CN115335387A - 核酸寡聚物的制造方法 - Google Patents

核酸寡聚物的制造方法 Download PDF

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CN115335387A CN202180023282.5A CN202180023282A CN115335387A CN 115335387 A CN115335387 A CN 115335387A CN 202180023282 A CN202180023282 A CN 202180023282A CN 115335387 A CN115335387 A CN 115335387A
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田中雄树
加纳俊史
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Sumitomo Chemical Co Ltd
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Sumitomo Chemical Co Ltd
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Abstract

本发明提供核酸寡聚物的高效的制备方法。具体而言，本发明提供式(2)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括使式(1)所示的核酸寡聚物、和甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为90×10‑6以下的二氯乙酸溶液进行反应的工序，
Figure DDA0003857384830000011
式(1)中，符号具有说明书中记载的含义；

Description

核酸寡聚物的制造方法
技术领域
本申请主张于2020年3月27日提出申请的日本专利申请2020-058880号的优先权及其利益，其全部内容通过参照并入本申请中。
本发明涉及核酸寡聚物的制造方法。
背景技术
近年来，对核酸寡聚物在医疗领域的应用的兴趣不断高涨。例如可举出反义核酸、适配体、核酶及siRNA等诱导RNA干扰(RNAi)的核酸等，它们被称作核酸药物。
核酸寡聚物可利用固相合成法合成，将在固相载体上使核酸延伸而合成的核酸寡聚物从固相载体切出，接着，就包含核糖的核酸寡聚物而言，对核糖的2’位的羟基的保护基进行去保护以将其除去，制造目标核酸寡聚物。固相合成法中将核苷的亚磷酰胺(以下称作“酰胺(amidite)”)作为原料使用，已知使用二氯乙酸溶液对5’位的羟基的保护基进行去保护，但以往使用二氯乙酸溶液所合成的核酸寡聚物的收率并不总令人满意，合成也并非是高效的(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第99/43694号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供核酸寡聚物的高效的制备方法。
用于解决课题的手段
本申请发明人为了达成上述目的而反复进行了认真研究，结果提供核酸寡聚物的高效的制造方法，其特征在于，在合成核酸寡聚物时，使用甲醛浓度为一定以下的二氯乙酸溶液、或者在提高二氯乙酸的品质后进行使用。
本发明包含以下方式，但不限定于此。
1.式(2)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括使式(1)所示的核酸寡聚物、和甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为90×10-6以下的二氯乙酸溶液进行反应的工序，
[化学式1]
Figure BDA0003857384810000021
式(1)中，
G2表示羟基的保护基，
Ba相同或彼此不同，各自独立地表示可被保护基保护的核酸碱基，
R1、R2及R3相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基，
R相同或彼此不同，各自独立地表示经保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基，
Y相同或彼此不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，
n表示1～200中的任一整数，
W1表示OZ基且X1表示R基，或者
W1表示OV基且X1表示OZ基，
V表示羟基的保护基，
Z为具有由固相载体及连接基团组成的结构的基团，
并且，n为2以上的整数时，可以在式(1)所示的核酸寡聚物的各核苷酸之间组入非核苷酸接头；
[化学式2]
Figure BDA0003857384810000031
式(2)中，
G2、Ba、R、Y、X1、W1及n与前述相同，并且
可以以式(1)中所定义的方式，在核苷酸之间组入非核苷酸接头。
2.式(2’)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括下述工序：
前项1所述的工序；
进一步从该工序中生成的式(2)所示的核酸寡聚物除去Z所表示的基团的工序；以及
除去羟基及核酸碱基的保护基的工序，
[化学式3]
Figure BDA0003857384810000041
式(2’)中，
Y及n与前述相同，
Bc相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
G4相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
R’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’与前述相同，
X3及W3分别各自独立地表示羟基，或者
X3表示R’基且W3表示羟基。
3.如前项1所述的制造方法，其还包括下述工序：
得到式(3)所示的核酸化合物的工序，所述式(3)所示的核酸化合物是将式(2)所示的核酸寡聚物利用酰胺法任意地延伸链长而成的；以及
从式(3)所示的化合物切出式(4)所示的化合物，进一步对式(4)所示的化合物进行去保护来制造式(5)所示的核酸寡聚物的工序，
[化学式4]
Figure BDA0003857384810000051
式(3)中，
G2、Ba、R、Y、X1及W1与前述相同，
G5表示下式所示的羟基的保护基、或氢原子，[化学式5]
Figure BDA0003857384810000052
R1、R2及R3与前述相同，
m为满足m≥n的整数；
[化学式6]
Figure BDA0003857384810000053
式(4)中，
G5、R、Y及m与前述相同，
G4相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
BC相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
X2表示羟基且W2表示OV基，或者
X2表示R基且W2表示羟基，
V表示羟基的保护基；
[化学式7]
Figure BDA0003857384810000061
式(5)中，
G4、Bc、Y及m与前述相同，
R’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’与前述相同，
X3及W3分别各自独立地表示羟基，或者
X3表示R’基且W3表示羟基。
4.如前项1～3中任一项所述的制造方法，其中，非核苷酸接头为包含氨基酸骨架的接头。
5.如前项4所述的制造方法，其中，包含氨基酸骨架的接头为具有选自由下述式(A14-1)、(A14-2)及(A14-3)组成的组中的结构的接头，
[化学式8]
Figure BDA0003857384810000071
式中，Y与前述相同。
6.如前项1～5中任一项所述的制造方法，其中，二氯乙酸溶液包含选自由二氯甲烷、乙腈、及芳香族有机溶剂组成的组中的至少1种溶剂。
7.如前项1～6中任一项所述的制造方法，其中，二氯乙酸溶液中的甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为43×10-6以下。
