디아졸릴(예: 1,3,4-옥사디아졸-2-일), 벤조푸릴(예: 2-벤조[b]푸릴, 3-벤조[b]푸릴, 4-벤조[b]푸릴, 5-벤조[b]푸릴, 6-벤조[b]푸릴, 7-벤조[b]푸릴), 벤조티에닐(예: 2-벤조[b]티에닐, 3-벤조[b]티에닐, 4-벤조[b]티에닐, 5-벤조[b]티에닐, 6-벤조[b]티에닐, 7-벤조[b]티에닐), 벤즈이미다졸릴(예: 1-벤조이미다졸릴, 2-벤조이미다졸릴, 4-벤조이미다졸릴, 5-벤조이미다졸릴), 디벤조푸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 퀴녹살릴(예: 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 6-퀴녹살리닐), 시놀리닐(예: 3-시놀리닐, 4-시놀리닐, 5-시놀리닐, 6-시놀리닐, 7-시놀리닐, 8-시놀리닐), 퀴나졸릴(예: 2-퀴나졸리닐, 4-퀴나졸리닐, 5-퀴나졸리닐, 6-퀴나졸리닐, 7-퀴나졸리닐, 8-퀴나졸리닐), 퀴놀릴(예: 2-퀴놀릴, 3-퀴놀릴, 4-퀴놀릴, 5-퀴놀릴, 6-퀴놀릴, 7-퀴놀릴, 8-퀴놀릴), 프탈라지닐(예: 1-프탈라지닐, 5-프탈라지닐, 6-프탈라지닐), 이소퀴놀릴(예: 1-이소퀴놀릴, 3-이소퀴놀릴, 4-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 6-이소퀴놀릴, 7-이소퀴놀릴, 8-이소퀴놀릴), 프릴, 프테리디닐(예: 2-프테리디닐, 4-프테리디닐, 6-프테리디닐, 7-프테리디닐), 카르바졸릴, 페난트리디닐, 아크리디닐(예: 1-아크리디닐, 2-아크리디닐, 3-아크리디닐, 4-아크리디닐, 9-아크리디닐), 인돌릴(예: 1-인돌릴, 2-인돌릴, 3-인돌릴, 4-인돌릴, 5-인돌릴, 6-인돌릴, 7-인돌릴), 이소인돌릴, 페나지닐(예: 1-페나지닐, 2-페나지닐) 또는 페노티아지닐(예: 1-페노티아지닐, 2-페노티아지닐, 3-페노티아지닐, 4-페노티아지닐) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「시클로알킬」은, 예컨대, 환형 포화 탄화수소기이고, 탄소수는, 예컨대, 3∼15이다. 상기 시클로알킬은, 예컨대, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 가교 환식 탄화수소기, 스피로 탄화수소기 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 가교 환식 탄화수소기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「가교 환식 탄화수소기」는, 예컨대, 비시클로[2.1.0]펜틸, 비시클로[2.2.1]헵틸, 비시클로[2.2.2]옥틸 및 비시클로[3.2.1]옥틸, 트리시클로[2.2.1.0]헵틸, 비시클로[3.3.1]노난, 1-아다만틸, 2-아다만틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「스피로 탄화수소기」는, 예컨대, 스피로[3.4]옥틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「시클로알케닐」은, 예컨대, 환형의 불포화 지방족 탄화수소기를 둘러싸고, 탄소수는, 예컨대, 3∼7개이다. 상기 기는, 예컨대, 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로헵테닐 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐 등이다. 상기 시클로알케닐은, 예컨대, 고리 중에 불포화 결합을 갖는 가교 환식 탄화수소기 및 스피로 탄화수소기도 포함한다.
본 발명에 있어서, 「아릴알킬」은, 예컨대, 벤질, 2-페네틸, 및 나프탈레닐메틸 등을 들 수 있고, 「시클로알킬알킬」 또는 「시클릴알킬」은, 예컨대, 시클로헥실메틸, 아다만틸메틸 등을 들 수 있으며, 「히드록시알킬」은, 예컨대, 히드록시메틸 및 2-히드록시에틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「알콕시」는, 예컨대, 상기 알킬-O-기를 포함하고, 예컨대, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 및 n-부톡시 등을 들 수 있으며, 「알콕시알킬」은, 예컨대, 메톡시메틸 등을 들 수 있고, 「아미노알킬」은, 예컨대, 2-아미노에틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「헤테로시클릴」은, 예컨대, 1-피롤리닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 1-피롤리디닐, 2-피롤리디닐, 3-피롤리디닐, 피롤리디논, 1-이미다졸리닐, 2-이미다졸리닐, 4-이미다졸리닐, 1-이미다졸리디닐, 2-이미다졸리디닐, 4-이미다졸리디닐, 이미다졸리디논, 1-피라졸리닐, 3-피라졸리닐, 4-피라졸리닐, 1-피라졸리디닐, 3-피라졸리디닐, 4-피라졸리디닐, 피페리디논, 피페리디노, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-피페리디닐, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐, 피페라지논, 2-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 모르폴리노, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로푸라닐 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「헤테로시클릴알킬」은, 예컨대, 피페리디닐메틸, 피페라지닐메틸 등을 들 수 있고, 「헤테로시클릴알케닐」은, 예컨대, 2-피페리디닐에테닐 등을 들 수 있으며, 「헤테로아릴알킬」은, 예컨대, 피리딜메틸 및 퀴놀린-3-일메틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「실릴」은, 식 R3Si-로 나타내는 기를 포함하고, R은, 독립적으로, 상기 알킬, 아릴 및 시클로알킬에서 선택할 수 있으며, 예컨대, 트리메틸실릴기, tert-부틸디메틸실릴기 등을 들 수 있고, 「실릴옥시」는, 예컨대, 트리메틸실릴옥시기 등을 들 수 있으며, 「실릴옥시알킬」은, 예컨대, 트리메틸실릴옥시메틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「알킬렌」은, 예컨대, 메틸렌, 에틸렌, 및 프로필렌 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 전술한 각종 기는, 치환되어도 좋다. 상기 치환기는, 예컨대, 히드록시, 카르복시, 할로겐, 할로겐화알킬(예: CF3, CH2CF3, CH2CCl3), 니트로, 니트로소, 시아노, 알킬(예: 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸), 알케닐(예: 비닐), 알키닐(예: 에티닐), 시클로알킬(예: 시클로프로필, 아다만틸), 시클로알킬알킬(예: 시클로헥실메틸, 아다만틸메틸), 시클로알케닐(예: 시클로프로페닐), 아릴(예: 페닐, 나프틸), 아릴알킬(예: 벤질, 페네틸), 헤테로아릴(예: 피리딜, 푸릴), 헤테로아릴알킬(예: 피리딜메틸), 헤테로시클릴(예: 피페리딜), 헤테로시클릴알킬(예: 모르폴릴메틸), 알콕시(예: 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시), 할로겐화알콕시(예: OCF3), 알케닐옥시(예: 비닐옥시, 알릴옥시), 아릴옥시(예: 페닐옥시), 알킬옥시카르보닐(예: 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐), 아릴알킬옥시(예: 벤질옥시), 아미노[알킬아미노(예: 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노), 아실아미노(예: 아세틸아미노, 벤조일아미노), 아릴알킬아미노(예: 벤질아미노, 트리틸아미노), 히드록시아미노], 알킬아미노알킬(예: 디에틸아미노메틸), 술파모일, 옥소 등을 들 수 있다.
2. 뉴클레오티드 잔기
상기 뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 구성 요소로서, 당, 염기 및 인산을 포함한다. 상기 뉴클레오티드 잔기는, 전술한 바와 같이, 예컨대, 리보뉴클레오티드 잔기 및 데옥시리보뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 리보뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 당으로서 리보스 잔기를 가지고, 염기로서, 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 우라실(U)을 가지며, 상기 데옥시리보스 잔기는, 예컨대, 당으로서 데옥시리보스 잔기를 가지고, 염기로서, 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 티민(T)을 갖는다.
상기 뉴클레오티드 잔기는, 미수식 뉴클레오티드 잔기 및 수식 뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 미수식 뉴클레오티드 잔기는, 상기 각 구성 요소가, 예컨대, 천연에 존재하는 것과 동일 또는 실질적으로 동일하고, 바람직하게는, 인체에 있어서 천연에 존재하는 것과 동일 또는 실질적으로 동일하다.
상기 수식 뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 상기 미수식 뉴클레오티드 잔기를 수식한 뉴클레오티드 잔기이다. 상기 수식 뉴클레오티드는, 예컨대, 상기 미수식 뉴클레오티드 잔기의 구성 요소 중 어느 것이 수식되어도 좋다. 본 발명에 있어서, 「수식」은, 예컨대, 상기 구성 요소의 치환, 부가 및/또는 결실, 상기 구성 요소에 있어서의 원자 및/또는 작용기의 치환, 부가 및/또는 결실이고, 「개변」이라고 할 수 있다. 상기 수식 뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 천연에 존재하는 뉴클레오티드 잔기, 인공적으로 수식한 뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 상기 천연 유래의 수식 뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 림바흐 등(Limbach et al., 1994, Summary: the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res.22: 2183∼2196)을 참조할 수 있다. 또한, 상기 수식 뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 상기 뉴클레오티드의 대체물의 잔기여도 좋다.
상기 뉴클레오티드 잔기의 수식은, 예컨대, 리보스-인산 골격(이하, 리보인산 골격)의 수식 등을 들 수 있다.
상기 리보인산 골격에 있어서, 예컨대, 리보스 잔기를 수식할 수 있다. 상기 리보스 잔기는, 예컨대, 2'위 탄소를 수식할 수 있고, 구체적으로는, 예컨대, 2'위 탄소에 결합하는 수산기를, 수소 또는 플루오로 등으로 치환할 수 있다. 상기 2'위 탄소의 수산기를 수소로 치환함으로써, 리보스 잔기를 데옥시리보스로 치환할 수 있다. 상기 리보스 잔기는, 예컨대, 입체 이성체로 치환할 수 있고, 예컨대, 아라비노스 잔기로 치환하여도 좋다.
상기 리보인산 골격은, 예컨대, 비리보스 잔기 및/또는 비인산을 갖는 비리보인산 골격으로 치환하여도 좋다. 상기 비리보인산 골격은, 예컨대, 상기 리보인산 골격의 비하전체 등을 들 수 있다. 상기 비리보인산 골격으로 치환된, 상기 뉴클레오티드의 대체물은, 예컨대, 모르폴리노, 시클로부틸, 피롤리딘 등을 들 수 있다. 상기 대체물은, 이 외에, 예컨대, 인공 핵산 모노머 잔기 등을 들 수 있다. 구체예로서, 예컨대, PNA(펩티드 핵산), LNA(Locked Nucleic Acid), ENA(2'-O,4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 PNA이다.
상기 리보인산 골격에 있어서, 예컨대, 인산기를 수식할 수 있다. 상기 리보인산 골격에 있어서, 당 잔기에 가장 가까운 인산기는, α 인산기라고 불린다. 상기 α 인산기는, 음으로 하전하며, 그 전하는, 당 잔기에 비결합인 2개의 산소 원자에 걸쳐, 균일하게 분포하고 있다. 상기 α 인산기에 있어서의 4개의 산소 원자 중, 뉴클레오티드 잔기 사이의 포스포디에스테르 결합에 있어서, 당 잔기와 비결합인 2개의 산소 원자는, 이하, 「비결합(non-linking) 산소」라고도 한다. 한편, 상기 뉴클레오티드 잔기 사이의 포스포디에스테르 결합에 있어서, 당 잔기와 결합하고 있는 2개의 산소 원자는, 이하, 「결합(linking) 산소」라고 한다. 상기 α 인산기는, 예컨대, 비하전이 되는 수식, 또는, 상기 비결합 원자에 있어서의 전하 분포가 비대칭형이 되는 수식을 행하는 것이 바람직하다.
상기 인산기는, 예컨대, 상기 비결합 산소를 치환하여도 좋다. 상기 산소는, 예컨대, S(황), Se(셀레늄), B(붕소), C(탄소), H(수소), N(질소) 및 OR(R은, 예컨대, 알킬기 또는 아릴기) 중 어느 하나의 원자로 치환할 수 있고, 바람직하게는, S로 치환된다. 상기 비결합 산소는, 예컨대, 양방이 치환되어 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 양방이 S로 치환된다. 상기 수식 인산기는, 예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트에스테르, 포스포네이트수소, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴포스포네이트, 및 포스포트리에스테르 등을 들 수 있고, 그 중에서도, 상기 2개의 비결합 산소가 양쪽 모두 S로 치환되어 있는 포스포로디티오에이트가 바람직하다.
상기 인산기는, 예컨대, 상기 결합 산소를 치환하여도 좋다. 상기 산소는, 예컨대, S(황), C(탄소) 및 N(질소) 중 어느 하나의 원자로 치환할 수 있다. 상기 수식 인산기는, 예컨대, N으로 치환한 가교 포스포로아미데이트, S로 치환한 가교 포스포로티오에이트, 및 C로 치환한 가교 메틸렌포스포네이트 등을 들 수 있다. 상기 결합 산소의 치환은, 예컨대, 본 발명의 ssPN 분자의 5' 말단 뉴클레오티드 잔기 및 3' 말단 뉴클레오티드 잔기 중 적어도 한쪽에 있어서 행하는 것이 바람직하고, 5'측의 경우, C에 의한 치환이 바람직하며, 3'측의 경우, N에 의한 치환이 바람직하다.
상기 인산기는, 예컨대, 상기 인 비함유의 링커로 치환하여도 좋다. 상기 링커는, 예컨대, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌옥사이드 링커, 술포네이트, 술폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조, 및 메틸렌옥시메틸이미노 등을 포함하고, 바람직하게는, 메틸렌카르보닐아미노기 및 메틸렌메틸이미노기를 포함한다.
본 발명의 ssPN 분자는, 예컨대, 3' 말단 및 5' 말단 중 적어도 한쪽의 뉴클레오티드 잔기가 수식되어도 좋다. 상기 수식은, 예컨대, 3' 말단 및 5' 말단 중 어느 한쪽이어도 좋고, 양쪽이어도 좋다. 상기 수식은, 예컨대, 전술한 대로이며, 바람직하게는, 말단의 인산기에 행하는 것이 바람직하다. 상기 인산기는, 예컨대, 전체를 수식하여도 좋고, 상기 인산기에 있어서의 1개 이상의 원자를 수식하여도 좋다. 전자의 경우, 예컨대, 인산기 전체의 치환이어도 좋고, 결실이어도 좋다.
상기 말단의 뉴클레오티드 잔기의 수식은, 예컨대, 다른 분자의 부가 등을 들 수 있다. 상기 다른 분자는, 예컨대, 전술한 바와 같은 표지 물질, 보호기 등의 기능성 분자 등을 들 수 있다. 상기 보호기는, 예컨대, S(황), Si(규소), B(붕소), 에스테르 함유기 등을 들 수 있다. 상기 표지 물질 등의 기능성 분자는, 예컨대, 본 발명의 ssPN 분자의 검출 등에 이용할 수 있다.
상기 다른 분자는, 예컨대, 상기 뉴클레오티드 잔기의 인산기에 부가하여도 좋고, 스페이서를 개재하여, 상기 인산기 또는 상기 당 잔기에 부가하여도 좋다. 상기 스페이서의 말단 원자는, 예컨대, 상기 인산기의 상기 결합 산소, 또는, 당잔기의 O, N, S 혹은 C에, 부가 또는 치환할 수 있다. 상기 당잔기의 결합 부위는, 예컨대, 3' 위치의 C 혹은 5' 위치의 C, 또는 이들에 결합하는 원자가 바람직하다. 상기 스페이서는, 예컨대, 상기 PNA 등의 뉴클레오티드 대체물의 말단 원자에, 부가 또는 치환할 수도 있다.
상기 스페이서는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, O(CH2CH2O)nCH2CH2OH, 무염기당, 아미드, 카르복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 티오에테르, 디술피드, 티오요소, 술폰아미드, 및 모르폴리노 등과, 비오틴 시약 및 플루오레세인 시약 등을 포함하여도 좋다. 상기 식에 있어서, n은, 양의 정수이며, n=3 또는 6이 바람직하다.
상기 말단에 부가하는 분자는, 이들 외에, 예컨대, 색소, 인터컬레이트(intercalate)제(예컨대, 아크리딘), 가교제(예컨대, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환식 방향족 탄화수소(예컨대, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예컨대, EDTA), 친유성 담체(예컨대, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄초산, 1-피렌부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미틴산, 미리스틴산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩티드 복합체(예컨대, 안테나페디아펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 인산, 아미노, 머캅토, PEG(예컨대, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환 알킬, 방사선 표지 마커, 효소, 합텐(예컨대, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예컨대, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예컨대, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸클러스터, 아크리딘-이미다졸 복합체, 테트라아자마크로 고리의 Eu3 + 복합체) 등을 들 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 상기 5' 말단이, 예컨대, 인산기 또는 인산기 아날로그로 수식되어도 좋다. 상기 인산화는, 예컨대, 5'일인산((HO)2(O)P-O-5'), 5'이인산((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'), 5'삼인산((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'), 5'-구아노신 캡(7-메틸화 또는 비메틸화, 7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'), 5'-아데노신 캡(Appp), 임의의 수식 또는 비수식 뉴클레오티드 캡구조(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'), 5'일티오인산(포스포로티오에이트: (HO)2(S)P-O-5'), 5'일디티오인산(포스포로디티오에이트: (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올산((HO)2(O)P-S-5'), 황 치환의 일인산, 이인산 및 삼인산(예컨대, 5'-α-티오삼인산, 5'-γ-티오삼인산 등), 5'-포스포르아미데이트((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스폰산(예컨대, RP(OH)(O)-O-5', (OH)2(O)P-5'-CH2, R은 알킬(예컨대, 메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등)), 5'-알킬에테르포스폰산(예컨대, RP(OH)(O)-O-5', R은 알킬에테르(예컨대, 메톡시메틸, 에톡시메틸 등)) 등을 들 수 있다.
상기 뉴클레오티드 잔기에 있어서, 상기 염기는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 염기는, 예컨대, 천연의 염기여도 좋고, 비천연의 염기여도 좋다. 상기 염기는, 예컨대, 천연 유래여도 좋고, 합성품이어도 좋다. 상기 염기는, 예컨대, 일반적인 염기, 그 수식 아날로그 등을 사용할 수 있다.
