CN109072224B - 人工单导rna及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：具有与天然型sgRNA同等或不低于天然型sgRNA的活性、且提高了在生物体内的稳定性的新型人工sgRNA、以及组合了该人工sgRNA和Cas9的有效的CRISPR/Cas9系统。即使将sgRNA中的、用于连接crRNA的3'末端和tracrRNA的5'末端而单链化的核苷酸连接子部分置换为氨基酸衍生物连接子，利用在体外的DNA切断法也可保持与原本的sgRNA同等以上的活性。进而，即使将存在于tracrRNA的茎‑环1与茎‑环2之间的连接子区域和/或茎‑环2的环部分置换为氨基酸衍生物连接子，或者在sgRNA的5’末端和/或3’末端附近添加/插入氨基酸衍生物连接子，也可保持与原本的sgRNA同等以上的活性。通过将1个以上的氨基酸衍生物连接子导入sgRNA中，从而能够提高在生物体内的稳定性。

Description

人工单导RNA及其用途
技术领域
本发明涉及具有与天然型同等或高于天然型的活性且在生物体内稳定性提高了的人工单导RNA(以下也称为“sgRNA”。)、组合了该人工sgRNA和CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9：Cas9)的CRISPR/Cas9系统、及其用途。
背景技术
规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR：clustered regularly interspacedshort palindromic repeats)是存在于细菌中的数十个碱基对的短的重复序列，其参与针对噬菌体、质粒等的外源DNA的获得性免疫机制。CRISPR上游的Cas基因组中的1个识别外源DNA中的被称为前间区序列邻近基序(PAM：proto-spacer adjacent motif)的特定的短序列，并切取其上游数十个碱基对，插入至CRISPR区域。插入的靶序列与重复序列一起作为一系列的CRISPRRNA(crRNA)前体被转录后，通过与crRNA部分互补的反式激活crRNA(trans-activating crRNA：tracrRNA)的作用，重复序列被切断，从而成为成熟crRNA，然后与tracrRNA、作为Cas基因组之一且是双链切断核酸内切酶的Cas9一起形成复合体。该复合体识别外源DNA中的PAM序列并与和该PAM序列相邻的靶序列结合，Cas9切断除去外源DNA。将该一系列的机构称为CRISPR/Cas9系统。
Figure GDA0001817942680000011
(n分别独立地为A、G、C或U，(n)20表示crRNA的引导区域。)
虽然tracrRNA是crRNA的成熟、以及介由与crRNA形成的发夹结构与Cas9形成复合体所必须的，但若使crRNA的3’末端和tracrRNA的5’末端短链化，通过核苷酸连接子制作单链的单导RNA(sgRNA)，则仅通过Cas9和sgRNA这2者即可进行基因组编集。源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(SpCas9)识别NGG作为PAM，因此若在3’侧存在GG，则仅通过将sgRNA的5’末端侧约20碱基置换为期望的靶序列就能够在靶部位切断任意的双链DNA(double-stranded DNA break；DSB)。sgRNA以使用体外转录体系、重组细胞生成的天然型RNA的形态，或以编码sgRNA的DNA的形态与Cas9 mRNA或蛋白质、或编码Cas9的DNA一起导入细胞中。导入细胞内(表达)的sgRNA与Cas9蛋白质形成复合体，与靶序列结合而使靶基因产生DSB。该DSB通过非相同的末端结合(NHEJ)而修复，但靶基因被此时所产生的偶发性的碱基的插入/缺失(indel)导致的移码突变所破坏。另外，通过一起导入在两端具有与靶相同的序列的供体DNA，从而发生相同重组修复，能够进行碱基修饰、基因插入。
然而，DSB伴随由脱靶切断导致的预料不到的基因组修饰，因此存在如下问题：有较强的细胞毒性、染色体移位等的副作用，生存细胞数极少、或在单细胞微生物的情况下，原本就难以进行基因突变。编码sgRNA、Cas9的DNA表达载体的使用，由于伴随sgRNA和Cas9的持续性表达，因而使脱靶切断的问题进一步扩大，另外，还存在将表达载体组入染色体所导致的基因干扰的风险。通过将sgRNA以RNA的形态导入、且将Cas9以mRNA或蛋白质的形态导入，从而能够避免或降低上述问题，但天然型(非修饰)RNA在生物体内是不稳定的，因此存在在体内的基因组编集效率降低的问题。
为了提高核酸酶耐性并改善生物体内稳定性，或出于提高细胞内传递性的目的，使用经修饰的核苷酸来化学合成siRNA、反义RNA分子的技术是公知的，但使用了经化学修饰的sgRNA的基因组编集的报道是极其有限的。Hendel等人(非专利文献1)报道了：修饰了5’和3’末端的核苷酸的核糖的2’位和磷酸二酯键的化学修饰sgRNA显著提高了人初代培养细胞中的基因组编集效率，但完全没有有关sgRNA的内部核苷酸的化学修饰的报道。
然而，出于改善在生物体内的稳定性、减轻由自然免疫应答亢进带来的副作用的目的，开发出了用各种连接子连接siRNA、microRNA等双链核酸的末端的、可以得到1个或2个发夹型部分二维结构的单链核酸分子(例如，参照专利文献1-6)。然而，完全没有有关将该连接子用于具有较复杂的二维结构的sgRNA这样的报道，也完全无法预料到与Cas9形成复合体、进而对基因组编集效率产生的影响。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2012/017919号
专利文献2：国际公开第2013/103146号
专利文献3：国际公开第2012/005368号
专利文献4：国际公开第2013/077446号
专利文献5：国际公开第2013/133393号
专利文献6：国际公开第2013/180038号
非专利文献
非专利文献1：Hendel et al.,Nat.Biotechnol.,33(9):985-989(2015)
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，在利用了CRISPR/Cas9系统的基因组编集中，以RNA的形态导入sgRNA具有一定的优点，相反却存在如下问题：天然型RNA在生物体内是不稳定的，而且在重组、基于体外转录进行制造时需要制备载体、模板DNA，且培养、酶反应、RNA纯化需要花费时间和劳力。另一方面，使用了化学修饰RNA的情况，可以说在基因组编集效率、特别是通过相同重组进行的基因插入突变的导入效率方面并不令人满意。
因此，本发明的目的在于提供具有与天然型RNA同等或不低于天然型RNA的活性且提高了在生物体内的稳定性的新型人工sgRNA，通过组合该人工sgRNA和Cas9，从而提供更有效的CRISPR/Cas9系统。
用于解决问题的方案
本发明人等发现：即使将sgRNA中的、用于连接crRNA的3’末端和tracrRNA的5’末端而单链化的核苷酸连接子(对应于SpCas9的sgRNA(下式)中5’-GAAA-3’的四核苷酸环(可列举出Nishimasu et al.,Cell,156:935-949(参照2014)))部分置换为氨基酸衍生物连接子，利用在体外(无细胞系或细胞内)的DNA切断法也可保持与原本的sgRNA同等或高于sgRNA的活性。进而还发现：即使将存在于tracrRNA的茎-环1与茎-环2之间的连接子区域和/或茎-环2的环部分置换为氨基酸衍生物连接子，或在sgRNA的5’末端和/或3’末端附近(下式箭头)添加/插入氨基酸衍生物连接子，至少在无细胞系中也可保持与原本的sgRNA同等或高于sgRNA的活性。另外，即使作为将茎-环1或茎-环3的环部分置换为氨基酸衍生物连接子、或将四核苷酸环及后续的茎部分和/或茎-环2部分置换为氨基酸衍生物连接子的短链化sgRNA，至少在无细胞系中，虽然比原本的sgRNA低但也保持了充分的活性。
特别意义深刻的发现是：作为不仅四核苷酸环部分而且茎-环2的环部分也置换为氨基酸衍生物连接子的、在两处导入了连接子的sgRNA，具有与原本的sgRNA同等或高于原本的sgRNA的细胞内的DNA切断活性。原因在于这样的人工sgRNA的在生物体内的稳定性改善效果更大。
Figure GDA0001817942680000041
(n分别独立地为A、G、C或U，(n)20表示crRNA的引导区域。)
由此，本发明人等成功地通过在sgRNA中导入1个以上的氨基酸衍生物连接子，从而在保持sgRNA的活性(通过与Cas9的组合的靶双链DNA切断活性)的情况下可使sgRNA的生物体内稳定性提高，以至完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种单导RNA(single guide RNA)，其是(1)或(2)的单导RNA，
(1)由下式(A)表示的单导RNA：
Figure GDA0001817942680000051
[式(A)中，Xa是由下式(I)表示的氨基酸衍生物连接子：
Figure GDA0001817942680000052
(式(I)中，
X1和X2分别独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2分别独立地为单键、CH2、NH、O或S；
L1是具有n个碳原子的亚烷基链，亚烷基碳原子上的氢原子任选被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代或未被取代，或
L1是前述亚烷基链上的一个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链，
其中，Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
L2是具有m个碳原子的亚烷基链，亚烷基碳原子上的氢原子任选被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代或未被取代，或
L2是前述亚烷基链上的一个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链，
其中，Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地为取代基或保护基团；
m为0～30的整数；
n为0～30的整数；
R1和R2任选存在或不存在，R1和R2存在时，R1和R2分别独立地为核苷酸残基或前述式(I)的结构，
A为任意的原子团，其中，下式(Ia)为氨基酸或肽。)，
Figure GDA0001817942680000061
前述Xa借助前述-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合，
式(A)中，Xb和Y分别独立地为1个至5个任意的核苷酸连接子，或是由上述式(I)表示的氨基酸衍生物连接子，
前述Xb和Y分别独立地借助前述-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合，
式(A)中，Xc和Xd任选存在或不存在，Xc和Xd存在时，分别独立地为由前述式(I)表示的氨基酸衍生物连接子，
前述Xc和Xd分别独立地借助前述-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合，
式(A)中，(n)20各自独立地是由作为A、G、C或U的20±5个核苷酸残基构成的核苷酸序列。]；
(2)在前述式(A)中、(n)20除外的区域置换、缺失、插入或添加有1个至几个核苷酸残基并且与Cas9蛋白质形成复合体而具有识别包含与前述(n)20互补的靶核苷酸序列的双链DNA的活性的、单导RNA。
[2]根据[1]所述的单导RNA，其中，前述式(Ia)的氨基酸或构成肽的氨基酸是任选具有取代基或保护基团的、选自由甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟基赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷、氨基苯甲酸、氨基吡啶羧酸和由下述化学式(Ia2)表示的氨基酸组成的组中的至少1种，
Figure GDA0001817942680000071
(式(Ia2)中，R100为任意的取代基，任选存在或不存在，R100存在时，任选是1个或多个，是多个时任选彼此相同或不同。
[3]根据[1]或[2]所述的单导RNA，其中，前述Xa由下式(I-1)～(I-7)中的任一者表示，
Figure GDA0001817942680000081
(各式中，n和m分别独立地为0～30的整数。)。
[4]根据[3]所述的单导RNA，其中，前述Xa由前述式(I-4)或(I-7)表示，且该式中，n＝5和m＝4。
[5]根据[3]所述的单导RNA，其中，前述Xa由前述式(I-1)表示，且该式中，n＝5和m＝4，或由前述式(I-6)表示，且该式中，n＝4和m＝4。
[6]根据[1]或[2]所述的单导RNA，其中，前述Xa由下式(II)表示：
Figure GDA0001817942680000091
(式(II)中，
X1和X2分别独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2分别独立地为单键、CH2、NH、O或S；
R3是键合至环A上C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基；
L1是由n个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子任选被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代或未被取代，或
L1是前述亚烷基链上的一个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链，
其中，Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
L2是由m个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子任选被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代或未被取代，或
L2是前述亚烷基链上的一个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链，
其中，Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地为取代基或保护基团；
l为1或2；
m为0～30的整数；
n为0～30的整数；
在环A上，前述环A上的C-2除外的1个碳原子任选被氮、氧或硫取代，
还任选在前述环A内包含碳-碳双键或碳-氮双键，
R1和R2任选存在或不存在，R1和R2存在时，R1和R2分别独立地为核苷酸残基或前述式(II)的结构，
前述Xa借助-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合。)
[7]根据[6]所述的单导RNA，其中，前述Xa由下式(II-1)～(II-9)中的任一者表示：
Figure GDA0001817942680000101
(各式中，n和m分别独立地为0～30的整数、q为0～10的整数。)。
[8]根据[7]所述的单导RNA，其中，前述Xa由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4、n＝7和m＝6、n＝9和m＝8、或n＝11和m＝10。
[9]根据[1]或[2]所述的单导RNA，其中，前述Xa由下式(III-1)～(III-3)中的任一者表示：
Figure GDA0001817942680000111
(各式中，n和m分别独立地为0～30的整数。)。
