WO2020202950A1 - 無機多孔質担体及びこれを用いた核酸の製造方法 - Google Patents

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inorganic porous
porous body
carbon atoms
porous carrier
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香菜子 山▲崎▼
北原　真樹
原　孝志
吉岡　健
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住友化学株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an inorganic porous carrier, a method for producing a nucleic acid using the same, and a silane coupling agent suitable for introducing a functional group into the inorganic porous body.
  • a solid-phase synthesis method based on the phosphoramidite method is widely used.
  • a functional group such as an amino group is introduced onto the inorganic porous body using a silane coupling agent or the like, and the nucleoside which is the 3'end of the nucleic acid is bound to the functional group.
  • a nucleic acid extension reaction is carried out on a solid phase carrier starting from the nucleoside.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide an inorganic porous carrier capable of further increasing the yield and the like in the production of nucleic acid, and a method for producing nucleic acid using the same. ..
  • the present invention adopts the following configuration.
  • the first aspect of the present invention is characterized by having a linker represented by the following general formula (1) and having a pore distribution having a pore diameter (mode diameter, the same applies hereinafter) of 0.04 ⁇ m or more. It is an inorganic porous carrier.
  • R 1 and R 2 may independently have a substituent selected from the group consisting of an alkoxy group and a fluorine atom.
  • L is a single bond, an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 2 to 20 carbon atoms, and has at least one -CH 2- CH 2- group constituting the alkylene group.
  • a second aspect of the present invention is an inorganic porous material having a linker represented by the following general formula (2) and having a pore size (mode diameter) of 0.04 ⁇ m or more. It is a carrier (hereinafter, this inorganic porous carrier may be referred to as a "solid phase carrier").
  • R 1 and R 2 may independently have a substituent selected from the group consisting of an alkoxy group and a fluorine atom.
  • L is a single bond, an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 2 to 20 carbon atoms, and has at least one -CH 2- CH 2- group constituting the alkylene group.
  • L 1 in the general formula (2) may be a succinyl linker or universal linker.
  • the specific surface area per volume of the inorganic porous body may be 0.1 m 2 / mL or more and 100 m 2 / mL or less.
  • the pore volume per volume of the inorganic porous body may be 0.05 mL / mL or more and 0.6 mL / mL or less.
  • the porosity of the inorganic porous body may be 50% or more.
  • the carrier density of the linker is 0.1 ⁇ mol / m 2 or more and 5.0 ⁇ mol / m with respect to the specific surface area per mass of the inorganic porous body. It may be 2 or less.
  • the particle size (median diameter) of the inorganic porous body may be 1 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less.
  • the inorganic porous body may be silica, silica gel, zeolite or glass.
  • a third aspect of the present invention is to use an inorganic porous carrier in which R b in the general formula (2) represents a nucleoside or a nucleotide having a protected hydroxyl group as a reactive group, and 5'of the nucleoside.
  • R b in the general formula (2) represents a nucleoside or a nucleotide having a protected hydroxyl group as a reactive group, and 5'of the nucleoside.
  • the step (B) for producing phosphite the step (C) for producing nucleotides by oxidizing the phosphite produced in the step (B), and the 5'position of the nucleotide produced in the step (C).
  • a method for producing a nucleic acid (hereinafter, referred to as "method for producing a nucleic acid of the present invention"), which comprises a step (D) of deprotecting a protecting group of a hydroxyl group.
  • the method for producing nucleic acid further condenses the product produced in the step (D) with an amidite compound having a nucleoside base to be introduced next.
  • Step of reacting to produce phosphite (B') The step (C') of oxidizing the phosphite produced in the step (B') to produce an oligonucleotide, and Step (D') to deprotect the protecting group of the hydroxyl group at the 5'position at the end of the oligonucleotide chain generated in the step (C'). May include.
  • the method for producing nucleic acid further comprises a series of steps including the steps (B'), steps (C') and steps (D') described above.
  • the step (E) of cutting out the elongated nucleic acid after reacting m amidite compounds by repeating m times (m represents an integer of 1 or more) may be included.
  • a fourth aspect of the present invention is a silane coupling agent (hereinafter, referred to as "silane coupling agent of the present invention”), which is represented by the following general formula (3).
  • R 1 and R 2 may each independently have a substituent selected from the group consisting of an alkoxy group and a fluorine atom, or an alkyl group having 3 to 10 carbon atoms, or an alkyl group.
  • L is a single bond, an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 2 to 20 carbon atoms, and has at least one -CH 2- CH 2- group constituting the alkylene group.
  • R 3 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • L is a methylene group
  • R 1 is an isopropyl group
  • R 2 is an isopropyl group
  • R 3 is an ethyl group
  • L is a methylene group
  • R 1 is an n-propyl group. Excludes those in which R 2 is an n-propyl group and R 3 is an n-propyl group.
  • a fifth aspect of the present invention is the use of the inorganic porous carrier according to the first aspect or the solid phase carrier according to the second aspect in the production of nucleic acid by the phosphoramidite method.
  • the purity or yield can be further increased in the production of nucleic acid.
  • the purity or yield can be further increased, and particularly long-stranded nucleic acid can be obtained in high yield.
  • Inorganic porous carrier The inorganic porous carrier according to the first aspect of the present invention will be described.
  • the inorganic porous body constituting the inorganic porous carrier of the present embodiment is an inorganic porous body having a pore distribution having a pore diameter of 0.04 ⁇ m or more, and typically carries a silane coupling agent. It has a silanol group that can be used.
  • Typical examples of such an inorganic porous body are silica, silica gel, zeolite, glass, quartz, or two or more thereof, and silica gel, silica gel, zeolite, or glass is preferable.
  • these products commercially available products may be used, or those prepared by a synthetic method such as the following may be used.
  • Examples of the method for producing an inorganic porous body containing a silanol group include a dry method and a wet method. Specific examples of the former include a combustion method and an arc method, and specific examples of the latter include synthesis methods such as a sedimentation method, a sol-gel method, and a hydrothermal synthesis method (Reference: TOSOH Research & Technology Review Vol). . 45 (2001).).
  • Such an inorganic porous body is prepared by, for example, using silicate, alkoxysilane, chlorosilanes and the like as raw materials, and using a solvent and a template as described above.
  • the obtained inorganic porous body is preferably in the form of particles, and may be formed into a spherical shape, or may be in the form of a lump or a crushed form. However, when these are used as a carrier, the filling property into the nucleic acid synthesis column From the viewpoint, spherical or crushed form is preferable.
  • the molding method is not particularly limited, but a spray drying method or an emulsion method can be used.
  • the size of the inorganic porous body is not particularly limited, but is measured by a laser diffraction method (scattering method) from the viewpoint of column filling efficiency during solid-phase synthesis of nucleic acid, liquid feeding rate during column filling, and the like.
  • the particle size (median diameter, the same applies hereinafter) is preferably 1 to 1000 ⁇ m, more preferably 5 to 500 ⁇ m, and even more preferably 10 to 300 ⁇ m.
  • the inorganic porous body in the present embodiment a porous body having a pore diameter of 0.04 ⁇ m or more is used.
  • the inorganic porous body to be used can be appropriately selected according to the chain length of the nucleic acid to be synthesized. Usually, when the chain length of the nucleic acid to be synthesized is long, it is preferable to select a nucleic acid having a large pore diameter.
  • the pore diameter is preferably 0.04 ⁇ m or more and 0.5 ⁇ m or less, and more preferably 0.04 ⁇ m or more and 0.3 ⁇ m or less.
  • the pore diameter is the peak top in the pore diameter distribution obtained by the mercury intrusion method (the X-axis is the value of the pore diameter and the Y-axis is the value obtained by differentiating the pore volume with the pore diameter). It is obtained from the value of the X-axis of.
  • the specific surface area per volume of the inorganic porous body is not particularly limited. In order to increase the amount of nucleic acid produced per column, it is preferable that the specific surface area per volume is high regardless of the chain length of the nucleic acid. Specifically, the specific surface area per volume is preferably 0.1 to 100 m 2 / mL, more preferably 1 to 50 m 2 / mL, and even more preferably 3 to 20 m 2 / mL.
  • the pore volume of the inorganic porous body of the present embodiment is not particularly limited. In general, in order to increase the amount of nucleic acid produced per column, it is preferable that the pore volume (mL / mL) per volume is high regardless of the chain length of the nucleic acid.
  • the pore volume per volume is preferably 0.05 to 0.6 mL / mL, more preferably 0.05 to 0.5 mL / mL.
  • the pore volume per volume is determined by the product of the bulk density (g / mL) obtained by the mercury intrusion method and the cumulative pore volume (mL / g) having a pore diameter in the range of 0.04 ⁇ m to 1 ⁇ m. ..
  • the porosity of the inorganic porous body is not particularly limited, and generally, in order to increase the amount of nucleic acid produced per column, a high porosity is preferable regardless of the chain length of the nucleic acid.
  • the porosity is determined by a mercury intrusion method, and is preferably 50% or more, more preferably 70% or more.
  • the porosity here is calculated from the pore volume in the range of the pore diameter of 0.004 to 200 ⁇ m, which is the measurement range of the mercury intrusion method. That is, it is obtained by the product of the cumulative pore volume (mL / g) and the bulk density (g / mL) in the range of 0.004 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the inorganic porous carrier of the present embodiment has a linker represented by the following general formula (1).
  • R 1 and R 2 may independently have a substituent selected from the group consisting of an alkoxy group and a fluorine atom.
  • L is a single bond, an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 2 to 20 carbon atoms, and has at least one -CH 2- CH 2- group constituting the alkylene group.
  • the alkyl group in R 1 and R 2 may be any of a linear alkyl group, a branched chain alkyl group or a cyclic alkyl group, and the yield can be easily increased. It is preferably a chain alkyl group.
  • the alkyl group in R 1 and R 2 preferably has 3 to 10 carbon atoms, preferably 3 to 6 carbon atoms, and more preferably 3 or 4 carbon atoms.
  • Examples of the alkyl group in R 1 and R 2 include linear alkyl groups such as n-propyl group, n-butyl group, n-hexyl group and n-octyl group; isopropyl group, isobutyl group and sec-butyl group.
  • Substituents that may be substituted with the alkyl group represented by R 1 and R 2 are an alkoxy group and a fluorine atom. Examples of this alkoxy group include an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms.
  • Substituents that may be substituted with the phenyl group represented by R 1 and R 2 are an alkyl group, an alkoxy group, and a fluorine atom.
  • Examples of the alkyl group here include alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms.
  • Examples of the alkoxy group here include an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 1 and R 2 may be the same or different from each other, and are preferably the same from the viewpoint of synthesis (for example, convenience and efficiency).
  • the alkylene group having 1 to 20 carbon atoms in L may be either a linear alkylene group or a branched chain alkylene group, and the yield can be easily increased. It is preferably a chain alkylene group.
  • the alkylene group in L preferably has 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, and more preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • L is an alkylene group having 2 to 20 carbon atoms, and -O- and -NH are added to at least one -CH 2- CH 2- group constituting the alkylene group. It can also represent a group containing -CH 2- Q-CH 2-, in which any group Q selected from the group consisting of-, -NH-CO- and -NH-CO-NH- is inserted. .. However, the carbon atom of the methylene group bonded to the group Q does not bond at the same time as another group Q.
  • the inorganic porous carrier of the present embodiment can be produced, for example, by a method of surface-treating the inorganic porous body with a silane coupling agent represented by the following general formula (3a).
  • R 1 and R 2 may each independently have a substituent selected from the group consisting of an alkoxy group and a fluorine atom, or an alkyl group having 3 to 10 carbon atoms, or an alkyl group.
  • L is a single bond, an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 2 to 20 carbon atoms, and has at least one -CH 2- CH 2- group constituting the alkylene group.
  • -CH 2- Q-CH 2- represents a group into which any group Q selected from the group consisting of -O-, -NH-, -NH-CO- and -NH-CO-NH- is inserted: -CH 2- Q-CH 2- Represents a group. However, the carbon atom of the methylene group bonded to the group Q does not bond at the same time as another group Q.
  • R 3 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the alkyl group for R 3 is preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a methyl group, or ethyl group.
  • silane coupling agent represented by the general formula (3a) is given below.
  • the silane coupling agent of the above general formula (3a) can be produced by the reaction route (synthetic route 1, synthetic route 2, or synthetic route 3) shown below.
  • an amine compound or a halogen compound having a terminal olefin for example, allylamine or 6-chloro-1-hexene
  • a platinum catalyst to synthesize a silane compound 4 (Step 3).
  • compound 1 is an alkoxysilane (trimethoxysilane, triethoxysilane, etc.)
  • a substituent R 1 , R 2
  • the silane compound 4 may be synthesized by the hydrosilylation reaction.
  • Step2 R 3 O groups in Step6 introduction of (methoxy group, an ethoxy group, or propoxy group or the like), a method of adding methanol as a reagent R 3 OH, ethanol, propanol or the like, the solution containing the compound 2 or compound 6, Alternatively, compound 2 or compound 6 can be added dropwise to the corresponding alcohol or a solution containing the corresponding alcohol.
  • Synthetic Route 3 (Step 7): In the above-mentioned synthetic route 1 and synthetic route 2, a silane compound 4 having a functional group Y (amino group or halogen atom) can be obtained.
  • the functional group Y is an amino group
  • various silane coupling agents can be produced by using a method of carbamoylizing, amidating or ureidizing the amino group of the silane compound 4.
  • the functional group Y is a halogen atom
  • the silane compound 4a is reacted with an ammonia or a primary amine compound to remove the halogen atom and introduce an amino group or an imino group (-NH-).
  • a silane compound 4b can be obtained and various silane coupling agents can be produced as it is or by the same method as described above (Step 7).
  • reaction solvent pentane, hexane, heptane, toluene, tetrahydrofuran and the like, or two or more kinds of organic solvents thereof are preferable.
  • Distillation under normal pressure or reduced pressure conditions is usually used for purification of the silane compound.