상기 염기는, 예컨대, 아데닌 및 구아닌 등의 퓨린 염기, 시토신, 우라실 및 티민 등의 피리미딘 염기 등을 들 수 있다. 상기 염기는, 이 외에, 이노신, 티민, 크산틴, 하이포크산틴, 누뷸라린(nubularine), 이소구아니신(isoguanisine), 튜베르시딘(tubercidine) 등을 들 수 있다. 상기 염기는, 예컨대, 2-아미노아데닌, 6-메틸화퓨린 등의 알킬 유도체; 2-프로필화퓨린 등의 알킬 유도체; 5-할로우라실 및 5-할로시토신; 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신; 6-아조우라실, 6-아조시토신 및 6-아조티민; 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노알릴우라실; 8-할로화, 아미노화, 티올화, 티오알킬화, 히드록실화 및 그 외 8-치환 퓨린; 5-트리플루오로메틸화 및 그 외 5-치환 피리미딘; 7-메틸구아닌; 5-치환 피리미딘; 6-아자피리미딘; N-2, N-6, 및 O-6 치환 퓨린(2-아미노프로필아데닌을 포함함); 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신; 디히드로우라실; 3-데아자-5-아자시토신; 2-아미노퓨린; 5-알킬우라실; 7-알킬구아닌; 5-알킬시토신; 7-데아자아데닌; N6, N6-디메틸아데닌; 2,6-디아미노퓨린; 5-아미노-알릴-우라실; N3-메틸우라실; 치환 1,2,4-트리아졸; 2-피리디논; 5-니트로인돌; 3-니트로피롤; 5-메톡시우라실; 우라실-5-옥시초산; 5-메톡시카르보닐메틸우라실; 5-메틸-2-티오우라실; 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우라실; 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실; 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실; 3-메틸시토신; 5-메틸시토신; N4-아세틸시토신; 2-티오시토신; N6-메틸아데닌; N6-이소펜틸아데닌; 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌; N-메틸구아닌; O-알킬화 염기 등을 들 수 있다. 또한, 퓨린 및 피리미딘은, 예컨대, 미국 특허 제3,687,808호, 「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」, 858∼859페이지, 크로쉬비츠 제이 아이(Kroschwitz J.I.) 편저, John Wiley & Sons, 1990, 및 잉글리시 등(Englisch 등), Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30권, p.613에 개시된 것이 포함된다.
상기 수식 뉴클레오티드 잔기는, 이들 외에, 예컨대, 염기를 결실하는 잔기, 즉, 무염기의 리보인산 골격을 포함하여도 좋다. 또한, 상기 수식 뉴클레오티드 잔기는, 예컨대, 미국 가출원 제60/465,665호(출원일: 2003년 4월 25일), 및 국제 출원 제PCT/US04/07070호(출원일: 2004년 3월 8일)에 기재된 잔기를 사용할 수 있고, 본 발명은 이들 문헌을 원용할 수 있다.
3. 본 발명의 ssPN 분자의 합성 방법
본 발명의 ssPN 분자의 합성 방법은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 상기 합성 방법은, 예컨대, 유전자 공학적 방법에 의한 합성법, 화학 합성법 등을 들 수 있다. 유전자 공학적 방법은, 예컨대, 인비트로 전사 합성법, 벡터를 이용하는 방법, PCR 카세트에 의한 방법 등을 들 수 있다. 상기 벡터는, 특별히 제한되지 않고, 플라스미드 등의 비바이러스 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 이것에 한정되지 않는다. 상기 화학 합성법은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 포스포로아미다이트법 및 H-포스포네이트법 등을 들 수 있다. 상기 화학 합성법은, 예컨대, 시판의 자동 핵산 합성기를 사용 가능하다. 상기 화학 합성법은, 일반적으로, 아미다이트가 사용된다. 상기 아미다이트는, 특별히 제한되지 않고, 시판의 아미다이트로서, 예컨대, RNA 포스포로아미다이트(2'-O-TBDMSi, 상품명, 삼천리 제약), ACE 아미다이트, TOM 아미다이트, CEE 아미다이트, CEM 아미다이트, TEM 아미다이트 등을 들 수 있다. 본 발명의 ssPN 분자에 대해서는, 예컨대, 상기 식 (I)로 표시되는 링커 영역의 합성 시, 후술하는 본 발명의 모노머를 사용하는 것이 바람직하다.
4. 조성물
본 발명의 발현 억제용 조성물은, 전술한 바와 같이, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물이고, 상기 본 발명의 ssPN 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물은, 상기 본 발명의 ssPN 분자를 포함하는 것이 특징이고, 그 외의 구성은, 조금도 제한되지 않는다. 본 발명의 발현 억제용 조성물은, 예컨대, 발현 억제용 시약이라고 할 수도 있다.
본 발명에 따르면, 예컨대, 상기 표적 유전자가 존재하는 대상에 투여함으로써, 상기 표적 유전자의 발현 억제를 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은, 전술한 바와 같이, 상기 본 발명의 ssPN 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물은, 상기 본 발명의 ssPN 분자를 포함하는 것이 특징이고, 그 외의 구성은 조금도 제한되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은, 예컨대, 의약품이라고 할 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은, 예컨대, 의약품이라고 할 수도 있다.
본 발명에 따르면, 예컨대, 유전자가 원인으로 되는 질환의 환자에게 투여함으로써, 상기 유전자의 발현을 억제하여, 상기 질환을 치료할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「치료」는, 전술한 바와 같이, 예컨대, 상기 질환의 예방, 질환의 개선, 예후의 개선의 의미를 포함하며, 어느 것이어도 좋다.
본 발명에 있어서, 치료의 대상이 되는 질환은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 유전자의 발현이 원인으로 되는 질환 등을 들 수 있다. 상기 질환의 종류에 따라, 그 질환의 원인이 되는 유전자를 상기 표적 유전자로 설정하고, 또한, 상기 표적 유전자에 따라, 상기 발현 억제 서열을 적절하게 설정하면 좋다.
구체예로서, 상기 표적 유전자를 상기 TGF-β1 유전자로 설정하고, 상기 유전자에 대한 발현 억제 서열을 상기 ssPN 분자에 배치하면, 예컨대, 염증성 질환, 구체적으로는, 급성 폐상해 등의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 발현 억제용 조성물 및 약학적 조성물(이하, 조성물이라고 함)의 사용 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 상기 표적 유전자를 갖는 투여 대상에, 상기 ssPN 분자를 투여하면 좋다.
상기 투여 대상은, 예컨대, 세포, 조직 또는 기관 등을 들 수 있다. 상기 투여 대상은, 예컨대, 인간, 인간을 제외한 비인간 포유류 등의 비인간 동물 등을 들 수 있다. 상기 투여는, 예컨대, 생체내여도 시험관내여도 좋다. 상기 세포는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, HeLa 세포, 293 세포, NIH3T3 세포, COS 세포 등의 각종 배양 세포, ES 세포, 조혈 줄기 세포 등의 줄기 세포, 초대 배양 세포 등의 생체로부터 단리한 세포 등을 들 수 있다.
상기 투여 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 투여 대상에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 상기 투여 대상이 배양 세포인 경우, 예컨대, 트랜스펙션 시약을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있다. 상기 투여가 생체내인 경우, 예컨대, 경구 투여라도 좋고, 비경구 투여라도 좋다. 상기 비경구 투여는, 예컨대, 주사, 피하 투여, 국소 투여 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은, 예컨대, 본 발명의 ssPN 분자만을 포함하여도 좋고, 추가로 그 외의 첨가물을 포함하여도 좋다. 상기 첨가물은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 약학적으로 허용된 첨가물이 바람직하다. 상기 첨가물의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 투여 대상의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 ssPN은, 예컨대, 상기 첨가물과 복합체를 형성하여도 좋다. 상기 첨가물은, 예컨대, 복합화제라고 할 수도 있다. 상기 복합체에 의해, 예컨대, 상기 ssPN 분자를 효율적으로 딜리버리할 수 있다. 상기 ssPN 분자와 상기 복합화제의 결합은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 비공유 결합 등을 들 수 있다. 상기 복합체는, 예컨대, 포접 복합체 등을 들 수 있다.
상기 복합화제는, 특별히 제한되지 않고, 폴리머, 시클로덱스트린, 아다만틴 등을 들 수 있다. 상기 시클로덱스트린은, 예컨대, 선형 시클로덱스트린 코폴리머, 선형 산화시클로덱스트린 코폴리머 등을 들 수 있다.
상기 첨가제는, 이 외에, 예컨대, 담체, 표적 세포에의 결합 물질, 축합제, 융합제 등을 들 수 있다.
상기 담체는, 예컨대, 고분자가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 생체 고분자이다. 상기 담체는, 예컨대, 생분해성이 바람직하다. 상기 담체는, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 리포 단백질(LDL), 글로불린 등의 단백질; 예컨대, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 시클로덱스트린, 히알루론산 등의 당질; 지질 등을 들 수 있다. 상기 담체는, 예컨대, 합성 폴리아미노산 등의 합성 폴리머도 사용할 수 있다. 상기 폴리아미노산은, 예컨대, 폴리리신(PLL), 폴리L-아스파라긴산, 폴리L-글루타민산, 스티렌-말레산 무수물 코폴리머, 폴리(L-락티드-코-글리콜라이드) 코폴리머, 디비닐에테르-말레산 무수물 코폴리머, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 코폴리머(HMPA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 폴리머, 또는 폴리포스파진(polyphosphazine) 등을 들 수 있다.
상기 결합 물질은, 예컨대, 갑상선 자극 호르몬, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 렉틴, 당단백질, 계면 활성제 프로테인 A, 뮤신당질, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 글리코실화폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타민산, 폴리아스파라긴산, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 엽산염, 비타민 B12, 비오틴, 네프록신(Neproxin), RGD 펩티드, RDG 펩티드 의사체 등을 들 수 있다.
상기 융합제 및 축합제는, 예컨대, 폴리에틸렌이민(PEI) 등의 폴리아미노쇄 등을 들 수 있다. PEI는, 예컨대, 직쇄형 및 분기형 중 어느 것이어도 좋고, 또한, 합성물 및 천연물 중 어느 것이어도 좋다. 상기 PEI는, 예컨대, 알킬 치환되어도 좋고, 지질 치환되어도 좋다. 또한, 상기 융합제는, 이 외에, 예컨대, 폴리히스티딘, 폴리이미다졸, 폴리피리딘, 폴리프로필렌이민, 멜리틴, 폴리아세탈 물질(예컨대, 카치온성 폴리아세탈 등) 등을 사용할 수 있다. 상기 융합제는, 예컨대, α 나선 구조를 가져도 좋다. 상기 융합제는, 예컨대, 멜리틴 등의 막 붕괴제여도 좋다.
본 발명의 조성물은, 예컨대, 상기 복합체의 형성 등에 대해서, 미국 특허 제6,509,323호, 미국 특허 공보 제2003/0008818호, PCT/US04/07070호 등을 원용할 수 있다.
상기 첨가제는, 이 외에, 예컨대, 양친매성 분자 등을 들 수 있다. 상기 양친매성 분자는, 예컨대, 소수성 영역 및 친수성 영역을 갖는 분자이다. 상기 분자는, 예컨대, 폴리머가 바람직하다. 상기 폴리머는, 예컨대, 이차 구조를 갖는 폴리머이며, 반복성의 이차 구조를 갖는 폴리머가 바람직하다. 구체예로서는, 예컨대, 폴리펩티드가 바람직하고, 보다 바람직하게는, α 나선형 폴리펩티드 등이다.
상기 양친매성 폴리머는, 예컨대, 2개 이상의 양친매성 서브 유닛을 갖는 폴리머여도 좋다. 상기 서브 유닛는, 예컨대, 적어도 하나의 친수성기 및 하나의 소수성기를 갖는 환형 구조를 갖는 서브 유닛 등을 들 수 있다. 상기 서브 유닛은, 예컨대, 콜산 등의 스테로이드, 방향족 구조 등을 가져도 좋다. 상기 폴리머는, 예컨대, 방향족 서브 유닛 등의 환형 구조 서브 유닛과 아미노산의 양방을 가져도 좋다.
5. 발현 억제 방법
본 발명의 발현 억제 방법은, 전술한 바와 같이, 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 본 발명의 ssPN 분자를 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 발현 억제 방법은, 상기 본 발명의 ssPN 분자를 사용하는 것을 특징으로 하며, 그 외의 공정 및 조건은, 조금도 제한되지 않는다.
본 발명의 발현 억제 방법에 있어서, 상기 유전자의 발현 억제의 메커니즘은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, RNA 간섭에 의한 발현 억제 등을 들 수 있다. 여기서, 본 발명의 발현 억제 방법은, 예컨대, 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭을 유도하는 방법이며, 상기 본 발명의 ssPN 분자를 사용하는 것을 특징으로 하는 발현 유도 방법이라고도 할 수 있다.
본 발명의 발현 억제 방법은, 예컨대, 상기 표적 유전자가 존재하는 대상에, 상기 ssPN 분자를 투여하는 공정을 포함한다. 상기 투여 공정에 의해, 예컨대, 상기 투여 대상에 상기 ssPN 분자를 접촉시킨다. 상기 투여 대상은, 예컨대, 세포, 조직 또는 기관 등을 들 수 있다. 상기 투여 대상은, 예컨대, 인간, 인간을 제외한 비인간 포유류 등의 비인간 동물 등을 들 수 있다. 상기 투여는, 예컨대, 생체내여도 시험관내여도 좋다.
본 발명의 발현 억제 방법은, 예컨대, 상기 ssPN 분자를 단독으로 투여하여도 좋고, 상기 ssPN 분자를 포함하는 상기 본 발명의 조성물을 투여하여도 좋다. 상기 투여 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 투여 대상의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
6. 치료 방법
본 발명의 질환의 치료 방법은, 전술한 바와 같이, 상기 본 발명의 ssPN 분자를, 환자에게 투여하는 공정을 포함하고, 상기 ssPN 분자가, 상기 발현 억제 서열로서, 상기 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 치료 방법은, 상기 본 발명의 ssPN 분자를 사용하는 것을 특징으로 하며, 그 외의 공정 및 조건은, 조금도 제한되지 않는다. 본 발명의 치료 방법은, 예컨대, 상기 본 발명의 발현 억제 방법을 원용할 수 있다.
7. ssPN 분자의 용도
본 발명의 용도는, 상기 표적 유전자의 발현 억제를 위한, 상기 본 발명의 ssPN 분자의 용도이다. 또한, 본 발명의 용도는, RNA 간섭의 유도를 위한, 상기 본 발명의 ssPN 분자의 용도이다.
본 발명의 핵산 분자는, 질환의 치료에 사용하기 위한 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자는, 상기 본 발명의 ssPN 분자이며, 상기 ssPN 분자가, 상기 발현 억제 서열로서, 상기 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
8. 모노머
본 발명의 모노머는, 핵산 합성용의 모노머로서, 하기 식 (II)의 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 모노머는, 특별히 나타내지 않는 한, 상기 본 발명의 ssPN 분자의 설명을 원용할 수 있다.
Figure 112013016609314-pct00005
본 발명의 모노머는, 예컨대, 상기 본 발명의 ssPN 분자의 합성에 있어서, 상기 식 (I)로 표시되는 링커 영역(Lx) 및 링커 영역(Ly)을 용이하게 합성할 수 있다. 본 발명의 모노머는, 예컨대, 자동 핵산 합성용의 아미다이트로서 사용할 수 있고, 예컨대, 일반적인 핵산 자동 합성 장치에 적용 가능하다. 상기 합성 방법은, 예컨대, 포스포로아미다이트법, 및, H-포스포네이트법 등을 들 수 있다.
상기 식 중,
X1 및 X2는, 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH이고;
Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S이며;
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, H, 보호기 또는 인산 보호기이고;
R3은, 고리 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이며;
L1은, n개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이고, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 혹은 SRa로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋으며, 또는,
L1은, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가, 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이고,
단, Y1이, NH, O 또는 S인 경우, Y1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, OR1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며;
L2는, m개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이고, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 혹은 SRc로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋으며, 또는,
L2는, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가, 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이고,
단, Y2가, NH, O 또는 S인 경우, Y2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, OR2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며;
Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고;
l은, 1 또는 2이며;
m은, 0∼30의 범위의 정수이고;
n은, 0∼30의 범위의 정수이며;
고리 A는, 상기 고리 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가, 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 좋고,
상기 고리 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함하여도 좋다.
상기 식 (II)에 있어서, 상기 식 (I)과 동일 개소는, 상기 식 (I)의 설명을 원용할 수 있다. 구체적으로, 상기 식 (II)에 있어서, 예컨대, X1, X2, Y1, Y2, R3, L1, L2, l, m, n 및 고리 A는, 상기 식 (I)의 설명을 전부 원용할 수 있다.
상기 식 (II)에 있어서, R1 및 R2는, 전술한 바와 같이, 각각 독립적으로, H, 보호기 또는 인산 보호기이다.
상기 보호기는, 예컨대, 상기 식 (I)에 있어서의 설명과 동일하며, 구체예로서, 예컨대, 군 I에서 선택할 수 있다. 상기 군 I은, 예컨대, 디메톡시트리틸(DMTr)기, TBDMS기, ACE기, TOM기, CEE기, CEM기, TEM기, 및, 하기 식에 나타내는 실릴 함유기를 들 수 있고, 그 중에서도, DMTr기 및 상기 실릴 함유기 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
[화학식 5]
Figure 112013016609314-pct00006
상기 인산 보호기는, 예컨대, 하기 식으로 나타낼 수 있다.
-P(OR6)(NR7R8)
상기 식에 있어서, R6은, 수소 원자 또는 임의의 치환기이다. 치환기 R6은, 예컨대, 탄화수소기가 바람직하고, 상기 탄화수소기는, 전자 흡인기로 치환되어 있어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 치환기 R6은, 예컨대, 할로겐, 할로알킬, 헤테로아릴, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 및, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬 등의 탄화수소 등을 들 수 있고, 추가로, 전자 흡인기로 치환되어 있어도 좋으며, 치환되어 있지 않아도 좋다. 치환기 R6은, 구체적으로는, 예컨대, β-시아노에틸기, 니트로페닐에틸기, 메틸기 등을 들 수 있다.
R7 및 R8은, 각각, 수소 원자 또는 임의의 치환기이며, 동일하여도 달라도 좋다. 치환기 R7 및 R8은, 예컨대, 탄화수소기가 바람직하고, 상기 탄화수소기는, 추가로 임의의 치환기로 치환되어 있어도 좋으며, 치환되어 있지 않아도 좋다. 상기 탄화수소기는, 예컨대, 전술한 상기 R6에서의 열거와 동일하며, 바람직하게는, 메틸기, 에틸기, 이소프로필기이다. 이 경우, -NR7R8은, 구체적으로는, 예컨대, 디이소프로필아미노기, 디에틸아미노기, 에틸메틸아미노기 등을 들 수 있다. 또는, 치환기 R7 및 R8이 일체가 되어, 이들이 결합하는 질소 원자와 함께(즉, -NR7R8이 일체가 되어), 질소 함유 고리(예컨대, 피페리딜기, 모르폴리노기 등)를 형성하여도 좋다.