[10]根据[9]所述的单导RNA，其中，前述各式中，n＝5和m＝4。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的单导RNA，其中，前述Xb和Y分别独立地为1个至5个任意的核苷酸连接子。
[12]根据[11]所述的单导RNA，其中，前述Xc和Xd不存在。
[13]根据[11]所述的单导RNA，其中，前述Xc和Xd分别独立地是由前述式(I)表示的氨基酸衍生物连接子。
[14]根据[13]所述的单导RNA，其中，前述Xc和Xd是由前述式(II)表示的氨基酸衍生物连接子。
[15]根据[14]所述的单导RNA，其中，前述Xc和Xd由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4。
[16]根据[13]所述的单导RNA，其中，前述Xc和Xd由前述式(I-1)、(I-4)、(I-7)和(III-1)～(III-3)中的任一者表示，且该式中，n＝5和m＝4，或由前述式(I-6)表示，且该式中，n＝4和m＝4。
[17]根据[1]～[10]中任一项所述的单导RNA，其中，前述Xb是由前述式(I)表示的氨基酸衍生物连接子。
[18]根据[17]所述的单导RNA，其中，前述Xb是由前述式(II)表示的氨基酸衍生物连接子。
[19]根据[18]所述的单导RNA，其中，前述Xb由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4。
[20]根据[17]所述的单导RNA，其中，前述Xb由前述式(I-1)、(I-4)、(I-7)和(III-1)～(III-3)中的任一者表示，且该式中，n＝5和m＝4，或由前述式(I-6)表示，且该式中，n＝4和m＝4。
[21]根据[17]～[20]中任一项所述的单导RNA，其中，前述Y是1个至5个任意的核苷酸连接子。
[22]根据[17]～[20]中任一项所述的单导RNA，其中，前述Y是由前述式(I)表示的氨基酸衍生物连接子。
[23]根据[22]所述的单导RNA，其中，前述Y是由前述式(I-4)表示，且该式中，n＝5和m＝4。
[24]根据[22]所述的单导RNA，其中，前述Y是由前述式(II)表示的氨基酸衍生物连接子。
[25]根据[24]所述的单导RNA，其中，前述Y由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4、n＝7和m＝6、n＝9和m＝8、或n＝11和m＝10。
[26]根据[22]所述的单导RNA，其中，前述Y由前述式(I-1)、(I-7)和(III-1)～(III-3)中的任一者表示，且该式中，n＝5和m＝4，或由前述式(I-6)表示，且该式中，n＝4和m＝4。
[27]根据[7]所述的单导RNA，其中，前述Xa由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4，且与前述Xa相邻的茎的1～3碱基对缺失。
[28]根据[19]所述的单导RNA，其中，与前述Xb相邻的茎的1～4碱基对缺失。
[29]根据[28]所述的单导RNA，其中，前述Xa由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4，且与前述Xa相邻的茎的1～3碱基对缺失。
[30]一种单导RNA，其由前述式(A)表示，且该式中，Xa、Xb和Y是1个至5个任意的核苷酸连接子，Xc和Xd不存在，茎-环1的环部分(UA)或茎-环3的环部分(AGU)被由前述式(II-8)表示且该式中、n＝5和m＝4的氨基酸衍生物连接子置换。
[31]一种CRISPR/Cas9系统，其是组合[1]～[30]中任一项所述的单导RNA和Cas9组合而成的。
[32]根据[31]所述的CRISPR/Cas9系统，其中，Cas9源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
[33]根据[31]或[32]所述的CRISPR/Cas9系统，其中，Cas9是蛋白质的形态、编码该Cas9的mRNA的形态、或包含编码该Cas9的DNA的表达载体的形态。
[34]一种双链DNA的识别方法，其包括使[31]～[33]中任一项所述的CRISPR/Cas9系统与靶双链DNA接触。
[35]根据[34]所述的方法，其中，Cas9蛋白质具有双链DNA切断活性。
[36]根据[35]所述的方法，其中，前述双链DNA的切断在细胞内进行。
[37]根据[36]所述的方法，其用于敲除靶基因。
[38]根据[36]所述的方法，其用于突变靶基因内的碱基、或用于在该基因内插入外源性基因。
[39]一种单体，其是核酸分子合成用的单体，由下述式(IV-1)～(IV-3)中的任一者表示：
Figure GDA0001817942680000141
(各式中，R11和R21分别独立地为氢原子、保护基团或磷酸保护基团，n和m分别独立地为0～30的整数。)。
[40]根据[39]所述的单体，其中，前述各式中，n＝5和m＝4。
[41]一种核酸分子的制造方法，其特征在于，使用[39]或[40]所述的单体。
[42]根据[41]所述的方法，其中，前述核酸分子是[1]～[26]中任一项所述的单导RNA。
[43]一种[39]或[40]所述的单体在制造核酸分子中的应用。
[44]根据[43]所述的应用，其中，前述核酸分子是[1]～[26]中任一项所述的单导RNA。
发明的效果
根据本发明的人工sgRNA，能够容易地以低成本来合成，且能够在不损害靶双链DNA的切断活性的前提下提高sgRNA的生物体内稳定性，因此能够改善基因组编集效率、特别是在体内的基因组编集效率。
附图说明
图1是示出以KRAS基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图2是示出以BCL-2基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图3是示出以KRAS基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图4是示出以KRAS基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图5是示出以KRAS基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图6是示出以KRAS基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图7是将以KRAS基因为靶向的人工sgRNA在体外的切断活性与天然型sgRNA进行比较的图。
图8是示出以BCL-2基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图9是示出以BCL-2基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图10是示出以BRAF基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图11是示出以BRAF基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性的图。
图12是示出以BCL-2基因为靶向的sgRNA在细胞内的切断活性的图。
图13是将以BCL-2基因为靶向的人工sgRNA在细胞内的切断活性与天然型sgRNA进行比较的图。
图14是示出以BRAF基因为靶向的sgRNA在细胞内的切断活性的图。
图15是将以BRAF基因为靶向的人工sgRNA在细胞内的切断活性与天然型sgRNA进行比较的图。
具体实施方式
1.人工sgRNA
本发明提供：经化学修饰的sgRNA(本说明书中也称为“本发明的人工sgRNA”。)，其中，源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的crRNA和tracrRNA由下述式所示：
Figure GDA0001817942680000161
(n分别独立地为A、G、C或U，(n)20表示crRNA的引导区域。)
在使所述crRNA和tracrRNA嵌合化(短链化和单链化)而成的下述单导RNA(天然型sgRNA)中，
Figure GDA0001817942680000162
至少在其内部序列中包含1个以上的氨基酸衍生物连接子。
如上所述，本发明的作为人工sgRNA的基础的天然型sgRNA(原本sgRNA本身是人工RNA，但在本说明书中是指仅由“天然型(即，非修饰)核苷酸”构成的sgRNA，称为天然型sgRNA。)在5’末端包含与靶核苷酸序列互补的引导区域((n)20)，在其下游使源自crRNA的重复区域与源自tracrRNA的反义重复区域借助由4核苷酸(GAAA)构成的四核苷酸环而连接，形成了茎-环结构。进而，在反义重复区域的下游包含源自tracrRNA的3个茎-环结构、并且在茎-环1与茎-环2之间具有由5核苷酸(UUAUC)构成的连接子区域。
引导区域的核苷酸序列((n)20)的长度只要足以使sgRNA与靶核苷酸序列特异性地结合即可，例如，在哺乳动物的基因组DNA中的特定的部位导入突变的情况，根据该基因组大小，为12核苷酸以上、优选为15核苷酸以上、更优选为17核苷酸以上。长度的上限没有特别限制，优选为25核苷酸以下、更优选为22核苷酸以下。更具体而言，引导区域的核苷酸长度为20±5核苷酸、优选为17～22核苷酸、特别是优选为20核苷酸。
具体而言，本发明的人工sgRNA的特征在于，其天然型sgRNA的四核苷酸环部分至少被氨基酸衍生物连接子(Xa)置换。即，本发明的人工sgRNA是由下式(A)表示的单导RNA或(2)的单导RNA：
Figure GDA0001817942680000171
[式(A)中，Xa是由下式(I)表示的氨基酸衍生物连接子：
Figure GDA0001817942680000172
(式(I)中，
X1和X2分别独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2分别独立地为单键、CH2、NH、O或S；
L1是具有n个碳原子的亚烷基链，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代或未被取代，或
L1是前述亚烷基链上的一个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链，
其中，Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
L2是具有m个碳原子的亚烷基链，亚烷基碳原子上的氢原子任选被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代或未被取代，或
L2是前述亚烷基链上的一个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链，
其中，Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地为取代基或保护基团；
m为0～30的整数；
n为0～30的整数；
R1和R2任选存在或不存在，R1和R2存在时，R1和R2分别独立地为核苷酸残基或前述式(I)的结构，
A为任意的原子团，其中，下式(Ia)为氨基酸或肽。)，
Figure GDA0001817942680000181
前述Xa借助前述-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合，
式(A)中，Xb和Y分别独立地为1个至5个任意的核苷酸连接子，或是由上述式(I)表示的氨基酸衍生物连接子，
前述Xb和Y分别独立地借助前述-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合，
式(A)中，Xc和Xd任选存在或不存在，Xc和Xd存在时，分别独立地为前述式(I)表示的氨基酸衍生物连接子，
前述Xc和Xd分别独立地借助前述-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合，
式(A)中，(n)20各自独立地是由作为A、G、C或U的20±5个核苷酸残基构成的核苷酸序列。]
(2)在前述式(A)中、(n)20除外的区域置换、缺失、插入或添加有1个至几个核苷酸残基并且与Cas9蛋白质形成复合体而具有切断与前述(n)20互补的靶核苷酸序列的双链DNA的活性。
前述式(I)中，X1和X2例如分别独立地为H2、O、S或NH。前述式(I)中，X1为H2是指：X1与X1所结合的碳原子一起形成CH2(亚甲基)。对于X2同样适用。
前述式(I)中，Y1和Y2分别独立地为单键、CH2、NH、O或S。
前述式(I)中，L1是具有n个碳原子的亚烷基链。前述亚烷基碳原子上的氢原子例如任选被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代或未被取代。或者，L1任选是前述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链。前述聚醚链例如为聚乙二醇。需要说明的是，Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如Y1为O时，该氧原子与L1的氧原子不相邻，OR1的氧原子与L1的氧原子不相邻。
前述式(I)中，L2是具有m个碳原子的亚烷基链。前述亚烷基碳原子上的氢原子例如任选被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代或未被取代。或者，L2任选是前述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链。需要说明的是，Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如，Y2为O时，该氧原子与L2的氧原子不相邻，OR2的氧原子与L2的氧原子不相邻。
L1的n和L2的m没有特别限制，各自的下限例如为0，上限也没有特别限制。n和m可根据前述连接子区域(Lx)所期望长度适宜设定。从制造成本和收率等观点出发，n和m各自优选0～30、更优选为0～20、进一步优选为0～15。n和m任选相同(n＝m)或不同。n+m为例如0～30、优选为0～20、更优选为0～15。
Ra、Rb、Rc和Rd例如分别独立地为取代基或保护基团，任选相同或不同。前述取代基例如可列举出：羟基、羧基、磺基、卤素、卤代烷基(卤代烷基例如：CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亚硝基、氰基、烷基(例：甲基、乙基、异丙基、叔丁基)、烯基(例：乙烯基)、炔基(例：乙炔基)、环烷基(例：环丙基、金刚烷基)、环烷基烷基(例：环己基甲基、金刚烷基甲基)、环烯基(例：环丙烯基)、环基、羟基烷基(例：羟基甲基、羟基乙基)、烷氧基烷基(例：甲氧基甲基、乙氧基甲基、乙氧基乙基)、芳基(例：苯基、萘基)、芳基烷基(例：苄基、苯乙基)、烷基芳基(例：对甲基苯基)、杂芳基(例：吡啶基、呋喃基)、杂芳基烷基(例：吡啶基甲基)、杂环基(例：哌啶基)、杂环基烯基、杂环基烷基(例：吗啉基甲基)、烷氧基(例：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤代烷氧基(例：OCF3)、烯氧基(例：乙烯基氧基、烯丙基氧基)、芳基氧基(例：苯基氧基)、烷基氧基羰基(例：甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基)、芳基烷基氧基(例：苄基氧基)、氨基[烷基氨基(例：甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基)、酰基氨基(例：乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳基烷基氨基(例：苄基氨基、三苯甲基氨基)、羟基氨基]、氨基烷基(例：氨基甲基)、烷基氨基烷基(例：二乙基氨基甲基)、氨基甲酰基、氨基磺酰基、氧基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基等。这些取代基任选被一种或多种进一步的取代基或进一步的保护基团取代。前述进一步的取代基没有特别限定，例如可以是上述例示的取代基。前述进一步的保护基团没有特别限定，例如可以是下述例示的保护基团。以下是同样的。