  • silane coupling agent for example, liquid separation, distillation, or column chromatography is used.
  • the production of the inorganic porous carrier having the linker represented by the general formula (1) is, for example, a method of mixing the inorganic porous body, a specific silane coupling agent, and a solvent, and then removing the solvent. It is done in. In this case, the mixing causes a specific silane coupling agent to covalently bond with a silanol group on the surface of the inorganic porous body to form an inorganic porous carrier carrying a linker represented by the general formula (1).
  • solvent examples include acetonitrile, toluene, anisole, 2-heptane, propylene glycol monomethyl ether acetate, N, N-dimethylformamide, tetrahydrofuran, pentane, hexane, heptane, xylene, mesitylene, dichloromethane, chlorobenzene, water and the like. , Or two or more of these can be used, and among these, toluene is preferable.
  • the above-mentioned inorganic porous body and solvent are preferably used after being dehydrated from the viewpoint of suppressing the polymerization of the silane coupling agents and promoting the reaction between the silane coupling agent and the surface of the inorganic porous body.
  • the dehydration method is not particularly limited, but for example, a method of heating the inorganic porous body under reduced pressure or a method of dispersing the inorganic porous body in a solvent and then distilling off the solvent under normal pressure or reduced pressure to azeotrope. A method of dehydration can be mentioned.
  • the mixture is usually heated to near the boiling point of the solvent to promote the reaction, but the temperature is not limited to this, and the mixture may be cooled to room temperature or lower. You may.
  • the reaction between the inorganic porous material and the silane coupling agent is usually carried out in about 1 to 12 hours, but in the case of the silane coupling agent having an amino group, since it has a catalytic effect of promoting the reaction itself, the number is several. It may be done in about a minute.
  • the addition amount of the silane coupling agent is determined by N 2 adsorption-desorption measurements, relative to the weight per specific surface area of the inorganic porous material, typically, the loading density of the linker is 0.1 ⁇ 5.0 ⁇ mol / m 2 The amount is preferably 0.5 to 2.0 ⁇ mol / m 2 .
  • the silanol group not used in the reaction with the silane coupling agent may be optionally capped with a functional group that is inert to nucleic acid synthesis, such as a trimethylsilyl group.
  • an inorganic porous carrier modified with an aminosilyl group having a substituent (R 1 , R 2 ) can be produced. it can.
  • nucleic acid production method In the method for producing nucleic acid of the present embodiment, the nucleic acid can be synthesized by using the above-mentioned inorganic porous carrier and applying a known method. Of these, the production of nucleic acids by the phosphoramidite method is preferable. Hereinafter, the nucleic acid synthesis method by the phosphoramidite method will be described.
  • the solid-phase carrier is a carrier in which a nucleoside or nucleotide in which a reactive group is protected or deprotected is bound via a divalent group to the amino group (-NH 2 ) of the above-mentioned inorganic porous carrier.
  • an inorganic porous carrier having a linker represented by the following general formula (2) and having a pore diameter (mode diameter) of 0.04 ⁇ m or more is used as the solid phase carrier. Can be done.
  • R 1 and R 2 may independently have a substituent selected from the group consisting of an alkoxy group and a fluorine atom.
  • L is a single bond, an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, or an alkylene group having 2 to 20 carbon atoms, and has at least one -CH 2- CH 2- group constituting the alkylene group.
  • -CH 2- Q-CH 2- represents a group into which any group Q selected from the group consisting of -O-, -NH-, -NH-CO- and -NH-CO-NH- is inserted: -CH 2- Q-CH 2- Represents a group. However, the carbon atom of the methylene group bonded to the group Q does not bond at the same time as another group Q.
  • Rb represents a nucleoside or nucleotide in which the reactive group is protected or deprotected.
  • L 1 represents a divalent group bonded to the oxygen atom of the primary or secondary hydroxyl group of R b . ]
  • R 1 , R 2 and L in the formula (2) is the same as the description of R 1 , R 2 and L in the formula (1).
  • a typical example of the divalent group L 1 is composed of a succinyl linker, a universal linker, or a group linking an imino group (-NH-) in the above formula (2) with a universal linker, and a universal linker.
  • the linking group to be used is exemplified.
  • the universal linker is bound to the hydroxyl group of the nucleotide that is the starting point of nucleic acid synthesis, the functional group that forms phosphite (typically, the hydroxyl group), and the amino group at the linker terminal represented by the above formula (1).
  • Adjacent protected functional groups that have a functional group capable of nucleophilically attacking the phosphorus atom of phosphoric acid under the conditions for cleaving the synthesized nucleic acid in the same molecule. (For example, all have a protected amino group, hydroxyl group, thiol group). More specifically, as the divalent group L 1 , a linking group represented by the following formula L 10 or a linking group represented by the formula L 11 is exemplified.
  • L 10 and Formula L 11 is coupled marked with ⁇ , representing the binding to the imino group in the formula (2) (-NH-).
  • the bond marked with # represents the bond of the primary or secondary hydroxyl group of R b in the above formula (2) with the oxygen atom.
  • Z 1 represents any protected amino group, a hydroxyl group or a thiol group.
  • the oxygen atom and Z 1 bonded to Z represent a group that is adjacent to each other (for example, the carbon atoms of Z that are vicinal and are bonded to each other are directly bonded to each other).
  • L 12 represents a group that links the imino group (-NH-) and the universal linker (eg, ⁇ -CO (CH 2 ) 2 CO- &).
  • the bond with & represents the bond with Z).
  • nucleic acid When a universal linker is used, no matter what kind of nucleoside or nucleotide the 3'end of the nucleic acid to be synthesized is, the nucleic acid is extended by normal nucleic acid automatic synthesis of the nucleoside phosphoramidido which becomes the 3'end. It can be introduced by reacting in the same manner as the process of Examples of such universal linkers include, but are not limited to, the compounds described in the following documents. References: AP Guzaev, and M. Manoharan, J AmChem Sec, 2003, 125, 2380-2381. References: RK Kumar, AP Guzaev, C. Rentel, and VT Ravikumar, Tetrahedron, 2006, 62, 4528.
  • R b the hydroxyl group at the 5'position of the nucleoside, which is the starting point of the nucleic acid extension reaction, is protected by a trityl protecting group (for example, 4,4'-dimethoxytrityl (DMTr) group, etc.). Is preferred.
  • a trityl protecting group for example, 4,4'-dimethoxytrityl (DMTr) group, etc.
  • DMTr 4,4'-dimethoxytrityl
  • the preparation of the solid phase carrier having the linker represented by the formula (2) is typically performed with the inorganic porous carrier having the linker represented by the general formula (1) and the compound ( Rb- L 10). -W) is subjected to a condensation reaction.
  • This L 10 represents a linking group represented by the above formula L 10 .
  • W represents a reactive functional group (eg, a hydroxyl group).
  • the nucleoside linker corresponding to the 3'-terminal base is selected according to the sequence of RNA to be synthesized.
  • the nucleoside linker include a nucleoside linker having a succinyl group as a functional group that reacts with an amino group (-NH 2 ).
  • Nucleoside linkers containing a succinyl group are illustrated below. * In the formula represents the bond to the imino group (-NH-) in the formula (2).
  • TBDMS means the tert-butyldimethylsilyl group.
  • Ac means an acetyl group.
  • Me means a methyl group.
  • Ph means a phenyl group.
  • the inorganic porous carrier, the compound ( Rb- L 10- W), a condensing agent, and an appropriate solvent are mixed and usually shaken at room temperature or condensed. The temperature is raised to promote the reaction.
  • This condensation reaction may be carried out by allowing it to stand without shaking and stirring it.
  • any condensing agent generally used for amide condensation can be used.
  • the condensing agent N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDAC), 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), 1- [bis (dimethylamino) methylene] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxide hexa Fluorophosphate (HATU), 1- [bis (dimethylamino) methylene] -1H-1,2,3-benzotriazolium 3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), 1- [bis (dimethylamino) methylene)
  • the solid phase carrier after the condensation reaction is filtered by filtering with a solvent.
  • the solvent for filtration include acetonitrile and the like.
  • Capping treatment can be performed on the unreacted amino group.
  • the capping treatment agent for example, acetic anhydride (acetic anhydride-tetrahydrofuran solution or the like) or phenoxyacetic acid anhydride (phenoxyacetic acid anhydride / N-methylimidazole solution or the like) is used.
  • the success or failure of capping can be determined by the ninhydrin test.
  • the quantification of the reacted nucleoside can be performed by cleavage of the DMTr group with an acid and measurement of absorbance.
  • DMTr 4,4'-dimethoxytrityl
  • the amount of (R b- L 1 ) supported is usually 0.1 to 5.0 ⁇ mol / m 2 with respect to the specific surface area per mass of the inorganic porous body determined by N 2 adsorption / desorption measurement.
  • the amount is preferably 0.5 to 2.0 ⁇ mol / m 2 .
  • the solid-phase carrier of this embodiment is suitable as a base material for solid-phase synthesis of nucleic acids (DNA, RNA). Above all, the solid phase carrier of the present embodiment is particularly suitable for the synthesis of RNA, which is considered to have a problem in stability as compared with DNA.
  • R 4 represents a base
  • Tr represents a protecting group
  • X represents -H, -OH or -OR 5 (R 5 is a protecting group), respectively.
  • the base (R 4 ) constituting the nucleoside of the solid phase carrier (Sp-Nu) having the linker represented by the general formula (2) and the amidite monomer (Am-1) is usually a nucleic acid, typically RNA. Although it is a natural base constituting the above, an unnatural base may be used in some cases. Examples of such non-natural bases include modified analogs of natural or non-natural bases.
  • the base represented by R 4 for example, adenine, isoguanine, xanthine, purine bases such as hypoxanthine and guanine; and, cytosine, pyrimidine bases such as uracil and thymine and the like.
  • R 5 represents a protecting group for the hydroxyl group.
  • R 4 represents a protected nucleobase.
  • the solid phase carrier of this embodiment can also be used to incorporate a divalent group other than a nucleoside or a nucleotide into a nucleic acid sequence.
  • amidite having a proline skeleton such as amidite P described later
  • amidite method can be incorporated into a nucleic acid sequence by the amidite method (see the same method as the method of Example A4 of International Publication No. 2012/017919).
  • amidite represented by the following structural formulas (Am-11), (Am-12) and (Am-13), respectively see Examples A1 to A3 of International Publication No. 2013/103146
  • it can also be used. it can.
  • iPr represents an isopropyl group.
  • DMTr represents a 4,4'-dimethoxytrityl group.
  • Tfa represents a trifluoroacetyl group.
  • Solid-phase synthesis of RNA The solid phase carrier (Sp-Nu) having the linker represented by the general formula (2) is deprotected (-Tr) to obtain a solid phase carrier (Am-2). After that, the amidite monomer (Am-1) and the solid phase carrier (Am-2) are subjected to a condensation reaction to obtain a reaction product (Am-3). After this, the reaction product (Am-3) is oxidized to obtain the product (Am-4). After this, the product (Am-4) is deprotected (-Tr) to obtain the product (Am-5). Next, the amidite monomer (Am-1) and the product (Am-5) are further subjected to a condensation reaction to extend the phosphodiester bond.
  • the hydroxyl group at the 5'position at the end of the extended oligonucleotide chain is repeated as many times as necessary in a series of deprotection, condensation reaction, and oxidation cycles so as to have a desired sequence, and then a solid-phase carrier.
  • a nucleic acid molecule having a desired sequence can be produced.
  • nucleic acid is produced by a production method including the following steps.
  • Step (C) An oxidation step of oxidizing the phosphite produced in the step (B) to produce nucleotides.
  • the production method including the above steps (A) to (D) optionally includes the following steps.
  • Step (B') A step of further condensing the product produced in the above step (D) with an amidite compound having a nucleoside base to be introduced next to produce phosphite.
  • Step (C') A step of oxidizing the phosphite produced in the step (B') to produce an oligonucleotide.
  • nucleic acid extension reaction in this embodiment can be carried out according to the procedure of a general phosphoramidite method.
  • nucleic acid extension reaction means a reaction in which a nucleic acid chain, particularly an RNA chain, is extended by sequentially binding nucleotides via a phosphodiester bond.
  • the nucleic acid extension reaction may be carried out using an automatic nucleic acid synthesizer or the like that employs the phosphoramidite method.
  • the protecting group of the hydroxyl group at the 5'position at the end of the RNA chain supported on the solid phase carrier is deprotected.
  • a trityl-based protecting group typically, a DMTr group
  • Deprotection can be performed with an acid.
  • the acid for deprotection include trifluoroacetic acid, trichloroacetic acid, dichloroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, methanesulfonic acid, hydrochloric acid, acetic acid, p-toluenesulfonic acid and the like, or two or more of them. ..
  • nucleoside phosphoramidite is bound to the hydroxyl group at the 5'position at the end of the RNA chain deprotected by the deprotection step to produce phosphite.
  • a protecting group for example, DMTr group
  • the condensation step can be carried out by using an activator that activates the nucleoside phosphoramidite.
  • activator include 5-benzylthio-1H-tetrazole (BTT), 1H-tetrazole, 4,5-dicyanoimidazole (DCI), 5-ethylthio-1H-tetrazole (ETT), and N-methylbenzimidazolium.
  • N-MeBIT benzimidazolium triflate
  • BIT N-phenylimidazolium triflate
  • IMT imidazolium triflate
  • NBT 5-nitrobenzimidazolium triflate
  • HOBT 1-hydroxybenzotriazole
  • Activator-42 5- (bis-3,5-trifluoromethylphenyl) -1H-tetrazole
  • an unreacted hydroxyl group at the 5'position may be capped as appropriate.
  • Capping can be performed using acetic anhydride-tetrahydrofuran solution, phenoxyacetic acid / N-methylimidazole solution, or two or more known capping solutions thereof.
  • the oxidation step is a step of oxidizing the phosphite formed by the condensation step.
  • the oxidation step can be carried out using an oxidizing agent.