8.如前项1～6中任一项所述的制造方法，其中，二氯乙酸溶液中的甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为22×10-6以下。
9.如前项1～8中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为核糖核酸(RNA)。
10.如前项1～8中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为核糖核酸(RNA)，其核糖的2’位的羟基的保护基为式(6)所示的保护基，
[化学式9]
Figure BDA0003857384810000072
式(6)中，
q表示1～5中的任一整数，
Ra及Rb相同或彼此不同，各自独立地表示甲基、乙基或氢原子，
＊标记表示与来自核糖的2’位的羟基的氧原子的键合位点，并且
EW表示吸电子基团。
11.如前项10所述的制造方法，其中，Ra及Rb同时为氢原子且EW为氰基。
12.如前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为40链长以上的寡聚物。
13.如前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为50链长以上的寡聚物。
14.如前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为60链长以上的寡聚物。
15.如前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为80链长以上的寡聚物。
16.如前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为100链长以上的寡聚物。
17.二氯乙酸溶液，其中，甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为90×10-6以下。
18.如前项17所述的二氯乙酸溶液，其中，甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为43×10-6以下。
19.如前项17所述的二氯乙酸溶液，其中，甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为22×10-6以下。
20.如前项17～19中任一项所述的二氯乙酸溶液的制造方法，其包括下述工序：
通过从包含含甲醛的未纯化二氯乙酸溶液、和与甲醛共沸的溶剂的溶液中共沸蒸馏去除甲醛，从而得到纯化二氯乙酸溶液。
21.如前项20所述的制造方法，其中，共沸溶剂的沸点为194℃以下。
22.如前项20或21所述的制造方法，其中，共沸溶剂为二氯甲烷、乙腈或芳香族有机溶剂。
23.如前项22所述的制造方法，其中，芳香族有机溶剂为甲苯。
24.核酸寡聚物的制造方法，其包括前项20所述的二氯乙酸溶液的纯化工序、及使用该工序中得到的纯化二氯乙酸溶液的前项1～3中任一项所述的工序。
发明的效果
本发明提供高效的核酸寡聚物的制造方法。利用本发明的制造方法，能够期待所制造的核酸寡聚物的收率提高。
附图说明
[图1]图1为示出由式(1)所示的核酸寡聚物制造式(5)所示的核酸寡聚物的典型例的路线A。图中，作为G1，只要能够作为羟基的保护基发挥功能，则能够没有特别限制地使用，能够广泛使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。另外，G3相同或彼此不同，各自独立地表示烷基，或者也可以2个G3彼此键合形成环状结构。作为G3，相同或彼此不同，各自独立地表示烷基，例如优选甲基、乙基、丙基、或异丙基，更优选二者均为异丙基。其它符号与前述相同。
具体实施方式
对使甲醛浓度为一定以下的二氯乙酸溶液与前述式(1)所示的核酸寡聚物进行反应而得到前述式(2)所示的核酸寡聚物的方法进行说明。
本发明的二氯乙酸溶液中的甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)通常为90×10-6以下，优选为43×10-6以下，更优选为22×10-6以下。二氯乙酸溶液中的甲醛浓度测定方法中，有气相色谱法或高效液相色谱法。气相色谱法中，对甲醛进行直接分析来计算浓度。高效液相色谱法中，使甲醛与乙酰丙酮进行反应，测定所得到的3,5-二乙酰基-1,4-二氢二甲基吡啶的量，计算甲醛的浓度。
二氯乙酸溶液中的二氯乙酸的浓度通常为0.1～2.4M，优选为0.1～1.2M，更优选为0.1～0.6M，进一步优选为0.2～0.4M。
作为二氯乙酸的稀释溶剂，只要不参与反应，则没有特别限定，能够举出二氯甲烷、乙腈、芳香族有机溶剂、水或任意的混合溶剂，优选举出选自由二氯甲烷、乙腈、及芳香族有机溶剂组成的组中的至少1种溶剂，更优选举出芳香族有机溶剂。作为芳香族有机溶剂，能够举出甲苯。
上述反应中的反应温度优选为0～40℃，更优选为10～30℃。
二氯乙酸溶液中的甲醛能够通过与任意的溶剂或任意的混合溶剂的共沸来除去，作为共沸溶剂，只要是沸点比二氯乙酸低的溶剂，则没有特别限定，能够举出二氯甲烷、乙腈、芳香族有机溶剂或任意的混合溶剂，优选举出二氯甲烷、乙腈、或芳香族有机溶剂，更优选举出芳香族有机溶剂。作为芳香族有机溶剂，能够举出甲苯。
共沸溶剂的沸点优选为200℃以下，更优选为194℃以下。
二氯乙酸溶液的保存能够使用玻璃制容器、塑料制容器、或金属制容器。作为塑料制容器，能够使用聚乙烯或聚丙烯制等容器，作为金属制容器，能够使用SUS制容器或哈氏合金制等容器。
能够在空气气氛下或非活性气体气氛下保存氧化溶液，作为非活性气体，能够使用氩气、氮气、二氧化碳或氦气等。
作为在5’位的羟基具有保护基的核酸化合物，可例示出前述式(1)的核酸化合物。作为使二氯乙酸溶液进行反应而生成的核酸化合物，可例示出前述式(2)所示的核酸化合物。
前述式(1)及(2)中，作为呈现Q’所表示的、相同或彼此不同且各自独立的与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基的化合物，具体而言，可举出下述式(7)的LNA-1、LNA-2、或LNA-3所示的结构。
[化学式10]
Figure BDA0003857384810000111
(式中，Ba表示可被保护的核酸碱基)
作为Z所示的、具有由固相载体、及将固相载体与核酸寡聚物的3’末端的核糖的2’位或3’位的羟基的氧原子连接的连接基团组成的结构的基团，更具体而言，可举出下述式(8)所示的结构。
[化学式11]
Figure BDA0003857384810000112
式(8)中，Sp表示间隔基。
作为间隔基(Sp)，例如可例示出具有下式(9)示出的结构式的基团。
[化学式12]
Figure BDA0003857384810000113
接头(Linker)例如可以为下式(10)中示出的结构，或者也可以为式(10)的结构中不具有六亚甲基氨基(hexamethylene amino group)部分的结构、氨基丙基键合于Si的结构。或者，Linker也可以为下式(11)所示的结构。
[化学式13]
Figure BDA0003857384810000121
Figure BDA0003857384810000122
(式中，
A可以为羟基、烷氧基、或烷基中的任一者。作为烷氧基，例如可举出甲氧基及乙氧基。作为烷基，例如可举出甲基、乙基、异丙基、正丙基。表示Si与载体表面的羟基的氧键合。)
作为固相载体(Solid support)，可举出无机多孔载体、有机系树脂载体等。对于无机多孔载体，例如可举出可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass(CPG))。对于有机系树脂载体，例如可举出由聚苯乙烯形成的载体。
作为本发明中使用的核酸寡聚物内所含的核苷(核糖及脱氧核糖)，可例示出DNA、RNA、2’-O-MOE(2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-Me、2’-F RNA及前述的LNA，但前述核苷不限定于此。
利用包括前述基于二氯乙酸溶液的去保护工序的固相合成法进行的核酸寡聚物的合成方法典型地包括以下的工序。
(1)对介由接头与固相载体键合的羟基经保护的核苷的5’位的羟基进行去保护的工序；
(2)使前述工序中生成的5’位的羟基与亚磷酰胺化合物进行偶联反应，从而得到亚磷酸三酯化合物的工序；