前述保护基团(或前述进一步的保护基团)例如是使高反应性官能团转变为失活的官能团，可列举出公知的保护基团等。前述保护基团可以援用例如文献(J.F.W.McOmie,“Protecting Groups in Organic Chemistry”Prenum Press,London and New York,1973)中的记载。前述保护基团没有特别限制，例如可列举出：叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙基氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)和甲苯磺酰基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。R3为OR4时，前述保护基团没有特别限制，例如可列举出：TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基等。此外，可列举出下式(P1)和(P2)的含甲硅烷基的基团，其中，优选为DMtr基和含前述甲硅烷基的基团中的任一者。
Figure GDA0001817942680000211
前述式(I)中，氢原子例如分别独立地可以由Cl、Br、F和I等卤素取代。
前述Xa借助-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合。此处，R1和R2任选存在或不存在。R1和R2存在时，R1和R2分别独立地为核苷酸残基或前述式(I)的结构。R1和/或R2为前述式(I)的结构时，Xa成为2个以上的由前述式(I)的结构构成的氨基酸衍生物残基连接而成的结构。前述式(I)的结构例如可以包含1个、2个、3个或4个。由此，包含多个前述结构时，前述(I)的结构例如可以直接连接，或还可以借助前述核苷酸残基结合。
相邻的核苷酸残基、与-OR1-和-OR2-的结合的组合没有特别限制，例如可列举出以下任意的条件。
条件(1)
相邻的核苷酸残基的3’末端借助-OR2-、并且相邻的核苷酸残基的5’末端借助-OR1-、与前述式(I)的结构结合。
条件(2)
相邻的核苷酸残基的3’末端借助-OR1-、并且相邻的核苷酸残基的5’末端借助-OR2-、与前述式(I)的结构结合。
前述式(I)中，原子团A只要为下式(Ia)所示的氨基酸或肽就没有特别限制。
Figure GDA0001817942680000212
例如，前述(I)或(Ia)中的原子团A例如任选包含或不包含选自由链式原子团、脂环式原子团和芳香族性原子团组成的组中的至少一种。前述链式原子团没有特别限定，例如可列举出：烷基、烯基、炔基、卤代烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基等。前述脂环式原子团没有特别限定，例如可列举出：环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基等。前述芳香族性原子团没有特别限定，例如可列举出：芳基、芳基烷基、烷基芳基、稠环芳基、稠环芳基烷基、稠环烷基芳基等。另外，前述式(I)或(Ia)中的原子团A中，前述各原子团进而任选具有或不具有取代基或保护基团。前述取代基或保护基团为多个时任选相同或不同。作为前述取代基，例如可列举出：前述Ra、Rb、Rc和Rd所示例的取代基，更具体而言，例如可列举出：卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨基磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。前述保护基团例如与前述Ra、Rb、Rc和Rd所示例的保护基团同样。
本发明中，“氨基酸”是指在分子中分别包含一个以上氨基和一个以上羧基的任意有机化合物。另外，“肽”是指2分子以上的氨基酸经肽键结合而成的结构的有机化合物。前述肽键可以是酰胺结构、也可以是酰亚胺结构。另外，前述式(Ia)表示的氨基酸分子中存在多个氨基时，前述式(Ia)中明示的氨基还可以是任意的氨基。另外，在前述式(Ia)表示的氨基酸分子中存在多个羧基时，前述式(Ia)中明示的羧基还可以是任意的羧基。
本发明的人工sgRNA的前述连接子区域(Xa)中，前述氨基酸可以是天然氨基酸、还可以是人工氨基酸。需要说明的是，“天然氨基酸”是指具有天然存在结构的氨基酸或其光学异构体。前述天然氨基酸的制造方法不特别限定，例如其可从天然提取或可合成。此外，在本发明中，“人工氨基酸”是指具有天然不存在结构的氨基酸。即，前述人工氨基酸为氨基酸即含有氨基的羧酸衍生物(分子中分别含有一个以上氨基和一个以上羧基的有机化合物)且具有天然不存在的结构。前述人工氨基酸优选不含有例如杂环。前述氨基酸可以是构成例如蛋白质的氨基酸。前述氨基酸可以是例如选自由甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、4-羟脯氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷、氨基苯甲酸、氨基吡啶羧酸和由下列化学式(Ia2)表示的氨基酸组成的组的至少一种氨基酸，并且可进一步具有或可不进一步具有取代基或保护基团。前述取代基例如可列举出：前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的取代基。更具体地，例如可列举出：卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨基磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。前述保护基团与例如前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的保护基团相同。当前述化学式(Ia)的氨基酸或肽存在有异构体如光学异构体、几何异构体和立体异构体等，可使用任何异构体。
Figure GDA0001817942680000231
前述化学式(Ia2)中，
R100为任意取代基，其可存在或可不存在，且当R100存在时，其可单独存在1个或多个存在，且当R100多个存在时，它们可彼此相同或不同。前述R100的任意取代基例如可列举出：前述Ra、Rb、Rc或Rd所列举的取代基。更具体地，例如可列举出：卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨基磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。另外，前述化学式(Ia2)的结构可以是例如下列化学式(Ia3)。
Figure GDA0001817942680000241
需要说明的是，当前述化学式(Ia)的结构为前述化学式(Ia2)时，前述化学式(I)中的原子团A的结构由下列化学式(A2)表示。下列化学式(A2)中的R100与前述化学式(Ia2)中的R100相同。另外，当前述化学式(Ia)的结构为前述化学式(Ia3)时，前述化学式(I)中的原子团A的结构由下列化学式(A2a)表示。
Figure GDA0001817942680000242
前述化学式(I)的结构例如可以示例出下述化学式(I-1)～(I-7)，下述化学式(I-1)～(I-7)中，n和m与前述化学式(I)中的相同。
Figure GDA0001817942680000251
前述化学式(I-1)～(I-7)中，n和m没有特别限制，如前所述。作为具体例，可列举出：前述化学式(I-1)中n＝11和m＝12、或n＝5和m＝4(下述实施例的Gly)、前述化学式(I-4)中n＝5和m＝4(下述实施例的GlyGly)、前述化学式(I-6)中，n＝4和m＝4(下述实施例的TP)、及前述化学式(1-7)中n＝5和m＝4(下述实施例的K)。这些结构由下述化学式(I-1a)、(I-1b)、(I-4a)、(I-6a)和(I-7a)表示。其中，优选式(I-1b)、(I-6a)和(I-7a)。
Figure GDA0001817942680000261
或者，本发明的人工sgRNA中，前述连接子区域(Xa)由下述式(II)表示。
Figure GDA0001817942680000262
前述式(II)中，
X1和X2分别独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2分别独立地为单键、CH2、NH、O或S；
R3是键合至环A上C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基，
L1是由n个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子任选被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代或未被取代，或
L1是前述亚烷基链上的一个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链，
其中，Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
L2是由m个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子任选被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代或未被取代，或
L2是前述亚烷基链上的一个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链，
其中，Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地为取代基或保护基团；
l为1或2；
m为0～30的整数；
n为0～30的整数；
环A的前述环A上的C-2除外的1个碳原子任选被氮、氧、硫取代，
在前述环A内还任选包含碳-碳双键或碳-氮双键，
R1和R2任选存在或不存在，R1和R2存在时，R1和R2分别独立地为核苷酸残基或前述式(II)的结构，
前述Xa借助前述-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合。
前述式(II)中，X1和X2例如分别独立地为H2、O、S或NH。前述式(II)中，X1为H2是指：X1与X1所结合的碳原子一起形成CH2(亚甲基)。对于X2同样适用。
前述式(II)中，Y1和Y2分别独立地为单键、CH2、NH、O或S。
前述式(II)中，L1是由n个原子构成的亚烷基链。前述亚烷基碳原子上的氢原子例如任选被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代或未被取代。或者，L1任选是前述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链。前述聚醚链例如为聚乙二醇。需要说明的是，Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如Y1为O时，该氧原子与L1的氧原子不相邻，OR1的氧原子与L1的氧原子不相邻。
前述式(II)中，L2是由m个原子构成的亚烷基链。前述亚烷基碳原子上的氢原子例如任选被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代或未被取代。或者，L2任选是前述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而成的聚醚链。需要说明的是，Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如，Y2为O时，该氧原子与L2的氧原子不相邻，OR2的氧原子与L2的氧原子不相邻。
L1的n和L2的m没有特别限制，各自的下限例如为0，上限也没有特别限制。n和m例如任选根据前述非核苷酸结构的期望的长度适宜设定。从制造成本和产量等的观点，n和m例如各自优选0～30、更优选为0～20、进一步优选为0～15。n和m任选相同(n＝m)或不同。n+m为例如0～30、优选为0～20、更优选为0～15。
Ra、Rb、Rc和Rd例如分别独立地为取代基或保护基团。前述取代基和前述保护基团例如与前述同样。
前述式(II)中，氢原子例如分别独立地任选由Cl、Br、F和I等卤素取代。
前述Xa借助-OR1-或-OR2-与相邻的核苷酸残基结合。此处，R1和R2任选存在还可以不存在。R1和R2存在时，R1和R2分别独立地为核苷酸残基或前述式(II)的结构。R1和/或R2为前述式(II)的结构时，Xa成为2个以上的由前述式(II)的结构构成的氨基酸衍生物残基连接而成的结构。前述式(II)的结构例如可以是1个、2个、3个或4个。由此，包含多个前述结构时，前述(II)的结构例如可以直接连接，或还可以借助前述核苷酸残基结合。
相邻的核苷酸残基与-OR1-和-OR2-的结合的组合没有特别限制，例如可列举出以下任意的条件。
条件(1)
相邻的核苷酸残基的3’末端借助-OR2-、且相邻的核苷酸残基的5’末端借助-OR1-、与前述式(II)的结构结合。
条件(2)
相邻的核苷酸残基的3’末端借助-OR1-、且相邻的核苷酸残基的5’末端借助-OR2-、与前述式(II)的结构结合。
前述式(II)中，环A中，l为1或2。l＝1时，环A为5元环，例如可列举出前述吡咯烷骨架。前述吡咯烷骨架例如可列举出：脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等，可以示例出它们的二价结构。l＝2时，环A为6元环，例如可列举出前述哌啶骨架。环A的环A上的C-2除外的1个碳原子可以被氮、氧或硫取代。另外，在环A中，在环A内可以包含碳-碳双键或碳-氮双键。环A例如可以是例如L型或D型。
前述式(II)中，R3是键合至环A上C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基。R3为前述取代基时，取代基R3可以是一个或多个，或可以不存在。R3以多个存在时，它们可以相同的或不同。
取代基R3例如是卤素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4或氧基(＝O)等。
R4和R5例如分别独立地为取代基或保护基团，任选相同或不同。前述取代基例如可列举出：卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基等。以下同样适用。取代基R3还可以是上述列举的取代基。
前述保护基团例如是使高反应性官能团变为失活的官能团，可列举出公知的保护基团等。前述保护基团可以援用例如文献(J.F.W.McOmie,“Protecting Groups inOrganic Chemistry”Prenum Press,London and New York,1973)中的记载。前述保护基团没有特别限制，例如可列举出：叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙基氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)和甲苯磺酰基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。R3为OR4时，前述保护基团没有特别限制，例如可列举出：TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基等。此外，还可列举出含甲硅烷基团。以下同样适用。
前述式(II)的结构例如可以示例出下述式(II-1)～式(II-9)，下述式中，n和m为与前述式(II)相同。下述式中，q为0～10的整数。