  • Oxidizing agents include iodine, m-chloroperbenzoic acid, tert-butyl hydroperoxide, 2-butanone peroxide, bis (trimethylsilyl) peroxide, 1,1-dihydroperoxycyclododecane, hydrogen peroxide, etc., or two of these. The above can be mentioned.
  • the oxidation step may be performed after the capping operation, or conversely, the capping operation may be performed after the oxidation step, and the order is not limited.
  • RNA having a desired sequence can be synthesized by repeating the above condensation reaction, oxidation, and deprotection steps according to the nucleotide sequence of RNA to be synthesized. ..
  • the RNA strand is cleaved and recovered from the solid phase carrier using ammonia, amines or the like.
  • the amines here include methylamine, ethylamine, isopropylamine, ethylenediamine, diethylamine, triethylamine and the like, or two or more of them.
  • a universal linker is used, after the synthesis of the RNA chain is completed, cleavage is performed from the solid phase carrier using ammonia, amines, or the like, and the universal linker is removed by a nucleophile.
  • the 3'position of the terminal nucleotide becomes a hydroxyl group and the phosphate binds to the universal linker to form a cyclic phosphodiester.
  • the recovered RNA may be appropriately purified by a known method.
  • the inorganic porous body is modified with aminosilane having a substituent (R 1 , R 2 ).
  • the inorganic porous carrier of the present embodiment suppresses the over-dense modification of aminosilane to the carrier, and is introduced into the carrier in a state where the amino groups are appropriately separated from each other. ..
  • the amino groups are separated in this way, steric hindrance between the oligonucleic acids is unlikely to occur during the nucleic acid extension reaction, and the extension reaction can easily proceed stably to the target chain length. Therefore, by using the inorganic porous carrier of the present embodiment, the yield can be further increased in the production of RNA. Further, according to the method for producing RNA of the present embodiment, the yield can be further increased in the production of RNA, and particularly long RNA can be stably obtained in a higher yield.
  • RNA can be obtained in good yield even when long-chain RNA of 40 mer or more is synthesized.
  • yield of RNA refers to the ratio (%) of actually isolated RNA to the amount of RNA theoretically calculated from the amount of nucleosides subjected to the reaction.
  • RNA purity refers to the percentage (%) at which nucleic acid of the desired strand length is obtained. It is determined by the surface percentage (that is, the area percentage) in the chromatogram by liquid chromatography, or the 10% width of the main peak.
  • the specific surface area per volume is the ratio of the bulk density (g / mL) obtained by the mercury intrusion method and the specific surface area per mass (m 2 / g) obtained by N 2 adsorption / desorption isotherm measurement. Obtained by product.
  • Inorganic porous body SP (1) A zeolite molded product was obtained in the same manner as in Example 1 described in Japanese Patent No. 5875843. The obtained zeolite molded product was turbid in an acetonitrile solvent to prepare a turbid liquid. Then, the turbid liquid was sequentially sieved with JIS sieves having a mesh size of 125 ⁇ m and 38 ⁇ m. Then, the powder solid remaining on the sieve having an opening of 38 ⁇ m was air-dried at room temperature to prepare an inorganic porous body SP (1) which is a white powder solid.
  • Inorganic porous body SP (2) As the inorganic porous body SP (2), a commercially available spherical silica gel powder (trade name: MSGEL, manufactured by AGC SI-Tech Co., Ltd.) was used.
  • MSGEL spherical silica gel powder
  • Inorganic porous body SP (3) A zeolite calcined product was obtained in the same manner as in Example 1 described in Japanese Patent No. 5875843. Next, 10 g of the obtained fired product was placed in a petri dish, allowed to stand in a 2 liter separable flask containing 100 mL of water, the lid was closed, and then the separable flask was placed in a constant temperature bath at 80 ° C. for 24 hours. I left it. After taking out the separable flask, it was allowed to cool to 20 ° C.
  • Inorganic porous body SP (4) Stainless steel autoclave of capacity 1.5 L, tetraethyl orthosilicate [Si (OC 2 H 5) 4] 115g, 40 wt% tetra -n- propyl ammonium solution 57 g, potassium hydroxide (purity 85%) 0.9 g And 325 g of water were added, and the mixture was vigorously stirred at room temperature for 120 minutes.
  • the molar ratios of water, tetra-n-propylammonium ion, hydroxide ion and potassium ion to silicon in the obtained mixed solution were 36, 0.20, 0.24 and 0.048, respectively. This mixed solution was stirred at 105 ° C.
  • Inorganic porous body SP (5) Stainless steel autoclave of capacity 1.5 L, tetraethyl orthosilicate [Si (OC 2 H 5) 4] 155g, 40 wt% tetra -n- propyl aqueous ammonium 136 g, potassium hydroxide (purity 85%) 0.3 g And 162 g of water were added, and the mixture was vigorously stirred at room temperature for 120 minutes. The molar ratios of water, tetra-n-propylammonium ion, hydroxide ion and potassium ion to silicon in the obtained mixed solution were 18, 0.36, 0.38 and 0.048, respectively. This mixed solution was stirred at 105 ° C.
  • Inorganic porous body SP (6) Stainless steel autoclave of capacity 1600L, tetraethyl orthosilicate [Si (OC 2 H 5) 4] 186kg, 40 wt% tetra -n- propyl aqueous ammonium 166Kg, potassium hydroxide (purity 85%) 0.3 kg and water 490 kg was added and stirred at room temperature for 120 minutes.
  • the molar ratios of water, tetra-n-propylammonium ion, hydroxide ion and potassium ion to silicon in the obtained mixed solution were 37, 0.36, 0.39 and 0.049, respectively. This mixed solution was stirred at 105 ° C.
  • the solid was further treated with a mixed solution of an aqueous ammonium nitrate solution and an aqueous ammonia solution in the same manner as described above four times, and then washed with water and dried to obtain an inorganic porous body SP (6).
  • Inorganic porous body SP (7) As the inorganic porous body SP (7), commercially available porous glass (trade name: CPG-1000, manufactured by Geneact Co., Ltd.) was used.
  • silane coupling agent As the silane coupling agent, the following components (C1), (C2), (C3), (C4), (C5), (C6), and (C7) were used.
  • (C1) component A commercially available 3-aminopropyldiisopropylethoxysilane was purchased and used.
  • (C2) component Isopropanol solution of trichlorosilane (5 mL, 50 mmol), 6-chloro-1-hexene (3.80 g, 32 mmol) and hexachloroplatinic (IV) acid hexahydrate (1M, 5 ⁇ L, 5 ⁇ mol) at room temperature for 18.5 hours. Stirred. THF (50 mL) was added to the obtained mixed solution, a THF solution of isopropylmagnesium chloride (1 M, 150 mL, 150 mmol) was slowly added dropwise under ice-cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 73.5 hours.
  • the obtained reaction solution was added dropwise to a mixed solution of isopropanol (40 mL), triethylamine (80 mL) and THF (120 mL) under ice-cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours, and then the insoluble material was removed by filtration.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure, hexane (30 mL) was added to the obtained residue, the insoluble material was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 4.37 g of 6-chlorohexylisopropoxydiisopropylsilane. (Yield 47%).
  • (C3) component 3-Chloropropyltrimethoxysilane (3.97 g, 20 mmol) was added to tetrahydrofuran (THF) (20 mL), the mixture was cooled to 5 ° C., and a THF solution of phenylmagnesium bromide (1 M, 60 mL, 60 mmol) was slowly added dropwise. Then, the mixture was stirred at room temperature for 15 and a half hours. 4.36 mL of ethanol was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • THF tetrahydrofuran
  • the inorganic porous carrier of each example was obtained by surface-treating any of the inorganic porous bodies SP (1) to SP (7) with any of the components of the silane coupling agents (C1) to (C7). ..
  • Example 1 2.00 g of the inorganic porous body SP (1) was placed in a four-necked flask, and 100 mL of toluene was added. Under stirring, 4.8 mg of the component (C1) was further added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Then, the reaction solution was filtered, washed with toluene, and then dried under reduced pressure to obtain the inorganic porous carrier of Example 1.
  • Example 2 An inorganic porous carrier of Example 2 was obtained in the same manner as in the production method of Example 1 except that the component (C1) was changed to the component (C2) (addition amount: 27.2 mg).
  • Example 3 An inorganic porous carrier of Example 3 was obtained in the same manner as in the production method of Example 1 except that the component (C1) was changed to the component (C3) (addition amount: 14.2 mg).
  • Example 4 An inorganic porous carrier of Example 4 was obtained in the same manner as in the production method of Example 1 except that the component (C1) was changed to the component (C4) (addition amount: 8.3 mg).
  • Example 5 Production of Example 1 except that the inorganic porous body SP (1) was changed to the inorganic porous body SP (2) (1.00 g) and the amount of the component (C1) added was changed to 2.4 mg.
  • the inorganic porous carrier of Example 5 was obtained in the same manner as the method.
  • Example 6 Production of Example 1 except that the inorganic porous body SP (1) was changed to the inorganic porous body SP (3) (2.00 g) and the amount of the component (C1) added was changed to 6.8 mg.
  • the inorganic porous carrier of Example 6 was obtained in the same manner as the method.
  • Example 7 Production of Example 1 except that the inorganic porous body SP (1) was changed to the inorganic porous body SP (4) (0.40 g) and the amount of the component (C1) added was changed to 1.2 mg.
  • the inorganic porous carrier of Example 7 was obtained in the same manner as the method.
  • Example 8 Production of Example 1 except that the inorganic porous body SP (1) was changed to the inorganic porous body SP (5) (2.00 g) and the amount of the component (C1) added was changed to 9.5 mg.
  • the inorganic porous carrier of Example 8 was obtained in the same manner as the method.
  • Example 9 Production of Example 1 except that the inorganic porous body SP (1) was changed to the inorganic porous body SP (6) (0.35 g) and the amount of the component (C1) added was changed to 3.0 mg.
  • the inorganic porous carrier of Example 9 was obtained in the same manner as the method.
  • Example 10 Example 1 except that the silane coupling agent added to the inorganic porous body SP (1) (1.00 g) was changed from the component (C1) to the component (C7) (addition amount: 7.1 mg).
  • the inorganic porous carrier of Example 10 was obtained in the same manner as in the production method.
  • Example 11 The component (C1) (55 mg) and toluene (72.32 g) were mixed in a glass vial to prepare a component (C1) / toluene solution.
  • the inorganic porous body SP (7) (7.00 g) was placed in a round bottom flask, and the prepared component (C1) / toluene solution (34.23 g) was added thereto at room temperature.
  • the round bottom flask was introduced into an oil bath at 100 ° C. and reacted for 5 hours. Then, the reaction mixture was filtered, the solid content was washed with toluene, and then dried under reduced pressure to obtain the inorganic porous carrier of Example 11.
  • Comparative Example 1 An inorganic porous carrier of Comparative Example 1 was obtained in the same manner as in the production method of Example 1 except that the component (C1) was changed to the component (C5) (addition amount: 3.8 mg).
  • Comparative Example 2 An inorganic porous carrier of Comparative Example 2 was obtained in the same manner as in the production method of Example 1 except that the component (C1) was changed to the component (C6) (addition amount: 4.9 mg).
  • Comparative Example 3 Except that the inorganic porous body SP (1) was changed to the inorganic porous body SP (2) (1.00 g) and the component (C1) was changed to the component (C6) (addition amount: 2.4 mg). , An inorganic porous carrier of Comparative Example 3 was obtained in the same manner as in the production method of Example 1.
  • Comparative Example 4 Except that the inorganic porous body SP (1) was changed to the inorganic porous body SP (3) (0.50 g) and the component (C1) was changed to the component (C6) (addition amount: 2.7 mg). , An inorganic porous carrier of Comparative Example 4 was obtained in the same manner as in the production method of Example 1.
  • Example 11 and Comparative Example 5 211 mg of U-succinate (5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyl-3'-O-succinyluridine) and 1- [bis (dimethylamino) methylene] -1H- in a glass vial. 105 mg of 1,2,3-benzotriazolium 3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), 121 ⁇ L of N, N-diisopropylethylamine and 11 mL of acetonitrile were mixed. 1.63 mL of the prepared mixed solution was mixed with 300.0 mg of the inorganic porous carrier of any of Example 11 and Comparative Example 5, respectively.
  • HBTU 1,2,3-benzotriazolium 3-oxide hexafluorophosphate
  • the oligonucleotide consisting of the sequence (A) or the sequence (B) is prepared by using a nucleic acid synthesizer (trade name: NTS M-4-MX-E, manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.) based on the phosphoramidite method. It was synthesized from the'side to the 5'side (see the reaction pathway (condensation reaction, oxidation, deprotection) above). For such solid phase synthesis, each solid phase carrier produced above was used.
  • Examples of the amidite monomer include adenosine EMM amidite (described in Example 4 of US Patent Application Publication No.
  • a high-purity toluene trichloroacetate solution is used as a deblocking solution
  • 5-benzyl mercapto-1H-tetrazole is used as a condensing agent
  • an iodine solution is used as an oxidizing agent
  • a capping solution is used.
  • a phenoxyacetic acid solution and an N-methylimidazole solution were used.
  • the solid phase carrier after completion of the synthesis was placed in a glass vial with a lid, and a 1: 1 to 2: 1 solution of 28% NH 4 OH and EtOH was added. Then, it was allowed to stand at 40 ° C. for 4 hours. The solution after the reaction was filtered and washed successively with water and EtOH. The resulting solution is dried to give an unprotected crude oligonucleotide, which is then deprotected by the action of tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) in the presence of nitromethane to give the crude product. It was.
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • the yield of oligonucleic acid in the case of using the solid phase carriers of Examples 1 to 4 and Example 10 was higher than that in the case of using the solid phase carriers of Comparative Examples 1 and 2. Can be confirmed to be high. It can be confirmed that the yield of the oligonucleic acid is higher when the solid phase carrier of Example 5 is used than when the solid phase carrier of Comparative Example 3 is used. It can be confirmed that the yield of the oligonucleic acid is higher when the solid phase carrier of Example 6 is used than when the solid phase carrier of Comparative Example 4 is used. It can be confirmed that the yield of the oligonucleic acid is higher when the solid phase carrier of Example 11 is used than when the solid phase carrier of Comparative Example 5 is used.