상기 인산 보호기의 구체예로서는, 예컨대, 하기 군 II에서 선택할 수 있다. 군 II는, 예컨대, -P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2), -P(OCH3)(N(i-Pr)2) 등을 들 수 있다. 상기 식에 있어서, i-Pr는, 이소프로필을 나타낸다.
상기 식 (II)에 있어서, 예컨대, R1 및 R2는, 어느 한쪽이, H 또는 보호기이며, 다른쪽이, H 또는 인산 보호기이다. 바람직하게는, 예컨대, R1이, 상기 보호기인 경우, R2는, H 또는 상기 인산 보호기가 바람직하고, 구체적으로는, R1이, 상기 군 I에서 선택되는 경우, R2는, H 또는 상기 군 II에서 선택되는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는, 예컨대, R1이, 상기 인산 보호기인 경우, R2는, H 또는 상기 보호기가 바람직하고, 구체적으로는, R1이, 상기 군 II에서 선택되는 경우, R2는, H 또는 상기 군 I에서 선택되는 것이 바람직하다.
상기 식 (II)의 구조는, 예컨대, 하기 식 (II-1)∼식 (II-9)를 예시할 수 있고, 하기 식에 있어서, n 및 m은, 상기 식 (II)와 동일하다. 하기 식에 있어서, q는, 0∼10의 정수이다.
Figure 112013016609314-pct00007
상기 식 (II-1)∼(II-9)에 있어서, n, m 및 q는, 특별히 제한되지 않고, 전술한 대로이다. 구체예로서, 상기 식 (II-1)에 있어서, n=8, 상기 (II-2)에 있어서, n=3, 상기 식 (II-3)에 있어서, n=4 또는 8, 상기 (II-4)에 있어서, n=7 또는 8, 상기 식 (II-5)에 있어서, n=3 및 m=4, 상기 (II-6)에 있어서, n=8 및 m=4, 상기 식 (II-7)에 있어서, n=8 및 m=4, 상기 (II-8)에 있어서, n=5 및 m=4, 상기 식 (II-9)에 있어서, q=1 및 m=4를 들 수 있다. 상기 식 (II-4)의 일례(n=8)를, 하기 식 (II-4a)에, 상기 식 (II-8)의 일례(n=5, m=4)를, 하기 식 (II-8a)에 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00008
본 발명의 모노머는, 예컨대, 상기 표지 물질을 포함하는 것이 바람직하고, 그 중에서도, 상기 안정 동위체를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 표지 물질은, 전술한 대로이다.
본 발명의 모노머가, 상기 안정 동위체 등의 동위체를 포함하는 경우, 예컨대, 간편하게, 상기 본 발명의 ssPN 분자에 상기 동위체를 도입할 수 있다. 동위체를 갖는 상기 모노머는, 예컨대, 상기 동위체를 도입한 피롤리딘 골격의 원료 및 피페리딘 골격의 원료로부터, 합성 가능하다. 상기 피롤리딘 골격의 원료는, 예컨대, 프롤린 및 프롤리놀 등을 들 수 있다.
이하에, 안정 동위체가 도입된 프롤린 및 프롤리놀을 원료로 하여, 안정 동위체가 도입된 본 발명의 모노머를 동성으로 하는 스킴을 예시한다. 이하의 스킴은 예시로서, 본 발명은 이것에 제한되지 않는다.
Figure 112013016609314-pct00009
안정 동위체가 도입된 프롤리놀로서, 예컨대, 중수소(D)가 도입된 프롤리놀은, 예컨대, 하기 식에 나타내는 바와 같이, 프롤린을 LiAlD4로 처리함으로써 조제할 수 있다.
Figure 112013016609314-pct00010
안정 동위체가 도입된 프롤린으로서, 예컨대, 중산소(18O)가 도입된 프롤린은, 예컨대, 하기 식에 나타내는 바와 같이, 염기성 조건 하에서, 프롤린메틸에스테르를 H2 18O와 반응시킴으로써 조제할 수 있다.
Figure 112013016609314-pct00011
중질소(15N) 도입 프롤린(프롤린-15N) 및 중질소(15N) 도입 프롤리놀(프롤리놀-15N)은, 예컨대, 이하의 스킴에 따라 합성할 수 있다. 즉, 우선, 푸란 또는 테트라히드로푸란과 15NH3을 반응시켜, 중질소(15N) 도입 피롤을 조제하고, 이것을 포르밀화하여, 중질소(15N) 도입 2-포르밀피롤을 얻는다. 이것을 카르복실산으로 산화하고, 피롤 부위를 환원함으로써, 프롤린-15N을 합성할 수 있다. 또한, 상기 중질소(15N) 도입 2-포르밀피롤을 환원함으로써, 프롤리놀-15N을 합성할 수 있다.
Figure 112013016609314-pct00012
상기 중탄소(13C) 도입 프롤린(프롤린-13C) 및 상기 중탄소(13C) 도입 프롤리놀(프롤리놀-13C)은, 예컨대, 이하의 스킴에 따라 합성할 수 있다. 즉, 우선, 피롤을, 상기 중탄소(13C) 도입 DMF(DMF-13C)에 의해 포르밀화하고, 중탄소(13C) 도입 2-포르밀피롤을 얻는다. 이것을 카르복실산으로 산화하고, 피롤 부위를 환원함으로써, 프롤린-13C를 합성할 수 있다. 또한, 상기 중탄소(13C) 도입 2-포르밀피롤을 환원함으로써, 프롤리놀-13C를 합성할 수 있다.
Figure 112013016609314-pct00013
이와 같이 하여, 안정 동위체가 도입된 모노머가 합성 가능하고, 또한, 상기 모노머를 합성용 아미다이트로서 사용함으로써, 안정 동위체가 상기 링커 영역에 도입된 핵산 분자를 합성 가능하다.
이하에 실시예 등에 의해 본 발명을 자세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것이 아니다.
실시예
(실시예 A1)
1. 프롤리놀의 합성
하기 식에 나타내는 스킴 1에 따라, 디메톡시트리틸기로 보호된 프롤리놀을 합성하였다.
Figure 112013016609314-pct00014
(1) Fmoc-L-프롤리놀(화합물 2)
L-프롤리놀(화합물 1)(0.61 g, 6.0 m㏖)을, 순수 70 mL에 용해하여, L-프롤리놀 수용액을 조제하였다. N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐옥시)숙신이미드(Fmoc-OSu)(2.0 g, 6.0 m㏖)를, THF 10 mL에 용해하였다. 이 THF 용액을, 상기 L-프롤리놀 수용액에 부가하고, 1시간 교반하여, 양자를 반응시켰다. 이 반응액을, 액체 획분과 침전 획분으로 분리하고, 각각의 획분을 초산에틸로 추출하여, 각각 유기층을 회수하였다. 그리고, 각각의 유기층을 합한 후, 무수 황산나트륨을 첨가하여, 수분을 흡수시켰다(이하, 건조라고 함). 상기 유기층을 여과하여, 여과액을 회수하고, 상기 여과액을 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:초산에틸=1:1)에 의해 정제하여, 화합물 2를 얻었다(1.4 g, 수율 74％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00015
(2) Fmoc-DMTr-L-프롤리놀(화합물 3)
상기 Fmoc-L-프롤리놀(화합물 2)(1.4 g, 4.3 m㏖)을, 피리딘 20 mL에 용해하여, 3회 공비하였다. 얻어진 잔류물을, 피리딘 20 mL에 용해하였다. 이 용액을, 아르곤 하, 빙욕(ice bath) 중에서, 교반하면서, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(DMTr-Cl)(1.8 g, 5.3 m㏖)를 첨가하였다. 이 반응액에 대해서, 클로로포름/메탄올의 TLC에 의해 반응을 추적하며, Fmoc-L-프롤리놀의 스폿이 없어질 때까지, 4시간 반응시켰다. 그리고, 과잉의 DMTr-Cl을 켄치하기 위해, 상기 반응액에, 메탄올 3 mL를 부가하여 10분 교반하였다. 상기 반응액에, 추가로, 클로로포름을 부가한 후, 유기층을 회수하였다. 회수한 상기 유기층에, 포화 식염수에 의한 세정, 5％ 탄산수소나트륨 수용액에 의한 세정을 행하고, 재차, 포화 식염수에 의한 세정을 행하였다. 세정 후의 유기층을, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하여, 얻어진 여과액을 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 클로로포름, 1％ 피리딘)에 의해 정제하여, 화합물 3을 얻었다(2.0 g, 수율 74％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00016
(3) DMTr-L-프롤리놀(화합물 4)
상기 Fmoc-DMTr-L-프롤리놀(화합물 3)(2.0 g, 3.2 m㏖)을, 20％ 피페리딘을 포함하는 DMF 용액 25 mL에 용해하여, 12시간 교반하였다. 이 용액을 감압 농축하여, 얻어진 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=85:15, 1％ 피리딘 함유)로 정제하여, 화합물 4를 얻었다(1.0 g, 수율 78％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00017
2. 아미다이트 유도체의 합성
다음에, 하기 식에 나타내는 스킴 2에 따라, 프롤리놀을 갖는 아미다이트 유도체를 합성하였다. 이하, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염을, 「EDC」, N,N-디메틸아미노피리딘(4-디메틸아미노피리딘)을 「DMAP」라고 한다.
Figure 112013016609314-pct00018
(1) DMTr-아미드-L-프롤리놀(화합물 5)
상기 DMTr-L-프롤리놀(화합물 4)(0.80 g, 2.0 m㏖), EDC(0.46 g, 2.4 m㏖) 및 DMAP(0.29 g, 2.4 m㏖)를, 디클로로메탄 20 mL에 용해하여 교반하였다. 이 용액에, 10-히드록시데칸산(0.45 g, 2.4 m㏖)을 첨가하여, 교반하였다. 이 반응액에 대해서, 초산에틸의 TLC에 의해 반응을 추적하며, DMTr-L-프롤리놀의 스폿이 없어질 때까지, 20시간 반응시켰다. 그리고, 상기 반응액에, 디클로로메탄을 부가한 후, 유기층을 회수하였다. 회수한 상기 유기층을, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하여, 얻어진 여과액을 감압 농축하고, 그 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(초산에틸, 1％ 피리딘 함유)에 의해 정제하여, 화합물 5를 얻었다(0.71 g, 수율 62％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00019
Figure 112013016609314-pct00020
Figure 112013016609314-pct00021
(2) DMTr-알킬-L-프롤리놀(화합물 6)
상기 DMTr-L-프롤리놀(화합물 4)(0.80 g, 2.0 m㏖)을, 메탄올 15 mL에 용해하고, 5-히드록시펜탄알(0.31 g, 3.0 m㏖)을 부가하여 교반하였다. 이 용액에, 시아노수소화붕소나트륨(0.25 g, 4.0 m㏖)을 부가하여, 추가로 교반하였다. 이 반응액에 대해서, 초산에틸/헥산의 TLC에 의해 반응을 추적하며, DMTr-L-프롤리놀의 스폿이 없어질 때까지, 24시간 반응시켰다. 그리고, 상기 반응액에, 초산에틸을 부가하여, 유기층을 회수하였다. 회수한 상기 유기층을, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하여, 얻어진 여과액을 감압 농축하고, 그 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:초산에틸=1:1, 1％ 피리딘 함유)에 의해 정제하여, 화합물 6을 얻었다(0.62 g, 수율 63％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00022
(3) DMTr-우레탄-L-프롤리놀(화합물 7)
1,4-부탄디올(0.90 g, 10 m㏖)을, 디클로로메탄 30 mL에 용해하고, 추가로, 카르보닐디이미다졸(1.4 g, 8.6 m㏖)을 부가하여, 3시간 교반하였다. 이 반응액의 유기층을, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하여, 얻어진 여과액을 감압 농축하고, 그 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=9:1)에 의해 정제하였다. 이에 의해, 1,4-부탄디올의 한쪽의 말단이 카르보닐디이미다졸로 활성화된 화합물을 얻었다(0.25 g, 1.5 m㏖). 이 화합물을 디클로로메탄 15 mL에 용해하고, 상기 DMTr-L-프롤리놀(화합물 4)(0.6 g, 1.5 m㏖)을 첨가하여, 24시간 교반하였다. 이 혼합액에, 추가로, 초산에틸을 부가하여, 유기층을 회수하였다. 회수한 상기 유기층을, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하여, 얻어진 여과액을 감압 농축하고, 그 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:초산에틸=1:1, 1％ 피리딘 함유)에 의해 정제하여, 화합물 7을 얻었다(0.61 g, 수율 77％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00023
(4) DMTr-우레이도-L-프롤리놀(화합물 8)
상기 DMTr-L-프롤리놀(화합물 4)(0.50 g, 1.2 m㏖) 및 트리포스겐(0.12 g, 0.40 m㏖)을, 디클로로메탄 8 mL에 용해하고, 아르곤 하, 빙욕 중에서, 교반하였다. 그리고, 상기 용액에, N,N-디이소프로필에틸아민(0.31 g, 2.4 m㏖)을 첨가하여, 1시간 교반하였다. 추가로, 상기 용액에, 8-아미노-1-옥탄올(0.17 g, 1.2 m㏖)을 첨가하여, 동일하게 하여 빙욕 중에서 30분 교반한 후, 실온에서 20시간 교반하였다. 상기 용액에, 디클로로메탄을 부가하여, 유기층을 회수하였다. 회수한 상기 유기층을, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하여, 얻어진 여과액을 감압 농축하고, 그 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:초산에틸=4:1, 1％ 트리에틸아민 함유)에 의해 정제하여, 화합물 8을 얻었다(0.44 g, 수율 62％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00024
(5) 프롤리놀을 갖는 아미다이트 유도체(화합물 9∼12)
상기 수식 프롤리놀(화합물 5∼8)을, 각각 원료로 하여, 이하에 나타내는 방법에 의해, 화합물 9∼12를 합성하였다. 상기 수식 프롤리놀 및 5-벤질티오-1H-테트라졸을, 아세토니트릴 3 mL에 용해하였다. 상기 수식 프롤리놀의 사용량은, 화합물 5의 경우, 0.69 g(1.2 m㏖), 화합물 6의 경우, 0.60 g(1.2 m㏖), 화합물 7의 경우, 0.60 g(1.2 m㏖), 화합물 8의 경우, 0.25 g(0.43 m㏖)으로 하였다. 또한, 5-벤질티오-1H-테트라졸의 사용량은, 화합물 5∼7에 대해서는, 0.15 g(0.78 m㏖), 화합물 8에 대해서는, 54 ㎎(0.15 m㏖)으로 하였다. 상기 용액에, 아르곤 하, 2-시아노에틸N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를 첨가하여, 2시간 교반하였다. 상기 2-시아노에틸N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트의 첨가량은, 상기 화합물 5∼7을 사용한 시스템에서는, 0.54 g(1.8 m㏖)으로 하고, 상기 화합물 8을 사용한 시스템에서는, 0.19 g(0.64 m㏖)으로 하였다. 그리고, 상기 용액에, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 추가로, 디클로로메탄으로 추출하여, 유기층을 회수하였다. 회수한 상기 유기층을, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하여, 얻어진 여과액을 감압 농축하고, 그 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:초산에틸=1:1, 1％ 트리에틸아민 함유)에 의해 정제하여, 화합물 9∼12를 얻었다. 이하에, 각 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
DMTr-아미드-L-프롤리놀아미다이트(화합물 9, 0.60 g, 수율 55％)
Figure 112013016609314-pct00025
DMTr-알킬-L-프롤리놀아미다이트(화합물 10, 0.71 g, 수율 60％)
Figure 112013016609314-pct00026
DMTr-우레탄-L-프롤리놀아미다이트(화합물 11, 0.67 g, 수율 52％)
Figure 112013016609314-pct00027
DMTr-우레이도-L-프롤리놀아미다이트(화합물 12, 0.20 g, 수율 61％)
Figure 112013016609314-pct00028
Figure 112013016609314-pct00029
(실시예 A2)
다음에, 하기 식에 나타내는 스킴 3에 따라, L-프롤린을 갖는 아미다이트 유도체를 합성하였다.
Figure 112013016609314-pct00030
(1) DMTr-히드록시아미드아미노-L-프롤린(화합물 11)
DMTr-아미드-L-프롤린(화합물 6)(1.00 g, 2.05 m㏖) 및 5-히드록시펜탄알(0.33 g, 3.07 m㏖)을 포함하는 에탄올 용액(7 mL)에, 빙냉 하, 초산 완충액(7 mL)을 부가하였다. 이 혼합액을, 빙냉 하, 20분 교반한 후, 시아노수소화붕소나트륨(0.77 g, 12.28 m㏖)을 부가하여, 추가로, 실온 하, 7시간 교반하였다. 상기 혼합액을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 세정한 후, 추가로 포화 식염수로 세정하였다. 그리고, 상기 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하고, 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=98:2, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하였다. 이어서, 얻어진 생성물을, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=98:2, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하고, 또한, 얻어진 생성물을, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 디클로로메탄:아세톤=7:3, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하였다. 이에 의해, 무색 시럽형의 화합물 11을 얻었다(0.49 g, 수율 41％).