Figure GDA0001817942680000301
前述式(II-1)～(II-9)中，n、m和q没有特别限制，如前所述。作为具体例，可列举出：前述式(II-1)中，n＝8、前述(II-2)中，n＝3、前述式(II-3)中，n＝4或8、前述(II-4)中，n＝7或8、前述式(II-5)中，n＝3和m＝4、前述(II-6)中，n＝8和m＝4、前述式(II-7)中，n＝8和m＝4、前述(II-8)中，n＝5和m＝4(下述实施例的P)、n＝7和m＝6(下述实施例的P13)、n＝9和m＝8(下述实施例的P14)、或n＝11和m＝10(下述实施例的P15)、前述式(II-9)中，q＝1和m＝4。将前述式(II-4)的一个例子(n＝8)示于下述式(II-4a)，将前述式(II-8)的一个例子(n＝5、m＝4)示于下述式(II-8a)。
Figure GDA0001817942680000311
本发明中，“烷基”例如包含直链状或支链状的烷基。前述烷基的碳数没有特别限制，例如为1～30、优选为1～6或1～4。前述烷基例如可列举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。例如优选列举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基等。
本发明中，“烯基”例如可列举出：直链或支链的烯基。前述烯基可列举出在前述烷基中具有一个或多个双键的烯基。前述烯基的碳数不特别限定，例如与前述烷基的碳数相同，优选2-8。前述烯基例如可列举出：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、3-甲基-2-丁烯基等。
本发明中，“炔基”例如可列举出：直链或支链的炔基。前述炔基可列举出在前述烷基中具有一个或多个三键的炔基。前述炔基的碳数不特别限定，例如与前述烷基的碳数相同，优选2～8。前述炔基例如可列举出：乙炔基、丙炔基、丁炔基等。前述炔基例如可以进一步具有一个或多个双键。
本发明中，“芳基”包括例如：单环芳族烃基和多环芳族烃基。前述单环芳族烃基例如可列举出：苯基等。前述多环芳族烃基例如可列举出：1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基、9-菲基等。优选例如可列举出苯基，如1-萘基和2-萘基等萘基等。
本发明中，“杂芳基”例如包含单环芳族杂环基和稠合芳族杂环基。前述杂芳基例如可列举出：呋喃基(如2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(如2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(如1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(如1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(如1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三唑基(如1,2,4-三唑-1-基、1,2,4-三唑-3-基、1,2,4-三唑-4-基)、四唑基(如1-四唑基、2-四唑基、5-四唑基)、噁唑基(如2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、异噁唑基(如3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噻唑基(如2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻二唑基、异噻唑基(如3-异噻唑基、4-异噻唑基、5-异噻唑基)、吡啶基(如2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、哒嗪基(如3-哒嗪基、4-哒嗪基)、嘧啶基(如2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋咕基(furazanyl)(如3-呋咕基)、吡嗪基(如2-吡嗪基)、噁二唑基(如1,3,4-噁二唑-2-基)、苯并呋喃基(如2-苯并[b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(如2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、苯并咪唑基(如1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、二苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹喔啉基(如2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、6-喹喔啉基)、噌啉基(如3-噌啉基、4-噌啉基、5-噌啉基、6-噌啉基、7-噌啉基、8-噌啉基)、喹唑啉基(如2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(如2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、酞嗪基(如1-酞嗪基、5-酞嗪基、6-酞嗪基)、异喹啉基(如1-异喹啉基、3-异喹啉基、4-异喹啉基、5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、嘌呤基、蝶啶基(如2-蝶啶基、4-蝶啶基、6-蝶啶基、7-蝶啶基)、咔唑基、菲啶基、吖啶基(如1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(如1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、异吲哚基、吩嗪基(如1-吩嗪基、2-吩嗪基)或吩噻嗪基(如1-吩噻嗪基、2-吩噻嗪基、3-吩噻嗪基、4-吩噻嗪基)等。
本发明中，“环烷基”例如可列举出：环状饱和烃基，碳数为例如3-15，前述环烷基例如可列举出：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、桥接环烃基和螺烃基等，优选环丙基、环丁基、环戊基、环己基、桥接环烃基等。
本发明中，“桥接环烃基”例如可列举出：二环[2.1.0]戊基、二环[2.2.1]庚基、二环[2.2.2]辛基和二环[3.2.1]辛基、三环[2.2.1.0]庚基、二环[3.3.1]壬烷、1-金刚烷基、2-金刚烷基等。
本发明中，“螺烃基”例如可列举出螺[3.4]辛基等。
本发明中，“环烯基”例如包括环状的不饱和脂肪族烃基，碳数例如为3～7个。前述基团例如可列举出：环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基等，优选为环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。前述环烯基还包括例如在环中具有不饱和键的桥接环烃基和螺烃基。
本发明中，“芳基烷基”例如可列举出：苯甲基、2-苯乙基或萘甲基等。“环烷基烷基”或”环基烷基”为例如环己基甲基、金刚烷基甲基等。“羟基烷基”可列举出羟基甲基和2-羟基乙基等。
本发明中，“烷氧基”包括例如前述烷基-O-基团，例如可列举出：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基等。“烷氧基烷基”例如可列举出甲氧基甲基等。“氨基烷基”例如可列举出2-氨基乙基等。
本发明中，“杂环基”例如可列举出：1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、吡咯烷酮、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、咪唑烷酮、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、哌啶酮、哌啶子基(piperidino)、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、哌嗪酮、2-吗啉基、3-吗啉基、吗啉代、四氢吡喃基、四氢呋喃基等。
本发明中，“杂环基烷基”例如可列举出：哌啶基甲基、哌嗪基甲基等。“杂环基烯基”例如可列举出：2-哌啶基乙烯基等。“杂芳烷基”例如可列举出：吡啶基甲基和喹啉-3-基甲基等。
本发明中，“甲硅烷基”包含由式R3Si-表示的基团，其中R可独立地选自前述烷基、芳基和环烷基，例如可列举出：三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基等。“甲硅烷基氧基”例如可列举出：三甲基甲硅烷基氧基等。“甲硅烷氧基烷基”例如可列举出：三甲基甲硅烷氧基甲基等。
本发明中，“亚烷基”例如可列举出：亚甲基、亚乙基和亚丙基等。
本发明中，前述的各种基团任选被取代。前述取代基例如可列举出：羟基、羧基、磺基、卤素、卤代烷基(卤代烷基，如CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亚硝基、氰基、烷基(如甲基、乙基、异丙基、叔丁基)、烯基(如乙烯基)、炔基(如乙炔基)、环烷基(如环丙基、金刚烷基)、环烷基烷基(如环己基甲基、金刚烷基甲基)、环烯基(如环丙烯基)、环基烷基、羟基烷基(如羟基甲基、羟基乙基)、烷氧基烷基(如甲氧基甲基、乙氧基甲基、乙氧基乙基)、芳基(如苯基、萘基)、芳基烷基(如苯甲基、苯乙基)、烷基芳基(如对甲苯基)、杂芳基(如吡啶基、呋喃基)、杂芳烷基(如吡啶基甲基)、杂环基(如哌啶基)、杂环基烯基、杂环基烷基(如吗啉基甲基)、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤代烷氧基(如OCF3)、烯氧基(如乙烯基氧基、烯丙基氧基)、芳氧基(如苯氧基)、烷氧基羰基(如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基)、芳基烷氧基(如苯甲基氧基)、氨基-[烷基氨基(如甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基)、酰基氨基(如乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳烷基氨基(如苯甲基氨基、三苯甲基氨基)、羟基氨基]、氨基烷基(如氨基甲基)、烷基氨基烷基(如二乙基氨基甲基)、氨基甲酰基、氨基磺酰基、氧基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基等。
或本发明的人工sgRNA中，前述连接子区域(Xa)由下述式(III-1)～(III-3)中的任一者表示。各式中，n和m与前述化学式(I)中的相同。
Figure GDA0001817942680000351
前述化学式(III-1)～(III-3)中，n和m没有特别限制，如前所述。作为具体例，可列举出：前述化学式(III-1)中，n＝5和m＝4(下述实施例的F)、前述化学式(III-2)中n＝5和m＝4(下述实施例的L)、前述化学式(III-3)中，n＝5和m＝4(下述实施例的E)。
将这些结构示于下述化学式(III-1a)、(III-2a)和(III-3a)。
Figure GDA0001817942680000361
对于本发明的人工sgRNA，除了前述氨基酸衍生物连接子(Xa)之外，还可以将天然型sgRNA的(1)茎-环2的环部分(GAAA)和/或(2)连接子区域(UUAUC)置换为前述式(I)表示的氨基酸衍生物连接子(Xb，Y)。或者/除了之外，可以在天然型sgRNA的(3)5’末端和/或(4)3’末端附近添加和/或插入前述式(I)表示的氨基酸衍生物连接子(Xc，Xd)。
Figure GDA0001817942680000362
氨基酸衍生物连接子Xb、Y、Xc和Xd可以分别独立地为前述式(I)表示的任意的氨基酸衍生物，例如，作为前述Xb，优选由前述式(II)表示的脯氨酸衍生物连接子，更优选为由前述式(II-8)表示且该式中、n＝5和m＝4的脯氨酸衍生物连接子(P)。
或者，作为前述Xb，还优选：由前述式(I-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酸衍生物连接子(Gly)；由前述式(I-4)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子(GlyGly)；由前述式(I-6)表示，且该式中，为n＝4和m＝4的对苯二甲酸衍生物连接子(TP)；由前述式(I-7)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的赖氨酸衍生物连接子(K)，由(III-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的苯丙氨酸衍生物连接子(F)；由前述式(III-2)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的亮氨酸衍生物连接子(L)；由前述式(III-3)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的谷氨酸衍生物连接子(E)。
作为前述Y，优选例如，前述式(I-4)表示的甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子，由前述式(II)表示的脯氨酸衍生物连接子；更优选由前述式(I-4)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子(GlyGly)；由前述式(II-8)表示，且该式中，为n＝5和m＝4(P)、n＝7和m＝6(P13)、n＝9和m＝8(P14)、或n＝11和m＝10(P15)的脯氨酸衍生物连接子。
或者，作为前述Y，还优选：由前述式(I-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酸衍生物连接子(Gly)；由前述式(I-6)表示，且该式中，为n＝4和m＝4的对苯二甲酸衍生物连接子(TP)；由前述式(I-7)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的赖氨酸衍生物连接子(K)；由(III-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的苯丙氨酸衍生物连接子(F)；由前述式(III-2)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的亮氨酸衍生物连接子(L)；由前述式(III-3)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的谷氨酸衍生物连接子(E)。
作为前述Xc和Xd，分别独立地，例如优选为由前述式(II)表示的脯氨酸衍生物连接子，更优选为由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4的脯氨酸衍生物连接子(P)。
或者，作为前述Xc和Xd，还优选：由前述式(I-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酸衍生物连接子(Gly)；由前述式(I-4)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子(GlyGly)；由前述式(I-6)表示，且该式中，为n＝4和m＝4的对苯二甲酸衍生物连接子(TP)；由前述式(I-7)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的赖氨酸衍生物连接子(K)，由(III-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的苯丙氨酸衍生物连接子(F)；由前述式(III-2)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的亮氨酸衍生物连接子(L)；由前述式(III-3)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的谷氨酸衍生物连接子(E)。