(3)将前述工序中生成的亚磷酸三酯氧化转化成磷酸三酯而制造延伸的核酸分子的工序，或者转化成硫代磷酸三酯的任意工序；
(4)反复进行任意次数前述工序(1)～(3)、即由生成的核酸分子的5’位的羟基的去保护工序、5’位的羟基与酰胺化合物的偶联工序、以及生成的亚磷酸三酯的氧化工序所构成的一系列的反应的循环，从而在固相载体上合成核酸分子的工序；以及
(5)将在工序(4)中生成的固相载体上的核酸分子供于切出及去保护的工序，使其自固相载体游离，制造保护基被除去的核酸寡聚物的工序。
其中，前述核酸寡聚物的合成方法中，在工序(2)或(3)之后，可以包括对未进行与亚磷酰胺化合物的偶联反应的5’位的羟基进行加帽(capping)的工序，也可以在构成工序(4)的一系列的反应的循环的任何工序之间附加加帽工序。
对于前述(5)的工序，更具体而言，通过将工序(4)中生成的固相载体上的核酸分子以以下的工序(5-1)及(5-2)的反应的顺序实施，接着供于工序(5-3)的反应来实施。此处，工序(5-1)的反应的实施也可以是任意的，工序(5-2)的反应的实施也可以使用日本专利第4705716号公报中记载的方法。其结果，能够制造自固相载体游离的、保护基已从核酸分子中被除去的核酸寡聚物、或5’末端的羟基经保护的核酸寡聚物。
(5-1)对核酸分子的5’末端的羟基的保护基进行去保护的反应；
(5-2)将核酸分子从固相载体切出并使其游离的反应；以及
(5-3)对构成核酸分子的核糖的2’位或3’末端的3’位的羟基的保护基进行去保护的反应。
图1中示出前述工序(1)至(5)的路线。图1所示的工序(1)或工序(4)中的去保护反应使用前述的二氯乙酸溶液来实施。路线A中的化学式中的取代基的定义与前述定义相同。
前述式(1)的核酸化合物能够进一步利用酰胺法使用核苷酸型或非核苷酸型的接头仅延伸任意的链长，并用于前述式(3)所示的核酸化合物的制造。从与前述式(3)的固相载体键合的核酸化合物仅切出核酸化合物，得到前述式(4)所示的核酸寡聚物之后，进而进行去保护，能够得到前述式(5)所示的核酸寡聚物。以下，针对各式中的取代基进行进一步详细说明。
Ba所示的可被保护基保护的核酸碱基及Bc所示的核酸碱基没有特别限定。作为该核酸碱基，可举出腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、及1-甲基假尿嘧啶等。另外，该核酸碱基也可以利用取代基进行取代。作为这样的取代基，例如可举出氟基、氯基、溴基、碘基这样的卤原子、乙酰基这样的酰基、甲基、乙基这样的烷基、苄基这样的芳烷基、甲氧基这样的烷氧基、甲氧基乙基这样的烷氧基烷基、氰基乙基这样的氰烷基、羟基、羟基烷基、酰氧基甲基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基及硝基等、以及上述中的2种以上的取代基的组合。
作为Ba所示的可被保护基保护的核酸碱基的保护基，没有特别限定，能够使用已知的核酸化学中使用的保护基，作为这样的保护基，例如可举出苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、4-甲基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基及(二甲基氨基)亚甲基等、以及上述中的2种以上的保护基的组合。
更具体而言，Ba表示下式中任一者所示的基团。
[化学式14]
Figure BDA0003857384810000141
(上式中，
R4表示氢原子、甲基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或苯甲酰基，
R5表示氢原子、乙酰基、异丁酰基或苯甲酰基，
R6表示氢原子、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或异丁酰基，
R7表示2-氰基乙基，
R8表示氢原子、甲基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基或4-甲基苯甲酰基，并且
R9表示二甲基氨基亚甲基。)
作为Bc，更具体而言，可举出从上述Ba的具体例除去保护基的基团。
G5优选以下基团。
[化学式15]
Figure BDA0003857384810000151
(式中，
R1、R2及R3相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基。)
R1、R2及R3优选1个为氢原子、剩余的2个为相同或彼此不同(优选相同)的烷氧基，作为烷氧基，特别优选甲氧基。更优选G5为4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr基)。
作为G2，只要能够作为羟基的保护基发挥功能，则能够没有特别限制地使用，能够广泛使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。作为G2，例如可举出烷基、链烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、杂环基链烯基、杂环基烷基、杂芳烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、单烷基甲硅烷基、二烷基甲硅烷基或三烷基甲硅烷基、单烷基甲硅烷氧基烷基、二烷基甲硅烷氧基烷基或三烷基甲硅烷氧基烷基等，它们可被1个以上的吸电子基团取代。
G2优选为已被吸电子基团取代的烷基。作为该吸电子基团，例如可举出氰基、硝基、烷基磺酰基、卤原子、芳基磺酰基、三卤代甲基及三烷基氨基等，优选氰基。
作为G2，特别优选以下基团。
[化学式16]
Figure BDA0003857384810000161
前述R1、R2、R3及G2的定义中的烷基可以为直链状或支链状中的任一种，优选为碳原子数为1～12的烷基，更优选为碳原子数为1～6的烷基。作为具体的烷基的例子，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基及己基。前述取代基的定义中的构成烷氧基的烷基部分具有与此处的烷基的定义相同的定义。
另外，本发明的方法中，酰胺化合物能够以游离的状态或盐的状态来使用。作为酰胺化合物的盐，可举出碱加成盐或酸加成盐，没有特别限制。作为碱加成盐，具体而言，可举出钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、铝盐等与无机碱形成的盐；与甲胺、乙胺、乙醇胺等有机碱形成的盐；与赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等碱性氨基酸形成的盐；及铵盐。作为酸加成盐，具体而言，可举出与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸等有机酸；及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成的酸加成盐。酰胺化合物也包括盐、水合物、溶剂合物及多晶型等形态。
R优选表示经保护的羟基，R表示经保护的羟基时的保护基、或V所示的羟基的保护基只要在酰胺法中能够使用即可，例如能够使用2’-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS基)、2’-双(2-乙酰氧基)甲基(ACE基)、2’-(三异丙基甲硅烷氧基)甲基(TOM基)、2’-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE基)、2’-(2-氰基乙氧基)甲基(CEM基)、2’-对甲苯磺酰基乙氧基甲基(TEM基)、2’-EMM基(国际公开第2006/022323号公报)、以及国际公开第2013/027843号公报及国际公开第2019/208571号公报中记载的基团。V优选2’-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)基。另外，在利用本发明的方法制造的核酸寡聚物为核糖核酸(RNA)的情况等、核酸寡聚物内包含核糖的情况下，作为其核糖的2’位的羟基的保护基，可例示出前述式(6)所示的保护基作为优选保护基。进一步优选例示出具有氰基作为EW所示的吸电子基团的式(12)所示的保护基。
[化学式17]
Figure BDA0003857384810000171