Ms(FAB+): m/z 575(M+), 303(DMTr+)
(2) DMTr-아미드아미노-L-프롤린아미다이트(화합물 12)
얻어진 상기 DMTr-히드록시아미드아미노-L-프롤린(화합물 11)(0.50 g, 0.87 m㏖)을 무수 아세토니트릴과 혼합하여, 실온에서 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 디이소프로필암모늄테트라졸라이드(178 ㎎, 1.04 m㏖)를 부가하고, 감압 하에서 탈기하여, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합물에 대하여, 무수 아세토니트릴(1 mL)을 부가하고, 추가로, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(313 ㎎, 1.04 m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(1 mL)을 부가하였다. 이 혼합물을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 4시간 교반하였다. 그리고, 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하여, 포화 중조수 및 포화 식염수로, 순차 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 상기 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노실리카를 이용한 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세톤=7:3, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 12(0.57 g, 순도 93％, 수율 79％)를 얻었다. 상기 순도는, HPLC에 의해 측정하였다(이하, 동일). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00031
(3) DMTr-히드록시아미드카르바모일-L-프롤린(화합물 13)
DMTr-아미드-L-프롤린(화합물 6)(1.00 g, 2.05 m㏖)을 용해한 무수 아세토니트릴 용액(10 mL)에, 1-이미다졸릴카르보닐옥시-8-히드록시옥탄(1.12 g, 4.92 m㏖)을 용해한 무수 아세토니트릴 용액(20 mL)을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 부가하였다. 이 혼합액을, 40℃∼50℃에서 2일간 가열한 후, 5일간 실온에서 방치하였다. 상기 혼합액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 디클로로메탄:아세톤=4:1, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하였다. 이에 의해, 무색 시럽형의 화합물 13을 얻었다(0.68 g, 수율 50％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00032
(4) DMTr-아미드카르바모일-L-프롤린아미다이트(화합물 14)
얻어진 상기 DMTr-히드록시아미드카르바모일-L-프롤린(화합물 13)(0.63 g, 1.00 m㏖)을 무수 피리딘과 혼합하여, 실온에서 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 디이소프로필암모늄테트라졸라이드(206 ㎎, 1.20 m㏖)를 부가하고, 감압 하에서 탈기하여, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합물에 대하여, 무수 아세토니트릴(1 mL)을 부가하고, 추가로, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(282 ㎎, 1.12 m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(1 mL)을 부가하였다. 이 혼합물을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 4시간 교반하였다. 그리고, 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하여, 포화 중조수 및 포화 식염수로 순차 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노실리카를 이용한 컬럼 크로마토(전개 용매 헥산:아세톤=7:3, 0.5％ 피리딘 함유)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 14(0.74 g, 순도 100％, 수율 87％)를 얻었다. 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00033
(5) DMTr-t-부틸디메틸실록시아미드우레이도-L-프롤린(화합물 15)
트리포스겐(1.22 g, 4.10 m㏖)에, 아르곤 분위기 및 빙냉 하, 무수 테트라히드로푸란 용액(10 mL)을 부가하였다. 이 혼합액에, 아르곤 분위기 및 빙냉 하, DMTr-아미드-L-프롤린(화합물 6)(1.00 g, 2.05 m㏖) 및 DIEA(9.80 g, 75.8 m㏖)를 용해한 무수 테트라히드로푸란 용액(10 mL)을, 30분간으로 적하하고, 그 후, 실온에서 1시간 교반하였다. 상기 혼합액에, 아르곤 분위기 및 빙냉 하, 10-아미노-1-t-부틸디메틸실록시데칸(2.66 g, 10.25 m㏖) 및 DIEA(3.20 g, 24.76 m㏖)를 용해한 무수 테트라히드로푸란 용액(20 mL)을, 45분간 적하하였다. 그리고, 상기 혼합물을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 이 혼합액을 초산에틸(200 mL)로 희석하여, 유기층을 회수하였다. 상기 유기층을, 포화 중조수로 세정한 후, 추가로, 포화 식염수로 세정하였다. 그리고, 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하고, 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 디클로로메탄:아세톤=4:1, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하였다. 이에 의해, 무색 시럽형의 화합물 15를 얻었다(0.87 g, 수율 55％).
(6) DMTr-히드록시아미드우레이도-L-프롤린화합물(16)
얻어진 상기 DMTr-t-부틸디메틸실록시아미드우레이도-L-프롤린(15)(0.87 g, 1.12 m㏖)에, 아르곤 분위기 하, 무수 테트라히드로푸란디클로로메탄 용액(10 mL)을 실온에서 부가하였다. 상기 혼합액에, 아르곤 분위기 하, 1 ㏖/L 테트라부틸암모늄플루오라이드 함유 테트라히드로푸란 용액(4.69 mL, 토쿄카세이)을 부가하여, 실온에서 3일간 교반하였다. 상기 혼합액을 디클로로메탄(150 mL)으로 희석하고, 물로 세정한 후, 추가로 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 디클로로메탄:아세톤=1:1, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 16을 얻었다(0.68 g, 수율 92％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00034
(7) DMTr-아미드우레이도-L-프롤린아미다이트(화합물 17)
얻어진 상기 DMTr-히드록시아미드우레이도-L-프롤린(화합물 16)(0.62 g, 0.94 m㏖)을 무수 아세토니트릴과 혼합하여, 실온에서 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 디이소프로필암모늄테트라졸라이드(192 ㎎, 1.12 m㏖)를 부가하고, 감압 하에서 탈기하여, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합액에 대하여, 무수 아세토니트릴(1 mL)을 부가하고, 추가로, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(282 ㎎, 1.12 m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(1 mL)을 부가하였다. 이 혼합물을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 4시간 교반하였다. 그리고, 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 중조수 및 포화 식염수로, 순차 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 상기 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노실리카를 이용한 컬럼 크로마토(전개 용매 헥산:아세톤=1:1, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 17을 얻었다(0.77 g, 순도 88％, 수율 84％). 이하에, 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00035
(실시예 A3) 프롤린디아미드아미다이트의 합성
프롤린 골격을 갖는 링커를 포함하는 본 발명의 핵산 분자를 생성하기 위해, 상기 스킴 3에 따라, L-프롤린디아미드아미다이트 및 D-프롤린디아미드아미다이트를 합성하였다.
(B3-1) L-프롤린디아미드아미다이트
(1) Fmoc-히드록시아미드-L-프롤린(화합물 4)
상기 스킴 3의 화합물 2(Fmoc-L-프롤린)를 개시 원료로 하였다. 상기 화합물 2(10.00 g, 29.64 m㏖), 4-아미노-1-부탄올(3.18 g, 35.56 m㏖) 및 1-히드록시벤조트리아졸(10.90 g, 70.72 m㏖)을 혼합하여, 상기 혼합물에 대하여, 감압 하에서 탈기하여, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합물에, 무수 아세토니트릴(140 mL)을 실온에서 부가하고, 추가로, 디시클로헥실카르보디이미드(7.34 g, 35.56 m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(70 mL)을 첨가한 후, 아르곤 분위기 하, 실온에서 15시간 교반하였다. 반응 종료 후, 생성된 침전을 여과 분별하여, 회수한 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사에 디클로로메탄(200 mL)을 부가하고, 포화 중조수(200 mL)로 세정하였다. 그리고, 유기층을 회수하여, 황산마그네슘으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하고, 그 잔사에 디에틸에테르(200 mL)를 부가하여, 분말화하였다. 생성된 분말을 여과 채취함으로써, 무색 분말형의 화합물 4(10.34 g, 수율 84％)를 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00036
(2) DMTr-아미드-L-프롤린(화합물 6)
Fmoc-히드록시아미드-L-프롤린(화합물 4)(7.80 g, 19.09 m㏖)을 무수 피리딘(5 mL)과 혼합하여, 실온에서 2회 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(8.20 g, 24.20 m㏖), DMAP(23 ㎎, 0.19 m㏖) 및 무수 피리딘(39 mL)을 부가하였다. 이 혼합물을, 실온에서 1시간 교반한 후, 메탄올(7.8 mL)을 부가하여, 실온에서 30분 교반하였다. 이 혼합물을, 디클로로메탄(100 mL)으로 희석하고, 포화 중조수(150 mL)로 세정 후, 유기층을 분리하였다. 상기 유기층을, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 미정제의 잔사에, 무수 디메틸포름아미드(39 mL) 및 피페리딘(18.7 mL, 189 m㏖)을 부가하여, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 상기 혼합액에 대해서, 감압 하, 실온에서, 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(상품명 Wakogel C-300, 전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=9:1, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하여, 담황색 오일형의 화합물 6(9.11 g, 수율 98％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00037
(3) DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린(화합물 8)
얻어진 상기 DMTr-아미드-L-프롤린(화합물 6)(6.01 g, 12.28 m㏖), EDC(2.83 g, 14.74 m㏖), 1-히드록시벤조트리아졸(3.98 g, 29.47 m㏖) 및 트리에틸아민(4.47 g, 44.21 m㏖)의 무수 디클로로메탄 용액(120 mL)을 혼합하였다. 이 혼합액에, 추가로, 아르곤 분위기 하, 실온에서, 6-히드록시헥산산(1.95 g, 14.47 m㏖)을 부가하고, 그 후, 아르곤 분위기 하, 실온에서, 1시간 교반하였다. 상기 혼합액을 디클로로메탄(600 mL)으로 희석하고, 포화 식염수(800 mL)로 3회 세정하였다. 유기층을 회수하고, 상기 유기층을, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 이에 의해, 담황색 포말형의 상기 화합물 8(6.29 g, 수율 85％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00038
Figure 112013016609314-pct00039
(4) DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트(화합물 10)
얻어진 상기 DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린(화합물 8)(8.55 g, 14.18 m㏖)을 무수 아세토니트릴과 혼합하여, 실온에서 3회 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 디이소프로필암모늄테트라졸라이드(2.91 g, 17.02 m㏖)를 부가하고, 감압 하에서 탈기하여, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합물에 대하여, 무수 아세토니트릴(10 mL)을 부가하고, 추가로, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(5.13 g, 17.02 m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(7 mL)을 부가하였다. 이 혼합물을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 2시간 교반하였다. 그리고, 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 중조수(200 mL)로 3회 세정한 후, 포화 식염수(200 mL)로 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 상기 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:초산에틸=1:3, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 10(10.25 g, 순도 92％, 수율 83％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00040
(B3-2) D-프롤린디아미드아미다이트
(1) Fmoc-히드록시아미드-D-프롤린(화합물 3)
상기 스킴 3의 화합물 1(Fmoc-D-프롤린)을 개시 원료로 하였다. 상기 화합물 1(1.5 g, 4.45 m㏖), 디시클로헥실카르보디이미드(1.1 g, 5.34 m㏖) 및 1-히드록시벤조트리아졸(1.5 g, 10.69 m㏖)의 혼합물에 대하여, 감압 하에서 탈기하여, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합물에, 무수 아세토니트릴(24 mL)을 실온에서 부가하고, 추가로, 4-아미노-1-부탄올(0.48 g, 5.34 m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(6 mL)을 첨가한 후, 아르곤 분위기 하, 실온에서 15시간 교반하였다. 반응 종료 후, 생성된 침전을 여과 분별하고, 회수한 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사에 디클로로메탄을 부가하고, 초산 완충액(pH 4.0)으로 3회, 포화 중조수로 3회 세정하였다. 그리고, 유기층을 회수하여, 황산마그네슘으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하고, 그 잔사에 디에틸에테르(50 mL)를 부가하여, 분말화하였다. 생성된 분말을 여과 채취함으로써, 백색 분말형의 화합물 3을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00041
(2) DMTr-아미드-D-프롤린(화합물 5)
Fmoc-히드록시아미드-D-프롤린(화합물 3)(1.0 g, 2.45 m㏖)을 무수 피리딘(5 mL)과 혼합하고, 실온에서 2회 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(1.05 g, 3.10 m㏖), DMAP(3 ㎎, 0.024 m㏖) 및 무수 피리딘(5 mL)을 부가하였다. 이 혼합물을, 실온에서 1시간 교반한 후, 메탄올(1 mL)을 부가하여, 실온에서 30분 교반하였다. 이 혼합물을, 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 중조수로 세정 후, 유기층을 분리하였다. 상기 유기층을, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 미정제의 잔사에, 무수 디메틸포름아미드(5 mL) 및 피페리딘(2.4 mL, 24 m㏖)을 부가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 상기 혼합액에 대해서, 감압 하, 실온에서, 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(상품명 Wakogel C-300, 전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=9:1, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하여, 담황색 오일형의 화합물 5(1.26 g, 수율 96％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00042
(3) DMTr-히드록시디아미드-D-프롤린(화합물 7)
얻어진 상기 DMTr-아미드-D-프롤린(화합물 5)(1.2 g, 2.45 m㏖), EDC(566 ㎎, 2.95 m㏖), 1-히드록시벤조트리아졸(796 ㎎, 5.89 m㏖), 및 트리에틸아민(1.2 mL, 8.84 m㏖)의 무수 디클로로메탄 용액(24 mL)을 혼합하였다. 이 혼합액에, 추가로, 아르곤 분위기 하, 실온에서, 6-히드록시헥산산(390 ㎎, 2.95 m㏖)을 부가하고, 그 후, 아르곤 분위기 하, 실온에서 1시간 교반하였다. 상기 혼합액을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 중조수로 3회 세정하였다. 유기층을 회수하여, 상기 유기층을, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 이에 의해, 담황색 오일형의 화합물 7(1.4 g, 수율 95％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00043
Figure 112013016609314-pct00044
(4) DMTr-디아미드-D-프롤린아미다이트(화합물 9)
얻어진 상기 DMTr-히드록시디아미드-D-프롤린(화합물 7)(1.2 g, 1.99 m㏖)을 무수 아세토니트릴과 혼합하여, 실온에서 3회 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 디이소프로필암모늄테트라졸라이드(410 ㎎, 2.40 m㏖)를 부가하고, 감압 하에서 탈기하여, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합물에 대하여, 무수 아세토니트릴(2.4 mL)을 부가하고, 추가로, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(722 ㎎, 2.40 m㏖)를 부가하였다. 이 혼합물을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 2시간 교반하였다. 그리고, 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 중조수로 3회 세정 후, 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:초산에틸=1:3)에 제공하여, 무색 오일형의 화합물 9(1.4 g, 순도 95％, 수율 83％)를 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00045
Figure 112013016609314-pct00046
(실시예 A4)
프롤린 골격을 갖는 링커를 포함하는 본 발명의 핵산 분자를 생성하기 위해, 하기 스킴 4에 따라, L-프롤린디아미드아미다이트 타입 B를 합성하였다.
Figure 112013016609314-pct00047
(1) Fmoc-t-부틸-디메틸실록시아미드-L-프롤린(화합물 18)
Fmoc-히드록시아미드-L-프롤린(화합물 4)(2.00 g, 30 m㏖), t-부틸-디메틸실릴클로라이드(1.11 g, 35 m㏖) 및 이미다졸(10.90 g, 71 m㏖)을 혼합하였다. 상기 혼합물에 대하여, 감압 하에서 탈기하고, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합물에, 무수 아세토니트릴(20 mL)을 실온에서 부가하고, 아르곤 분위기 하, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 상기 혼합물에 디클로로메탄(150 mL)을 부가하여, 물로 3회 세정하고, 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산마그네슘으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하고, 그 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=95:5)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 18(2.35 g, 수율 92％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00048
(2) t-부틸-디메틸실록시아미드-L-프롤린(화합물 19)
얻어진 상기 Fmoc-t-부틸-디메틸실록시아미드-L-프롤린(화합물 18)(1.18 g, 2.5 m㏖)에 대하여, 무수 아세토니트릴(5 mL) 및 피페리딘(2.4 mL)을 부가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 상기 혼합물에 아세토니트릴(50 mL)을 부가하고, 불용물을 여과 분별하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=9:1)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 19(0.61 g, 수율 90％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00049
Figure 112013016609314-pct00050
(3) t-부틸-디메틸실록시아미드히드록시아미드-L-프롤린(화합물 20)
얻어진 상기 t-부틸-디메틸실록시아미드-L-프롤린(화합물 19)(550 ㎎, 1.8 m㏖), 6-히드록시헥산산(300 ㎎, 2.3 m㏖), EDC(434 ㎎, 2.3 m㏖), 및 1-히드록시벤조트리아졸(695 ㎎, 4.5 m㏖)의 무수 디클로로메탄 용액(20 mL)을 혼합하였다. 상기 혼합물에, 아르곤 분위기 하, 실온에서, 트리에틸아민(689 ㎎, 6.8 m㏖)을 부가하고, 그 후, 아르곤 분위기 하, 실온에서, 밤새 교반하였다. 상기 혼합액을 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 회수하고, 상기를 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=9:1)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 20(696 ㎎, 수율 92％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00051
(4) DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린 타입 B(화합물 21)
얻어진 상기 t-부틸-디메틸실록시아미드히드록시아미드-L-프롤린(화합물 20)(640 ㎎, 1.54 m㏖)을 무수 피리딘(1 mL)과 혼합하고, 실온에서 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(657 ㎎, 1.85 m㏖), DMAP(2 ㎎) 및 무수 피리딘(5 mL)을 부가하고, 실온에서 4시간 교반한 후, 메탄올(1 mL)을 부가하여, 30분 실온에서 교반하였다. 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 중조수로 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사에, 무수 아세토니트릴(5 mL) 및 1 ㏖/L 테트라부틸암모늄플루오라이드 함유 테트라히드로푸란 용액(1.42 mL, 테트라부틸암모늄플루오라이드 1.42 m㏖)을 부가하여, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 상기 혼합물에 초산에틸(100 mL)을 부가하고, 물로 세정한 후, 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=95:5, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 21(680 ㎎, 수율 73％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00052
Figure 112013016609314-pct00053
(5) DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트 타입 B(화합물 22)
얻어진 상기 DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린 타입 B(화합물 21)(637 ㎎, 1.06 m㏖)를 무수 아세토니트릴과 혼합하여, 실온에서 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 디이소프로필암모늄테트라졸라이드(201 ㎎, 1.16 m㏖)를 부가하고, 감압 하에서 탈기하여, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합물에 대하여, 무수 아세토니트릴(1 mL)을 부가하고, 추가로, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(350 ㎎, 1.16 m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(1 mL)을 부가하였다. 이 혼합물을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 4시간 교반하였다. 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 중조수 및 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세톤=7:3)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 22(680 ㎎, 순도 95％, 수율 76％)를 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00054
Figure 112013016609314-pct00055
(실시예 A5)
프롤린 골격을 갖는 링커를 포함하는 본 발명의 핵산 분자를 생성하기 위해, 하기 스킴 5에 따라, DMTr-아미드에틸렌옥시에틸아미노-L-프롤린아미다이트(이하, PEG 스페이서 타입이라고 함)를 합성하였다.
Figure 112013016609314-pct00056
(1) DMTr-아미드히드록시에톡시에틸아미노-L-프롤린(화합물 23)
DMTr-아미드-L-프롤린(화합물 6)(1.00 g, 2.05 m㏖), 4-톨루엔술폰산2-(2-히드록시에톡시)에틸에스테르(3.10 g, 12.30 m㏖), 및 탄산칼륨(0.85 g, 6.15 m㏖)의 무수 디메틸포름아미드 용액(10 mL)을 혼합하고, 아르곤 분위기 하, 실온에서 4일간 교반하였다. 상기 혼합물에 대해서, 감압 하, 실온에서 용매를 증류 제거한 후, 디클로로메탄(20 mL)을 부가하여, 여과하였다. 여과액을 농축하여, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 제공하였다. 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피의 전개 용매는, 우선, 0.05％ 피리딘을 포함하는 초산에틸을 사용한 후, 0.05％ 피리딘을 포함하는 CH2Cl2와 CH3OH의 혼합액(CH2Cl2:CH3OH=9:1)을 사용하였다. 그 결과, 무색 시럽형의 화합물 23(1.15 g, 수율 97％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00057
(2) DMTr-아미드에틸렌옥시에틸아미노-L-프롤린아미다이트(화합물 24)
얻어진 상기 DMTr-아미드히드록시에톡시에틸아미노-L-프롤린(화합물 23)(0.63 g, 1.00 m㏖)을 무수 피리딘과 혼합하여, 실온에서 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물에, 디이소프로필암모늄테트라졸라이드(206 ㎎, 1.20 m㏖)를 부가하고, 감압 하에서 탈기하여, 아르곤 가스를 충전하였다. 상기 혼합물에 대하여, 무수 아세토니트릴(1 mL)을 부가하고, 추가로, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(282 ㎎, 1.12 m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(1 mL)을 부가하였다. 이 혼합물을, 아르곤 분위기 하, 실온에서 4시간 교반하였다. 그리고, 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 중조수 및 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 회수하여, 황산나트륨으로 건조한 후, 상기 유기층을 여과하였다. 얻어진 상기 여과액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세톤=7:3, 0.05％ 피리딘 함유)에 제공하여, 무색 시럽형의 화합물 24(0.74 g, 순도 100％, 수율 87％)를 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00058
(실시예 A6)
1. 보호 프롤리놀의 합성
이하에 나타내는 스킴 6에 따라, 디메톡시트리틸기로 보호된 프롤리놀(화합물 3)을 합성하였다.