在优选的一个实施方式中，本发明的人工sgRNA还可以是仅将天然型sgRNA的四核苷酸环部分置换为前述氨基酸衍生物连接子(Xa)的人工sgRNA。即，下式(A)中，Xb和Y是由1个至5个任意的核苷酸残基构成的核苷酸连接子，Xc和Xd不存在。
Figure GDA0001817942680000381
Xb和Y可以分别是天然型sgRNA的茎-环2的环部分(GAAA)和连接子区域(UUAUC)，只要保持天然型sgRNA中的茎-环2和连接子区域的结构，还可以置换为其它核苷酸连接子。例如报道了：即使仅将UUAUC置换为U，前述Y也可以得到同等或高于其的DSB活性。
在另一优选的实施方式中，本发明的人工sgRNA除了天然型sgRNA的四核苷酸环部分之外，茎-环2的环部分(GAAA)也可置换为前述氨基酸衍生物连接子，优选置换为由前述式(II)表示的脯氨酸衍生物连接子，更优选置换为由前述式(II-8)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的脯氨酸衍生物连接子(P)。
或者，还优选茎-环2的环部分(GAAA)置换为：由前述式(I-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酸衍生物连接子(Gly)；由前述式(I-4)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子(GlyGly)；由前述式(I-6)表示，且该式中，为n＝4和m＝4的对苯二甲酸衍生物连接子(TP)；由前述式(I-7)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的赖氨酸衍生物连接子(K)；由(III-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的苯丙氨酸衍生物连接子(F)；由前述式(III-2)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的亮氨酸衍生物连接子(L)；或由前述式(III-3)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的谷氨酸衍生物连接子(E)。
可认为，天然型sgRNA的除了四核苷酸环部分之外、茎-环2的环部分(GAAA)也置换为前述氨基酸衍生物连接子的本发明的人工sgRNA的在生物体内的稳定性改善效果更优异，而且保持与天然型sgRNA同等或高于天然型sgRNA的在细胞内的DNA切断活性，因此作为体内基因组编集的工具是特别有用的。
进而另一优选的实施方式中，本发明的人工sgRNA除了天然型sgRNA的四核苷酸环部分和茎-环2的环部分(GAAA)之外，连接子区域(UUAUC)也置换为前述氨基酸衍生物连接子，优选置换为前述式(I-4)表示的甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子，由前述式(II)表示的脯氨酸衍生物连接子，更优选置换为由前述式(I-4)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子(GlyGly)；由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4(P)、n＝7和m＝6(P13)、n＝9和m＝8(P14)、或n＝11和m＝10(P15)的脯氨酸衍生物连接子。
或者，还优选连接子区域(UUAUC)置换为：由前述式(I-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酸衍生物连接子(Gly)；由前述式(I-4)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子(GlyGly)；由前述式(I-6)表示，且该式中，为n＝4和m＝4的对苯二甲酸衍生物连接子(TP)；由前述式(I-7)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的赖氨酸衍生物连接子(K)；由(III-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的苯丙氨酸衍生物连接子(F)；由前述式(III-2)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的亮氨酸衍生物连接子(L)；或由前述式(III-3)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的谷氨酸衍生物连接子(E)。
其中，考虑到与Cas9组合时的、在细胞内的DNA切断活性，作为本发明的人工sgRNA，在某些情况下，优选前述式(A)中的Xa、Xb和Y未同时置换为氨基酸衍生物连接子。
进而在另一优选的实施方式中，本发明的人工sgRNA除了天然型sgRNA的四核苷酸环部分之外，还可以在5’末端和3’末端附近分别添加和插入：前述氨基酸衍生物连接子，优选为由前述式(II)表示的脯氨酸衍生物连接子，更优选为由前述式(II-8)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的脯氨酸衍生物连接子(P)。
或者，还优选在5’末端和3’末端附近分别添加和插入：由前述式(I-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酸衍生物连接子(Gly)；由前述式(I-4)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子(GlyGly)；由前述式(I-6)表示，且该式中，为n＝4和m＝4的对苯二甲酸衍生物连接子(TP)；由前述式(I-7)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的赖氨酸衍生物连接子(K)；由(III-1)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的苯丙氨酸衍生物连接子(F)；由前述式(III-2)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的亮氨酸衍生物连接子(L)；或由前述式(III-3)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的谷氨酸衍生物连接子(E)。
可认为：天然型sgRNA的除了四核苷酸环部分之外、在5’末端和3’末端附近分别添加和插入了前述氨基酸衍生物连接子，优选为由前述式(II)表示的脯氨酸衍生物连接子，更优选为由前述式(II-8)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的脯氨酸衍生物连接子(P)的本发明的人工sgRNA的在生物体内的稳定性改善、通过自然免疫应答的亢进带来的副作用减轻效果更优异，而且保持与天然型sgRNA同等或不低于天然型sgRNA的在细胞内的DNA切断活性，因此作为体内基因组编集的工具是特别有用的。
如上所述，对于导入了2个以上的氨基酸衍生物连接子的上述任意人工型sgRNA，与仅在Xa处导入了氨基酸衍生物连接子的人工型sgRNA同样地、在与Cas9组合时，可以得到与天然型sgRNA同等或不低于天然型sgRNA的在细胞内的靶双链DNA的切断活性。通过导入2个以上的氨基酸衍生物连接子而可进一步提高sgRNA的核酸酶耐性，可以改善在生物体内的稳定性。需要说明的是，对于在生物体内的稳定性的改善效果，例如可以在体外通过对于血清和/或核酸酶实施耐性试验来确认。
在本发明的人工sgRNA中不仅包括由前述式(A)表示的核苷酸序列，而且包括如下核苷酸序列：具有在该核苷酸序列中置换、缺失、插入或添加有1个至几个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸残基的核苷酸序列，且在与Cas9组合时，具有与天然型sgRNA同等或高于天然型sgRNA的靶双链DNA的识别能力(结合活性)的核苷酸序列。例如，即使将重复区域与反义重复区域的沃森-克里克碱基对(UUUU/AAAA)置换为CCCC/GGGG、或将茎-环2的沃森-克里克碱基对(ACUU/UGAA)置换为CGCC/GCGG或插入2个碱基对(ACUUGA/UGAACU)，也未发现与Cas9组合时的DSB活性显著降低，另外，有报道：将连接子区域(UUAUC)短链化成仅为U时，DSB活性显著增大。因此，即使在前述式(A)的核苷酸序列中导入保持了sgRNA的特征性发夹结构那样的突变，也可以发挥本发明的人工sgRNA的作用效果。
根据本发明人等的研究，在天然型sgRNA中不导入任何本发明的氨基酸衍生物连接子的情况下，缺失了3’末端、进而缺失了tracrRNA的茎-环2和连接子区域的短链化sgRNA与Cas9组合时的DSB活性显著降低。另一方面，如下述试验例3所示，通过将天然型sgRNA的、不仅四核苷酸环而且与其相邻的茎的1～3碱基对、和/或不仅茎-环2的环部分而且与其相邻的茎的1-4碱基对也置换为前述氨基酸衍生物连接子，优选置换为由前述式(II)表示的脯氨酸衍生物连接子，更优选置换为由前述式(II-8)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的脯氨酸衍生物连接子(P)，由此虽然作为短链化sgRNA，不如天然型sgRNA但也能够保持充分的DSB活性。
另外，即使不修饰四核苷酸环、tracrRNA的茎-环2、连接子区域、sgRNA的两末端，通过将tracrRNA的茎-环1或茎-环3的环部分置换为前述氨基酸衍生物连接子，优选置换为由前述式(II)表示的脯氨酸衍生物连接子，更优选置换为由前述式(II-8)表示，且该式中，为n＝5和m＝4的脯氨酸衍生物连接子(P)，在与Cas9组合时，也能够保持良好的DSB活性。
因此，本发明还提供以下的人工sgRNA。
(a)其是由前述式(A)表示的sgRNA，
(i)式中Xa由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4，且与Xa相邻的茎的1～3碱基对缺失；和/或
(ii)式中Xb由前述式(II-8)表示，且该式中，n＝5和m＝4，且与Xb相邻的茎的1～4碱基对缺失。
(b)其是由前述式(A)表示的sgRNA，该式中，Xa、Xb和Y是1个至5个任意的核苷酸连接子，Xc和Xd不存在，茎-环1的环部分(UA)或茎-环3的环部分(AGU)被由前述式(II-8)表示且该式中、n＝5和m＝4的氨基酸衍生物连接子置换。
构成本发明的人工sgRNA的核苷酸残基例如，作为构成要素，包括糖、碱基和磷酸。如上所述，前述核苷酸残基可列举出例如核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。前述核糖核苷酸残基具有例如核糖残基作为糖、并且具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)作为碱基。前述脱氧核糖残基具有例如脱氧核糖残基作为糖、并且具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)作为碱基。
前述核苷酸残基可列举出未修饰的核苷酸残基和修饰的核苷酸残基。前述未修饰的核苷酸残基的前述各构成要素与例如天然存在的核苷酸残基的构成要素相同或基本上相同。优选地，与人体内天然存在的核苷酸残基的构成要素相同或基本上相同。
前述修饰的核苷酸残基为例如通过修饰前述未修饰的核苷酸残基而得到的核苷酸残基。前述修饰的核苷酸例如可以被前述未修饰的核苷酸残基的构成要素的任一者修饰。本发明中，“修饰”是指例如：前述构成要素的置换、添加和/或缺失；前述构成要素中的原子和/或官能团的置换、添加和/或缺失，还可称作“修饰”。前述修饰的核苷酸残基例如可列举出：天然存在的核苷酸残基、人工修饰的核苷酸残基。关于前述源自天然的修饰核苷酸残基，可查阅例如Limbach等人(Limbach等人，1994,Summary:the modified nucleosidesof RNA,Nucleic Acids Res.22:pp.2183至2196)。另外，前述修饰的核苷酸残基可以是例如前述核苷酸残基的代替物的残基。
前述核苷酸残基的修饰例如可列举出：核糖-磷酸骨架(下文中称作“核糖磷酸(ribophosphate)骨架”)的修饰。
在前述核糖磷酸骨架中，例如可修饰核糖残基。在前述核糖残基中，例如，可修饰2’-位碳。具体地，例如将键合至2’-位碳的羟基置换为氢或氟等。通过用氢置换键合至前述2’-位碳的羟基，从而用脱氧核糖残基置换核糖残基。例如前述核糖残基可置换为立体异构体，并可置换成例如阿拉伯糖残基。
前述核糖磷酸骨架可置换成例如具有非核糖残基和/或非磷酸的非核糖磷酸骨架。前述非核糖磷酸骨架可列举出前述核糖磷酸骨架的非带电体。前述被置换成非核糖磷酸骨架的、前述核苷酸残基的代替物例如可列举出：吗啉代、环丁基、吡咯烷等。前述代替物除此以外例如可列举出人工核酸单体残基等。作为具体例可列举出：PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)(Locked NucleicAcid)、ENA(2’-O,4’-C-亚乙基桥接核酸)等。其中，优选PNA。
在前述核糖磷酸骨架中，例如，可修饰磷酸基。在前述核糖磷酸骨架中，与糖残基距离最近的磷酸基被称为“α-磷酸基”。前述α-磷酸基带负电，且其电荷均匀分布在不与糖残基键合的两个氧原子上。在前述α-磷酸基的四个氧原子中，核苷酸残基之间的磷酸二酯键中不与糖残基键合的两个氧原子在下文中也称作“非结合(non-linking)氧”。另一方面，在前述核苷酸残基之间的磷酸二酯键中，与糖残基键合的两个氧原子在下文中称作“结合氧”。例如，前述α-磷酸基优选被修饰为不带电，或者修饰为使前述非结合原子中的电荷分布不对称。
前述磷酸基团中，例如也可以置换前述非结合氧。前述氧可被例如S(硫)、Se(硒)、B(硼)、C(碳)、H(氢)、N(氮)和OR(R为例如烷基或芳基)的任意原子置换，并优选被S置换。前述非结合氧优选例如两个都被置换，更优选两个都被S置换。前述修饰磷酸基团例如可列举出：硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯、硒酸磷酸酯(phosphoroselenates)、硼酸磷酸酯(boranophosphates)、硼酸磷酸酯酯、氢膦酸酯(hydrogen phosphonates)、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯等。特别地，优选其中前述两个非结合氧均被S置换的二硫代磷酸酯。
在前述磷酸基团中，例如也可置换前述结合氧。前述氧可被例如S(硫)、C(碳)和N(氮)的任意原子置换。前述修饰的磷酸基团例如可列举出：被N置换的交联氨基磷酸基；被S置换的交联硫代磷酸基；和、被C置换的交联亚甲基膦酸基。优选地，前述结合氧的置换在例如本发明的人工sgRNA的5’末端核苷酸残基和3’末端核苷酸残基的至少一者中进行。当置换在5’侧进行时，优选用C置换。当置换在3’侧进行时，优选用N置换。
前述磷酸基可被例如前述不含有磷的连接子置换。前述连接子可包含硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛(thioformacetal)、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼和亚甲氧基甲基亚氨基等。优选地，连接子可包含亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