(式中，
q、Ra及Rb与前述式(6)中的定义相同。)
进一步优选例示出式(12)所示的基团中q为1、Ra及Rb同时为氢原子的基团。
式(12)所示的保护基能够依照例如国际公开第2013/027843号公报及国际公开第2019/208571号公报中的记载来合成，能够将具有该保护基的酰胺化合物用于核酸化合物的制造。
核酸的延伸反应中，使用图1的路线A中记载的式(13)的酰胺化合物。
作为非核苷酸接头，可例示出包含氨基酸骨架的接头(例如，日本专利第5157168号公报或日本专利第5554881号公报中记载的包含氨基酸骨架的接头)。具体而言，作为非限定的例子，例如可例示出式(A14-1)或(A14-2)或(A14-3)(例如，国际公开第2019/074110号公报中记载)所表示的接头。这些接头之外，可例示出国际公开第2012/005368号公报、国际公开第2018/182008号公报或国际公开第2019/074110号公报中记载的接头。
[化学式18]
Figure BDA0003857384810000181
(式中，Y与前述相同。)
式(13)中的R基及式(5)中的R’基为除羟基以外的取代基的核苷酸及酰胺也能够由利用日本专利第3745226号公报等中记载的已知的方法、国际公开第2001/053528号公报或日本特开2014-221817号公报及它们引用的已知的方法合成的核苷进行制造，此外，能够使用可作为市售品购入的物质，基于后述的实施例中记载的方法或利用对这些方法加以适当变更的方法进行制造。
G4表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子。作为碱金属离子，例如可举出钠离子及锂离子。另外，作为烷基铵离子，作为具体的烷基的例子，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基及己基，更具体而言，例如可举出二乙基铵离子、三乙基铵离子、四丁基铵离子、己基铵离子及二丁基铵离子等。另外，作为羟基烷基铵离子，作为具体的羟基烷基部分的例子，例如可举出羟基甲基、羟基乙基、羟基正丙基、羟基异丙基、羟基正丁基及三羟基甲基，作为更具体的羟基烷基铵离子的例子，可举出三羟基甲基铵离子等。G4优选表示氢原子。
G5表示氢原子、或前述羟基的保护基，在表示保护基的情况下G1也表示相同的保护基。G5在经去保护的情况下为氢原子，该情况下的核苷酸化合物也供于一系列的核酸延伸反应的工序。
Y优选为氧原子。
W1及X1优选W1表示OZ基且X1表示R基。
W2及X2优选W2表示羟基且X2表示R基。
W3及X3优选分别各自独立地表示羟基。
R’优选为羟基。
就利用前述工序(1)至(5)的酰胺法进行的核酸化合物的合成而言，图1的路线中的工序(1)或工序(5)中的本发明涉及的去保护工序之外，能够依照通常已知的方法(例如，前述日本专利第5157168号公报或日本专利第5554881号公报中记载的方法)进行核酸延伸反应。以下针对各工序进行说明。
(核酸延伸反应)
本说明书中，“核酸延伸反应”是指通过介由磷酸二酯键使核苷酸依次键合，从而使寡核苷酸延伸的反应。核酸延伸反应能够依照通常的亚磷酰胺法的步骤进行。核酸延伸反应也可以使用采用亚磷酰胺法的核酸自动合成装置等进行。
核酸寡聚物的链长例如可以为20mer以上(即n≥19)、40mer以上(即n≥39)、50mer以上(即n≥49)、60mer以上(即n≥59)、80mer以上(即n≥79)、100mer以上(即n≥99)、2～200mer(即1≤n≤199)、10～150mer(即9≤n≤149)、15～110mer(即14≤n≤109)。
工序(1)的去保护工序为对担载于固相载体上的寡核苷酸链末端的5’羟基的保护基进行去保护的工序。作为通常的保护基，可使用4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr基)、4-单甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基。去保护能够使用酸来进行。作为去保护用的酸，例如可举出三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸及对甲苯磺酸等。
工序(2)的缩合工序为使图1的路线A中记载的下式(13)所示的核苷亚磷酰胺与利用前述去保护工序进行了去保护的寡核苷酸链末端的5’羟基键合的反应。需要说明的是，作为核酸延伸中使用的亚磷酰胺，使用式(13)或(A9)～(A12)所示的酰胺化合物。另外，作为其他可使用的亚磷酰胺，可举出2’-OMe、2’-F、2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-H及2’-氟-2’-脱氧-β-D-阿糖呋喃基等。作为前述核苷亚磷酰胺，使用5’羟基被保护基(例如DMTr基)保护的核苷亚磷酰胺。缩合工序能够使用激活前述核苷亚磷酰胺的激活剂或缩合剂而进行。作为激活剂或缩合剂，例如可举出5-苄硫基-1H-四氮唑(BTT)(也称作5-苄巯基-1H-四氮唑)、1H-四氮唑、4,5-二氰基咪唑(DCI)、5-乙硫基-1H-四氮唑(ETT)、N-甲基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-MeBIT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(BIT)、N-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-PhIMT)、咪唑鎓三氟甲磺酸盐(IMT)、5-硝基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(NBT)、1-羟基苯并三唑(HOBT)或5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1H-四氮唑等。
图1的路线A中记载的式(13)所示的核苷亚磷酰胺(以下称作酰胺)所指如下。
式(13)所示的化合物。
[化学式19]
Figure BDA0003857384810000201
(式中，
G1、G2、G3、Ba及R与前述相同。)
在缩合工序之后，也可以适当对未反应的5’羟基进行加帽。加帽能够使用乙酸酐-四氢呋喃溶液、或苯氧乙酸酐/N-甲基咪唑溶液等已知的加帽溶液而进行。
工序(3)的氧化工序为将利用前述缩合工序而形成的亚磷酸基转化成磷酸基或硫代磷酸基的工序。本工序为使用氧化剂将三价磷转化成五价磷的反应，能够通过使氧化剂与担载于固相载体的寡核酸衍生物进行反应来实施。
在将亚磷酸基转化成磷酸基的情况下，作为“氧化剂”，例如能够使用碘。该氧化剂能够以成为0.005～2M的浓度的方式进行配制而使用。作为氧化的氧源，能够使用水，作为使反应进行的碱，能够使用吡啶、N-甲基咪唑(NMI)、N-甲基吗啉、或三乙胺等。另外，作为溶剂，只要不参与反应，则没有特别限定，可举出乙腈、四氢呋喃(THF)、或它们的任意的比例的混合溶剂。例如能够使用碘/水/吡啶/乙腈、或碘/水/吡啶或碘/水/吡啶/NMI、或碘/水/吡啶/THF。反应温度优选为5℃～50℃。反应时间通常适宜为1分钟～30分钟。相对于担载于固相载体的化合物1mol，使用的试剂的量优选为1～100mol，更优选为1～10mol。
在将亚磷酸三酯基转化成硫代磷酸三酯基的情况下，作为“氧化剂”，例如能够使用硫、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(B eaucage试剂)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮([(N,N-Dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione)(DDTT)及苯乙酰二硫化物(PADS)。该氧化剂能够以成为0.001～2M的浓度的方式用适宜的溶剂进行稀释而使用。作为反应中使用的溶剂，只要不参与反应，则没有特别限定，例如可举出二氯甲烷、乙腈、吡啶或它们的任意的比例的混合溶剂。氧化工序可以在前述加帽操作之后进行，反之也可以在氧化工序之后进行加帽操作，该顺序没有限定。
工序(5-1)中，对于在延伸的最后引入的核苷酸的5’位的羟基的保护基而言，可以在后述从固相载体切出及保护基的去保护之后，用于以5’位的羟基的保护基为标签的柱纯化，可以在柱纯化后对5’位的羟基的保护基进行去保护。