Figure 112013016609314-pct00059
(1) 트리플루오로아세틸-L-프롤리놀(화합물 1)
L-프롤리놀(2.0 g, 20 m㏖)을 THF 20 mL에 용해하였다. 한편, 트리플루오로초산에틸(3.0 g, 21 m㏖)을 THF 20 mL에 용해하였다. 그리고, 후자의 THF 용액을, 전자의 L-프롤리놀 함유 THF 용액에 적하하여, 12시간 교반하였다. 이 반응액을 감압 농축하여, 화합물 1을 얻었다(3.7 g, 수율 97％). 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00060
(2) 트리플루오로아세틸-DMTr-L-프롤리놀(화합물 2)
얻어진 상기 트리플루오로아세틸-L-프롤리놀(화합물 1)(3.7 g, 19 m㏖)을 피리딘에 용해하여, 3회, 실온에서 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물을 피리딘 15 mL에 녹여, 아르곤 하, 빙욕 중에서 교반하면서, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(DMTr-Cl)(8.1 g, 24 m㏖)를 부가하고, 추가로, 실온에서 4시간 반응시켰다. 그리고, 과잉의 DMTr-Cl을 켄치하기 위해, 상기 반응액에, 추가로, 메탄올 10 mL를 부가하여 10분 교반하였다. 그 후, 상기 반응액에, 디클로로메탄을 부가하여 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 세정하였다. 세정 후의 회수한 유기층을, 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하여, 얻어진 여과액을 감압 농축하고, 그 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=95:5, 0.1％ 피리딘 함유)에 제공하여, 정제한 화합물 2를 얻었다(8.5 g, 수율 89％). 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00061
(3) DMTr-L-프롤리놀(화합물 3)
얻어진 상기 트리플루오로아세틸-DMTr-L-프롤리놀(화합물 2)(5 g, 10 m㏖)을 THF 100 mL에 용해하였다. 이 THF 용액에 5％ 수산화 나트륨 수용액 100 mL를 부가하여, 교반하였다. 이 용액에, 1M 불화테트라-n-부틸암모늄(TBAF) 용액 5 mL를 부가하여, 실온에서 12시간 교반하였다. 이 반응액을, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 세정하였다. 세정 후의 회수한 유기층을, 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하고, 얻어진 여과액을 감압 농축하여, 화합물 3을 얻었다(3.6 g, 수율 90％). 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00062
2. 아미다이트 유도체의 합성
상기 「1.」에서 합성한 보호 프롤리놀(화합물 3)을 이용하여, 하기 스킴 7에 따라, 결합 형식이 다른, 프롤리놀을 갖는 아미다이트 유도체를 합성하였다.
Figure 112013016609314-pct00063
(1) DMTr-우레탄-L-프롤리놀(화합물 4)
1,8-옥탄디올(9.0 g, 62 m㏖)을 THF 90 mL에 용해하여, 아르곤 하에 두었다. 한편, 카르보닐디이미다졸(2.0 g, 12 m㏖)을 THF 10 mL에 용해하였다. 후자의 THF 용액을, 전자의 THF 용액에 부가하여, 실온에서 1시간 교반하였다. 이 반응액을, 1,8-옥탄디올의 TLC 스폿이 없어질 때까지, 물로 세정하였다. 추가로, 세정 후에 회수한 유기층을, 포화 식염수로 세정하고, 회수한 유기층을, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하고, 얻어진 여과액을 감압 농축하였다. 그 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 CH2Cl2:CH3OH=95:5)에 제공하여, 정제한 화합물을 얻었다. 이 화합물은, 1,8-옥탄디올의 편말단이 카르보닐디이미다졸로 활성화된 화합물이었다(2.3 g, 수율 77％).
상기 화합물 0.9 g을 아세토니트릴 10 mL로 용해하여, 아르곤 하에 두었다. 한편, DMTr-L-프롤리놀(화합물 3)(1.9 g, 4.8 m㏖)을 아세토니트릴 20 mL에 용해하였다. 후자의 아세토니트릴 용액을, 상기 전자의 아세토니트릴 용액에 부가하여, 실온에서 24시간 교반하였다. 그리고, 이 반응액을, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 세정하고, 회수한 유기층을, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하고, 얻어진 여과액을 감압 농축하였다. 그 잔사를, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 디클로로메탄:아세톤=9:1, 0.1％ 피리딘 함유)에 제공하여, 정제한 화합물 4(프롤리놀우레탄아미다이트)를 얻었다(1.5 g, 수율 65％). 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00064
(2) DMTr-우레이도-L-프롤리놀(화합물 5)
아르곤 하, 트리포스겐(2.0 g, 6.7 m㏖)을 THF 10 mL에 용해하고, 0℃에서 교반하였다. 한편, DMTr-L-프롤리놀(화합물 3)(1.3 g, 3.2 m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(16 g, 124 m㏖)을 THF 10 mL에 용해하고, 상기 트리포스겐의 THF 용액에 적하하였다. 이 반응액을, 0℃에서 1시간, 계속해서, 실온에서 2시간 교반하였다. 그리고, 8-아미노-1-옥탄올(2.3 g, 16 m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(5.0 g, 38 m㏖)을 THF 30 mL에 용해하였다. 이 THF 용액에, 상기 교반 후의 반응액을 적하하여, 0℃에서 1시간, 계속해서, 실온에서 48시간 교반하였다. 이 반응액을 감압 농축하고, 그 잔사를 디클로로메탄에 용해하였다. 이 용액을, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 세정하고, 회수한 유기층을, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하고, 얻어진 여과액을 감압 농축하여, 그 잔사를, 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 제공하여, 정제하였다. 이때, 전개 용매는, 0.1％ 피리딘을 함유하는 아세톤과 물의 혼합 용매를 사용하고, 상기 아세톤과 물과의 혼합 비율은, 스텝 와이즈(step-wise)로 하며, 구체적으로는, 아세톤:물의 몰비를, 2:8, 3:7, 4:6 및 5:5의 순서로 변화시켰다. 원하는 화합물 5를 포함하는 프랙션을, 디클로로메탄으로 추출하고, 이 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 상기 유기층을 여과하고, 얻어진 여과액을 감압 농축하여, 화합물 5(프롤리놀우레이도아미다이트)를 얻었다(0.9 g, 수율 49％). 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00065
(3) 프롤리놀을 갖는 아미다이트 유도체(화합물 6 및 7)
수식 프롤리놀로서, 얻어진 상기 화합물 4(0.80 g, 1.4 m㏖)를 아세토니트릴에 용해하여, 실온에서 3회 공비 건조하였다. 얻어진 잔류물을 아세토니트릴 1 mL에 용해하여, 아르곤 하에 두었다. 이 아세토니트릴 용액에, 디이소프로필암모늄테트라졸라이드(0.24 g, 1.4 m㏖)를 첨가하여, 반응액으로 하였다. 한편, 2-시아노에틸N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(0.50 g, 1.7 m㏖)를 아세토니트릴 1 mL에 용해하였다. 이것을, 상기 반응액에 첨가하여, 실온에서 4시간 교반하였다. 상기 반응액에, 디클로로메탄을 부가하여, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 세정하였다. 세정 후의 회수한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켜, 상기 유기층을 여과하고, 얻어진 여과액을 감압 농축하였다. 그 잔사를, 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세톤=10:1, 0.1％ 피리딘 함유)에 제공하여, 정제한 화합물 6(DMTr-우레탄-L-프롤리놀아미다이트)(0.90 g, 수율 83％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00066
상기 수식 프롤리놀로서, 상기 화합물 4 대신에, 상기 화합물 5를 사용한 것 이외에는, 동일하게 처리를 행하여, 정제한 화합물 7(DMTr-우레이도-L-프롤리놀아미다이트)(0.80 g, 수율 74％)을 얻었다. 이하에, 상기 화합물의 NMR의 결과를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00067
(실시예 B1) RNA의 고상 합성
본 발명의 링커를 갖는 RNA를 합성하였다. RNA는, 포스포로아미다이트법에 기초하여, 핵산 합성기(상품명 ABI Expedite(등록 상표) 8909 Nucleic Acid Synthesis System, 어플라이드바이오시스템스)에 의해, 3'측으로부터 5'측을 향하여 합성하였다. 상기 합성에는, RNA 아미다이트로서, RNA 포스포로아미다이트(2'-O-TBDMSi, 상품명, 삼천리 제약)를 이용하였다(이하, 동일). 상기 아미다이트의 탈보호는, 정해진 법칙에 따라, 합성한 RNA는, HPLC에 의해 정제하였다. 이하의 실시예에 있어서, RNA의 합성은, 특별히 나타내지 않는 한, 동일하게 행하였다.
구체적으로는, 본 실시예의 RNA(Ex)로서, 상기 스킴 2의 상기 화합물 12를 링커로서 갖는 ssRNA(PH-0001)를 합성하였다. 우선, 하기 서열번호 1로 나타내는 서열의 RNA를 합성하였다. 그리고, 상기 RNA의 5' 말단에, 상기 화합물 12를 연결하였다. 추가로, 상기 서열번호 1로 나타내는 RNA의 5'측에, 상기 화합물 12를 개재하여, 하기 서열번호 2로 나타내는 서열의 RNA를 합성하였다.
Figure 112013016609314-pct00068
이와 같이 하여 합성한 ssRNA를, 실시예의 ssRNA(PH-0001)라고 한다. 상기 PH-0001은, 하기 서열번호 3으로 나타내는 바와 같이, 5'측에, 상기 서열번호 2의 RNA 서열을 가지고, 3'측에, 상기 서열번호 1의 RNA 서열을 가지며, 상기 RNA 서열이, 링커 Lx(즉 상기 화합물 12)를 개재하여 연결되어 있는 구조로 하였다. 또한, 하기 서열로 나타내는 바와 같이, 상기 서열번호 2의 RNA 서열과, 상기 서열번호 1의 RNA 서열은, 상보적인 서열을 가지고 있다. 이 때문에, 상기 PH-0001은, 하기 식에 나타내는 바와 같이, 자기 어닐링하여 스템 구조를 취하고 있다. 또한, 하기 서열에 있어서, 밑줄 부분 GUUGUCAUACUUCUCAUGG(서열번호 4)가, GAPDH 유전자의 발현 억제에 관여하는 영역이다.
Figure 112013016609314-pct00069
Figure 112013016609314-pct00070
한편, 본 발명의 링커를 갖지 않는 비교예의 RNA로서, RNAi 포지티브 컨트롤(Pc)의 하기 shRNA(NH-0001)를 합성하였다. 이하에 나타내는 바와 같이, 상기 NH-0001은, 5' 영역의 대문자로 나타내는 서열이, 상기 PH-0001과 동일한 서열번호 2의 RNA 서열이고, 3' 영역의 대문자로 나타내는 서열이, 상기 PH-0001과 동일한 서열번호 1의 RNA 서열이다. 그리고, 상기 NH-0001은, 서열번호 2의 RNA 서열과 서열번호 1의 RNA 서열 사이에, 링커로서, 상기 화합물 12 대신에, 소문자로 나타내는 RNA 서열을 갖는다. 상기 NH-0001은, 상기 PH-0001과 마찬가지로, 하기 식에 나타내는 바와 같이, 자기 어닐링하여 스템을 형성하여, shRNA의 구조를 취하고 있다. 또한, 하기 서열에 있어서, 밑줄 부분 GUUGUCAUACUUCUCAUGG(서열번호 4)가, 발현 억제에 관여하는 영역이다.
Figure 112013016609314-pct00071
Figure 112013016609314-pct00072
(실시예 B2) HCT116 세포에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제 효과
본 발명의 RNA를 이용하여, 시험관내에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
실시예의 RNA(Ex)로서, 상기 실시예 B1의 ssRNA(PH-0001)를 사용하였다. 상기 RNA를, 원하는 농도(1 μ㏖/L, 5 μ㏖/L, 25 μ㏖/L)가 되도록, 주사용 증류수(오오츠카세이야쿠, 이하 동일)에 용해하여, RNA 용액을 조제하였다.
세포는, HCT116 세포(DS 파머바이오메디칼)를 사용하고, 배지는, 10 ％ FBS를 포함하는 McCoy's 5A(Invitrogen) 배지를 사용하며, 배양 조건은, 37℃, 5％ CO2 하로 하였다.
우선, HCT116 세포를, 상기 배지 중에서 배양하여, 그 배양액을, 24구멍 플레이트에, 400 ㎕씩, 2×104 세포/웰이 되도록 분주(分注)하였다. 추가로, 상기 웰 중의 세포를 24시간 배양한 후, 상기 RNA를, 트랜스펙션 시약 Lipofectamine2000(Invitrogen)을 이용하여, 상기 트랜스펙션 시약의 첨부 프로토콜에 따라, 트랜스펙션하였다. 구체적으로는, 상기 웰당의 조성을 이하와 같이 설정하고, 트랜스펙션을 행하였다. 또한, 상기 웰에 있어서, 상기 RNA의 최종 농도는, 1 n㏖/L, 5 n㏖/L, 25 n㏖/L로 하였다.
Figure 112013016609314-pct00073
트랜스펙션 후, 상기 웰 중의 세포를 24시간 배양한 후, RNeasy Mini Kit(Qiagen, 네덜란드)를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라, RNA를 회수하였다. 다음에, 역전사 효소(상품명 SuperScript III, Invitrogen)를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라, 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 그리고, 이하에 나타내는 바와 같이, 합성한 상기 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 행하고, GAPDH 유전자의 발현량 및 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량을 측정하였다. 상기 GAPDH 유전자의 발현량은, 상기 β-액틴 유전자의 발현량에 따라 보정하였다.
상기 PCR은, 시약으로서 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(상품명, Roche), 기기로서 Light Cycler DX400(상품명, Roche)을 이용하였다(이하, 동일). 상기 GAPDH 유전자 및 β-액틴 유전자의 증폭에는, 각각, 이하의 프라이머 세트를 사용하였다.
GAPDH 유전자용 PCR 프라이머 세트
Figure 112013016609314-pct00074
β-액틴 유전자용 프라이머 세트
Figure 112013016609314-pct00075
또한, 컨트롤 1로서, 상기 (B)액 100 μL만을 첨가한 세포에 대해서도, 유전자 발현량을 측정하였다(-). 또한, 컨트롤 2로서, 트랜스펙션에 있어서, 상기 RNA 용액을 미첨가로 하고, 상기 (A) 1.5 ㎕와 상기 (B)를 합계 100 ㎕ 첨가한 것 이외에는, 동일하게 하여 처리한 세포에 대해서도, 유전자 발현량을 측정하였다(mock).
보정 후의 GAPDH 유전자 발현량에 대해서, 컨트롤(-)의 세포의 발현량을 1로 하여, 각 RNA를 도입한 세포의 발현량의 상대값을 구하였다.
(2) 결과
이들의 결과를, 도 4에 나타낸다. 도 4는 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이고, 종축은, 상대 유전자 발현량이다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 상기 실시예 B1의 PH-0001은, 발현 저해 활성을 손상시키는 일이 없었다. 또한, 상기 PH-0001은, 본 발명의 링커인 상기 화합물 12에 의해 안정화되어 있다고 생각된다.
(실시예 B3) 인간 혈청 중에서의 안정성
본 발명의 RNA에 대해서, 인간 혈청 중에서의 안정성을 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
실시예의 RNA(Ex)로서, 상기 실시예 B1의 ssRNA(PH-0001)를 사용하였다. 비교예의 RNA로서, 상기 실시예 B1에 나타내는, RNAi 포지티브 컨트롤(Pc)의 상기 shRNA(NH-0001)를 사용하였다.
우선, 1×PBS에, 상기 RNA 및 정상 인간 혈청(MP Biomedicals)을 혼합한 혼합액 30 ㎕를, 37℃에서 인큐베이팅하였다. 상기 혼합액 30 ㎕에 있어서, 상기 RNA의 첨가량은, 60 p㏖로 하고, 상기 정상 인간 혈청의 첨가량은, 최종 농도 10％로 하였다. 그리고, 인큐베이팅 개시로부터, 0시간 후, 0.5시간 후, 1시간 후 및 2시간 후에, 페놀·클로로포름 추출에 의해 반응을 정지하였다. 얻어진 추출액을 15％ 폴리아크릴아미드 겔로 전기 영동한 후, SYBR Green II(상품명, Lonza)로 염색하여, E-BOX-VX2(엠에스키키, 토쿄)를 이용하여 분석하였다.
(2) 결과
이 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5는 안정성을 나타내는 전기 영동 사진이다. 도 5에 있어서, 레인 「M」은, 분자량 마커이며, (h)는, 인큐베이팅 시간을 나타낸다.
도 5에 나타내는 바와 같이, 천연의 뉴클레오티드로 이루어지는 비교예의 NH-0001은, 인큐베이팅 0.5시간 후에 있어서, 빠른 분해 반응이 이미 개시되어 있고, 그 결과, 0.5∼2시간의 모든 결과에 있어서, 0시간의 결과보다, RNA 사이즈가 작아진 것이 확인되었다. 이에 대하여, 본 발명의 링커를 포함하는 실시예의 PH-0001은, 인큐베이팅 시간의 경과에 따른 영동도의 변화, 즉, 분해에 의한 분자량의 감소가, 거의 확인되지 않았다. 이 결과로부터, 본 발명의 링커를 갖는 RNA를 이용함으로써, 인간 혈청 중에서의 안정성이 향상되는 것이 실증되었다.
(실시예 B4) HCT116 세포에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제 효과
프롤린을 포함하는 하기 식의 링커를 갖는 ssRNA를 합성하여, GAPDH 유전자의 발현 억제 효과를 확인하였다.
[화학식 22]
Figure 112013016609314-pct00076
(1) 재료 및 방법
(1. 1) ssRNA의 고상 합성
상기 RNA는, 상기 실시예 B1과 동일하게 하여, 포스포로아미다이트법에 기초하여 합성하였다.