本发明的人工sgRNA例如，3’末端核苷酸残基和5’末端核苷酸残基的至少之一可被修饰。例如，3’末端和5’末端任一处的核苷酸残基可被修饰，或3’末端和5’末端两处的核苷酸残基均可被修饰。前述修饰可为例如如上所述，优选在末端的磷酸基进行修饰。例如，整个前述磷酸基可被修饰，或者前述磷酸基中的一个以上原子可被修饰。在前一种情况下，例如整个磷酸基可被置换或缺失。
前述末端的核苷酸残基的修饰可列举出其它分子的添加。前述其它分子例如可列举出：功能性分子例如如上所述的标记物质和保护基团等。前述保护基团例如可列举出：S(硫)、Si(硅)、B(硼)、含酯基团等。
前述其它分子可例如添加至前述核苷酸残基的磷酸基、或可经间隔子添加至前述磷酸基或前述糖残基。例如，前述间隔子的末端原子可在前述磷酸基的前述结合氧、或者糖残基的O、N、S或C处进行添加或置换。前述糖残基的结合位点优选为例如3’-位C、5’-位C或与之结合的原子。例如，前述间隔子还可添加至或置换前述核苷酸代替物如PNA的末端原子。
前述间隔子不特别限定，例如可以包括：-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、脱碱基糖(abasic sugars)、酰胺、羧基、胺、羟基胺(oxyamine)、羟基亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺酰胺和吗啉代等，以及生物素试剂和荧光素试剂等。在前述式中，n为正整数，优选n＝3或6。
添加至末端的前述分子除此以外例如可列举出：色素、嵌入剂(如吖啶)、交联剂(如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉类(TPPC4、特沙弗林(texaphyrin)、赛普弗林(sapphyrin))、多环芳烃(如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切酶(如EDTA)、亲脂性载体(如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基(geranyloxyhexyl group)、十六烷基甘油、茨醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或噻吩嗪和肽复合物(如触足(Antennapedia)肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG(如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(如生物素)、转运/吸收促进剂(如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(如咪唑、二咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑复合物、四氮杂大环(tetraazamacrocycles)的Eu3+复合物)等。
本发明的人工sgRNA例如前述5’末端可被磷酸基或磷酸基类似物修饰。前述磷酸化例如可列举出：5’-单磷酸((HO)2(O)P-O-5’)；5’-二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化，7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-腺苷帽(Appp)；任何修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸(硫代磷酸：(HO)2(S)P-O-5’)；5’-二硫代磷酸(二硫代磷酸：(HO)(HS)(S)P-O-5’)；5’-硫代磷酸((HO)2(O)P-S-5’)；硫取代的单磷酸、二磷酸和三磷酸(如5’-α-硫代三磷酸、5’-γ-硫代三磷酸等)；5’-氨基磷酸((HO)2(O)P-NH-5’,(HO)(NH2)(O)P-O-5’)；5’-烷基磷酸(如RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2，其中R为烷基(如甲基、乙基、异丙基、丙基等))；5’-烷基醚磷酸(如RP(OH)(O)-O-5’，其中R为烷基醚(如甲氧基甲基、乙氧基甲基等))等。
在前述核苷酸残基中，前述碱基不特别限定。前述碱基可为例如天然碱基或非天然碱基。前述碱基可为例如源自天然的碱基或合成碱基。作为前述碱基，例如可使用常用碱基和其修饰类似物等。
前述碱基例如可列举出：嘌呤碱基如腺嘌呤和鸟嘌呤等；嘧啶碱基如胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等。前述碱基除此以外例如可列举出：肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟苷(isoguanisine)、杀结核菌素(tubercidine)等。前述碱基例如可列举出：2-氨基腺嘌呤、6-甲基化嘌呤等烷基衍生物；2-丙基化嘌呤等烷基衍生物；5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶；8-卤代、氨基化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化和其它8-取代嘌呤；5-三氟甲基化和其它5-取代嘧啶；7-甲基鸟嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮杂嘧啶；N-2、N-6和O-6取代嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；二氢尿嘧啶；3-脱氮-5-氮胞嘧啶；2-氨基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷基鸟嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-脱氮腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；5-氨基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代的1,2,4-三唑；2-吡咯烷酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧代乙酸；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫代尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙酰胞嘧啶；2-硫代胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-异戊基腺嘌呤；2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤；N-甲基鸟嘌呤；O-烷基化碱基等。另外，嘌呤和嘧啶包括例如：美国专利3,687,808号、Kroschwitz J.I,John Wiley&Sons编辑的“Concise Encyclopedia ofPolymer Science and Engineering”,pp.858-859,1990和Englisch等人的AngewandteChemie,国际版,1991,vol.30,p.613中公开的那些。
前述修饰核苷酸残基除此以外还可以包含例如缺失碱基的残基、即无碱基的核糖磷酸骨架。另外，前述修饰核苷酸残基可以使用例如美国临时申请第60/465,665号(申请日：2003年4月25日)和国际申请第PCT/US04/07070号(申请日：2004年3月8日)中记载的残基，本发明可以援用这些文献。
本发明的人工sgRNA例如可以利用WO2013/180038号中记载的方法，制成借助以氨基酸衍生物连接子为代表的非核苷酸残基添加了任意功能性分子的修饰体。
2.本发明的人工sgRNA的合成方法
本发明的人工sgRNA的合成方法没有特别限制，可以采用现有公知的方法。例如可列举出：亚磷酰胺法和H-磷酸酯法等。前述化学合成法例如可以使用市售的自动核酸合成机。前述化学合成法通常可使用亚酰胺(amidite)。前述亚酰胺没有特别限制，作为市售的亚酰胺，例如可列举出：RNA亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi、商品名、三千里制药)、ACE亚酰胺、TOM亚酰胺、CEE亚酰胺、CEM亚酰胺、TEM亚酰胺等。对于本发明的人工sgRNA例如优选使用前述式(I)表示的连接子区域合成时的、下述本发明的单体。
3.本发明的单体
本发明的单体是核酸合成用的单体，其特征在于，具有下述式(IV)的结构。
Figure GDA0001817942680000471
(式中，X1、X2、Y1、Y2、L1、L2和A与前述式(I)含义相同，R11和R21分别独立地为氢原子、保护基团或磷酸保护基团。)
R11和R21中，保护基团例如与前述式(I)中的说明同样，作为具体例，例如可列举出：二甲氧基三苯甲(DMTr)基、TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基、TEM基、以及下述式(P1)或(P2)表示的含甲硅烷基团(组I)，其中，优选为DMtr基和前述含甲硅烷基团中的任一个。
Figure GDA0001817942680000481
前述磷酸保护基团可以由例如下述式表示。
-P(OR6)(NR7R8)
前述式中，R6为氢原子或任意取代基。例如，取代基R6优选为烃基，前述烃基可被电子基团取代或可不被吸电子基团取代。取代基R6例如可列举出：卤素、卤代烷基、杂芳基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳烷基；以及、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基等烃类，进一步，其可被吸电子基团取代或可不被吸电子基团取代。取代基R6具体可列举出：β-氰乙基、硝基苯乙基和甲基。
R7和R8分别为氢原子或任意取代基且它们任选相同或不同。取代基R7和R8优选为例如烃基，且前述烃基可被任意取代基进一步取代或可不被任意取代基进一步取代。前述烃基的实例与上述关于R6的描述中所列的那些相同，并且所述烃基优选甲基、乙基、异丙基。在该情况中，-NR7R8的具体可列举出例如：二异丙基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基等。或者，取代基R7和R8成为一体，与和它们结合的氮原子一起(即，-NR7R8成为一体)形成含氮环(例如，哌啶基、吗啉基等)。
作为前述磷酸保护基团的具体例，例如可列举出-P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)、-P(OCH3)(N(i-Pr)2)等(组II)。前述式中，i-Pr表示异丙基。
前述式(IV)中，例如，R11和R21之一可以是氢原子或保护基团，另一者可以是氢原子或磷酸保护基团。例如，优选R11为前述保护基团时，R21为氢原子或前述磷酸保护基团，具体而言，R11选自前述组I时，R2优选氢原子或选自前述组II。另外，例如，R11为前述磷酸保护基团时，R21优选为氢原子或前述保护基团，具体而言，R11选自前述组II时，R21优选氢原子或选自前述组I。
作为本发明的单体，具体而言，例如可列举出WO2013/103146号等中记载的单体、下述式(IV-1)～(IV-3)表示的单体。
Figure GDA0001817942680000491
(各式中，R11和R21与前述式(IV)含义相同，n和m分别独立地为0～30的整数。)
本发明的单体可以利用例如WO2013/103146号等中记载的方法、下述实施例中记载的方法来合成。
4.CRISPR/Cas9系统
本发明还提供CRISPR/Cas9，其是组合上述本发明的人工sgRNA和Cas9而成的。
对于本发明中使用的Cas9，只要与本发明的人工sgRNA形成复合体且可识别并结合靶双链DNA中的靶核苷酸序列及与其相邻的前间区序列邻近基序(proto-spaceradjacent motif，PAM)就没有特别限制，优选为源自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9(SpCas9；PAM序列NGG(N为A、G、T或C。以下相同))，只要可以与本发明的人工sgRNA形成复合体就可以使用源自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9(StCas9；PAM序列NNAGAAW)、源自魏克塞尔包姆氏杆菌(Neisseria meningitidis)的Cas9(MmCas9；PAM序列NNNNGATT)等，但特别优选受PAM制约少的SpCas9(实质上为2个碱基，理论上可以在基因组上的几乎任何位置靶标化)。作为本发明中使用的Cas9，除了可以使用能切断双链DNA两个链的野生型Cas9之外，还可以使用具有使一个链的切断能力失活的切口酶活性的Cas9(nCas9)。例如，SpCas9的情况可列举出：第10位的Asp残基置换为Ala残基而成的、欠缺切断与sgRNA形成互补链的链的反义链的能力的D10A突变体；或者，第840位的His残基置换为Ala残基而成的、欠缺切断与sgRNA形成互补链的链的能力的H840A突变体，但不限定于这些。进而，根据使用目的还可以使用欠缺两个链的切断能力的双重突变体(dCas9)。作为使用dCas9、nCas9的具体的实施方式，例如可列举出：使dCas9/nCas9与转录调节因子、染色质修饰因子融合，从而控制靶基因的转录，或者融合荧光蛋白质而使靶基因座可视化(实时成像)等，但不限定于这些。
另外，还可以代替Cas9使用Cpf1。作为Cpf1，例如可列举出：源自弗朗西斯杆菌(Francisella novicida)的Cpf1(FnCpf1；PAM序列NTT)、源自氨基酸球菌sp.(Acidaminococcus sp.)的Cpf1(AsCpf1；PAM序列NTTT)、源自毛螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)的Cpf1(LbCpf1；PAM序列NTTT)等，但不限定于这些。还可以与Cpf1的情况同样地使用欠缺一个或两个链的切断活性的突变体。例如，FnCpf1的情况，可以使用第917位的Asp残基置换为Ala残基(D917A)、或第1006位的Glu残基置换为Ala残基(E1006A)的、欠缺两个链的切断能力的突变体(dCpf1)。
用于本发明的CRISPR/Cas9系统的Cas9可以是蛋白质的形态，还可以是编码该Cas9的mRNA的形态。或者还可以是包含编码Cas9的DNA的表达载体的形态。将CRISPR/Cas9系统作为无细胞系的酶反应进行时，Cas9可以以蛋白质的形态提供。另一方面，在出于对细胞内的靶基因进行突变的目的时，Cas9还可以以蛋白质的形态、编码该Cas9的mRNA的形态、包含编码该Cas9的DNA的表达载体的任意形态导入细胞内。
编码Cas9的DNA例如可以通过如下方式克隆：将由产生该蛋白质的细胞制备的总RNA或mRNA级分作为模板使用，利用RT-PCR法进行扩增，由此进行克隆。突变Cas9可以通过如下方式得到：对于经克隆化的编码Cas9的DNA，使用原本公知的位点特异性突变诱发法，以将对DNA切断活性重要的位点的氨基酸残基(例如，Cas9的情况，可列举出第10位的Asp残基、第840位的His残基，但不限定于这些)置换为其它氨基酸的方式导入突变。或者，编码Cas9的DNA还可以通过组合化学合成或PCR法或Gibson Assembly法，构建为具有适于在使用的宿主细胞中表达的密码子使用的DNA。例如，为了在真核细胞中表达SpCas9而进行了最优化的CDS序列是公知的。