  • the present invention provides a method for producing nucleic acid, which can improve the yield and purity even in the synthesis of long-stranded nucleic acid.
  • the nucleic acid obtained by the production method using the inorganic porous carrier according to the present invention is useful as a raw material for pharmaceutical products.
  • SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing represent the base sequences of oligonucleotides produced according to the production method of the present invention.

Abstract

本発明は、核酸の製造において収率等をより高められる、式（１）［式中、＊は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。Ｒ１及びＲ２は、炭素数３～１０のアルキル基又はフェニル基を表す。Ｌは、単結合、炭素数１～２０のアルキレン基、又は、炭素数２～２０のアルキレン基であって当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。］、で表されるリンカーを有し、細孔径（モード径）が０．０４μｍ以上の細孔分布を有する無機多孔質担体、及びこれを用いた核酸の製造方法を提供する。

Description

無機多孔質担体及びこれを用いた核酸の製造方法
　本特許出願は、日本国特許出願２０１９－０６７９９４号（２０１９年３月２９日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が、本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は、無機多孔質担体及びこれを用いた核酸の製造方法、並びに無機多孔質体への官能基の導入に好適なシランカップリング剤に関する。
　核酸の化学合成法としては、ホスホロアミダイト法による固相合成法が広く用いられている。この方法では、まず、シランカップリング剤等を用いて無機多孔質体上にアミノ基等の官能基を導入し、前記官能基に核酸の３’末端となるヌクレオシドを結合させる。その後、前記ヌクレオシドを起点として、固相担体上で核酸伸長反応を行う。
　固相合成法では、合成する核酸の鎖長が長くなると、合成効率が急速に低下し、多量の副生成物が混入する結果になりがちである。これは、固相担体表面上で伸長する核酸分子どうしが干渉し、伸長反応の阻害や副反応等が生じているためと考えられる。
　固相担体表面上での核酸分子どうしの干渉を防ぐ技術として、例えば、担体上に導入するアルキルアミノ基のスペーサーを長くすることが提案されている（非特許文献１参照）。
Ｊ．Ｋａｔｚｈｅｎｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４５，２７７７，１９８９
　一般的に、合成する核酸が長くなるほど、核酸分子どうしの干渉の影響が大きくなるため、従来の固相合成法では、核酸合成の収率や純度が低下しやすい。
　本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたものであり、核酸の製造において収率等をより高められる無機多孔質担体及びこれを用いた核酸の製造方法を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するため、本発明は、以下の構成を採用する。
　すなわち、本発明の第１の態様は、下記一般式（１）で表されるリンカーを有し、細孔径（モード径、以下同じ）が０．０４μｍ以上の細孔分布を有することを特徴とする、無機多孔質担体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基、又は、アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基を表す。
　Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。］
　本発明の第２の態様は、下記一般式（２）で表されるリンカーを有し、細孔径（モード径）が０．０４μｍ以上の細孔分布を有することを特徴とする、無機多孔質担体（以下この無機多孔質担体を「固相担体」と記すこともある。）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基、又は、アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基を表す。
　Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
　Ｒｂは、反応性の基が保護あるいは脱保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを表す。
　Ｌ１は、Ｒｂの１級又は２級のヒドロキシル基の酸素原子と結合している２価の基を表す。］
（以下、第１の態様の無機多孔質担体および第２の態様の無機多孔質担体をまとめて本発明の無機多孔質担体と称する）。
　本発明の第２の態様における、ある１実施態様によれば、前記一般式（２）中のＬ１が、スクシニルリンカー又はユニバーサルリンカーであってもよい。
　本発明の第１または２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体の体積当たり比表面積が、０．１ｍ２／ｍＬ以上１００ｍ２／ｍＬ以下であってもよい。
　本発明の第１または２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体の体積当たり細孔容積が、０．０５ｍＬ／ｍＬ以上０．６ｍＬ／ｍＬ以下であってもよい。
　本発明の第１または２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体の気孔率が、５０％以上であってもよい。
　本発明の第２の態様における、ある１実施態様によれば、前記リンカーの担持密度が、前記無機多孔質体の質量当たり比表面積に対して、０．１μｍｏｌ／ｍ２以上５．０μｍｏｌ／ｍ２以下であってもよい。
　本発明の第１または２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体の粒子径（メジアン径）が、１μｍ以上１０００μｍ以下であってもよい。
　本発明の第１または２の態様における、ある１実施態様によれば、前記無機多孔質体が、シリカ、シリカゲル、ゼオライト又はガラスであってもよい。
　本発明の第３の態様は、前記一般式（２）中のＲｂが、反応性の基としてヒドロキシル基が保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す無機多孔質担体を用い、前記のヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ａ）、前記工程（Ａ）において生成したヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基と、第２のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とを縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ）、前記工程（Ｂ）において生成したホスファイトを酸化させて、ヌクレオチドを生成する工程（Ｃ）、及び、前記工程（Ｃ）において生成したヌクレオチドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ）、を含むことを特徴とする、核酸の製造方法（以下、「本発明の核酸の製造方法」と称する）である。
　本発明の第３の態様における、ある１実施態様によれば、核酸の製造方法は、前記工程（Ｄ）において生成した生成物と、次に導入予定のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とをさらに縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ’）、
　前記工程（Ｂ’）において生成したホスファイトを酸化させて、オリゴヌクレオチドを生成する工程（Ｃ’）、及び、
　前記工程（Ｃ’）において生成したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ’）
を含んでいてもよい。
　本発明の第３の態様における、ある１実施態様によれば、核酸の製造方法は、前記の工程（Ｂ’）、工程（Ｃ’）及び工程（Ｄ’）からなる一連の工程を、さらにｍ回（ｍは、１以上の整数を表す。）繰り返して、ｍ個のアミダイト化合物を反応させた後、伸長した核酸を切り出す工程（Ｅ）を含んでいてもよい。
　本発明の第４の態様は、下記一般式（３）で表されることを特徴とする、シランカップリング剤（以下、「本発明のシランカップリング剤」と称する）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基、又は、アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基を表す。
　Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
　Ｒ３は、水素原子又は炭素数が１～４のアルキル基を表す。
　ただし、Ｌがメチレン基であり、Ｒ１がイソプロピル基であり、Ｒ２がイソプロピル基であり、Ｒ３がエチル基であるものと、Ｌがメチレン基であり、Ｒ１がｎ－プロピル基であり、Ｒ２がｎ－プロピル基であり、Ｒ３がｎ－プロピル基であるものとを除く。］
　本発明の第５の態様は、前記第１の態様に係る無機多孔質担体、又は前記第２の態様に係る固相担体の、ホスホロアミダイト法による核酸の製造における使用である。
　本発明に係る無機多孔質担体によれば、核酸の製造において純度又は収率をより高められる。
　本発明に係る核酸の製造方法によれば、純度又は収率をより高められ、特に長鎖核酸を高収率で得ることができる。
　本明細書中、ある数値範囲について、「ＡからＢ」または「Ａ～Ｂ］という場合には、特に断らない限り、「Ａ以上から（～）Ｂ以下」の範囲を意味する。
（無機多孔質担体）
　本発明の第１の態様である無機多孔質担体について説明する。
　本実施形態の無機多孔質担体を構成する無機多孔質体は、細孔径が０．０４μｍ以上である細孔分布を有する無機多孔質体であり、典型的には、シランカップリング剤を担持することができる、シラノール基を有するものである。かかる無機多孔質体として典型的には、シリカ、シリカゲル、ゼオライト、ガラス、石英、またはそれらの２種以上が例示され、好ましくはシリカ、シリカゲル、ゼオライト又はガラスである。これらのものは、市販のものを使用するか、あるいは以下のような合成方法で調製したものを使用してもよい。
［シラノール基を含む無機多孔質体の製造方法］
　シラノール基を含む無機多孔質体の製造方法としては、乾式法と湿式法が例示される。前者の具体例としては、燃焼法やアーク法が挙げられ、後者の具体例としては、沈降法、ゾルゲル法、水熱合成法等の合成方法が挙げられる（参考文献：TOSOH Research ＆ Technology Review Vol. 45 (2001).）。
　かかる無機多孔質体の調製は、例えば、ケイ酸塩、アルコキシシラン、クロロシラン類等を原料とし、溶媒やテンプレートを用いて前記のような合成方法で調製される。
　かかる無機多孔質体の調製は、例えば、１．シリカを析出させた後、シリカの骨格中に含まれる溶媒を除去する方法、２．シリカ以外の、例えばアルミニウムやホウ素などの異種金属を混ぜて固体を析出させた後、シリカ成分とシリカ以外の成分とに相分離させ、シリカ以外の成分を除去する方法、３．アンモニウム塩や高分子をテンプレート剤として混ぜてシリカを析出させた後、テンプレート剤を除去する方法、又は、４．析出させたシリカを凝集させる方法、のいずれかを用いて行うことができる。これら２つ以上の方法を組み合わせて用いてもよい。
　前記１および３の、溶媒又はテンプレート剤を除去する方法としては、乾燥、超臨界抽出、焼成等を用いることができる。
　得られた無機多孔質体は、その形態として粒子が好ましく、球状に成形されていてもよいし、塊状又は破砕状でもよいが、これらを担体として使用する際、核酸合成カラムへの充填性の観点から、球状又は破砕状が好ましい。
　成形法としては、特に限定されないが、噴霧乾燥法やエマルジョン法を用いることができる。
　前記無機多孔質体の大きさは、特に限定されないが、核酸の固相合成の際のカラム充填効率及びカラム充填時の送液速度等の観点から、レーザー回折法（散乱式）により測定される粒子径（メジアン径、以下同じ）が１～１０００μｍであることが好ましく、５～５００μｍであることがより好ましく、１０～３００μｍであることがさらに好ましい。
　本実施形態における無機多孔質体には、０．０４μｍ以上の細孔径を有する多孔質体が使用される。合成する核酸の鎖長に応じて、使用する無機多孔質体は、適宜選択することができる。通常、合成する核酸の鎖長が長い場合には、細孔径の大きいものを選択することが好ましい。例えば、４０～２００ｍｅｒのＲＮＡを合成する場合、細孔径としては、０．０４μｍ以上０．５μｍ以下であることが好ましく、０．０４μｍ以上０．３μｍ以下であることがより好ましい。
　細孔径（モード径）は、水銀圧入法により得られる細孔径分布（Ｘ軸を細孔径の値とし、Ｙ軸を細孔容積を細孔径で微分した値としたグラフとする）において、ピークトップのＸ軸の値から求められる。
　前記無機多孔質体の体積当たり比表面積は、特に限定されない。カラム当たりの核酸の生成量を高めるために、核酸の鎖長に関わらず、体積当たり比表面積は高い方が好ましい。体積当たり比表面積として具体的には、０．１～１００ｍ２／ｍＬであることが好ましく、１～５０ｍ２／ｍＬであることがより好ましく、３～２０ｍ２／ｍＬであることがさらに好ましい。
　体積当たり比表面積は、水銀圧入法により得られる嵩密度（ｇ／ｍＬ）と、Ｎ２吸脱着等温線測定により得られる、質量当たり比表面積（ｍ２／ｇ）との積により求められる。なお、ここでの質量当たり比表面積は、αｓ－ｐｌｏｔ法といった手法により、αｓ＝１．７～２．１の範囲の平均勾配から求められる値を用いる。
　本実施形態の、無機多孔質体の細孔容積は、特に限定されない。一般的には、カラム当たりの核酸の生成量を高めるために、核酸の鎖長にかかわらず、体積当たりの細孔容積（ｍＬ／ｍＬ）は高い方が好ましい。体積当たり細孔容積は０．０５～０．６ｍＬ／ｍＬであることが好ましく、０．０５～０．５ｍＬ／ｍＬであることがより好ましい。