실시예의 RNA(Ex)로서, 이하에 나타내는 ssRNA(PK-0004)를 사용하였다. 하기 서열에 있어서, 「Lx」 및 「Ly」는, 각각, 프롤린을 포함하는 상기 식([화학식 22])의 링커이다. 상기 ssRNA의 합성 시, 서열번호 11에 따라, 상기 RNA 아미다이트(상품명 RNA Phosphoramidites, 삼천리 제약)를 이용하여, 3'측으로부터 RNA를 합성하고, 「Lx」 및 「Ly」의 부위는, 상기 실시예 A3-1에서 합성한 DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트(스킴 3의 화합물 10)를 연결하였다. 또한, 상기 서열에 있어서, GUUGUCAUACUUCUCAUGG(서열번호 4)의 서열이, 발현 억제에 관여하는 영역이다.
Figure 112013016609314-pct00077
비교예의 RNA는, RNAi 네거티브 컨트롤(Nc)의 ssRNA(PK-0003)를 사용하였다. 하기 서열에 있어서, 「Lx」 및 「Ly」는, 각각, 프롤린을 포함하는 상기 식([화학식 22])의 링커이다. 상기 ssRNA의 합성 시, 서열번호 12에 따라, 상기 RNA 아미다이트(상품명 RNA Phosphoramidites, 삼천리 제약)를 이용하여, 3'측으로부터 RNA를 합성하고, 「Lx」 및 「Ly」의 부위는, 상기 실시예 A3에서 합성한 DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트(스킴 3의 화합물 10)를 연결하였다. 또한, 상기 발현 억제에 관여하는 서열 대신에, 스크램블 서열로 하였다.
Figure 112013016609314-pct00078
(1. 2) 유전자의 발현 억제
동결 보존한 상기 RNA를, 20 μ㏖/L가 되도록, 주사용 증류수(오오츠카세이야쿠)에 용해하여, RNA 용액을 조제하였다.
상기 RNA 용액을 사용하여, 상기 실시예 B2와 동일하게 하여, HCT116 세포에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현량을 확인하였다. 또한, 트랜스펙션에 있어서, 웰당의 조성은, 이하와 같이 설정하였다. 하기 조성에 있어서, (B)는, Opti-MEM(Invitrogen), (C)는, 20 μ㏖/L 상기 RNA 용액이며, 양자를 합하여 98.5 ㎕ 첨가하였다. 상기 웰에 있어서, 상기 RNA의 최종 농도는, 1 n㏖/L, 3 n㏖/L, 10 n㏖/L로 하였다.
Figure 112013016609314-pct00079
(2) 결과
이들의 결과를, 도 6에 나타낸다. 도 6은 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 링커를 갖는 실시예의 PK-0004는, 강한 유전자 발현 억제 활성을 나타내고, 그 활성은 투여량 의존적이었다. 한편, 네거티브 컨트롤의 PK-0003은, 억제 효과가 관찰되지 않았다.
(실시예 B5) 다이서 단백질의 반응성
프롤린을 갖는 링커로 치환한 ssRNA에 대한, 재조합 인간 다이서 단백질의 반응성을 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
실시예의 RNA(Ex)로서, 상기 실시예 B4의 ssRNA(PK-0004)를 사용하였다. 비교예의 RNA로서, 상기 실시예 B4에 나타내는, RNAi 네거티브 컨트롤(Nc)의 ssRNA(PK-0003), 이하에 나타내는 RNAi 포지티브 컨트롤(Pc)의 ssRNA(NK-0016)를 사용하였다. 상기 NK-0016은, 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 내부 5'측 영역(X), 상기 3'측 영역(Yc) 및 상기 내부 3'측 영역(Y)이, 상기 PK-0004와 동일한 서열이고, 상기 Xc와 X 사이, Yc와 Y 사이에, 상기 PK-0004의 상기 식([화학식 22])의 링커(Lx, Ly) 대신에, 폴리뉴클레오티드를 링커로서 갖는 구조로 하였다.
Figure 112013016609314-pct00080
시약으로서 Coldshock-DICER(상품명, 다카라바이오)를 이용하여, 첨부 프로토콜에 따라, 상기 다이서 단백질과 상기 RNA를 포함하는 반응액을 조제하고, 이것을 37℃에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 시간은, 0, 3, 6, 9시간으로 하였다. 소정 시간 인큐베이팅 후의 상기 반응액에, 상기 시약의 반응 정지액을 부가하고, 15％ 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 행하였다. 그 후, 상기 폴리아크릴아미드 겔을, SYBR Green II(상품명, Lonza)로 염색하고, E-BOX-VX2(상품명, 엠에스키키)를 사용하여 분석하였다.
(2) 결과와 고찰
이들의 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7은 ssRNA에 대한 다이서 단백질의 반응성을 나타내는 전기 영동의 결과이다. 도 7에 있어서, 레인 「M」은, 분자량 마커(20bp, 30bp, 40bp 및 50bp)이고, (h)는, 상기 인큐베이팅의 시간을 나타낸다.
천연의 뉴클레오티드로 이루어지는 비교예의 NK-0016은 상기 다이서 단백질과 조속하게 반응하여, 9시간 후까지는 소실되었다. 이에 대하여, 프롤린을 포함하는 링커를 갖는 RNA, 즉, 실시예의 PK-0004와 네거티브 컨트롤의 PK-0003은, 상기 다이서에 서서히 반응하였기 때문에, 9시간 후에 있어서도 완전히 소실되지 않았다. 이 결과로부터, 프롤린을 포함하는 링커를 가짐으로써, 세포 내에서의 안정성이 향상되는 것을 알 수 있었다. 즉, 유전자 발현 억제 효과의 결과와 아울러 고려하면, 프롤린을 포함하는 링커를 갖는 본 발명의 RNA는, 세포 내에서의 RNA 간섭 효과의 지속성을 향상시키는 효과가 있다고 생각된다.
(실시예 B6) A549 세포 및 293 세포에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제 효과
프롤린을 갖는 링커로 치환한 ssRNA를 이용하여, 시험관내에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
실시예의 RNA(Ex)로서, 상기 실시예 B4의 ssRNA(PK-0004)를 사용하였다. 비교예의 RNA로서, 상기 실시예 B4에 나타내는, RNAi 네거티브 컨트롤(Nc)의 ssRNA(PK-0003)를 사용하였다. 상기 RNA를, 20 μ㏖/L가 되도록, 주사용 증류수(오오츠카세이야쿠)에 용해하여, RNA 용액을 조제하였다.
세포는, A549 세포 및 293 세포(DS 파머바이오메디칼)를 사용하였다. 전자의 배지는, 10％ FBS를 포함하는 DMEM(Invitrogen), 후자의 배지는, 10％ FBS를 포함하는 MEM(Invitrogen) 배지를 사용하였다. 배양 조건은, 37℃, 5％ CO2 하로 하였다.
우선, 세포를, 상기 배지 중에서 배양하고, 그 배양액을, 24구멍 플레이트에, 400 ㎕씩, 5×104 세포/웰이 되도록 분주하였다. 추가로, 상기 웰 중의 세포를 24시간 배양한 후, 상기 RNA를 트랜스펙션 시약 Lipofectamine2000(Invitrogen)을 이용하여, 상기 트랜스펙션 시약의 첨부 프로토콜에 따라, 트랜스펙션하였다. 구체적으로는, A549 세포 및 293 세포에 대하여, 각각, 상기 웰당의 조성을 이하와 같이 설정하고, 트랜스펙션을 행하였다. 하기 조성에 있어서, (B)는, Opti-MEM(Invitrogen), (C)는, 20 μ㏖/L 상기 RNA 용액이고, 양자를 합하여 98.5 ㎕ 또는 99 ㎕ 첨가하였다. 또한, 상기 웰에 있어서, 상기 RNA의 최종 농도는, 1 n㏖/L, 3 n㏖/L, 10 n㏖/L로 하였다.
Figure 112013016609314-pct00081
트랜스펙션 후, 상기 실시예 B4와 동일하게 하여, 상기 세포의 배양, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR을 행하여, GAPDH 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다.
(2) 결과
이들의 결과를, 도 8 및 도 9에 나타낸다. 도 8은 A549 세포의 결과이고, 도 9는 293 세포의 결과이다. 도 8 및 도 9는 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 8 및 도 9에 나타내는 바와 같이, 실시예의 PK-0004는, 강한 유전자 발현 억제 활성을 나타내고, 농도 의존적으로 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 한편, 네거티브 컨트롤의 PK-0003은, 억제 효과가 관찰되지 않았다.
(실시예 B7) HCT116 세포에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제 효과
프롤린 또는 프롤리놀을 갖는 링커로 치환한 ssRNA를 이용하여, HCT116 세포에서의 GAPDH 발현 억제 효과를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
(1. 1) ssRNA의 고상 합성
실시예의 RNA(Ex ssRNA)로서, 상기 실시예 B4와 동일한 Ex ssRNA를 합성하였다. 상기 RNA의 합성은, 특별히 나타내지 않는 한, 상기 실시예 B4에 준하였다.
Figure 112013016609314-pct00082
링커용 아미다이트는, 상기 실시예 A3-1에서 합성한 L-프롤린디아미드아미다이트(스킴 3의 화합물 10), 상기 실시예 A6에서 합성한 프롤리놀우레탄아미다이트(스킴 7의 화합물 6), 프롤리놀우레이도아미다이트(스킴 7의 화합물 7), 프롤린아미드아민아미다이트(스킴 3의 화합물 12), 및 프롤린아미드우레이도아미다이트(스킴 3의 화합물 17)를 이용하였다. 합성한 각 RNA에 대해서, 링커부의 합성에 사용한 아미다이트를 하기 표에 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00083
(1. 2) 유전자의 발현 억제
상기 RNA를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B4와 동일하게 하여, HCT116 세포에의 트랜스펙션, 배양, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR을 행하여, GAPDH 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다.
(2) 결과
이들의 결과를, 도 10에 나타낸다. 도 10은 HCT116 세포의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 10에 나타내는 바와 같이, 프롤린 또는 프롤리놀을 포함하는 ssRNA(PK-0004, PK-0006, PK-0010, PK-0012, PK-0016)는, 강한 유전자 발현 억제 활성을 나타내고, 농도 의존적으로 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
(실시예 B8) HCT116 세포에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제 효과
프롤린을 갖는 링커로 치환한 ssRNA를 이용하여, HCT116 세포에서의 GAPDH 발현 억제 효과를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
(1. 1) ssRNA의 고상 합성
실시예의 RNA(Ex ssRNA)로서, 상기 실시예 B4와 동일한 Ex ssRNA를 합성하였다. 상기 RNA의 합성은, 특별히 나타내지 않는 한, 상기 실시예 B4에 준하였다.
Figure 112013016609314-pct00084
링커용 아미다이트로서, 상기 실시예 A3-1에서 합성한 D-프롤린디아미드아미다이트(스킴 3의 화합물 9) 및 상기 실시예 A4에서 합성한 프롤린디아미드아미다이트 타입 B(스킴 4의 화합물 22)를 이용하였다. 합성한 각 RNA에 대해서, 링커부의 합성에 사용한 아미다이트를 하기 표에 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00085
(1. 2) 유전자의 발현 억제
상기 RNA를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B4와 동일하게 하여, HCT116 세포에의 트랜스펙션, 배양, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR을 행하여, GAPDH 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다.
(2) 결과
이들의 결과를, 도 11에 나타낸다. 도 11은 HCT116 세포의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 11에 나타내는 바와 같이, 프롤린을 포함하는 ssRNA(PK-0004, PK-0034, PK-0036)는, 강한 유전자 발현 억제 활성을 나타내고, 농도 의존적으로 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
(실시예 B9) 시험관내에서의 TGF-β1 유전자의 발현 억제 효과
프롤린을 갖는 링커로 치환한 ssRNA를 이용하여, Hepa1-6 세포에서의 TGF 발현 억제 효과를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
(1. 1) ssRNA의 고상 합성
실시예의 RNA로서, 이하에 나타내는 PK-0007, PK-0026, PK-0027, PK-0028을 합성하였다. 상기 RNA의 합성은, 특별히 나타내지 않는 한, 상기 실시예 B4에 준하였다. 링커용 아미다이트로서, 상기 실시예 A3-1에서 합성한 L-프롤린디아미드아미다이트(스킴 3의 화합물 10)를 이용하였다. 각 RNA는, TGF-β1 유전자의 발현을 억제하는 21 염기 길이의 하기 서열을 가지고 있다. 이 서열은, Cheng 등이 이용한 siRNA(Mol.Pharm., 2009, 6, 772-779)에 기초하여, 설계하였다. 하기 서열에 있어서, 「*」는, 프리 염기를 나타낸다.
TGF-β1 유전자 발현 억제 서열(서열번호 18)
5'-AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3'
Figure 112013016609314-pct00086
(1. 2) 유전자의 발현 억제
동결 보존한 상기 RNA를, 20 μ㏖/L가 되도록, 주사용 증류수(오오츠카세이야쿠)에 용해하여, RNA 용액을 조제하였다.
세포는, Hepa1-6 세포(이화학 연구소 바이오리소스 센터)를 사용하였다. 배지는, 10％ FBS를 포함하는 DMEM(Invitrogen) 배지를 사용하였다. 배양 조건은, 37℃, 5％ CO2 하로 하였다.
Hepal-6 세포를 상기 배지 중에서 배양하고, 그 배양액을, 24구멍 플레이트에, 400 ㎕씩, 3×104 세포/웰이 되도록 분주하였다. 그리고, 상기 RNA 용액을 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B4와 동일하게 하여, Hepal-6 세포에의 상기 ssRNA의 트랜스펙션, RNA 회수 및 cDNA 합성을 행하였다. 또한, 상기 트랜스펙션에 대해서, 상기 웰에 있어서의 상기 RNA의 최종 농도는, 1 n㏖/L로 하였다. 그리고, 프라이머로서, 하기 TGF-β1 유전자용 PCR 프라이머 세트 및 β-액틴 유전자용 프라이머 세트를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B4와 동일하게 하여, PCR을 행하여, TGF-β1 유전자의 발현량 및 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량을 측정하였다. 상기 TGF-β1 유전자의 발현량은, 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량에 따라 보정하였다.
TGF-β1 유전자용 PCR 프라이머 세트
Figure 112013016609314-pct00087
β-액틴 유전자용 프라이머 세트
Figure 112013016609314-pct00088
또한, 상기 실시예 B4와 동일하게 하여, 컨트롤(-) 및 컨트롤(mock)에 대해서, 유전자 발현량을 측정하였다. 그리고, 보정 후의 TGF-β1 유전자 발현량에 대해서, 컨트롤(-)의 세포의 발현량을 1로 하여, 각 RNA를 도입한 세포의 발현량의 상대값을 구하였다.
(2) 결과
이들의 결과를, 도 12에 나타낸다. 도 12는 TGF-β1 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 12에 나타내는 바와 같이, 프롤린을 포함하는 ssRNA는, 전부, 강한 유전자 발현 억제 활성을 나타내었다.
그 중에서도, 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 3' 말단으로부터 2번째 및 3번째로 한 PK-0027 및 PK-0028은, 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 3' 말단으로부터 4번째 및 5번째로 한 PK-0007 및 PK-0026보다, 높은 발현 억제 활성을 나타내었다. 이 결과로부터, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역의 중앙보다, 3'측에 배치할수록, 상기 발현 억제 활성을 향상시킬 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 상기 프리 염기의 위치는, 예컨대, 상기 내부 영역의 중앙보다, 5'측에 배치할수록, 상기 발현 억제 활성을 향상시킬 수 있는 것도 확인되었다. 이러한 프리 염기의 위치와 발현 억제 활성의 관계는, 후술하는 참고예의 결과와 동일한 거동을 나타내었다.
(실시예 B10) 생체내에서의 TGF-β1 유전자 발현 억제 효과 및 급성 폐상해 억제 효과
프롤린을 갖는 링커로 치환한 ssRNA를 이용하여, 생체내에서의 유전자 발현 억제 및 급성 폐상해 억제의 효과를 확인하였다. 상기 효과의 확인은, Takagi 등(J.Thromb Hemost 2009; 7: 2053-2063)에 기재된 방법에 따라 행하였다.
(B10-1) 생체내에서의 TGF-β1 유전자의 발현 억제 효과
프롤린을 갖는 링커로 치환한 ssRNA를 이용하여, 생체내에서의 TGF-β1 유전자의 발현 억제 효과를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
(1. 1) 급성 폐상해 마우스에의 RNA의 투여
실시예의 RNA(Ex)는, 상기 실시예 B9에 있어서의 ssRNA(PK-0007)를 사용하였다. 비교예의 RNA는, 이하에 나타내는, 네거티브 컨트롤(Nc)의 ssRNA(PK-0008), 포지티브 컨트롤(Pc)의 ssRNA(NK-0033) 및 그 네거티브 컨트롤(Nc)의 ssRNA(NK-0035), 포지티브 컨트롤(Pc)의 dsRNA(NI-0030) 및 그 네거티브 컨트롤(Nc)의 dsRNA(NI-0031)를 사용하였다.
Figure 112013016609314-pct00089
상기 RNA 100 ㎍을 멸균 생리 식염수 75 ㎕에 용해하여, RNA 용액을 조제하였다. 한편, 100 ㎍의 리포다당(LPS)을, 멸균 생리 식염수 50 ㎕에 용해하여, LPS 용액을 조제하였다.
우선, 상기 RNA 용액 80 ㎕를, 마우스의 기관 내에 적하하였다. 적하로부터 1시간 후에, 상기 마우스의 기관 내에, 상기 LPS 용액 50 ㎕를 적하하여, 폐상해를 유발하였다.
상기 LPS에 대한 네거티브 컨트롤로서, 상기 LPS 용액 대신에, LPS 미첨가의 멸균 생리 식염수 50 ㎕를 이용하였다. 또한, 상기 RNA 용액에 대한 네거티브 컨트롤로서, 멸균 생리 식염수 80 ㎕를 이용하였다.
이하에, 각 투여군을 나타낸다. 각 투여군에 있어서, 4∼6마리의 마우스를 사용하였다.
·투여군 1
멸균 생리 식염수 75 ㎕의 투여로부터 5분 후, 멸균 생리 식염수 50 ㎕를 투여
·투여군 2
멸균 생리 식염수 75 ㎕의 투여로부터 5분 후, 상기 LPS 용액 50 ㎕를 투여
·투여군 3
RNA 용액(PK-0007) 75 ㎕의 투여로부터 5분 후, 상기 LPS 용액 50 ㎕를 투여
·투여군 4
RNA 용액(PK-0008) 75 ㎕의 투여로부터 5분 후, 상기 LPS 용액 50 ㎕를 투여
·투여군 5
RNA 용액(NK-0033) 75 ㎕의 투여로부터 5분 후, 상기 LPS 용액 50 ㎕를 투여
·투여군 6
RNA 용액(NK-0035) 75 ㎕의 투여로부터 5분 후, 상기 LPS 용액 50 ㎕를 투여
·투여군 7
RNA 용액(NI-0030) 75 ㎕의 투여로부터 5분 후, 상기 LPS 용액 50 ㎕를 투여
·투여군 8
RNA 용액(NI-0031) 50 ㎕의 투여로부터 5분 후에, 상기 LPS 용액 50 ㎕를 투여
(1. 2) 기관지 폐포 세정액(BALF)의 샘플링
상기 LPS 용액 또는 멸균 생리 식염수(LPS에 대한 네거티브 컨트롤)를 적하하고 나서 24시간 후, 상기 마우스의 복강에, 과잉량의 펜토바르비탈을 투여하여 안락사시켰다. 그리고, 폐를 채취하여, 샘플로 하였다.