工序(5-2)中，对磷酸保护基进行去保护的工序为，在具有所期望的序列的核酸的合成完成后，使胺化合物发挥作用，以对磷酸部分的保护基进行去保护。作为胺化合物，例如可举出日本专利第4705716号公报中记载的二乙胺等。
对于工序(5-2)中的在固相载体上延伸至所期望的链长而成的核酸寡聚物从固相载体的切出而言，通常使用浓氨水作为切出剂来实施。
进一步使用氨水或胺化合物等，例如从固相载体切断寡核苷酸链并回收。作为胺化合物，例如可举出甲胺、乙胺、异丙胺、乙二胺、或二乙胺等。
工序(5-3)中，工序(5-2)中从固相载体切出的核酸化合物(4)的核糖的2’位或3’位的羟基的保护基能够依照国际公开第2006/022323号公报)、国际公开第2013/027843号公报、或国际公开第2019/208571号公报中记载的方法来除去，从而能够得到经去保护的核酸寡聚物(5)。
作为可使用本发明的制造方法制造的核酸寡聚物，可举出核酸寡聚物内所含的核苷为RNA、DNA、以及具有2’-O-MOE、2’-O-Me、2’-F的RNA、及LNA的核酸寡聚物，但不限定于此。例如可举出Xiulong,Shen等著、Nucleic Acids Research,2018,Vol.46,No.46,1584-1600、及Daniel O'Reilly等著、Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2,546-558中记载的各种各样的核苷的例子。优选利用本发明的方法所制造的核酸寡聚物为RNA。
对于在本发明的制造方法中可使用的核酸寡聚物的典型的例子，除了实施例中记载的例子以外，还示出了下述例子，但不限定于此。
以下，序列的说明中，U表示尿苷，C表示胞苷，A表示腺苷，或G表示鸟苷。
可举出国际公开第2019/060442号公报中记载的具有下述序列(A)及(B)的核酸寡聚物。
序列(A)：5’-AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT-3’(反义)(序列号1)21mer
序列(B)：5’-GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT-3’(正义)(序列号2)21mer
序列(A)及(B)中，Um表示2'-O-甲基尿苷，Cm表示2'-O-甲基胞苷，且dT表示胸苷。
可举出Daniel O'Reilly等著、Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2,546-558中记载的核酸寡聚物(参见553页)。作为典型例，可举出具有下述序列(C)的核酸寡聚物。
序列(C)：5’-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3’(序列号3)36mer
可举出日本专利第4965745号公报中记载的核酸寡聚物。作为典型例，可举出具有下述序列(D)的核酸寡聚物。
序列(D)：5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’(序列号4，5)49mer
序列(D)中，“P”由在以下式(A5)中用波浪线划分的局部结构表示。
需要说明的是，序列表中的序列号4的记载表示从序列(D)的5’末端至“P”之前为止的下述序列(D1)的碱基序列，序列号5的记载表示从序列(D)的“P”之后至3’末端为止的下述序列(D2)的碱基序列。
序列(D1)：5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3’(序列号4)23mer
序列(D2)：5’-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’(序列号5)25mer
可举出Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2:547中记载的具有下述序列(E)的核酸寡聚物。
序列(E)：5’-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’(序列号6)67mer
可举出日本特表2015-523856号公报、173页中记载的具有下述序列(F)的核酸寡聚物。
序列(F)：5’-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3’(序列号7)94mer
可举出日本特表2017-537626号公报中记载的核酸寡聚物。作为典型例，可举出具有下述序列(G)、(H)、(I)、及(J)的核酸寡聚物。
序列(G)：5’-AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’(序列号8)100mer
序列(H)：5’-GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’(序列号9)113mer
序列(I)：5’-dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’(序列号10)113mer
序列(I)中，dT表示胸苷，dC表示2'-脱氧胞苷，dA表示2'-脱氧腺苷，且dG表示2'-脱氧鸟苷。
序列(J)：5’-AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU-3’(序列号11)113mer
序列(J)中，Um表示2'-O-甲基尿苷，Am表示2'-O-甲基腺苷，Gm表示2'-O-甲基鸟苷，且s表示硫代磷酸修饰。
实施例
以下，利用实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不限定于此。
＜测定方法＞
首先，在以下的试验中使用的各种测定方法如下所示。
寡核苷酸纯度使用HPLC进行测定。
将HPLC测定条件示于下述表1。
(测定方法1：寡核苷酸纯度的测定)
[表1]
表1
Figure BDA0003857384810000251
(测定方法2：寡核苷酸收量的测定)
测定粗产物的OD260。OD260表示1mL溶液(pH＝7.5)中每10mm光程的UV260nm的吸光度。通常，已知RNA中1OD＝40μg，因此可基于前述OD260的测定值计算收量。
(测定方法3：甲醛浓度的测定)
二氯乙酸溶液中的甲醛浓度测定方法有气相色谱法或高效液相色谱法。气相色谱法中，对甲醛进行直接分析来计算浓度。高效液相色谱法中，使甲醛与乙酰丙酮进行反应，测定所得到的3,5-二乙酰基-1,4-二氢二甲基吡啶的量，计算甲醛的浓度。
＜二氯乙酸溶液的配制＞
以下试验中使用的甲醛浓度不同的二氯乙酸溶液是预先配制甲醛浓度低的二氯乙酸溶液并在所得到的二氯乙酸溶液中添加甲醛水溶液而配制的。
＜寡核苷酸的固相合成＞
序列(I)：5’-GGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’(序列号12)20mer
序列(II)：5’-AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’(序列号13)50mer
序列(III)：5’-AUAACUCAAUUUGUAAAAAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’(序列号14)100mer
前述序列(I)、(II)及(III)中，“A”由在以下式(A1)中用波浪线划分的局部结构表示。“C”由在以下式(A2)中用波浪线划分的局部结构表示。“G”由在以下式(A3)中用波浪线划分的局部结构表示。U由在以下式(A4)中用波浪线划分的局部结构表示。需要说明的是，3’末端的“U”由在以下式(A8)中用波浪线划分的局部结构表示。另外，序列(I)中，5’末端的“G”由在以下式(A6)中用波浪线划分的局部结构表示，序列(II)及(III)中，5’末端的“A”由在以下式(A7)中用波浪线划分的局部结构表示。
[化学式20]
Figure BDA0003857384810000261
[化学式21]
Figure BDA0003857384810000271
[化学式22]
Figure BDA0003857384810000272
[化学式23]