　前記体積当たり細孔容積は、水銀圧入法により得られる嵩密度（ｇ／ｍＬ）と、細孔径が０．０４μｍから１μｍの範囲にある累積細孔容積（ｍＬ／ｇ）との積により求められる。
　無機多孔質体の気孔率は、特に限定されず、一般的には、カラム当たりの核酸の生成量を高めるために、核酸の鎖長に関わらず、高い方が好ましい。前記気孔率は、水銀圧入法により求められ、５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがさらに好ましい。
　ここでの気孔率は、水銀圧入法の測定範囲である細孔径０．００４～２００μｍの範囲での細孔容積から算出する。すなわち、０．００４μｍから２００μｍの範囲にある累積細孔容積（ｍＬ／ｇ）と嵩密度（ｇ／ｍＬ）との積により求められる。
　本実施形態の無機多孔質担体は、下記一般式（１）で表されるリンカーを有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基、又は、アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基を表す。
　Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。］
　前記式（１）中、Ｒ１及びＲ２におけるアルキル基は、直鎖状アルキル基、分岐鎖状アルキル基又は環状アルキル基のいずれであってもよく、収率を高められやすいことから、分岐鎖状アルキル基であることが好ましい。Ｒ１及びＲ２におけるアルキル基は、炭素数が３～１０であり、炭素数が３～６であることが好ましく、炭素数が３又は４であることがより好ましい。
　Ｒ１及びＲ２におけるアルキル基としては、例えば、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基等の直鎖状アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、２－エチルヘキシル基、３，７－ジメチルオクチル基等の分岐鎖状アルキル基；及び、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等の環状アルキル基が挙げられる。
　Ｒ１及びＲ２で表されるアルキル基に置換していてもよい置換基は、アルコキシ基、フッ素原子である。このアルコキシ基としては、例えば、炭素数が１～３のアルコキシ基が挙げられる。
　Ｒ１及びＲ２で表されるフェニル基に置換していてもよい置換基は、アルキル基、アルコキシ基、フッ素原子である。ここでのアルキル基としては、例えば、炭素数が１～５のアルキル基が挙げられる。ここでのアルコキシ基としては、例えば、炭素数が１～３のアルコキシ基が挙げられる。
　Ｒ１及びＲ２は、相互に同一であってもよいし異なっていてもよく、合成上（例えば、簡便さ、効率さ）の点から、同一であることが好ましい。
　前記式（１）中、Ｌにおける炭素数が１～２０のアルキレン基については、直鎖状アルキレン基、分岐鎖状アルキレン基のいずれであってもよく、収率を高められやすいことから、直鎖状アルキレン基であることが好ましい。このＬにおけるアルキレン基は、炭素数が１～２０であり、炭素数が１～１０であることが好ましく、炭素数が１～６であることがより好ましい。
　また、前記式（１）中、Ｌは、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表すこともできる。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
［リンカーを担持する無機多孔質体（無機多孔質担体）の製造方法］
　本実施形態の無機多孔質担体は、例えば、前記無機多孔質体を、下記一般式（３ａ）で表されるシランカップリング剤で表面処理する方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基、又は、アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基を表す。
　Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
　Ｒ３は、水素原子又は炭素数が１～４のアルキル基を表す。］
　前記式（３ａ）中、Ｒ１、Ｒ２及びＬについての説明は、前記式（１）中のＲ１、Ｒ２及びＬについての説明と同様である。
　前記式（３ａ）中、Ｒ３におけるアルキル基は、炭素数１～３のアルキル基が好ましく、メチル基、又はエチル基がより好ましい。
　前記一般式（３ａ）で表されるシランカップリング剤の好適な具体例を以下に挙げる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　上記の一般式（３ａ）のシランカップリング剤は、以下に示す反応経路（合成ルート１、合成ルート２、又は合成ルート３）により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　合成ルート１（Ｓｔｅｐ１→Ｓｔｅｐ２→Ｓｔｅｐ３）の説明：
　例えば化合物１がトリクロロシランである場合、この化合物１に、Ｒ１及びＲ２に対応する有機リチウム化合物又は有機マグネシウム化合物を反応（求核置換反応）させて、化合物２を得る（Ｓｔｅｐ１）。次いで、Ｒ３ＯＨ（例えばメタノール、エタノール、又はプロパノール等）を塩基の存在下に反応させるか、あるいはＲ３ＯＮａ等のアルコラートあるいは水（Ｒ３：水素）を反応させて、シラン化合物３を得る（Ｓｔｅｐ２）。その後、末端オレフィンを有するアミン化合物又はハロゲン化合物（例えば、アリルアミン又は６－クロロ－１－ヘキセン）を、白金触媒の存在下に、ヒドロシリル化反応させて、シラン化合物４を合成することができる（Ｓｔｅｐ３）。
　あるいは、化合物１がアルコキシシラン（トリメトキシシラン、又はトリエトキシシラン等）である場合、この化合物１に、前記と同様の反応により、置換基（Ｒ１、Ｒ２）を求核置換反応によって導入し、その後、前記ヒドロシリル化反応によって，シラン化合物４を合成してもよい。
　合成ルート２（Ｓｔｅｐ４→Ｓｔｅｐ５→Ｓｔｅｐ６）の説明：
　例えば化合物１がトリクロロシランである場合、この化合物１を、白金触媒の存在下に、ヒドロシリル化反応させることにより、スペーサーとなる鎖を付加させて、化合物５を得る（Ｓｔｅｐ４）。次いで、前記同様の置換基（Ｒ１、Ｒ２）を求核置換反応によって導入して化合物６を得る（Ｓｔｅｐ５）。次いで、Ｒ３ＯＨ（例えばメタノール、エタノール、又はプロパノール等）を塩基の存在下に反応させるか、あるいはＲ３ＯＮａ等のアルコラートあるいは水（Ｒ３：水素）を反応させて、シラン化合物４を得る（Ｓｔｅｐ６）。
　Ｓｔｅｐ２、Ｓｔｅｐ６におけるＲ３Ｏ基（メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基等）の導入は、試薬Ｒ３ＯＨとしてメタノール、エタノール、プロパノール等を、化合物２又は化合物６を含む溶液に添加する方法、あるいは化合物２又は化合物６を、対応するアルコールもしくは対応するアルコールを含む溶液中に滴下する方法により行うことができる。
　合成ルート３（Ｓｔｅｐ７）の説明：
　上述の合成ルート１及び合成ルート２においては、官能基Ｙ（アミノ基あるいはハロゲン原子）を有するシラン化合物４が得られる。
　官能基Ｙがアミノ基である場合、シラン化合物４のアミノ基を、カルバモイル化あるいはアミド化あるいはウレイド化する方法を用いることにより、種々のシランカップリング剤を製造することができる。
　官能基Ｙがハロゲン原子である場合、シラン化合物４ａに、アンモニアあるいは１級アミン化合物を反応させることにより、ハロゲン原子を脱離させてアミノ基あるいはイミノ基（－ＮＨ－）を導入することにより、シラン化合物４ｂを得て、これをそのまま、あるいは上記と同様の方法により、種々のシランカップリング剤を製造することができる（Ｓｔｅｐ７）。
　上述した何れの反応においても、反応溶媒を用いることが好ましい。その反応溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、テトラヒドロフラン等、またはこれらの２種以上の有機溶媒が好ましい。
　シラン化合物の精製には、通常、常圧あるいは減圧条件下での蒸留が用いられる。得られたシランカップリング剤の精製には、例えば、分液や蒸留、カラムクロマトグラフィーが用いられる。
　前記一般式（１）で表されるリンカーを有する無機多孔質担体の製造は、例えば、前記無機多孔質体と、特定のシランカップリング剤と、溶媒とを混合した後、溶媒を除去する方法で行われる。この場合、前記混合により、特定のシランカップリング剤が無機多孔質体の表面のシラノール基と共有結合して、一般式（１）で表されるリンカーを担持する無機多孔質担体が生成する。
　ここでの溶媒には、例えば、アセトニトリル、トルエン、アニソール、２－ヘプタノン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、キシレン、メシチレン、ジクロロメタン、クロロベンゼン、水等、またはこれらの２種以上を用いることができ、これらの中でもトルエンが好ましい。
　前記の無機多孔質体及び溶媒は、シランカップリング剤同士の重合の抑制や、シランカップリング剤と無機多孔質体表面との反応促進の観点からは、脱水して用いることが好ましい。脱水方法は、特に限定されないが、例えば、無機多孔質体を減圧下で加熱する方法や、無機多孔質体を溶媒に分散させた後、常圧あるいは減圧下に溶媒を留去して共沸脱水する方法が挙げられる。
　無機多孔質体とシランカップリング剤と溶媒との前記混合の際、通常は反応促進のために溶媒の沸点近くまで加熱するが、これに限定されず、室温でもよいし、室温以下に冷却してもよい。
　無機多孔質体とシランカップリング剤との反応は、通常、１～１２時間程度で行うが、アミノ基を有するシランカップリング剤の場合、それ自身が反応を促進する触媒効果があるため、数分間程度で行ってもよい。
　シランカップリング剤の添加量は、Ｎ２吸脱着測定により求められる、無機多孔質体の質量当たり比表面積に対して、通常、リンカーの担持密度が０．１～５．０μｍｏｌ／ｍ２になる量であり、好ましくは０．５～２．０μｍｏｌ／ｍ２になる量である。
　シランカップリング剤との反応に使われなかったシラノール基は、所望であれば、トリメチルシリル基のような核酸合成に不活性な官能基でキャッピングしてもよい。
　このように、前記無機多孔質体を、特定のシランカップリング剤で表面処理することによって、置換基（Ｒ１、Ｒ２）を有するアミノシリル基で修飾された無機多孔質担体を製造することができる。
（核酸の製造方法）
　本実施形態の核酸の製造方法は、上述の無機多孔質担体を用い、公知の方法を適用して核酸を合成することができる。なかでもホスホロアミダイト法による核酸の製造が好適である。以下、ホスホロアミダイト法による核酸合成法について説明する。
　［固相担体の作製］
　固相担体とは、上述の無機多孔質担体が有するアミノ基（－ＮＨ２）に、２価の基を介して、反応性の基が保護あるいは脱保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドが結合したものをいう。
　本実施形態においては、下記一般式（２）で表されるリンカーを有し、細孔径（モード径）が０．０４μｍ以上の細孔分布を有する無機多孔質担体を、固相担体として用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基、又は、アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基を表す。
　Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
　Ｒｂは、反応性の基が保護あるいは脱保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す。Ｌ１は、Ｒｂの１級又は２級のヒドロキシル基の酸素原子と結合している２価の基を表す。］
　前記式（２）中、Ｒ１、Ｒ２及びＬについての説明は、前記式（１）中のＲ１、Ｒ２及びＬについての説明と同様である。
　前記式（２）中、イミノ基（－ＮＨ－）と結合する２価の基Ｌ１としては、官能基としてスクシニル基を有するものが好ましい。
　２価の基Ｌ１の典型的な例としては、スクシニルリンカー、ユニバーサルリンカー、又は前記式（２）中のイミノ基（－ＮＨ－）とユニバーサルリンカーとを連結する基と、ユニバーサルリンカーとから構成される連結基が例示される。
　ユニバーサルリンカーとは、核酸合成の起点となるヌクレオチドのヒドロキシル基とホスファイトを形成する官能基（典型的には、ヒドロキシル基）と、前記式（１）で表されるリンカー末端のアミノ基と結合する能力を有する官能基とを有し、かつ、同一分子内に、合成された核酸を切り離す際の条件下で、リン酸のリン原子を求核攻撃する能力を有する隣接する保護された官能基（例えば、いずれも保護されたアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基）を有する。
　より詳しくは、２価の基Ｌ１としては、下記の式Ｌ１０で表される連結基、又は式Ｌ１１で表される連結基が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　ここで、式Ｌ１０及び式Ｌ１１において、●を付した結合は、前記式（２）中のイミノ基（－ＮＨ－）への結合を表す。＃を付した結合は、前記式（２）中のＲｂの１級又は２級のヒドロキシル基の酸素原子との結合を表す。
　式Ｌ１１において、Ｚ１は、いずれも保護されたアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基を表す。Ｚに結合している酸素原子及びＺ１は、互いに隣接（例えば、ビシナルに存在し、それぞれが結合しているＺの炭素原子同士は、互いに直接結合している）している基を表す。
　Ｌ１２は、イミノ基（－ＮＨ－）とユニバーサルリンカーとを連結する基を表す（例えば、●－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ－＆を表す。
　＆を付した結合は、Ｚとの結合を表す）。
　尚、ユニバーサルリンカーを用いた場合、合成したい核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシド又はヌクレオチドであっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成において核酸を伸長する工程と同じように反応させて導入することができる。かかるユニバーサルリンカーとしては、例えば、下記の文献に記載の化合物が例示されるが、それらに限定されるものではない。
　文献：Ａ.Ｐ. Ｇｕｚａｅｖ, ａｎｄ Ｍ. Ｍａｎｏｈａｒａｎ, Ｊ ＡｍＣｈｅｍ Ｓｏｃ, ２００３, １２５, ２３８０－２３８１.
　文献：Ｒ.Ｋ. Ｋｕｍａｒ, Ａ.Ｐ. Ｇｕｚａｅｖ, Ｃ. Ｒｅｎｔｅｌ, ａｎｄ Ｖ.Ｔ.Ｒａｖｉｋｕｍａｒ, Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ, ２００６, ６２, ４５２８.