得到的编码Cas9的DNA根据宿主不同可以插入至适当的表达载体的启动子的下游。表达载体的导入根据宿主的种类不同可以依据公知的方法(例如，溶菌酶法、感受态法、PEG法、CaCl2共沉淀法、电穿孔法、显微注射法、粒子枪法、脂质体法、农杆菌法等)来实施。
本发明的人工sgRNA和Cas9优选可以利用核转染法导入宿主细胞。
导入细胞内的(表达)sgRNA与Cas9蛋白质形成复合体，与靶序列结合而使靶基因产生DSB。该DSB可通过非相同的末端结合(NHEJ)来修复，但此时靶基因被由所产生的偶发性的碱基的插入/缺失(indel)导致的移码突变所破坏(敲除)。另外，通过共同导入在两端具有靶的相同序列的供体DNA，从而发生相同重组修复，能够进行碱基修饰、基因插入(knock-in)。
以下通过实施例等对本发明进行详细地说明，但本发明不限定于这些实施例。
实施例
(实施例1)sgRNA的合成
基于亚磷酰胺法并利用核酸合成机(The ABI Expedite(R)8909 Nucleic AcidSynthesis System,Applied Biosystems)合成了表1所示的sgRNA。前述合成使用EMM亚酰胺作为RNA亚酰胺(国际公开第2013/027843号)(以下同样适用)。前述亚酰胺的脱保护依据规定方法进行，通过HPLC进行纯化。下述序列中，下划线是与靶核苷酸序列互补的引导区域，在P中导入脯氨酸二酰胺亚酰胺，在K中导入赖氨酸二酰胺亚酰胺，在X中导入甘氨酰基甘氨酸二酰胺亚酰胺。
[表1]
Figure GDA0001817942680000531
(试验例1)以KRAS基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性评价
按照随附的操作手册，使组入了具有人KRAS基因(基因库登录号No.NM_004985.3)的G12V突变的序列(NCBI Refference Sequence NP_0049762)的质粒DNA(pCMV6-Entry-KRAS(G12V)，OriGene Technologies)与限制性内切酶Tth111I(TaKaRa)进行了反应。反应结束后按照常规方法进行纯化，以最终浓度成为100ng/μL的方式溶解于TE缓冲剂(10mMTris-HCl,pH8，1mM EDTA)中作为基质DNA。
使用Cas9 Nuclease,S.pyogenes(New England Biolabs)中随附的试剂，将上述基质DNA与sgRNA和Cas9如下所示进行了混合；
100ng基质DNA+10ng sgRNA+0.3pmol Cas9(总量10μL)
将其在37℃下孵育30分钟后，进而在70℃下孵育10分钟使Cas9失活。然后进行电泳，溴化乙锭染色后使用凝胶成像系统PXi4(SYNGENE公司)测定了谱带强度。
基于测定结果，利用下述等式计算出切断效率。
切断效率＝裂解谱带强度的总和/(裂解谱带强度与未裂解谱带强度的总和)[Cleavage Efficiency＝sum of cleaved band intensities/(sum of the cleaved anduncleaved band intensities)]
将结果示于图1。任意的人工sgRNA均显示出与天然型sgRNA(SG-0001)同等的切断效率。
(试验例2)以BCL-2基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性评价
按照随附的操作手册，使组入了人BCL-2基因(基因库登录号No.NM_000633)的质粒DNA(pCAGGS-hbcl-2，Iwahashi et.al.,Nature,vol 390,pp414-417,1997)与限制性内切酶HindIII(TaKaRa)进行反应。反应结束后，按照常规方法进行纯化，以最终浓度成为100ng/μL的方式溶解于TE缓冲剂(10mM Tris-HCl,pH8，1mM EDTA)中作为基质DNA。
使用Cas9 Nuclease,S.pyogenes(New England Biolabs)中随附的试剂，将上述基质DNA与sgRNA和Cas9如下所示进行了混合；
100ng基质DNA+10ng sgRNA+0.3pmol Cas9(总量10μL)
将其在37℃下孵育30分钟后，进而在70℃下孵育10分钟使Cas9失活。然后进行电泳，溴化乙锭染色后使用凝胶成像系统PXi4(SYNGENE公司)测定了谱带强度。
基于测定结果，利用下述等式计算出切断效率。
切断效率＝裂解谱带强度的总和/(裂解谱带强度与未裂解谱带强度的总和)
将结果示于图2。任意的人工sgRNA均显示出与天然型sgRNA(SG-0017)同等或不低于天然型sgRNA的切断效率。
(实施例2)苯丙氨酸亚酰胺：化合物(5)的合成
根据下述流程图合成了化合物(5)。
Figure GDA0001817942680000551
[〔1〕化合物(1)的合成]
在Fmoc-苯丙氨酸(3.0g，7.7mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)(1.78g，9.3mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(HOBt)(2.51g，18.6mmol)的乙腈溶液(100mL)中加入4-氨基-1-丁醇(0.83g，9.3mmol)并在室温下搅拌一夜。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂。在残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩，得到目标化合物(1)的粗产物(4.1g)。
[〔2〕化合物(2)的合成]
将化合物(1)(4.1g，8.9mmol)与吡啶共沸，进行真空干燥。溶解于吡啶(80mL)中，加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(4.54g，13.4mmol)并在室温下搅拌一夜。反应结束后，加入甲醇搅拌30分钟，在减压下蒸馏除去溶剂。在残渣中加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩，得到目标化合物(2)的粗产物(9.8g)。
[〔3〕化合物(3)的合成]
在室温下、在化合物(2)(9.8g，12.9mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(50mL)和哌啶(8.9mL)，在室温下搅拌一夜。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂，将得到的残渣用硅胶柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝20：1、含0.05％吡啶)进行纯化，得到目标化合物(3)(3.1g，3阶段收率74％)。
[〔4〕化合物(4)的合成]
将化合物(3)(3.1g，5.8mmol)与吡啶共沸，进行真空干燥。在氩气气氛下、室温下加入6-羟基己酸(0.91g，6.9mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)(1.32g，6.9mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(HOBt)(1.87g，13.8mmol)和二氯甲烷(40mL)，搅拌10分钟后，加入三乙胺(2.1g，20.7mmol)，在室温下搅拌一夜。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：2、含0.05％吡啶)进行纯化，得到目标化合物(4)(2.0g，收率53％)。以下示出化合物(4)的仪器分析值。
化合物(4)：
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.41-7.39(2H,m),7.30-7.16(12H,m),6.84-6.80(4H,m),6.26(1H,d,J＝7.4Hz),5.71-5.69(1H,m),4.57-4.52(1H,m),3.79(6H,s),3.64-3.58(2H,m),3.18-3.15(1H,m),3.09-2.93(5H,m),2.19-2.16(2H,m),1.64-1.58(2H,m),1.56-1.50(2H,m),1.46-1.39(4H,m),1.36-1.30(2H,m).
[〔5〕化合物(5)的合成]
将化合物(4)(2.0g，3.1mmol)与吡啶共沸，进行真空干燥。接着，加入乙腈(4mL)和二异丙基四唑化铵(0.63g，3.7mmol)，进而加入2-氰基乙基-N,N,N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.1g，3.7mmol)，在40℃下搅拌2小时。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂，加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1、含有0.1％三乙胺)进行纯化，得到目标化合物(5)(2.4g，纯度97.5％,收率92％)。
示出化合物(5)的仪器分析值。
化合物(5)：
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.41-7.40(2H,m),7.33-7.16(12H,m),6.86-6.80(4H,m),6.28(1H,d,J＝7.7Hz),5.77(1H,t,J＝6.0Hz),4.58-4.54(1H,m),3.87-3.80(1H,m),3.79-3.74(1H,m),3.78(6H,s),3.67-3.53(4H,m),3.21-3.15(1H,m),3.10-2.94(5H,m),2.62(2H,t,J＝6.4Hz),2.18-2.12(2H,m),1.64-1.55(4H,m),1.46-1.39(4H,m),1.36-1.31(2H,m),1.17(12H,m).
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ:147.95,147.91
ESI-Mass：871.49[M+H2O+H]+
(实施例3)亮氨酸亚酰胺：化合物(10)的合成
根据下述流程图合成了化合物(10)。
Figure GDA0001817942680000581
[〔1〕化合物(6)的合成]
在Fmoc-亮氨酸(3.0g，8.5mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)(1.95g，10.2mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(HOBt)(2.75g，20.4mmol)的乙腈溶液(90mL)中加入4-氨基-1-丁醇(0.91g，10.2mmol)并在室温下搅拌一夜。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂。在残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩，得到目标化合物(6)的粗产物(4.42g)。
[〔2〕化合物(7)的合成]
将化合物(6)(4.42g，10.4mmol)与吡啶共沸，进行真空干燥。溶解于吡啶(80mL)中，加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(5.29g，15.6mmol)在室温下搅拌一夜。反应结束后，加入甲醇搅拌30分钟，在减压下蒸馏除去溶剂。在残渣中加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩，得到目标化合物(7)的粗产物(9.51g)。
[〔3〕化合物(8)的合成]
在室温下、在化合物(7)(9.51g，13.1mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(40mL)和哌啶(9.0mL)，在室温下搅拌一夜。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂，将得到的残渣用硅胶柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝30：1、含0.05％吡啶和氯甲烷：甲醇＝40：1、含0.05％吡啶)进行纯化，得到目标化合物(8)(3.89g，3阶段收率91％)。
[〔4〕化合物(9)的合成]
将化合物(8)(3.89g，7.7mmol)与吡啶共沸，进行真空干燥。在氩气气氛下、在室温下加入6-羟基己酸(1.22g，9.2mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)(1.77g，9.2mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(HOBt)(2.50g，18.5mmol)和二氯甲烷(50mL)，搅拌10分钟后，加入三乙胺(2.81g，27.7mmol)，在室温下搅拌一夜。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：4、含0.05％吡啶)进行纯化，得到目标化合物(9)(3.80g，收率80％)。以下示出化合物(9)的仪器分析值。
化合物(9)：
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.42-7.41(2H,m),7.31-7.27(6H,m),7.21-7.18(1H,m),6.83-6.80(4H,m),6.21(1H,t,J＝5.7Hz),6.05(1H,d,J＝8.3Hz),4.41-4.36(1H,m),3.78(6H,s),3.64-3.59(2H,m),3.31-3.15(2H,m),3.06(2H,t,J＝6.0Hz),2.20(2H,t,J＝7.4Hz),1.78(1H,t,J＝5.5Hz),1.68-1.47(10H,m),1.40-1.34(2H,m),0.93-0.91(6H,m).
[〔5〕化合物(10)的合成]
将化合物(9)(3.80g，6.1mmol)与吡啶共沸，进行真空干燥。接着，加入乙腈(7.6mL)和二异丙基四唑化铵(1.26g，7.4mmol)，进而加入2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(2.22g，7.4mmol)，在40℃下搅拌2小时。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂，加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液各清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：1、含有0.1％三乙胺)进行纯化，得到目标化合物(10)(4.80g，纯度97.5％,收率95.4％)。以下示出化合物(10)的仪器分析值。
化合物(10)：
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.42-7.40(2H,m),7.31-7.26(6H,m),7.21-7.18(1H,m),6.83-6.81(4H,m),6.29(1H,t,J＝5.6Hz),6.09(1H,d,J＝8.5Hz),4.42-4.37(1H,m),3.87-3.74(2H,m),3.78(6H,s),3.68-3.51(4H,m),3.29-3.23(1H,m),3.19-3.14(1H,m),3.06(2H,t,J＝5.7Hz),2.62(2H,t,J＝6.2Hz),2.19(2H,t,J＝8.0Hz),1.69-1.50(8H,m),1.40-1.35(2H,m),1.30-1.21(2H,m),1.17(12H,m),0.94-0.91(6H,m).