Figure BDA0003857384810000273
[化学式24]
Figure BDA0003857384810000281
[化学式25]
Figure BDA0003857384810000282
[化学式26]
Figure BDA0003857384810000283
[化学式27]
Figure BDA0003857384810000291
作为固相载体，使用可控多孔玻璃(CPG)，作为核酸合成仪，使用NTS M-4MX-E(Nihon Techno Service公司制)，利用亚磷酰胺固相合成法，从3’侧向5’侧合成由前述序列(I)、(II)及(III)组成的寡核苷酸。对于合成而言，以约1μmol规模实施。另外，合成中使用US2012/0035246的实施例2中记载的尿苷EMM酰胺(A11)、实施例3中记载的胞苷EMM酰胺(A9)、实施例4中记载的腺苷EMM酰胺(A12)及实施例5中记载的鸟苷EMM酰胺(A10)，使用3％二氯乙酸甲苯溶液作为去保护(deblocking)溶液，使用5-苄巯基-1H-四氮唑作为缩合剂，使用碘溶液作为氧化剂，使用苯氧基乙酸酐溶液和N-甲基咪唑溶液作为加帽溶液。
[化学式28]
Figure BDA0003857384810000292
[化学式29]
Figure BDA0003857384810000301
[化学式30]
Figure BDA0003857384810000302
[化学式31]
Figure BDA0003857384810000303
接着，示出利用本发明的制法制造的寡核苷酸(核酸寡聚物)的具体的制造例。此处，下述实施例中利用本发明的制法制造的寡核苷酸为具有前述序列(I)、(II)及(III)的寡核苷酸。
另外，以下实施例及比较例中记载的鸟苷衍生物是指下述结构式所示的化合物。下述结构式中图示的圆圈示意性地示出了CPG。
[化学式32]
Figure BDA0003857384810000311
(实施例1)
使用担载了0.98μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和式(A9)、式(A10)、式(A11)、或式(A12)中示出的酰胺，利用NTS M-4MX-E(Nihon Techno Service公司制)从3’侧向5’侧自动合成序列(I)中示出的核酸寡聚物。对于自动合成的步骤而言，首先，将3％二氯乙酸甲苯溶液送液至CPG，对5’位的三苯甲基保护基进行去保护。此时，所使用的二氯乙酸溶液中的甲醛浓度能够利用测定方法3进行测定，二氯乙酸溶液中的甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为43×10-7。接着，将各种酰胺和作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑送液至CPG，与5’位的羟基进行偶联反应。接着，对包含50mM碘的氧化溶液进行送液，将亚磷酸基转化成磷酸基。接着，使用0.1M苯氧基乙酸酐乙腈溶液和10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液作为加帽溶液，在未进行偶联的反应位点实施加帽。进一步将这些工序共计反复19次后，以3％二氯乙酸甲苯溶液对5’末端的碱基中的保护基(DMTr基)进行去保护，从而在CPG载体上合成序列(I)所示的序列的核酸寡核苷酸。然后，对担载了0.98μmol分量的寡核苷酸的CPG载体流入28％氨水1.5mL和乙醇0.5mL，将混合物于40℃进行4小时保温从而使核酸寡聚物自固相载体游离，然后利用浓缩除去溶剂。接着，将游离寡核苷酸溶解于二甲基亚砜1.5mL后，加入乙腈1.0mL、硝基甲烷20μL和搅拌子后，在基于搅拌器的搅拌下于室温流入以分子筛4A实施了脱水处理的1M的四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液2.08mL，将混合物于33℃进行4小时保温从而进行2’-EMM保护基的去保护。然后，利用沉淀操作得到核酸寡聚物的产物。针对所得到的产物，利用前述测定方法1中记载的方法对寡核苷酸的纯度进行测定，结果纯度为76.2％。另外，利用前述测定方法2中记载的方法对寡核苷酸的收量进行测定，结果收量为4032μg，若换算成每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的CPG的收量，则为4114μg。将结果示于表2。
(实施例2)
实施例1的实验中，使用担载了1.02μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为90×10-6的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。利用前述测定方法1中记载的方法对寡核苷酸的纯度进行测定，结果产物的纯度为75.0％。另外，利用前述测定方法2中记载的方法对寡核苷酸的收量进行测定，结果收量为4147μg，若换算成每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的CPG的收量，则收量为4066μg。将结果示于表2。
(参考例1)
实施例1的实验中，使用担载了1.03μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为20×10-5的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，以同样的方法得到序列(I)的核酸寡聚物。利用前述测定方法1中记载的方法对寡核苷酸的纯度进行测定，结果产物的纯度为73.8％。另外，利用前述测定方法2中记载的方法对寡核苷酸的收量进行测定，结果收量为3979μg，若换算成每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的CPG的收量，则为3863μg。将结果示于表2。
(实施例3)
使用担载了1.03μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和式(A9)、式(A10)、式(A11)、或式(A12)中示出的酰胺，利用NTS M-4MX-E(Nihon Techno Service公司制)从3’侧向5’侧自动合成序列(II)中示出的核酸寡聚物。对于自动合成的步骤而言，首先，将3％二氯乙酸甲苯溶液送液至CPG，对5’位的三苯甲基保护基进行去保护。此时，所使用的二氯乙酸溶液中的甲醛浓度能够利用测定方法3进行测定，二氯乙酸溶液中的甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为43×10-7。接着，将各种酰胺和作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑送液至CPG，与5’位的羟基进行偶联反应。接着，对包含50mM碘的氧化溶液进行送液，将亚磷酸基转化成磷酸基。接着，使用0.1M苯氧基乙酸酐乙腈溶液和10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液作为加帽溶液，在未进行偶联的反应位点实施加帽。进一步将这些工序共计反复49次后，以3％二氯乙酸甲苯溶液对5’末端的碱基中的保护基(DMTr基)进行去保护，从而在CPG载体上合成序列(II)所示的序列的核酸寡核苷酸。然后，对担载了1.03μmol分量的寡核苷酸的CPG载体流入28％氨水1.5mL和乙醇0.5mL，将混合物于40℃进行4小时保温从而使核酸寡聚物自固相载体游离，然后利用浓缩除去溶剂。接着，将游离寡核苷酸溶解于二甲基亚砜1.5mL后，加入乙腈1.0mL、硝基甲烷20μL和搅拌子后，在基于搅拌器的搅拌下于室温流入以分子筛4A实施了脱水处理的1M的四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液2.08mL，将混合物于33℃进行4小时保温从而进行2’-EMM保护基的去保护。然后，利用沉淀操作得到核酸寡聚物的产物。针对所得到的产物，利用前述测定方法1中记载的方法对寡核苷酸的纯度进行测定，结果纯度为50.8％。另外，利用前述测定方法2中记载的方法对寡核苷酸的收量进行测定，结果收量为9156μg，若换算成每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的CPG的收量，则为8889μg。将结果示于表2。