상기 마우스의 폐 샘플에 대해서, TGF-β1 Quantikine Colorimetric Sandwich ELISA(상품명, R&D Systems사)를 이용하여, 단위 중량의 폐당의 TGF-β1 발현량을 측정하였다.
(2) 결과
그 결과를, 도 13에 나타낸다. 도 13은 각 투여군에 있어서의 단위 중량의 폐당의 TGF-β1 유전자 발현량을 나타내는 그래프이고, 횡축은, TGF-β1 단백질의 발현량을 나타낸다. LPS(+)/PK-0007(+)의 투여군 3은, LPS(+)/ssRNA(-)의 투여군 2와 비교하여, TGF-β1 단백질의 발현량이 현저히 억제되었다. 이 억제 효과는, LPS(+)/포지티브 컨트롤 NK-0033(+)의 투여군 5 및 LPS(+)/포지티브 컨트롤 NI-0030의 투여군 7보다, 강한 것이 분명해졌다. 또한, 네거티브 컨트롤 PK-0008(+)의 투여군 4, 네거티브 컨트롤 NK-0035(+)의 투여군 6, 네거티브 컨트롤 NI-0031(+)의 투여군 8에서는, 억제 효과는 확인되지 않았다.
(B10-2) 생체내에서의 오프 타겟 효과
프롤린을 갖는 링커로 치환한 ssRNA를 이용하여, 생체내에서의 오프 타겟 효과를 확인하여, 부작용을 평가하였다.
실시예의 RNA는, 상기 실시예 B9의 ssRNA(PK-0007)를 사용하였다. 비교예의 RNA는, 상기 실시예 B10-1에 나타내는, RNAi 네거티브 컨트롤(Nc)의 상기 ssRNA(PK-0008)를 사용하였다. 상기 RNA 100 ㎍을 멸균 생리 식염수 75 ㎕에 용해하여, 각각의 RNA 용액을 조제하였다.
이하에, 각 투여군을 나타낸다. 각 투여군에 있어서, 2∼4마리의 마우스를 사용하였다.
·투여군 1
멸균 생리 식염수 75 ㎕를 투여
·투여군 2
ssRNA 용액(PK-0007) 75 ㎕를 투여
·투여군 3
ssRNA 용액(PK-0008) 75 ㎕를 투여
그리고, 투여로부터 24시간 후, 상기 실시예 B10-1과 동일하게 하여, 마우스를 안락사시켰다. 상기 마우스의 심장에 천자하여, 혈액 샘플을 회수하고, 3.8％ 시트르산나트륨 수용액을 포함하는 시험관에 첨가하였다. 상기 시트르산나트륨 수용액의 양(체적)은, 상기 혈액 샘플의 1/10로 하였다. 이 혼합액으로부터, Yasui 등(Am J Respir Crit Care Med 2001: 163: 1660-8)의 기재에 따라, BALF(기관지 폐포 세정액) 샘플을 회수하였다. 그리고, 상기 BALF 샘플의 상청에 대해서, TNF-α량 및 IFN-β량을 측정하였다.
상기 TNF-α량은, 상품명 Mouse TNF set II(Beckton Dickinson and Company)를 이용하여, 그 사용 설명서에 따라 정량하였다. 또한, 상기 IFN-β량은, 상품명 Rabbit Anti-Mouse Interferonβ(PBL Interferon Source) 및 상품명 Biotin Labeling Kit-NH2(도진카가쿠켄큐쇼)를 이용하여 제작한 ELISA 플레이트를 이용하여, 이들의 사용 설명서에 따라 정량하였다.
그 결과를, 도 14에 나타낸다. 도 14(A)는 각 투여군의 BALF 샘플 중의 TNF-α량을 나타내는 그래프이고, 도 14(B)는 각 투여군의 BALF 샘플 중의 IFN-β량을 나타내는 그래프이다. 도 14에 있어서, 횡축은, 각각의 양을 나타낸다. 상기 PK-0007(+)의 실시예 투여군 2는, ssRNA(-)의 투여군 1과 비교하여, TNF-α 및 IFN-β의 발현이 야기되지 않았다.
(실시예 B11) 리보뉴클레아제 내성
본 발명의 ssRNA에 대해서, 리보뉴클레아제 내성을 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
실시예의 RNA(Ex)로서, 상기 실시예 B9의 ssRNA(PK-0007)를 사용하였다. 비교예의 RNA로서, 상기 실시예 B10-1에 나타내는, 포지티브 컨트롤(Pc)의 dsRNA(NI-0030)를 사용하였다.
우선, 20 m㏖/L Tris-HCl(pH 8)에, 60 p㏖의 상기 RNA, 5×10-5 유닛의 RNase A(Roche) 및 5×10-5 유닛의 RNase T1(상품명, Roche)을 혼합하여, 37℃에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 개시로부터 10분, 20분, 30분 후에, 정해진 법칙에 따라 RNase의 반응을 정지시켰다. 그리고, 상기 반응액을 15％ 폴리아크릴아미드 겔로 전기 영동한 후, SYBR Green II(상품명, Lonza)로 염색하여, E-BOX-VX2(상품명, 엠에스키키, 토쿄)를 이용하여 분석하였다.
(2) 결과
이 결과를 도 15에 나타낸다. 도 15는 리보뉴클레아제 내성을 나타내는 전기 영동 사진이다. 도 15에 있어서, 레인 「M」은, 분자량 마커이고, (분)은, 인큐베이팅 시간을 나타낸다.
도 15에 나타내는 바와 같이, 천연의 뉴클레오티드로 이루어지는 비교예의 NI-0030은, 인큐베이팅 10분 후에 있어서, 거의 전부가 분해되었다. 이에 대하여, 실시예의 PK-0007은, 인큐베이팅 10분 후에 있어서도, 잔존하고 있었다. 이 결과로부터, 본 발명의 ssRNA는, dsRNA보다 리보뉴클레아제 내성이 우수힌 것을 알 수 있었다.
(실시예 B12) 뉴클레아제 내성
본 발명의 ssRNA에 대해서, 뉴클레아제 내성을 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
실시예의 RNA(Ex)로서, 상기 실시예 B9의 ssRNA(PK-0007)를 사용하였다. 비교예의 RNA로서, 상기 실시예 B10-1에 나타내는, RNAi 포지티브 컨트롤(Pc)의 dsRNA(NI-0030)를 사용하였다.
우선, 5 m㏖/L CaCl2를 포함하는 50 m㏖/L Tris-HCl(pH 8)에, 60 p㏖의 상기 ssRNA, 0.5 유닛의 S7 뉴클레아제(Roche)를 혼합하여, 37℃에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 개시(0 h)로부터 0.5시간 후에, 정해진 법칙에 따라 S7 뉴클레아제의 반응을 정지시켰다. 그리고, 상기 반응액을 정해진 법칙에 따라, 7M 요소-15％ 폴리아크릴아미드 겔로 전기 영동한 후, SYBR Green II(상품명, Lonza)로 염색하여, E-BOX-VX2(상품명, 엠에스키키)를 이용하여 분석하였다.
(2) 결과
이 결과를 도 16에 나타낸다. 도 16은 S7 뉴클레아제 내성을 나타내는 전기 영동 사진이다. 도 16에 있어서, 레인 「M」은, 분자량 마커이고, (h)는, 인큐베이팅 시간을 나타낸다.
도 16에 나타내는 바와 같이, 천연의 뉴클레오티드로 이루어지는 비교예의 NI-0030은, 인큐베이팅 0.5시간 후에 있어서, 거의 전부가 분해되었다. 이에 대하여, 실시예의 PK-0007은, 인큐베이팅 0.5시간 후에 있어서도, 잔존하고 있었다. 이 결과로부터, 본 발명의 ssRNA는, dsRNA보다 S7 뉴클레아제 내성이 우수한 것을 알 수 있었다.
상기 실시예 B의 각 결과로부터, 본 발명의 ssPN은, 예컨대, 표적 유전자의 종류에 의존하는 일없이, 구축 가능한 것을 알 수 있었다. 이것으로부터, 본 발명의 ssPN 분자는, 유전자의 발현 억제에 있어서, 표적 유전자의 종류에 의존하는 일없이 사용할 수 있는, 범용성이 높은 새로운 툴이라고 할 수 있다.
(참고예 1)
프리 염기의 위치가 다른 ssRNA를 사용하여, 시험관내에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
RNA로서, 도 17에 나타내는 ssRNA를 사용하였다. 도 17에 있어서, 우단의 번호는, 서열번호를 나타낸다. 도 17에 있어서, 5'측으로부터, 소문자 밑줄의 영역은, 상기 영역(Xc), 대문자 밑줄의 영역은, 상기 내부 영역(Z), 소문자 밑줄의 영역은, 상기 영역(Yc)을 나타낸다. 상기 Xc와 상기 Z 사이가, 링커 영역(Lx)이고, 상기 Z와 상기 Yc 사이가, 링커 영역(Ly)이다. 또한, 「Xc/Yc」는, 상기 영역(Xc)의 염기 길이(Xc)와, 상기 영역(Yc)의 염기 길이(Yc)의 비를 나타낸다. 도 17에 있어서, 「*」는, 프리 염기를 나타낸다.
각 ssRNA는, 모두, 내부 영역(Z)의 염기 길이를 26 염기, 링커 영역(Lx)의 염기 길이를 7 염기, 링커 영역(Ly)의 염기 길이를 4 염기로 하였다. 또한, NK-0036 및 NK-0040은, 상기 영역(Xc)과 상기 영역(Yc)의 합계 염기수(Xc+Yc)를 26 염기로 하고, 그 이외에는, 상기 영역(Xc)과 상기 영역(Yc)의 합계 염기수(Xc+Yc)를 25 염기로 하였다. 그리고, 이 조건 하, 상기 영역(Xc) 및 상기 영역(Yc)의 염기 길이를 변화시켰다. 이에 의해, NK-0036 및 NK-0040은, 프리 염기를 갖지 않는 분자로 하였다. 또한, 이들 이외의 각 ssRNA는, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의, 이중쇄를 형성하지 않는 프리 염기를 전부 1 염기로 하고, 또한, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 상기 프리 염기의 위치를 3'측으로부터 5'측으로 변동시켰다.
상기 RNA를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B2와 동일하게 하여, HCT116 세포에의 트랜스펙션, 배양, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR을 행하여, GAPDH 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 트랜스펙션 시의 RNA 농도는, 10 n㏖/L로 하였다.
(2) 결과 및 고찰
이들의 결과를, 도 18에 나타낸다. 도 18은 최종 농도 10 n㏖/L의 RNA를 사용한 경우에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 18에 나타내는 바와 같이, 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 길이를 변화시킨 어떤 ssRNA에 대해서도, GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인할 수 있었다.
특히, 상기 영역(Xc)의 염기 길이와 상기 영역(Yc)의 염기 길이의 차가 커짐에 따라, 상대적으로 유전자의 발현량이 저하하여, 발현 억제 활성이 증가한 것이 확인되었다. 즉, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역의 중앙보다, 5'측 또는 3'측에 배치할수록, 상기 발현 억제 활성을 향상시킬 수 있는 것을 알 수 있었다.
(참고예 2)
프리 염기의 위치가 다른 ssRNA를 사용하여, 시험관내에 있어서의 TGF-β1 유전자의 발현 억제 효과를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
RNA로서, 이하에 나타내는 ssRNA를 사용하였다. 하기 서열에 있어서, 「*」는, 프리 염기를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00090
(1. 2) 유전자의 발현 억제
동결 보존한 상기 RNA를, 20 μ㏖/L가 되도록, 주사용 증류수에 용해하여, RNA 용액을 조제하였다. 그리고, 상기 RNA 용액을 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B9와 동일하게 하여, Hepal-6 세포에의 상기 ssRNA의 트랜스펙션, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR을 행하여, TGF-β1 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 트랜스펙션 시의 RNA 농도는, 1 n㏖/L로 하였다.
(2) 결과
이들의 결과를, 도 19에 나타낸다. 도 19는 TGF-β1 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 19에 나타내는 바와 같이, 어떤 ssRNA도, 유전자 발현 억제 활성을 나타내었다. 또한, 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 3' 말단으로부터 2번째 및 3번째로 한 NK-0055 및 NK-0062는, 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 3' 말단으로부터 4번째 및 5번째로 한 NK-0033 및 NK-0061보다, 높은 발현 억제 활성을 나타내었다. 이 결과는, 다른 유전자를 타겟으로 하는 상기 참고예 1과 동일한 거동이었다.
(참고예 3)
프리 염기의 위치가 다른 ssRNA를 사용하여, 시험관내에 있어서의 LAMA1 유전자의 발현 억제를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
RNA로서, 이하에 나타내는 ssRNA를 사용하였다. 하기 서열에 있어서, 「*」는, 프리 염기를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00091
상기 RNA를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B6과 동일하게 하여, 293 세포에의 트랜스펙션을 행하고, 상기 세포를 48시간 배양하였다. 트랜스펙션 시의 RNA 농도는, 10 n㏖/L로 하였다. 그리고, 프라이머로서, 이하의 LAMA1 유전자용 프라이머 세트를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B2와 동일하게 하여, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR을 행하여, LAMA1 유전자의 발현량 및 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량을 측정하였다. 상기 LAMA1 유전자의 발현량은, 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량에 따라 보정하였다.
LAMA1 유전자용 프라이머 세트
Figure 112013016609314-pct00092
또한, 상기 실시예 B2와 동일하게 하여, 컨트롤 1(-) 및 컨트롤 2(mock)에 관해서도, 발현량을 측정하였다. 그리고, 보정 후의 LAMA1 유전자 발현량에 대해서, 컨트롤(-)의 세포의 발현량을 1로 하여, 각 RNA를 도입한 세포의 발현량의 상대값을 구하였다.
(2) 결과
이들의 결과를, 도 20에 나타낸다. 도 20은 293 세포에 있어서의 LAMA1 유전자의 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 20에 나타내는 바와 같이, 어떤 ssRNA도, 유전자 발현 억제 활성을 나타내었다. 또한, 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 3' 말단으로부터 2번째로 한 NK-0064는, 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 3' 말단으로부터 4번째로 한 NK-0043보다, 높은 발현 억제 활성을 나타내었다. 이 결과는, 다른 유전자를 타겟으로 하는 상기 참고예 1 및 참고예 2와 동일한 거동이었다.
(참고예 4)
프리 염기의 위치가 다른 ssRNA를 이용하여, 시험관내에 있어서의 LMNA 유전자의 발현 억제를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
RNA로서, 이하에 나타내는 ssRNA를 사용하였다. 하기 서열에 있어서, 「*」는, 프리 염기를 나타낸다.
Figure 112013016609314-pct00093
상기 RNA를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B6과 동일하게 하여, A549 세포에의 트랜스펙션을 행하여, 상기 세포를 48시간 배양하였다. 트랜스펙션 시의 RNA 농도는, 3 n㏖/L로 하였다. 그리고, 프라이머로서, 이하의 LMNA 유전자용 프라이머 세트를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 B2와 동일하게 하여, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR을 행하여, LMNA 유전자의 발현량 및 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량을 측정하였다. 상기 LMNA 유전자의 발현량은, 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량에 따라 보정하였다.
LMNA 유전자용 프라이머 세트
Figure 112013016609314-pct00094
또한, 상기 실시예 B2와 동일하게 하여, 컨트롤 1(-) 및 컨트롤 2(mock)에 관해서도, 발현량을 측정하였다. 그리고, 보정 후의 LMNA 유전자 발현량에 대해서, 컨트롤(-)의 세포의 발현량을 1로 하여, 각 RNA를 도입한 세포의 발현량의 상대값을 구하였다.
(2) 결과
이들의 결과를, 도 21에 나타낸다. 도 21은 A549 세포에 있어서의 LMNA 유전자의 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 21에 나타내는 바와 같이, 어떤 ssRNA도, 유전자 발현 억제 활성을 나타내었다. 또한, 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 3' 말단으로부터 2번째로 한 NK-0066은, 프리 염기의 위치를, 상기 내부 영역(Z)에 있어서의 3' 말단으로부터 4번째로 한 NK-0063보다, 높은 발현 억제 활성을 나타내었다. 이 결과는, 다른 유전자를 타겟으로 하는 상기 참고예 1∼참고예 3과 동일한 거동이었다.
참고예 1∼참고예 4의 결과로부터, 예컨대, 프리 염기의 위치에 관해서는, 표적 유전자의 종류 및 그에 대한 발현 억제 서열에 관계없이, 같은 거동을 나타내는 것은 분명하다. 그리고, 상기 실시예 B9에 있어서는, 이들 참고예와 동일한 거동을 나타내고 있는 것은, 전술한 대로이다.
(참고예 5)
상기 내부 5'측 영역(X), 상기 5'측 영역(Xc), 상기 내부 3'측 영역(Y) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 각 길이를 변화시킨 ssRNA를 이용하여, 시험관내에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인하였다.
(1) 재료 및 방법
RNA로서, 도 22에 나타내는 ssRNA를 사용하였다. 도 22에 있어서, 우단의 번호는, 서열번호를 나타낸다. 도 22에 있어서, 5'측으로부터, 소문자 밑줄의 영역은, 상기 영역(Xc), 대문자 밑줄의 영역은, 상기 내부 영역(Z), 소문자 밑줄의 영역은, 상기 영역(Yc)을 나타낸다. 또한, 「Xc+Yc/X+Y」는, 상기 영역(Xc)과 상기 영역(Yc)의 염기 길이의 합계와, 상기 영역(X)과 상기 영역(Y)의 염기 길이의 합계의 비를 나타낸다. 도 22에 있어서, 「*」는, 프리 염기를 나타낸다.
각 ssRNA는, 모두, 링커 영역(Lx)의 염기 길이를 7 염기, 링커 영역(Ly)의 염기 길이를 4 염기, 상기 영역(Yc)의 염기 길이를 1 염기로 하여, 상기 내부 영역(Z)의 3'측으로부터 2번째의 염기를, 프리 염기로 하였다. 그리고, 상기 내부 영역(Z)의 염기 길이와 상기 영역(Xc)의 염기 길이를 변동시켰다.