　前記式（２）中、Ｒｂは、核酸伸長反応の起点となるヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基が、トリチル系保護基（例えば、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基等）により保護されたものが好ましい。
　ユニバーサルリンカーを用いる場合も同様に、核酸伸長反応の起点となるヒドロキシル基が、トリチル系保護基（例えば、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基等）により保護されたものが好ましい。
　前記式（２）で表されるリンカーを有する固相担体の調製は、典型的には、前記一般式（１）で表されるリンカーを有する無機多孔質担体と、化合物（Ｒｂ－Ｌ１０－Ｗ）とを縮合反応させて行われる。このＬ１０は、前記の式Ｌ１０で表される連結基を表す。Ｗは、反応性の官能基（例えば、ヒドロキシル基）を表す。
　ヌクレオシドリンカーを用いる場合、合成するＲＮＡの配列に応じて、３’末端の塩基に対応するヌクレオシドリンカーを選択する。前記ヌクレオシドリンカーとしては、アミノ基（－ＮＨ２）と反応する官能基としてスクシニル基を有するヌクレオシドリンカーを挙げられる。
　スクシニル基を含むヌクレオシドリンカーを以下に例示する。
　式中の＊は、前記式（２）中のイミノ基（－ＮＨ－）への結合を表す。ＴＢＤＭＳは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基を意味する。Ａｃは、アセチル基を意味する。Ｍｅは、メチル基を意味する。Ｐｈは、フェニル基を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　ここでの縮合反応は、前記無機多孔質担体と、前記化合物（Ｒｂ－Ｌ１０－Ｗ）と、縮合剤と、適切な溶媒とを混合し、通常、室温で振とうするか、あるいは縮合反応促進のために昇温して行われる。この縮合反応は、振とうせずに静置し、撹拌しつつ行ってもよい。
　前記縮合反応の際に用いる縮合剤には、一般にアミド縮合に使用されているものであれば用いることができる。縮合剤として具体的には、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドテトラフルオロボラート（ＴＡＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＯＴＵ）等、またはこれらの２種以上が例示される。Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）や、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンなどの添加剤を加えてもよい。
　縮合反応後の固相担体は、溶媒を用いてろ過を行うことにより濾別する。ろ過用の溶媒としては、アセトニトリル等が挙げられる。未反応のアミノ基に対してはキャッピング処理を行うことができる。キャッピング処理剤には、例えば、無水酢酸（無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液など）やフェノキシ酢酸無水物（フェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液など）が用いられる。キャッピングの成否は、ニンヒドリン試験で行うことができる。４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基などの保護基を有するヌクレオシドリンカーやユニバーサルリンカーを用いた場合、反応したヌクレオシドの定量は、酸によるＤＭＴｒ基の切断と吸光度測定によって行うことができる。
　前記（Ｒｂ－Ｌ１）の担持量は、Ｎ２吸脱着測定により求められる、無機多孔質体の質量当たり比表面積に対して、通常、０．１～５．０μｍｏｌ／ｍ２になる量であり、好ましくは０．５～２．０μｍｏｌ／ｍ２になる量である。
　本実施形態の固相担体は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の固相合成用基材として好適なものである。中でも、本実施形態の固相担体は、ＤＮＡに比べて安定性に問題があるとされるＲＮＡの合成に特に適している。
　以下、ＲＮＡの固相合成を例に挙げて、以下に示す反応経路（縮合反応、酸化、脱保護）を参照しながら核酸の製造方法について説明する。
　尚、以下に示す反応経路については、前記式（２）中のＲｂにヌクレオシドを用いた例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　反応経路を示す化学式中、Ｒ４は塩基；Ｔｒは保護基；Ｘは－Ｈ、－ＯＨ又は－ＯＲ５（Ｒ５は保護基）をそれぞれ表している。
　前記一般式（２）で表されるリンカーを有する固相担体（Ｓｐ－Ｎｕ）及びアミダイトモノマー（Ａｍ－１）のヌクレオシドを構成する塩基（Ｒ４）は、通常、核酸、典型的にはＲＮＡを構成する天然の塩基であるが、非天然の塩基を場合によっては使用してもよい。かかる非天然の塩基としては、天然あるいは非天然の塩基の修飾アナログが例示される。
　Ｒ４で表される塩基としては、例えば、アデニン、イソグアニン、キサンチン、ヒポキサンチン及びグアニン等のプリン塩基；及び、シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基等が挙げられる。
　また、Ｒ４で表される塩基としては、例えば、２－アミノアデニン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン等のアミノ誘導体；５－メチルウラシル、５－メチルシトシン、７－メチルグアニン、６－メチルプリン、２－プロピルプリン等のアルキル誘導体；５－ハロウラシル及び５－ハロシトシン；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；６－アザウラシル、６－アザシトシン及び６－アザチミン；５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル；８－ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８－置換プリン；５－トリフルオロメチル化及び他の５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）；ジヒドロウラシル；３－デアザ－５－アザシトシン；７－デアザアデニン；Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン；５－アミノ－アリル－ウラシル；Ｎ３－メチルウラシル；置換１，２，４－トリアゾール；２－ピリジノン；５－ニトロインドール；３－ニトロピロール；５－メトキシウラシル；ウラシル－５－オキシ酢酸；５－メトキシカルボニルメチルウラシル；２－チオウラシル、５－メチル－２－チオウラシル；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル；５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル；３－メチルシトシン；Ｎ４－アセチルシトシン；２－チオシトシン；Ｎ６－メチルアデニン；Ｎ６－イソペンチルアデニン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン；Ｎ－メチルグアニン；Ｏ－アルキル化塩基等；およびこれらの２種以上が挙げられる。
　また、プリン化合物及びピリミジン化合物は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　Ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，８５８～８５９頁，クロシュビッツ　ジェー　アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ　Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０、及びイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０巻，ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
　好適なアミダイトモノマー（Ａｍ－１）としては、下記化学式（Ａｍ－１’）で表される化合物において、保護基Ｒ５が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、パラ－トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、（２－シアノエトキシ）メトキシメチル（ＥＭＭ）基などである、ＴＢＤＭＳアミダイト（ＴＢＤＭＳ　ＲＮＡ　Ａｍｉｄｉｔｅｓ、商品名、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト（Chakhmakhchevaの総説：Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides、Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol. 39, No. 1, pp. 1-21.）、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載）等が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 ［式中、Ｒ５は、ヒドロキシル基の保護基を表す。Ｒ４は、保護された核酸塩基を示す。］
　本実施形態の固相担体は、ヌクレオシドやヌクレオチド以外の２価の基を核酸配列に組み込むために使うこともできる。例えば、プロリン骨格を有するアミダイト（後述のアミダイトＰなど）を、アミダイト法により、核酸配列に組み込むことができる（国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ４の方法と同様の方法を参照）。また、下記の構造式（Ａｍ－１１）、（Ａｍ－１２）及び（Ａｍ－１３）でそれぞれ表されるアミダイト（国際公開第２０１３／１０３１４６号の実施例Ａ１～Ａ３参照）を使用することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 ［式中、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリチル基を表す。Ｔｆａはトリフルオロアセチル基を表す。］
　［ＲＮＡの固相合成］
　前記一般式（２）で表されるリンカーを有する固相担体（Ｓｐ－Ｎｕ）を脱保護（－Ｔｒ）して、固相担体（Ａｍ－２）を得る。この後、アミダイトモノマー（Ａｍ－１）と、固相担体（Ａｍ－２）とを縮合反応させて、反応生成物（Ａｍ－３）を得る。この後、反応生成物（Ａｍ－３）を酸化して、生成物（Ａｍ－４）を得る。この後、生成物（Ａｍ－４）を脱保護（－Ｔｒ）して、生成物（Ａｍ－５）を得る。次いで、アミダイトモノマー（Ａｍ－１）と生成物（Ａｍ－５）とをさらに縮合反応させて、ホスホジエステル結合を伸長していく。
　このように、伸長したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基を、所望の配列となるように、一連の脱保護、縮合反応、酸化のサイクルを必要なだけ繰り返し、この後、固相担体から切り出すことにより、所望の配列の核酸分子を製造することができる。
　より詳しくは、以下の工程を含む製造方法により核酸が製造される。
　工程（Ａ）：前記一般式（２）中のＲｂが、反応性の基としてヒドロキシル基が保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す無機多孔質担体を用い、前記のヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程、
　工程（Ｂ）：前記工程（Ａ）において生成したヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基と、第２のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とを縮合反応させて、ホスファイトを生成する縮合工程、
　工程（Ｃ）：前記工程（Ｂ）において生成したホスファイトを酸化させて、ヌクレオチドを生成する酸化工程、
　工程（Ｄ）：前記工程（Ｃ）において生成したヌクレオチドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程。
　前記の工程（Ａ）～（Ｄ）を含む製造方法は、任意に以下の工程を含む。
　工程（Ｂ’）：前記工程（Ｄ）において生成した生成物と、次に導入予定のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とをさらに縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程、
　工程（Ｃ’）：前記工程（Ｂ’）において生成したホスファイトを酸化させて、オリゴヌクレオチドを生成する工程、
　工程（Ｄ’）：前記工程（Ｃ’）において生成したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程、
　工程（Ｅ）：前記の工程（Ｂ’）、工程（Ｃ’）及び工程（Ｄ’）からなる一連の工程を、さらにｍ回（ｍは、１以上の整数を表す。）繰り返して、ｍ個のアミダイト化合物を反応（核酸伸長反応）させた後、伸長した核酸を切り出す工程。
　本実施形態における核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。
　本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、核酸鎖、特にＲＮＡ鎖を伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
　脱保護する工程では、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する。一般的な保護基としては、トリチル系保護基（典型的には、ＤＭＴｒ基）が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、及びｐ－トルエンスルホン酸等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
　縮合工程では、前記の脱保護する工程により脱保護したＲＮＡ鎖末端の５’位のヒドロキシル基に対して、ヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させて、ホスファイトを生成する。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’位のヒドロキシル基が保護基（例えばＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。
　また、縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－４２）等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
　縮合工程の後は、適宜、未反応の５’位のヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等、またはこれらの２種以上の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
　酸化工程は、前記縮合工程により形成されたホスファイトを酸化する工程である。酸化工程は、酸化剤を用いて行うことができる。酸化剤としては、ヨウ素、ｍ－クロロ過安息香酸、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、２－ブタノンペルオキシド、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、１，１－ジヒドロペルオキシシクロドデカン、過酸化水素等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
　酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順番は限定されない。
　酸化工程後は、脱保護工程に戻り、合成すべきＲＮＡのヌクレオチド配列に応じて、上記の縮合反応、酸化、脱保護の工程を繰り返すことにより、所望の配列を有するＲＮＡを合成することができる。
　所望の配列を有するＲＮＡ鎖の合成が完了した後は、アンモニア又はアミン類等を用いて、固相担体からＲＮＡ鎖を切断して回収する。
　ここでのアミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等、またはこれらの２種以上が挙げられる。
　ユニバーサルリンカーを用いる場合、ＲＮＡ鎖の合成が完了した後は、アンモニア又はアミン類等を用いて、固相担体からの切断を行い、求核試薬によるユニバーサルリンカーの除去を行う。除去が完了した際には、末端ヌクレオチドの３’位はヒドロキシル基となり、ホスフェートはユニバーサルリンカーに結合して環状ホスホジエステルを形成する。回収したＲＮＡは、適宜、公知の方法で精製してもよい。
　以上説明した本実施形態では、無機多孔質体が、置換基（Ｒ１、Ｒ２）を有するアミノシランで修飾されている。この置換基（Ｒ１、Ｒ２）により、本実施形態の無機多孔質担体は、担体へのアミノシランの過密な修飾が抑えられ、アミノ基同士が適度に離れた状態で担体に導入されている。このようにアミノ基間が離れていると、核酸伸長反応の際、オリゴ核酸同士の立体障害が生じにくく、目的の鎖長まで安定に伸長反応が進みやすくなる。このため、本実施形態の無機多孔質担体を使用することにより、ＲＮＡの製造において収率をより高められる。また、本実施形態のＲＮＡの製造方法によれば、ＲＮＡの製造において収率をより高められ、特に長鎖ＲＮＡを、より高収率で安定に得ることができる。
　加えて、本実施形態の無機多孔質担体を核酸合成に適用することにより、特に４０ｍｅｒ以上の長鎖ＲＮＡを合成する場合でも、高純度のＲＮＡを収率良く得ることができる。