(实施例4)
实施例3的实验中，使用担载了1.05μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为90×10-6的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，以同样的方法得到序列(II)的核酸寡聚物。利用前述测定方法1中记载的方法对寡核苷酸的纯度进行测定，结果产物的纯度为47.8％。另外，利用前述测定方法2中记载的方法对寡核苷酸的收量进行测定，结果收量为9378μg，若换算成每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的CPG的收量，则为8931μg。将结果示于表2。
(参考例2)
实施例3的实验中，使用担载了1.05μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为20×10-5的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，以同样的方法得到序列(II)的核酸寡聚物。利用前述测定方法1中记载的方法对寡核苷酸的纯度进行测定，结果产物的纯度为42.8％。另外，利用前述测定方法2中记载的方法对寡核苷酸的收量进行测定，结果收量为9307μg，若换算成每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的CPG的收量，则为8864μg。将结果示于表2。
(实施例5)
使用担载了0.99μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和式(A9)、式(A10)、式(A11)、或式(A12)中示出的酰胺，利用NTS M-4MX-E(Nihon Techno Service公司制)从3’侧向5’侧自动合成序列(III)中示出的核酸寡聚物。对于自动合成的步骤而言，首先，将3％二氯乙酸甲苯溶液送液至CPG，对5’位的三苯甲基保护基进行去保护。此时，所使用的二氯乙酸溶液中的甲醛浓度能够利用测定方法3进行测定，二氯乙酸溶液中的甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为43×10-7。接着，将各种酰胺和作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑送液至CPG，与5’位的羟基进行偶联反应。接着，对包含50mM碘的氧化溶液进行送液，将亚磷酸基转化成磷酸基。接着，使用0.1M苯氧基乙酸酐乙腈溶液和10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液作为加帽溶液，在未进行偶联的反应位点实施加帽。进一步将这些工序共计反复99次后，以3％二氯乙酸甲苯溶液对5’末端的碱基中的保护基(DMTr基)进行去保护，从而在CPG载体上合成序列(III)所示的序列的核酸寡核苷酸。然后，对担载了1.03μmol分量的寡核苷酸的CPG载体流入28％氨水1.5mL和乙醇0.5mL，将混合物于40℃进行4小时保温从而使核酸寡聚物自固相载体游离，然后利用浓缩除去溶剂。接着，将游离寡核苷酸溶解于二甲基亚砜1.5mL后，加入乙腈1.0mL、硝基甲烷20μL和搅拌子后，在基于搅拌器的搅拌下于室温流入以分子筛4A实施了脱水处理的1M的四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液2.08mL，将混合物于33℃进行4小时保温从而进行2’-EMM保护基的去保护。然后，利用沉淀操作得到核酸寡聚物的产物。针对所得到的产物，利用前述测定方法1中记载的方法对寡核苷酸的纯度进行测定，结果纯度为33.1％。另外，利用前述测定方法2中记载的方法对寡核苷酸的收量进行测定，结果收量为12889μg，若换算成每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的CPG的收量，则为13019μg。将结果示于表2。
(实施例6)
实施例5的实验中，使用担载了1.04μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为90×10-6的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，以同样的方法得到序列(III)的核酸寡聚物。利用前述测定方法1中记载的方法对寡核苷酸的纯度进行测定，结果产物的纯度为29.7％。另外，利用前述测定方法2中记载的方法对寡核苷酸的收量进行测定，结果收量为13375μg，若换算成每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的CPG的收量，则为12861μg。将结果示于表2。
(参考例3)
实施例5的实验中，使用担载了0.99μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为20×10-5的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，以同样的方法得到序列(III)的核酸寡聚物。利用前述测定方法1中记载的方法对寡核苷酸的纯度进行测定，结果产物的纯度为26.4％。另外，利用前述测定方法2中记载的方法对寡核苷酸的收量进行测定，结果收量为12675μg，若换算成每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的CPG的收量，则为12803μg。将结果示于表2。
(实施例7)
向甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为25×10-5的二氯乙酸溶液30g中加入甲苯300mL，使用蒸发器于40℃对甲苯和甲醛进行共沸蒸馏，得到淡黄色油状的二氯乙酸溶液34g。利用测定方法3中记载的方法对所得到的二氯乙酸溶液中所含的甲醛进行分析，结果甲醛与二氯乙酸的摩尔比为43×10-7。
[表2]
表2
Figure BDA0003857384810000361
根据上述表2的结果，与使用参考例1、参考例2及参考例3的二氯乙酸溶液的情况相比，使用甲醛浓度为一定以下的本发明的二氯乙酸溶液的情况下，可以以高收率得到核酸寡聚物。
工业上的可利用性
本发明提供高效的核酸寡聚物的制造方法。另外，能够期待依照核酸寡聚物的制造方法制造的核酸寡聚物的收率提高。
[序列表自由文本]
序列表的序列号1～14表示依照本发明的制造方法制造的寡核苷酸的碱基序列。
Figure IDA0003857384860000011
Figure IDA0003857384860000021
Figure IDA0003857384860000031
Figure IDA0003857384860000041
Figure IDA0003857384860000051

Claims (24)

1.式(2)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括使式(1)所示的核酸寡聚物、和甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为90×10-6以下的二氯乙酸溶液进行反应的工序，
[化学式1]
Figure FDA0003857384800000011
式(1)中，
G2表示羟基的保护基，
Ba相同或彼此不同，各自独立地表示可被保护基保护的核酸碱基，
R1、R2及R3相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基，
R相同或彼此不同，各自独立地表示经保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基，
Y相同或彼此不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，
n表示1～200中的任一整数，
W1表示OZ基且X1表示R基，或者
W1表示OV基且X1表示OZ基，
V表示羟基的保护基，
Z为具有由固相载体及连接基团组成的结构的基团，
并且，n为2以上的整数时，可以在式(1)所示的核酸寡聚物的各核苷酸之间组入非核苷酸接头；