특히 나타내지 않는 한은, 상기 실시예 B2와 동일하게 하여, 상기 RNA에 대해서, HCT116 세포에의 트랜스펙션, 배양, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR을 행하여, GAPDH 유전자의 발현량의 상대값을 산출하였다. 상기 트랜스펙션의 조건은, 상기 웰당의 조성을 상기 실시예 B4의 표 2와 동일하게 하였다.
(2) 결과 및 고찰
이들의 결과를, 도 23에 나타낸다. 도 23은 최종 농도 1 n㏖/L의 RNA를 사용한 경우에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 23에 나타내는 바와 같이, 상기 영역(X), 상기 영역(Xc), 상기 영역(Y) 및 상기 영역(Yc)의 길이를 변화시킨 어떤 ssRNA에 대해서도, GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인할 수 있었다.
이상, 실시형태를 참조하여 본원 발명을 설명하였지만, 본원 발명은 상기 실시형태에 한정되는 것이 아니다. 본원 발명의 구성이나 상세에는, 본원 발명의 범위 내에서 당업자가 이해할 수 있는 여러가지 변경을 할 수 있다.
본 출원은, 2010년 8월 3일에 출원된 일본 특허 출원 2010-174915, 2010년 10월 13일에 출원된 일본 특허 출원 2010-230806, 2010년 12월 2일에 출원된 일본 특허 출원 2010-269823, 및 2011년 7월 8일에 출원된 일본 특허 출원 2011-152381을 기초로 하는 우선권을 주장하며, 그 개시의 전부를 여기에 포함한다.
산업상 이용가능성
본 발명의 ssPN 분자에 의하면, 유전자의 발현 억제가 가능하고, 또한, 환형이 아니기 때문에, 그 합성이 용이하며, 또한, 일본쇄이기 때문에, 이본쇄의 어닐링 공정이 없어, 효율적으로 제조 가능하다. 또한, 상기 링커 영역이 상기 비뉴클레오티드 잔기를 포함하기 때문에, 예컨대, 종래와 같은 뉴클레오티드 잔기의 개변에 한정되지 않고, 예컨대, 상기 링커 영역에 있어서의 수식 등의 개변도 가능해진다. 이와 같이, 본 발명의 ssPN 분자는, 전술한 바와 같이 표적 유전자의 발현을 억제 가능하기 때문에, 예컨대, 의약품, 진단약 및 농약, 및, 농약, 의학, 생명 과학 등의 연구 툴로서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> BONAC CORPORATION <120> Single strand nucleic acid molecule having nitrogen containing alicyclic backbone <130> TF11004WO <150> JP 2010-174915 <151> 2010-08-03 <150> JP 2010-230806 <151> 2010-10-13 <150> JP 2010-269823 <151> 2010-12-02 <150> JP 2011-152381 <151> 2011-07-08 <160> 69 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 1 ggcuguuguc auacuucuca ugguu 25 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 2 ccaugagaag uaugacaaca gcc 23 <210> 3 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 3 ccaugagaag uaugacaaca gccggcuguu gucauacuuc ucaugguu 48 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 4 guugucauac uucucaugg 19 <210> 5 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 5 ccaugagaag uaugacaaca gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguu 55 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> 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acid molecule <400> 30 uugcgcuuuu uggugacgc 19 <210> 31 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 31 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu 60 cg 62 <210> 32 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 32 accaugagaa guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc 60 gg 62 <210> 33 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 33 ccaugagaag uaugacaaca gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg 60 ga 62 <210> 34 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 34 caugagaagu augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 aa 62 <210> 35 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 35 augagaagua ugacaacagc cccacaccgg cuguugucau acuucucaug guucuucgga 60 ac 62 <210> 36 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 36 ugagaaguau gacaacagcc ccacaccggc uguugucaua cuucucaugg uucuucggaa 60 cc 62 <210> 37 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 37 agaaguauga caacagcccc acaccggcug uugucauacu ucucaugguu cuucggaacc 60 au 62 <210> 38 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 38 aaguaugaca acagccccac accggcuguu gucauacuuc ucaugguucu ucggaaccau 60 ga 62 <210> 39 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 39 guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaaccauga 60 ga 62 <210> 40 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 40 augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aaccaugaga 60 ag 62 <210> 41 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 41 acaacagccc cacaccggcu guugucauac uucucauggu ucuucggaac caugagaagu 60 au 62 <210> 42 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 42 aacagcccca caccggcugu ugucauacuu cucaugguuc uucggaacca ugagaaguau 60 ga 62 <210> 43 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 43 cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu cggaaccaug agaaguauga 60 ca 62 <210> 44 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 44 agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaaccauga gaaguaugac 60 aa 62 <210> 45 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 45 gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg gaaccaugag aaguaugaca 60 ac 62 <210> 46 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 46 ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aaccaugaga aguaugacaa 60 ca 62 <210> 47 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 47 cccacaccgg cuguugucau acuucucaug guucuucgga accaugagaa guaugacaac 60 ag 62 <210> 48 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 48 ccacaccggc uguugucaua cuucucaugg uucuucggaa ccaugagaag uaugacaaca 60 gc 62 <210> 49 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 49 cagcuguaca uugacuuuag ccccacaccg gcuaaaguca auguacagcu gcuucuucgg 60 aa 62 <210> 50 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 50 agcuguacau ugacuuuagc cccacaccgg cuaaagucaa uguacagcug cuucuucgga 60 a 61 <210> 51 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 51 agcagcugua cauugacuuu agccccacac cggcuaaagu caauguacag cugcuucuuc 60 gg 62 <210> 52 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 52 gcagcuguac auugacuuua gccccacacc ggcuaaaguc aauguacagc ugcuucuucg 60 g 61 <210> 53 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 53 uguuugucuc guuacaauau ccccacaccg gauauuguaa cgagacaaac acuccuucgg 60 ga 62 <210> 54 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 54 aguguuuguc ucguuacaau auccccacac cggauauugu aacgagacaa acacuccuuc 60 gg 62 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 55 aaagctgcca atgcccctcg acc 23 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 56 taggtgggtg gccctcgtct tg 22 <210> 57 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 57 cgucaccaaa aagcgcaauu ccccacaccg gaauugcgcu uuuuggugac gcuucuucgg 60 aa 62 <210> 58 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 58 agcgucacca aaaagcgcaa uuccccacac cggaauugcg cuuuuuggug acgcuucuuc 60 gg 62 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 59 ctggacatca agctggccct ggac 24 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 60 caccagcttg cgcatggcca cttc 24 <210> 61 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 61 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucgu 60 ucgc 64 <210> 62 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 62 accaugagaa guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc 60 gg 62 <210> 63 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 63 accaugagaa guaugacaac agcccacacc gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 <210> 64 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 64 ccaugagaag uaugacaaca gcccacaccg cuguugucau acuucucaug guuuucga 58 <210> 65 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 65 accaugagaa guaugacaac agccacaccc uguugucaua cuucucaugg uucuucgg 58 <210> 66 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 66 ccaugagaag uaugacaaca gccacacccu guugucauac uucucauggu uuucga 56 <210> 67 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 67 caugagaagu augacaacag ccacacccug uugucauacu ucucaugguu ucga 54 <210> 68 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 68 ccaugagaag uaugacaaca ccacaccugu ugucauacuu cucaugguuu ucga 54 <210> 69 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> nucleic acid molecule <400> 69 caugagaagu augacaacac cacaccuguu gucauacuuc ucaugguuuc ga 52

Claims (52)

  1. 표적 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 서열을 포함하는 일본쇄 핵산 분자로서,
    5'측 영역(Xc), 링커 영역(Lx), 영역(X), 영역(Y), 링커 영역(Ly) 및 3'측 영역(Yc)을 이 순서로 포함하고,
    상기 영역(X)과 상기 영역(Y)이 연결되어, 내부 영역(Z)을 형성하고,
    상기 5'측 영역(Xc)이 상기 영역(X)과 상보적이고,
    상기 3'측 영역(Yc)이 상기 영역(Y)과 상보적이며,
    상기 내부 영역(Z)이 상기 발현 억제 서열을 포함하며,
    5' 말단과 3' 말단이 미결합하고,
    상기 링커 영역(Lx)이, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 한쪽을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 갖고,
    상기 내부 영역(Z)의 염기수(Z)가 19~30 염기이고,
    상기 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc)가 1~11 염기이거나, 또는 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)가 1~11 염기이고,
    상기 발현 억제 서열이 1개 뿐인 것을 특징으로 하는 일본쇄 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 링커 영역(Lx)이 하기 식 (I)로 표시되는 일본쇄 핵산 분자:
    Figure 112017022296755-pct00095

    상기 식 중,
    X1 및 X2는, 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH이며;
    Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S이고;
    R3은, 고리 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이며;
    L1은, n개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이고, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 혹은 SRa로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋으며, 또는,
    L1은, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가, 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이고,
    단, Y1이, NH, O 또는 S인 경우, Y1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, OR1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며;
    L2는, m개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이고, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 혹은 SRc로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋으며, 또는,
    L2는, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가, 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이고,
    단, Y2가, NH, O 또는 S인 경우, Y2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, OR2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며;
    Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고;
    l은, 1 또는 2이며;
    m은, 0∼30의 범위의 정수이고;
    n은, 0∼30의 범위의 정수이며;
    고리 A는, 상기 고리 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가, 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 좋고,
    상기 고리 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함하여도 좋으며,
    상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 영역(X)은, 각각, -OR1- 또는 -OR2-를 개재하여, 상기 링커 영역(Lx)에 결합하고,
    여기서, R1 및 R2는, 존재하여도 존재하지 않아도 좋으며, 존재하는 경우, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조 (I)이다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X) 및 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc)가, 하기 식 (3) 또는 식 (5)의 조건을 만족하는 일본쇄 핵산 분자.
    X>Xc···(3)
    X=Xc···(5)
  4. 제3항에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X) 및 상기 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc)가, 하기 식 (11)의 조건을 만족하는 일본쇄 핵산 분자.
    X-Xc=1, 2 또는 3···(11)
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 링커 영역(Ly)이, 피롤리딘 골격 또는 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 갖는 일본쇄 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커 영역(Ly)이, 하기 식 (I)로 표시되는 일본쇄 핵산 분자.
    Figure 112017022296755-pct00096

    상기 식 중,
    X1 및 X2는, 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH이고;
    Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S이며;
    R3은, 고리 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이고;
    L1은, n개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이며, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 혹은 SRa로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
    L1은, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가, 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
    단, Y1이, NH, O 또는 S인 경우, Y1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이고, OR1에 결합하는 L1의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고;
    L2는, m개의 원자로 이루어지는 알킬렌쇄이며, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 혹은 SRc로 치환되어도 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
    L2는, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가, 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
    단, Y2가, NH, O 또는 S인 경우, Y2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이고, OR2에 결합하는 L2의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고;
    Ra, Rb, Rc 및 Rd는, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이며;
    l은, 1 또는 2이고;
    m은, 0∼30의 범위의 정수이며;
    n은, 0∼30의 범위의 정수이고;
    고리 A는, 상기 고리 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가, 질소, 산소, 황으로 치환되어도 좋으며,
    상기 고리 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함하여도 좋고,
    상기 3'측 영역(Yc) 및 상기 영역(Y)은, 각각, -OR1- 또는 -OR2-를 개재하여, 상기 링커 영역(Ly)에 결합하며,
    여기서, R1 및 R2는, 존재하여도 존재하지 않아도 좋고, 존재하는 경우, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조 (I)이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc) 및 상기 영역(X)과, 상기 링커 영역(Lx)의 상기 식 (I)의 구조의 결합, 및,
    상기 3'측 영역(Yc) 및 상기 영역(Y)과, 상기 링커 영역(Ly)의 상기 식 (I)의 구조의 결합이, 각각, 하기 (1)∼(4) 중 어느 하나의 조건을 만족하는 일본쇄 핵산 분자:
    조건 (1)
    상기 5'측 영역(Xc)은 -OR2-를 개재하고, 상기 영역(X)은 -OR1-을 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합하고,
    상기 3'측 영역(Yc)은 -OR1-을 개재하고, 상기 영역(Y)은 -OR2-를 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
    조건 (2)
    상기 5'측 영역(Xc)은 -OR2-를 개재하고, 상기 영역(X)은 -OR1-을 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합하고,
    상기 3'측 영역(Yc)은 -OR2-를 개재하고, 상기 영역(Y)은 -OR1-을 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
    조건 (3)
    상기 5'측 영역(Xc)은 -OR1-을 개재하고, 상기 영역(X)은 -OR2-를 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합하고,
    상기 3'측 영역(Yc)은 -OR1-을 개재하고, 상기 영역(Y)은 -OR2-를 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
    조건 (4)
    상기 5'측 영역(Xc)은 -OR1-을 개재하고, 상기 영역(X)은 -OR2-를 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합하고,
    상기 3'측 영역(Yc)은 -OR2-를 개재하고, 상기 영역(Y)은 -OR1-을 개재하여, 상기 식 (I)의 구조와 결합한다.
  11. 제2항 또는 제9항에 있어서, 상기 식 (I)에 있어서, L1은 상기 폴리에테르쇄이고, 상기 폴리에테르쇄가 폴리에틸렌글리콜인 일본쇄 핵산 분자.
  12. 제2항 또는 제9항에 있어서, 상기 식 (I)에 있어서, L1의 원자 개수(n)와 L2의 원자 개수(m)의 합계(m+n)가, 0∼30의 범위인 일본쇄 핵산 분자.
  13. 제2항 또는 제9항에 있어서, 상기 식 (I)의 구조가, 하기 식 (I-1)∼식 (I-9) 중 어느 하나이고, 하기 식에 있어서, n은 0∼30의 정수, m은 0∼30의 정수, q는 0∼10의 정수인 일본쇄 핵산 분자.
    Figure 112013050219566-pct00097
  14. 제13항에 있어서, 상기 식 (I-1)에 있어서, n=8, 상기 (I-2)에 있어서, n=3, 상기 식 (I-3)에 있어서, n=4 또는 8, 상기 (I-4)에 있어서, n=7 또는 8, 상기 식 (I-5)에 있어서, n=3 및 m=4, 상기 (I-6)에 있어서, n=8 및 m=4, 상기 식 (I-7)에 있어서, n=8 및 m=4, 상기 (I-8)에 있어서, n=5 및 m=4, 상기 식 (I-9)에 있어서, q=1 및 m=4인 일본쇄 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 식 (I-4)가 하기 식 (I-4a)이고, 상기 식 (I-8)이 하기 식 (I-8a)인 일본쇄 핵산 분자.
    Figure 112013016609314-pct00098
  16. 제1항에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X), 상기 영역(Y)의 염기수(Y), 상기 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)가, 하기 식 (1) 및 (2)의 조건을 만족하는 일본쇄 핵산 분자.
    Z=X+Y ···(1)
    Z≥Xc+Yc···(2)
  17. 제1항에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X), 상기 5'측 영역 (Xc)의 염기수(Xc), 상기 영역(Y)의 염기수(Y) 및 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)가, 하기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 조건을 만족하는 일본쇄 핵산 분자:
    (a) 하기 식 (3) 및 (4)의 조건을 만족한다.
    X>Xc···(3)
    Y=Yc···(4)
    (b) 하기 식 (5) 및 (6)의 조건을 만족한다.
    X=Xc···(5)
    Y>Yc···(6)
    (c) 하기 식 (7) 및 (8)의 조건을 만족한다.
    X>Xc···(7)
    Y>Yc···(8)
    (d) 하기 식 (9) 및 (10)의 조건을 만족한다.
    X=Xc···(9)
    Y=Yc···(10)
  18. 제17항에 있어서, 상기 (a)∼(d)에 있어서, 상기 영역(X)의 염기수(X)와 상기 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc)의 차, 상기 영역(Y)의 염기수(Y)와 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)의 차가, 하기 조건을 만족하는 일본쇄 핵산 분자:
    (a) 하기 식 (11) 및 (12)의 조건을 만족한다.
    X-Xc=1, 2 또는 3···(11)
    Y-Yc=0 ···(12)
    (b) 하기 식 (13) 및 (14)의 조건을 만족한다.
    X-Xc=0 ···(13)
    Y-Yc=1, 2 또는 3···(14)
    (c) 하기 식 (15) 및 (16)의 조건을 만족한다.
    X-Xc=1, 2 또는 3···(15)
    Y-Yc=1, 2 또는 3···(16)
    (d) 하기 식 (17) 및 (18)의 조건을 만족한다.
    X-Xc=0 ···(17)
    Y-Yc=0 ···(18)
  19. 제1항에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc)가 1∼11 염기인 일본쇄 핵산 분자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc)가 1∼7 염기인 일본쇄 핵산 분자.
  21. 제19항에 있어서, 상기 5'측 영역(Xc)의 염기수(Xc)가 1∼3 염기인 일본쇄 핵산 분자.
  22. 제1항에 있어서, 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)가 1∼11 염기인 일본쇄 핵산 분자.
  23. 제22항에 있어서, 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)가 1∼7 염기인 일본쇄 핵산 분자.
  24. 제22항에 있어서, 상기 3'측 영역(Yc)의 염기수(Yc)가 1∼3 염기인 일본쇄 핵산 분자.
  25. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 수식된 잔기를 포함하는 일본쇄 핵산 분자.
  26. 제1항에 있어서, 표지 물질을 포함하는 일본쇄 핵산 분자.
  27. 제1항에 있어서, 안정 동위체를 포함하는 일본쇄 핵산 분자.
  28. 제1항에 있어서, RNA 분자인 일본쇄 핵산 분자.
  29. 제1항에 있어서, 상기 일본쇄 핵산 분자에 있어서, 염기수의 합계가 50 염기 이상인 일본쇄 핵산 분자.
  30. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현 억제가 RNA 간섭에 의한 발현 억제인 일본쇄 핵산 분자.
  31. 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물로서,
    제1항에 기재된 일본쇄 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 억제용 조성물.
  32. 제1항에 기재된 일본쇄 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 치료용 약학적 조성물.
  33. 삭제
  34. 시험관내(in vitro)에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서,
    제1항에 기재된 일본쇄 핵산 분자를 사용하는 것을 특징으로 하는 발현 억제 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 일본쇄 핵산 분자를 세포, 조직 또는 기관에 투여하는 공정을 포함하는 발현 억제 방법.
  36. 삭제
  37. 제34항에 있어서, 상기 유전자의 발현 억제가 RNA 간섭에 의한 발현 억제인 발현 억제 방법.
  38. 제1항에 기재된 일본쇄 핵산 분자를 사용하는 것을 특징으로 하는 시험관내에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭을 유도하는 방법.
  39. 질환의 치료 방법으로서,
    제1항에 기재된 일본쇄 핵산 분자를, 비인간 동물에게 투여하는 공정을 포함하고,
    상기 일본쇄 핵산 분자가, 상기 발현 억제 서열로서, 상기 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
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