　本明細書において、「ＲＮＡの収率」は、反応に供したヌクレオシドの量から理論上計算されるＲＮＡの量に対する、実際に単離したＲＮＡの割合（％）をいう。ＵＶの吸光度の測定から核酸量を算出する。かかる測定の方法として、具体的には、水又は緩衝水溶液中に核酸を溶解させ、光路長１ｃｍのセルに入れる。ＵＶの吸光度計を用いて、波長が２６０ｎｍにある吸光度から、下式により光学濃度Ｃを計算して、核酸量を算出する。係数は、４０μｇ／ｍＬを使用している。
　Ｃ＝α・Ｌ・Ａ２６０
　（Ａ２６０：吸光度、α：係数、Ｌ：光路長、Ｃ：光学濃度）
　「ＲＮＡの純度」は、目的の鎖長の核酸が得られている割合（％）をいう。液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムにおける面百値（すなわち、面積百分率）、又はメインピークの１０％幅により求められる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
＜無機多孔質体の作製＞
　無機多孔質体として、下記のＳＰ（１）～ＳＰ（７）を用いた。無機多孔質体ＳＰ（１）～ＳＰ（７）のそれぞれについて、細孔径（モード径；μｍ）、粒子径（メジアン径；μｍ）、体積当たり比表面積（ｍ２／ｍＬ）、気孔率（％）を求めた。この結果を表１、２に示した。
　細孔径（モード径；μｍ）及び気孔率（％）は、水銀圧入法により求めた。粒子径（μｍ）は、レーザー回折（散乱式）によりメジアン径を測定した。体積当たり比表面積（ｍ２／ｍＬ）は、水銀圧入法により得られる嵩密度（ｇ／ｍＬ）と、Ｎ２吸脱着等温線測定により得られる、質量当たり比表面積（ｍ２／ｇ）との積により求めた。
　無機多孔質体ＳＰ（１）：
　特許第５８７５８４３号公報に記載の実施例１と同様の方法でゼオライト成形体を得た。得られたゼオライト成形体を、アセトニトリル溶媒中で縣濁させて縣濁液を調製した。次いで、目開き１２５μｍ及び３８μｍのＪＩＳ篩で前記縣濁液を順次篩った。その後、目開き３８μｍの篩上に残存した粉末固体を、室温にて風乾して、白色粉末状固体である無機多孔質体ＳＰ（１）を作製した。
　無機多孔質体ＳＰ（２）：
　無機多孔質体ＳＰ（２）として、市販の球状シリカゲル粉末（商品名：Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ、ＡＧＣエスアイテック株式会社製）を用いた。
　無機多孔質体ＳＰ（３）：
　特許第５８７５８４３号公報に記載の実施例１と同様の方法でゼオライト焼成物を得た。次いで、得られた焼成物１０ｇをシャーレに入れ、水１００ｍＬを入れた２リットルのセパラブルフラスコ中に静置し、蓋を閉めた後、セパラブルフラスコを８０℃の恒温槽に入れ、２４時間放置した。セパラブルフラスコを取り出した後、２０℃まで放冷した。この固体８ｇをオートクレーブに入れ、この中に、７．５質量％硝酸アンモニウム水溶液８８ｇと２５質量％アンモニア水溶液１３４ｇとの混合液２２２ｇを加え、９０℃にて１時間撹拌した後、濾過により固体を分離した。この固体に対し、前記と同様の硝酸アンモニウム水溶液とアンモニア水溶液との混合液による処理をさらに９回繰り返した後、水洗、乾燥を行い、無機多孔質体ＳＰ（３）を得た。
　無機多孔質体ＳＰ（４）：
　容量１．５Ｌのステンレス製オートクレーブに、オルトケイ酸テトラエチル［Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）４］１１５ｇ、４０質量％水酸化テトラ－ｎ－プロピルアンモニウム水溶液５７ｇ、水酸化カリウム（純度８５％）０．９ｇ及び水３２５ｇを入れ、室温にて１２０分間激しく撹拌した。得られた混合液中のケイ素に対する、水、テトラ－ｎ－プロピルアンモニウムイオン、水酸化物イオン及びカリウムイオンのモル比は、それぞれ３６、０．２０、０．２４及び０．０４８であった。この混合液を、１０５℃にて４８時間、３００ｒｐｍの回転数で撹拌し、水熱合成反応を行った。得られた反応混合物を濾過し、濾液のｐＨが９．０以下になるまで繰り返し純水で洗浄した。得られたウェットケーキを１１０℃で乾燥させた後、乳鉢で粉砕した。得られた粉砕品を目開き２．３６ｍｍ及び目開き１．００ｍｍの篩いで順次篩別した。これを、管状炉を用い、５３０℃にて１時間窒素流通下に焼成し、次いで、さらに５３０℃にて１時間窒素と空気との混合ガス〔窒素：空気（体積比）＝９：１〕流通下で焼成することにより白色の焼成物を得た。
　次いで、上記で得られた焼成物１０ｇをシャーレに入れ、水１００ｍＬを入れた２リットルのセパラブルフラスコ中に静置し、蓋を閉めた後、セパラブルフラスコを８０℃の恒温槽に入れ、３４時間放置した。セパラブルフラスコを取り出した後、２０℃まで放冷した。この固体４ｇをオートクレーブに入れ、この中に、７．５質量％硝酸アンモニウム水溶液１１０ｇと２５質量％アンモニア水溶液１６８ｇとの混合液２７８ｇを加え、９０℃にて１時間撹拌した後、濾過により固体を分離した。この固体に対し、前記と同様の硝酸アンモニウム水溶液とアンモニア水溶液との混合液による処理をさらに３回繰り返した後、水洗、乾燥を行った。最後に、得られた白色固体を乳鉢で粉砕し、目開き１０６μｍ及び目開き３８μｍの篩いで順次篩別し、無機多孔質体ＳＰ（４）を得た。
　無機多孔質体ＳＰ（５）：
　容量１．５Ｌのステンレス製オートクレーブに、オルトケイ酸テトラエチル［Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）４］１５５ｇ、４０質量％水酸化テトラ－ｎ－プロピルアンモニウム水溶液１３６ｇ、水酸化カリウム（純度８５％）０．３ｇ及び水１６２ｇを入れ、室温にて１２０分間激しく撹拌した。得られた混合液中のケイ素に対する、水、テトラ－ｎ－プロピルアンモニウムイオン、水酸化物イオン及びカリウムイオンのモル比は、それぞれ１８、０．３６、０．３８及び０．０４８であった。この混合液を、１０５℃にて４８時間、３００ｒｐｍの回転数で撹拌し、水熱合成反応を行った。得られた反応混合物を濾過し、濾液のｐＨが９．０以下になるまで繰り返し純水で洗浄した。得られたウェットケーキを１１０℃で乾燥させた後、乳鉢で粉砕した。得られた粉砕品を目開き２．３６ｍｍ及び目開き１．００ｍｍの篩いで順次篩別した。これを、管状炉を用い、５３０℃にて１時間窒素流通下に焼成し、次いで、さらに５３０℃にて１時間窒素と空気の混合ガス〔窒素：空気（体積比）＝９：１〕流通下で焼成することにより白色の焼成物を得た。
　次いで、上記で得られた焼成物１０ｇをシャーレに入れ、水１００ｍＬを入れた２リットルのセパラブルフラスコ中に静置し、蓋を閉めた後、セパラブルフラスコを８０℃の恒温槽に入れ、５時間放置した。セパラブルフラスコを取り出した後、２０℃まで放冷した。この固体８ｇをオートクレーブに入れ、この中に、７．５質量％硝酸アンモニウム水溶液８８ｇと２５質量％アンモニア水溶液１３４ｇとの混合液２２２ｇを加え、９０℃にて１時間撹拌した後、濾過により固体を分離した。この固体に対し、前記と同様の硝酸アンモニウム水溶液とアンモニア水溶液との混合液による処理をさらに２回繰り返した後、水洗、乾燥を行った。最後に、得られた白色固体を乳鉢で粉砕し、目開き１０６μｍ及び目開き３８μｍの篩いで順次篩別し、無機多孔質体ＳＰ（５）を得た。
　無機多孔質体ＳＰ（６）：
　容量１６００Ｌのステンレス製オートクレーブに、オルトケイ酸テトラエチル［Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）４］１８６ｋｇ、４０質量％水酸化テトラ－ｎ－プロピルアンモニウム水溶液１６６ｋｇ、水酸化カリウム（純度８５％）０．３ｋｇ及び水４９０ｋｇを入れ、室温にて１２０分間撹拌した。得られた混合液中のケイ素に対する、水、テトラ－ｎ－プロピルアンモニウムイオン、水酸化物イオン及びカリウムイオンのモル比は、それぞれ３７、０．３６、０．３９及び０．０４９であった。この混合液を、１０５℃にて１２時間、６０ｒｐｍの回転数で撹拌し、水熱合成反応を行った。得られた反応混合物を無機多孔質体ＳＰ(５)と同様に、純水で洗浄した。洗浄後、結晶を含むスラリーを回収した。このスラリーをアトマイザー式スプレードライヤーで噴霧乾燥し、粒子状に成形した。これを、５５０℃にて２．５時間窒素流通下に焼成し、次いで、さらに５５０℃にて２．５時間窒素と空気の混合ガス〔窒素：空気（体積比）＝３：１〕流通下で焼成することにより白色の焼成物を得た。
　次いで、上記で得られた焼成物５０ｇをシャーレに入れ、水１００ｍＬを入れたセパラブルフラスコ中に静置し、蓋を閉めた後、セパラブルフラスコを８０℃の恒温槽に入れ、４時間放置した。この固体５．００ｇをオートクレーブに入れ、この中に、７．５質量％硝酸アンモニウム水溶液１７６ｇと２５質量％アンモニア水溶液２６８ｇとの混合液４４４ｇを加え、８６℃にて１時間撹拌した後、濾過により固体を分離した。この固体に対し、前記と同様の硝酸アンモニウム水溶液とアンモニア水溶液との混合液による処理をさらに４回繰り返した後、水洗、乾燥を行い、無機多孔質体ＳＰ（６）を得た。
　無機多孔質体ＳＰ（７）：
　無機多孔質体ＳＰ（７）として、市販の多孔質ガラス（商品名：CPG-1000、株式会社ジーンアクト製）を用いた。
＜シランカップリング剤の合成＞
　シランカップリング剤として、下記の（Ｃ１）成分、（Ｃ２）成分、（Ｃ３）成分、（Ｃ４）成分、（Ｃ５）成分、（Ｃ６）成分、および（Ｃ７）成分を用いた。
　（Ｃ１）成分：
　市販の３－アミノプロピルジイソプロピルエトキシシランを購入して使用した。
　（Ｃ２）成分：
　トリクロロシラン（５ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）、６－クロロ－１－ヘキセン（３．８０ｇ、３２ｍｍｏｌ）及びヘキサクロロ白金（ＩＶ）酸六水和物のイソプロパノール溶液（１Ｍ、５μＬ、５μｍｏｌ）を室温で１８．５時間撹拌した。得られた混合液にＴＨＦ（５０ｍＬ）を加え、氷冷下イソプロピルマグネシウムクロリドのＴＨＦ溶液（１Ｍ、１５０ｍＬ、１５０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で７３．５時間撹拌した。得られた反応液をイソプロパノール（４０ｍＬ）、トリエチルアミン（８０ｍＬ）及びＴＨＦ（１２０ｍＬ）の混合液に氷冷下で滴下し、室温で１．５時間撹拌した後、不溶物をろ去した。減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣にヘキサン（３０ｍＬ）を加え、不溶物をろ去後、ろ液を減圧下濃縮し、６－クロロヘキシルイソプロポキシジイソプロピルシラン４．３７ｇを得た（収率４７％）。
　密閉式溶解るつぼ中、得られた６－クロロヘキシルイソプロポキシジイソプロピルシラン（１．４６ｇ、５ｍｍｏｌ）にアンモニアのメタノール溶液（７Ｎ、２１．４ｍＬ、１５０ｍｍｏｌ）を加え、１４２℃で３時間撹拌した。得られた混合物をＴＨＦ（２００ｍＬ）に流入し、ろ過後、ろ液の溶媒を減圧下留去した。得られた残渣にヘプタン（２０ｍＬ）を加え、不溶物をろ去後、減圧下溶媒を留去し、６－アミノヘキシルイソプロポキシジイソプロピルシランを１．８３ｇ得た。
　得られた化合物についてＮＭＲ測定を行い、以下の測定結果からその構造を同定した。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 10.90-1.11 (18H, m), 1.13-1.45 (10h, m), 2.92-2.96 (2H, m), 4.00-4.04 (1H, m)
　（Ｃ３）成分：
　テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０ｍＬ）に、３－クロロプロピルトリメトキシシラン（３．９７ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、５℃に冷却し、フェニルマグネシウムブロミドのＴＨＦ溶液（１Ｍ、６０ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。
　その後、室温で１５時間半撹拌した。反応溶液にエタノール４．３６ｍＬを加え、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン）に供し、３－クロロプロピルジフェニルメトキシシラン３．６１ｇを得た（収率６２％）。
　密閉式溶解るつぼ中、得られた３－クロロプロピルジフェニルメトキシシラン（０．７ｇ、２．４ｍｍｏｌ）にメタノール（２ｍＬ）とアンモニアメタノール溶液（７Ｎ、１０ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）とを加え、１４２℃で３時間撹拌した。
　得られた混合物を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）に流入し、ろ過後、ろ液の溶媒を減圧下留去した。得られた残渣に、ヘプタン（１０ｍＬ）とメタノール（１０ｍＬ）とを加え、メタノール層の溶媒を減圧下で留去し、３－アミノプロピルジフェニルメトキシシラン０．４ｇを得た（収率６１％）。
　得られた化合物についてＮＭＲ測定を行い、以下の測定結果からその構造を同定した。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.20 (2H, dd), 1.78 (2H, m), 2.94 (2H, m), 3.44 (3H, s), 7.24-7.58 (10H, m)
　（Ｃ４）成分：
　ｎ－ヘキサン（２０ｍＬ）に、トリクロロシラン（２ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を加え撹拌した後、ｎ－ブチルリチウムのヘキサン溶液（１．６Ｍ、２７．５ｍＬ、４４ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で１．５時間撹拌した。エタノール（５ｍＬ）とトリエチルアミン（５ｍＬ）を加え、不溶物をろ去し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を、クーゲルロールを用いた蒸留に供し（～７０℃、７ｍｍＨｇ）、ジブチルエトキシシラン０．５３ｇを得た（収率５４％）。
　得られたジブチルエトキシシラン（０．４９ｇ、２．６ｍｍｏｌ）、アリルアミン（０．１５ｇ、２．６ｍｍｏｌ）及びヘキサクロロ白金（ＩＶ）酸六水和物のイソプロパノール溶液（１Ｍ、１．３μＬ、１．３μｍｏｌ）を１００℃で１時間撹拌した。アリルアミン（０．１５ｇ、２．６ｍｍｏｌ）とヘキサクロロ白金（ＩＶ）酸六水和物のイソプロパノール溶液（１Ｍ、５μＬ、５μｍｏｌ）を追加し、さらに２時間撹拌した。得られた混合物を、クーゲルロールを用いた蒸留に供し（～１２０℃、５ｍｍＨｇ）、３－アミノプロピルジブチルエトキシシラン０．２６ｇを得た（収率４１％）。
　（Ｃ５）成分：
　３－アミノプロピルジメチルエトキシシラン（Aldrich, CAS RN：18306-79-1　製品コード：588857）を使用した。
　（Ｃ６）成分：
　３－アミノプロピルトリエトキシシラン（TCI, CAS RN：919-30-2　製品コード：A0439）を使用した。
　（Ｃ７）成分：
　クロロジイソプロピルシラン（５．０ｍＬ、３７．５ｍｍｏｌ）およびアリルブロミド（１．６ｍＬ、１８．８ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２６ｍＬ）にヘキサクロロ白金（ＩＶ）酸六水和物のイソプロパノール溶液（１Ｍ、９．７μＬ、９．７μｍｏｌ）を加え、１４０℃で３時間撹拌した。反応液を冷却し、エタノールおよびトリエチルアミンを流入し、さらに撹拌を行った。得られた沈殿をろ過し、ろ液を濃縮して３－ブロモプロピルジイソプロピルエトキシシランの混合物を得た。その後、１，６－ジアミノヘキサン（０．５８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で２時間反応を行った。得られた混合物をろ過し、減圧留去したのち、シリカゲルカラム精製（クロロホルム／エタノール＝８０／２０）を行い、［３－（６－アミノヘキシルアミノ）プロピル］ジイソプロピルエトキシシラン（０．３６ｇ、２２％）を得た。
＜リンカーを担持する無機多孔質体（無機多孔質担体）の製造方法＞
　各例の無機多孔質担体は、無機多孔質体ＳＰ（１）～ＳＰ（７）のいずれかを、シランカップリング剤（Ｃ１）～（Ｃ７）成分のいずれかで表面処理することにより得た。
　（実施例１）
　無機多孔質体ＳＰ（１）２．００ｇを四つ口フラスコに入れ、トルエン１００ｍＬを加えた。撹拌下で、さらに（Ｃ１）成分４．８ｍｇを加え、室温にて３時間撹拌した。その後、反応液を濾過し、トルエンで洗浄した後、減圧下で乾燥させて、実施例１の無機多孔質担体を得た。
　（実施例２）
　（Ｃ１）成分を（Ｃ２）成分（添加量：２７．２ｍｇ）に変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例２の無機多孔質担体を得た。
　（実施例３）
　（Ｃ１）成分を（Ｃ３）成分（添加量：１４．２ｍｇ）に変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例３の無機多孔質担体を得た。
　（実施例４）
　（Ｃ１）成分を（Ｃ４）成分（添加量：８．３ｍｇ）に変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例４の無機多孔質担体を得た。
　（実施例５）
　無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（２）（１．００ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分の添加量を２．４ｍｇに変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例５の無機多孔質担体を得た。
　（実施例６）
　無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（３）（２．００ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分の添加量を６．８ｍｇに変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例６の無機多孔質担体を得た。
　（実施例７）
　無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（４）（０．４０ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分の添加量を１．２ｍｇに変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例７の無機多孔質担体を得た。
　（実施例８）