[化学式2]
Figure FDA0003857384800000021
式(2)中，
G2、Ba、R、Y、X1、W1及n与前述相同，并且
可以以式(1)中所定义的方式，在核苷酸之间组入非核苷酸接头。
2.式(2’)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括下述工序：
权利要求1所述的工序；
进一步从该工序中生成的式(2)所示的核酸寡聚物除去Z所表示的基团的工序；以及
除去羟基及核酸碱基的保护基的工序，
[化学式3]
Figure FDA0003857384800000022
式(2’)中，
Y及n与前述相同，
Bc相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
G4相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
R’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’与前述相同，
X3及W3分别各自独立地表示羟基，或者
X3表示R’基且W3表示羟基。
3.如权利要求1所述的制造方法，其还包括下述工序：
得到式(3)所示的核酸化合物的工序，所述式(3)所示的核酸化合物是将式(2)所示的核酸寡聚物利用酰胺法任意地延伸链长而成的；以及
从式(3)所示的化合物切出式(4)所示的化合物，进一步对式(4)所示的化合物进行去保护来制造式(5)所示的核酸寡聚物的工序，
[化学式4]
Figure FDA0003857384800000031
式(3)中，
G2、Ba、R、Y、X1及W1与前述相同，
G5表示下式所示的羟基的保护基、或氢原子，
[化学式5]
Figure FDA0003857384800000041
R1、R2及R3与前述相同，
m为满足m≥n的整数；
[化学式6]
Figure FDA0003857384800000042
式(4)中，
G5、R、Y及m与前述相同，
G4相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
BC相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
X2表示羟基且W2表示OV基，或者
X2表示R基且W2表示羟基，
V表示羟基的保护基；
[化学式7]
Figure FDA0003857384800000051
式(5)中，
G4、Bc、Y及m与前述相同，
R’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’与前述相同，
X3及W3分别各自独立地表示羟基，或者
X3表示R’基且W3表示羟基。
4.如权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，非核苷酸接头为包含氨基酸骨架的接头。
5.如权利要求4所述的制造方法，其中，包含氨基酸骨架的接头为具有选自由下述式(A14-1)、(A14-2)及(A14-3)组成的组中的结构的接头，
[化学式8]
Figure FDA0003857384800000061
式中，Y与前述相同。
6.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，二氯乙酸溶液包含选自由二氯甲烷、乙腈、及芳香族有机溶剂组成的组中的至少1种溶剂。
7.如权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，二氯乙酸溶液中的甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为43×10-6以下。
8.如权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，二氯乙酸溶液中的甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为22×10-6以下。
9.如权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为核糖核酸(RNA)。
10.如权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为核糖核酸(RNA)，其核糖的2’位的羟基的保护基为式(6)所示的保护基，
[化学式9]
Figure FDA0003857384800000062
式(6)中，
q表示1～5中的任一整数，
Ra及Rb相同或彼此不同，各自独立地表示甲基、乙基或氢原子，
＊标记表示与来自核糖的2’位的羟基的氧原子的键合位点，并且
EW表示吸电子基团。
11.如权利要求10所述的制造方法，其中，Ra及Rb同时为氢原子且EW为氰基。
12.如权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为40链长以上的寡聚物。
13.如权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为50链长以上的寡聚物。
14.如权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为60链长以上的寡聚物。
15.如权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为80链长以上的寡聚物。
16.如权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为100链长以上的寡聚物。
17.二氯乙酸溶液，其中，甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为90×10-6以下。
18.如权利要求17所述的二氯乙酸溶液，其中，甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为43×10-6以下。
19.如权利要求17所述的二氯乙酸溶液，其中，甲醛与二氯乙酸的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为22×10-6以下。
20.如权利要求17～19中任一项所述的二氯乙酸溶液的制造方法，其包括下述工序：
通过从包含含甲醛的未纯化二氯乙酸溶液、和与甲醛共沸的溶剂的溶液中共沸蒸馏去除甲醛，从而得到纯化二氯乙酸溶液。
21.如权利要求20所述的制造方法，其中，共沸溶剂的沸点为194℃以下。
22.如权利要求20或21所述的制造方法，其中，共沸溶剂为二氯甲烷、乙腈或芳香族有机溶剂。
23.如权利要求22所述的制造方法，其中，芳香族有机溶剂为甲苯。
24.核酸寡聚物的制造方法，其包括权利要求20所述的二氯乙酸溶液的纯化工序、及使用该工序中得到的纯化二氯乙酸溶液的权利要求1～3中任一项所述的工序。
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MICHAEL SEPTAK: "Kinetic studies on depurination and detritylation of CPG-bound intermediates during oligonucleotide synthesis", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》, vol. 24, no. 15, 31 December 1996 (1996-12-31), pages 3053 - 3058, XP055784527, DOI: 10.1093/nar/24.15.3053 *
SOHEIL POURSHAHIAN: "THERAPEUTIC OLIGONUCLEOTIDES, IMPURITIES, DEGRADANTS, AND THEIR CHARACTERIZATION BY MASS SPECTROMETRY", 《MASS SPECTROMETRY REVIEWS》, vol. 40, 16 December 2019 (2019-12-16), pages 75 *

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