　無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（５）（２．００ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分の添加量を９．５ｍｇに変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例８の無機多孔質担体を得た。
　（実施例９）
　無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（６）（０．３５ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分の添加量を３．０ｍｇに変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例９の無機多孔質担体を得た。
　（実施例１０）
　無機多孔質体ＳＰ（１）（１．００ｇ）に対して添加するシランカップリング剤を（Ｃ１）成分から（Ｃ７）成分（添加量：７．１ｍｇ）に変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、実施例１０の無機多孔質担体を得た。
　（実施例１１）
　ガラスバイアルに（Ｃ１）成分（５５ｍｇ）とトルエン（７２．３２ｇ）を混合し、（Ｃ１）成分／トルエン溶液を調製した。無機多孔質体ＳＰ（７）（７．００ｇ）を丸底フラスコに入れ、ここに調製した（Ｃ１）成分／トルエン溶液（３４．２３ｇ）を室温下にて加えた。１００℃のオイルバスに前記丸底フラスコを導入し５時間反応させた。その後、反応混合物を濾過し、固形分をトルエンで洗浄した後、減圧下で乾燥させて、実施例１１の無機多孔質担体を得た。
　（比較例１）
　（Ｃ１）成分を（Ｃ５）成分（添加量：３．８ｍｇ）に変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、比較例１の無機多孔質担体を得た。
　（比較例２）
　（Ｃ１）成分を（Ｃ６）成分（添加量：４．９ｍｇ）に変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、比較例２の無機多孔質担体を得た。
　（比較例３）
　無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（２）（１．００ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分を（Ｃ６）成分（添加量：２．４ｍｇ）に変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、比較例３の無機多孔質担体を得た。
　（比較例４）
　無機多孔質体ＳＰ（１）を無機多孔質体ＳＰ（３）（０．５０ｇ）に変更し、かつ、（Ｃ１）成分を（Ｃ６）成分（添加量：２．７ｍｇ）に変更した以外は、実施例１の製造方法と同様にして、比較例４の無機多孔質担体を得た。
　（比較例５）
　ガラスバイアルに（Ｃ６）成分（５４ｍｇ）とトルエン（７２．３２ｇ）を混合し、（Ｃ６）成分／トルエン溶液を調製した。無機多孔質体ＳＰ（７）（７．００ｇ）を丸底フラスコに入れ、ここに調製した（Ｃ６）成分／トルエン溶液（３４．２３ｇ）を室温下にて加えた。１００℃のオイルバスに前記丸底フラスコを導入し５時間反応させた。その後、反応混合物を濾過し、固形分をトルエンで洗浄した後、減圧下で乾燥させて、比較例５の無機多孔質担体を得た。
＜固相担体の製造＞
　（実施例１～１０および比較例１～４）
　Ｕ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－スクシニルウリジン）２５．１ｍｇと、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）１２．５ｍｇと、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン５．９μＬと、アセトニトリル２．７ｍＬとを混合し、この混合物に、実施例１～１０および比較例１～４のいずれかの無機多孔質担体３００．０ｍｇをそれぞれ加えた。
　２５℃で１８時間静置した後、ろ過し、固体（残渣）をアセトニトリル１０ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に、無水酢酸と、２，６－ルチジンのＴＨＦ溶液（無水酢酸／２，６－ルチジン／ＴＨＦ、容量比１／１／８）１ｍＬと、Ｎ－メチルイミダゾールのＴＨＦ溶液（Ｎ－メチルイミダゾール／ＴＨＦ、容量比１６／８４）１ｍＬとを加えた。１分間静置した後にろ過し、固体をアセトニトリル１０ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体を真空乾燥し、無機多孔質担体にヌクレオシドが担持した固相担体を得た。
　（実施例１１および比較例５）
　ガラスバイアルにＵ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－スクシニルウリジン）２１１ｍｇと、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）１０５ｍｇと、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１２１μＬと、アセトニトリル１１ｍＬとを混合した。調製した混合溶液１．６３ｍＬと、実施例１１および比較例５のいずれかの無機多孔質担体３００．０ｍｇとをそれぞれ混合した。２５℃で１８時間静置した後、ろ過し、固体（残渣）をアセトニトリル１０ｍＬで洗浄した。洗浄後の固体に、無水酢酸と、２，６－ルチジンのＴＨＦ溶液（無水酢酸／２，６－ルチジン／ＴＨＦ、容量比１／１／８）１ｍＬと、Ｎ－メチルイミダゾールのＴＨＦ溶液（Ｎ－メチルイミダゾール／ＴＨＦ、容量比１６／８４）１ｍＬとを加えた。１分間静置した後にろ過し、固形分をアセトニトリル１０ｍＬで洗浄した。洗浄後の固形分を真空乾燥し、無機多孔質担体にヌクレオシドが担持した固相担体を得た。
　（ヌクレオシド担持密度の測定）
　７０％過塩素酸溶液をメタノールで希釈し、３０％過塩素酸／メタノール溶液を調製した。上記で製造した実施例１～１１および比較例１～５の、ヌクレオシドを担持した各固相担体１０ｍｇをメスフラスコに採取し、３０％過塩素酸／メタノール溶液で１０ｍＬに希釈した。この溶液を３０％過塩素酸／メタノール溶液でさらに１０倍に希釈した後、４９８ｎｍでの吸光度を測定し、ヌクレオシド担持密度を下式より算出した。この結果を表１、２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000021
＜オリゴ核酸の固相合成＞
　配列（Ａ）：５’－ＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡＵＡＣＣ－Ｐ－ＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵ－３’（配列番号１，２）（４９ｍｅｒ）。ＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡＵＡＣＣ（配列番号１）およびＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵ（配列番号２）。
　配列（Ｂ）：５’－ＡＵＡＡＣＵＣＡＡＵＵＵＧＵＡＡＡＡＡＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ－３’（配列番号３）（１０３ｍｅｒ）
　前記の配列（Ａ）において、Ｐは、下記の波線で区切られた結合部位を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　前記の配列（Ａ）又は配列（Ｂ）からなるオリゴヌクレオチドを、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ　Ｍ－４－ＭＸ－Ｅ、日本テクノサービス株式会社製）を用い、３’側から５’側に向かって合成した（反応経路（上記縮合反応、酸化、脱保護）参照）。
　かかる固相合成には、上記で製造した各固相担体を使用した。
　また、アミダイトモノマーには、以下に示すアデノシンＥＭＭアミダイト（米国特許出願公開第２０１２／０３５２４６号明細書の実施例４に記載）、シチジンＥＭＭアミダイト（同ＵＳ文献の実施例３に記載）、グアノシンＥＭＭアミダイト（同ＵＳ文献の実施例５に記載）、ウリジンＥＭＭアミダイト（同ＵＳ文献の実施例２記載）、及びアミダイトＰ（国際公開第２０１７／１８８０４２号に記載）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　また、かかる固相合成には、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液とを使用した。
　合成終了後の固相担体を、蓋つきガラスバイアルに入れ、２８％ＮＨ４ＯＨとＥｔＯＨとの１：１ないし２：１溶液を加えた。その後、４０℃下で４時間静置した。反応後の溶液を濾過し、水、ＥｔＯＨで順次洗浄した。得られた溶液を乾燥して、未脱保護体の粗オリゴヌクレオチドとし、次いでニトロメタンの存在下でフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を作用させて脱保護を行い、粗生成物を得た。
［オリゴ核酸の収率の測定］
　得られた粗オリゴヌクレオチドを用いて調製した溶液について、ＵＶの吸光度計により波長が２６０ｎｍにある吸光度ＯＤ２６０を測定することで収量を算出し、各固相担体によるオリゴ核酸合成の収率（％）を求めた。その結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　表１に示す結果から、実施例１～４および実施例１０の固相担体を用いた場合の方が、比較例１～２の固相担体を用いた場合に比べて、オリゴ核酸の収率が高いことが確認できる。
　実施例５の固相担体を用いた場合の方が、比較例３の固相担体を用いた場合に比べて、オリゴ核酸の収率が高いことが確認できる。
　実施例６の固相担体を用いた場合の方が、比較例４の固相担体を用いた場合に比べて、オリゴ核酸の収率が高いことが確認できる。
　実施例１１の固相担体を用いた場合の方が、比較例５の固相担体を用いた場合に比べて、オリゴ核酸の収率が高いことが確認できる。
［オリゴ核酸の純度の測定］
　得られた粗オリゴヌクレオチドを用いて調製した溶液（実施例６、７および比較例４）について、高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＤＮＡＰａｃＴＭ　ＰＡ１００　４×２５０ｍｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの、主生成物のＬＣピーク頂点の高さの１０％の高さにおけるピーク幅を「１０％幅」として求めた。その結果を表２に示した。
　ここで、オリゴ核酸の純度が高い場合には「１０％幅」が小さな値となり、純度が低い場合には「１０％幅」が大きな値となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　表２に示す結果から、実施例６～７の固相担体を用いた場合の方が、比較例４の固相担体を用いた場合に比べて、オリゴ核酸の純度が高いことが確認できる。
　以上の結果から、本発明の固相担体を使用すれば、オリゴ核酸の製造において収率及び純度をより高められる、と言える。
　本発明により、長鎖核酸の合成においても収率及び純度を向上させることができる、核酸の製造方法が提供される。本発明に係る無機多孔質担体を採用した製造方法により得られる核酸は、医薬品の原料として有用である。
　配列表の配列番号１～３は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。

Claims (14)

  1. 　下記一般式（１）で表されるリンカーを有し、細孔径（モード径）が０．０４μｍ以上の細孔分布を有する無機多孔質担体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基、又は、アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基を表す。Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。］
  2. 　下記一般式（２）で表されるリンカーを有し、細孔径（モード径）が０．０４μｍ以上の細孔分布を有する無機多孔質担体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、＊を付された結合は、無機多孔質体のシラノール基の酸素原子への結合を表す。
    　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基、又は、アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基を表す。
    　Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。
    　ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
    　Ｒｂは、反応性の基が保護あるいは脱保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す。
    　Ｌ１は、Ｒｂの１級又は２級のヒドロキシル基の酸素原子と結合している２価の基を表す。］
  3. 　前記一般式（２）中のＬ１が、スクシニルリンカー又はユニバーサルリンカーである、請求項２に記載の無機多孔質担体。
  4. 　前記無機多孔質体の体積当たり比表面積が、０．１ｍ２／ｍＬ以上１００ｍ２／ｍＬ以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  5. 　前記無機多孔質体の体積当たり細孔容積が、０．０５ｍＬ／ｍＬ以上０．６ｍＬ／ｍＬ以下である、請求項１～４のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  6. 　前記無機多孔質体の気孔率が、５０％以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  7. 　前記リンカーの担持密度が、前記無機多孔質体の質量当たり比表面積に対して、０．１μｍｏｌ／ｍ２以上５．０μｍｏｌ／ｍ２以下である、請求項２～６のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  8. 　前記無機多孔質体の粒子径（メジアン径）が、１μｍ以上１０００μｍ以下である、請求項１～７のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  9. 　前記無機多孔質体が、シリカ、シリカゲル、ゼオライト又はガラスである、請求項１～８のいずれか一項に記載の無機多孔質担体。
  10. 　請求項２における一般式（２）中のＲｂが、反応性の基としてヒドロキシル基が保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを表す無機多孔質担体を用い、
    　前記のヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ａ）、
    　前記工程（Ａ）において生成したヌクレオシドの５’位のヒドロキシル基と、第２のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とを縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ）、
    　前記工程（Ｂ）において生成したホスファイトを酸化させて、ヌクレオチドを生成する工程（Ｃ）、及び、
    　前記工程（Ｃ）において生成したヌクレオチドの５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ）、
    を含む、核酸の製造方法。
  11. 　前記工程（Ｄ）において生成した生成物と、次に導入予定のヌクレオシド塩基を有するアミダイト化合物とをさらに縮合反応させて、ホスファイトを生成する工程（Ｂ’）、
    　前記工程（Ｂ’）において生成したホスファイトを酸化させて、オリゴヌクレオチドを生成する工程（Ｃ’）、及び、
    　前記工程（Ｃ’）において生成したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’位のヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程（Ｄ’）、
    を含む、請求項１０に記載の核酸の製造方法。
  12. 　前記の工程（Ｂ’）、工程（Ｃ’）及び工程（Ｄ’）からなる一連の工程を、さらにｍ回（ｍは、１以上の整数を表す。）繰り返して、ｍ個のアミダイト化合物を反応させた後、伸長した核酸を切り出す工程（Ｅ）を含む、請求項１１に記載の核酸の製造方法。
  13. 　下記一般式（３）で表されるシランカップリング剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよい炭素数が３～１０のアルキル基、又は、アルキル基、アルコキシ基及びフッ素原子からなる群から選ばれる置換基を有してもよいフェニル基を表す。
    　Ｌは、単結合、炭素数が１～２０のアルキレン基、又は、炭素数が２～２０のアルキレン基であって、当該アルキレン基を構成する少なくとも１つの－ＣＨ２－ＣＨ２－基に、－Ｏ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれる何れかの基Ｑが挿入されている基：－ＣＨ２－Ｑ－ＣＨ２－を含む基を表す。ただし、基Ｑと結合しているメチレン基の炭素原子は、さらに別の基Ｑと同時に結合することはない。
    　Ｒ３は、水素原子又は炭素数が１～４のアルキル基を表す。
    　ただし、Ｌがメチレン基であり、Ｒ１がイソプロピル基であり、Ｒ２がイソプロピル基であり、Ｒ３がエチル基であるものと、Ｌがメチレン基であり、Ｒ１がｎ－プロピル基であり、Ｒ２がｎ－プロピル基であり、Ｒ３がｎ－プロピル基であるものとを除く。］
  14. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の無機多孔質担体の、ホスホロアミダイト法による核酸の製造における使用。
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