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ:147.95
ESI-Mass：841.47[M+Na]+
(实施例4)谷氨酸亚酰胺：化合物(15)的合成
根据下述流程图合成了化合物(15)。
Figure GDA0001817942680000601
[〔1〕化合物(11)的合成]
在6-羟基己酸(1.00g，7.6mmol)与二甲基氨基吡啶(DMAP)(92mg，0.8mmol)的吡啶溶液(25ml)中加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(2.6g，7.6mmol)并在室温下搅拌5小时。通过TLC确认原料消失后，加入甲醇搅拌30分钟。在减压下蒸馏除去溶剂，加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗3次、用饱和盐水清洗1次。将有机层用硫酸钠干燥后，进行减压浓缩，使用己烷进行了研磨。进行减压干燥，得到油状粗产物。在该油状粗产物中加入二氯甲烷(32mL)，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)(2.48g，13.0mmol)、N-羟基琥珀酸酰亚胺(1.49g，13.0mmol)并在室温下搅拌一夜。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂，加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠溶液清洗3次、用饱和盐水清洗1次。将有机层用硫酸钠干燥后，在减压下蒸馏除去溶剂，得到目标化合物(11)的粗产物(3.40g)。
[〔2〕化合物(12)的合成]
向Boc-谷氨酸(OMe)(2.0g，7.7mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)(1.76g，9.2mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(HOBt)(2.48g，18.4mmol)的乙腈溶液(40mL)中加入4-氨基-1-丁醇(0.82g，9.2mmol)并在室温下搅拌一夜。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂。在残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩，得到目标化合物(12)的粗产物(2.30g)。
[〔3〕化合物(13)的合成]
在化合物(12)(2.30g，6.9mmol)中加入1,4-二氧六环(23ml)并溶解，在0℃下加入盐酸(2.3ml)，恢复至室温并搅拌30分钟。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂，使用异丙醚进行研磨使其减压干燥，得到目标化合物(13)的粗产物(2.06g)。
[〔4〕化合物(14)的合成]
在化合物(13)(0.93g，4.0mmol)的DMF溶液(9ml)中加入三乙胺(0.61g，6.0mmol)、化合物(11)(2.34g，4.4mmol)的DMF溶液(9ml)并在室温下搅拌一夜。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂，在残渣中加入二氯甲烷，用饱和盐水清洗3次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，在减压下蒸馏除去溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯、含0.05％吡啶)对得到的粗产物进行了纯化。进行2次该反应而得到目标化合物(14)(0.85g)。以下示出化合物(14)的仪器分析值。
化合物(14)：
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.43-7.41(2H,m),7.32-7.26(6H,m),7.21-7.18(1H,m),6.87-6.85(1H,m),6.83-6.80(4H,m),6.51(1H,d,J＝7.3Hz),4.43-4.38(1H,m),3.79(6H,s),3.67(3H,s),3.63(2H,d,J＝6.1Hz),3.28-3.25(2H,m),3.02(2H,t,J＝6.6Hz),2.54-2.48(1H,m),2.38-2.32(1H,m),2.20-2.17(2H,m),2.14-2.07(1H,m),1.96-1.89(1H,m),1.64-1.53(8H,m),1.40-1.34(2H,m)
[〔5〕化合物(15)的合成]
将化合物(14)(0.85g，1.3mmol)与吡啶共沸，进行真空干燥。接着，加入乙腈(2.5mL)和二异丙基四唑化铵(0.27g，1.6mmol)，进而加入2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.47g，1.6mmol)，在室温下搅拌2小时。反应结束后，在减压下蒸馏除去溶剂，加入乙酸乙酯用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次、用饱和氯化钠水溶液清洗1次。将清洗后的有机层用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩。将得到的粗产物利用硅胶柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1：2、含有0.1％三乙胺)进行纯化，得到目标化合物(15)(0.95g，纯度92.％,收率86.4％)。以下示出化合物(15)的仪器分析值。
化合物(15)：
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.43-7.41(2H,m),7.32-7.26(6H,m),7.21-7.17(1H,m),6.83-6.80(4H,m),6.63-6.60(1H,m),6.47(1H,d,J＝7.4Hz),4.44-4.40(1H,m),3.88-3.82(1H,m),3.80-3.75(1H,m),3.78(6H,s),3.71-3.67(1H,m),3.66(3H,s),3.64-3.55(3H,m),3.31-3.21(2H,m),3.03(2H,t,J＝6.4Hz),2.64(2H,t,J＝6.4Hz),2.53-2.47(1H,m),2.38-2.32(1H,m),2.18(2H,t,J＝7.5Hz),2.14-2.07(1H,m),1.96-1.89(1H,m),1.64-1.56(8H,m),1.41-1.34(2H,m),1.19-1.16(12H,m).
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ:147.89
ESI-Mass：867.49[M+H2O+H]+
(实施例5)脯氨酸亚酰胺：化合物(5a-c)的合成
根据下述流程图合成了化合物(5a-c)。
Figure GDA0001817942680000631
[〔1〕化合物(1a)的合成]
将Fmoc-L-脯氨酸(3.0g、8.9mmol)溶解于脱水N,N-二甲基甲酰胺(50mL)中。加入6-氨基-1-己醇(1.3g、1.2eq)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(2.0g、1.2eq)、1-羟基苯并三唑(3.3g、2.4eq)，在氩气气氛下、在室温下搅拌整夜。反应结束后，对于反应混合物在减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。将得到的残渣供于硅胶柱色谱法(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(20：1))，得到目标物质2.9g(收率75％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.76-7.83(m,2H)、7.50-7.63(m,2H)、7.38-7.43(m,2H)、7.27-7.34(m,2H)，4.54-4.35(m,2H)，4.13-4.35(m,2H)，3.54-3.63(m,2H)、3.35-3.54(m,2H)、3.17-3.28(m,2H)、1.82-2.07(m,3H)、1.21-1.59(m,9H)
[〔2〕化合物(2a)的合成]
使用脱水吡啶，将化合物1a(2.9g，6.6mmol)共沸干燥。将残渣溶解于脱水吡啶(40mL)中。在0℃下加入4,4-二甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl)(2.7g，1.2eq.)并在室温下搅拌整夜。通过TLC确认原料消失后，加入甲醇搅拌30分钟。在减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。进行减压干燥，得到油状物质5.0g。
[〔3〕化合物(3a)的合成]
将化合物2a(5.0g，6.6mmol)溶解于脱水N,N-二甲基甲酰胺(40mL)中。加入哌啶(6.5mL)，在氩气气氛下、在室温下搅拌整夜。反应结束后，对于反应混合物在减压下蒸馏除去溶剂。将得到的残渣供于硅胶柱色谱法(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(20：1)、0.05％吡啶)，得到目标物质2.6g(收率76％、2阶段)。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.44-7.49(m,2H)、7.28-7.38(m,6H)、7.20-7.26(m,1H)、6.83-6.88(m,4H)、3.83(s,6H)、3.70(dd，1H,J＝9.2Hz，5.2Hz)、3.20(q,2H,J＝6.9Hz)、3.03(t，2H,J＝6.6Hz)、2.97-3.00(m,1H)、2.86-2.93(m,1H)、2.10-2.21(m,1H)、1.58-1.97(m,5H)、1.25-1.57(m,6H)
[〔4〕化合物(4a)的合成]
将化合物3a(2.5g、4.8mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中。将8-羟基辛酸(0.93g、1.2eq)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1.1g、1.2eq)、1-羟基苯并三唑(1.8g、2.4eq)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中。在在0℃下加入化合物3a的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在氩气气氛下、在室温下搅拌整夜。反应结束后，对于反应混合物在减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。将得到的残渣供于硅胶柱色谱法(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(40：1)、0.05％吡啶)，得到目标物质2.1g(收率71％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.42-7.46(m,2H)、7.26-7.36(m,6H)、7.16-7.24(m,1H)、6.81-6.86(m,4H)、3.79(s,6H)、3.58-3.66(m,2H)、3.49-3.56(m,1H)、3.37-3.44(m,1H)、3.10-3.27(m,1H)、3.01(2H,t,J＝6.6Hz)、2.29-2.35(m,2H)、1.42-1.71(m,10H)、1.21-1.41(m,12H)
[〔5〕化合物(5a)的合成]
在共沸干燥的化合物4a(2.0g，2.6mmol)的乙腈溶液(8mL)中加入二异丙基四唑化铵(DIPAT)(0.64g，1.2eq.)。加入2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.1g，1.2eq.)的乙腈溶液(2mL)，在室温下搅拌2小时。加入二氯甲烷并用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。将残渣供于使用了氨基二氧化硅的硅胶柱色谱法(展开溶剂：正己烷-乙酸乙酯(1：1)、0.1％三乙胺)，得到目标物质2.1g(收率81％)。
31P-NMR(CDCl3)：δ＝147.821
ESI-Mass m/z：877.55[M+H2O+H]+,960.66[M+TEA+H]+
[〔6〕化合物(1b)的合成]
将Fmoc-L-脯氨酸(3.0g、8.9mmol)溶解于脱水N,N-二甲基甲酰胺(60mL)中。加入8-氨基-1-辛醇(1.5g、1.2eq)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(2.0g、1.2eq)、1-羟基苯并三唑(3.3g、2.4eq)，在氩气气氛下、在室温下搅拌整夜。反应结束后，对于反应混合物在减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。将得到的残渣供于硅胶柱色谱法(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(20：1))，得到目标物质3.0g(收率73％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.76-7.83(m,2H)、7.50-7.64(m,2H)、7.39-7.45(m,2H)、7.30-7.36(m,2H)，4.58-4.37(m,2H)，4.16-4.37(m,2H)，3.57-3.65(m,2H)、3.38-3.57(m,2H)、3.10-3.30(m,2H)、1.82-2.07(m,3H)、1.21-1.59(m,13H)
[〔7〕化合物(2b)的合成]
使用脱水吡啶，使化合物1b(3.0g，6.5mmol)共沸干燥。将残渣溶解于脱水吡啶(40mL)中。在0℃下加入4,4-二甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl)(2.6g，1.2eq.)并在室温下搅拌整夜。通过TLC确认原料消失后，加入甲醇搅拌30分钟。在减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。进行减压干燥，得到油状物质5.0g。
[〔8〕化合物(3b)的合成]
将化合物2b(5.0g，6.5mmol)溶解于脱水N,N-二甲基甲酰胺(40mL)中。加入哌啶(6.4mL)，在氩气气氛下、在室温下搅拌整夜。反应结束后，对于反应混合物在减压下蒸馏除去溶剂。将得到的残渣供于硅胶柱色谱法(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(15：1)、0.05％吡啶)，得到目标物质2.9g(收率83％、2阶段)。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.43-7.47(m,2H)、7.26-7.37(m,6H)、7.18-7.23(m,1H)、6.81-6.86(m,4H)、3.80(s,6H)、3.71(dd，1H,J＝9.2Hz，5.2Hz)、3.21(q,2H,J＝6.9Hz)、2.97-3.06(m,3H)、2.85-2.91(m,1H)、2.09-2.18(m,1H)、1.87-1.96(m,1H)、1.66-1.74(m,2H)、1.57-1.65(m,2H)、1.44-1.52(m,2H)、1.22-1.38(m,8H)
[〔9〕化合物(4b)的合成]
将化合物3b(2.8g、5.1mmol)溶解于脱水二氯甲烷(40mL)中。加入10-羟基癸酸(1.2g、1.2eq)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1.2g、1.2eq)、1-羟基苯并三唑(1.9g、2.4eq)、三乙胺(2.6mL)，在氩气气氛下、在室温下搅拌整夜。反应结束后，对于反应混合物在减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。将得到的残渣供于硅胶柱色谱法(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(20：1)、0.05％吡啶)，得到目标物质2.5g(收率70％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.41-7.45(m,2H)、7.25-7.35(m,6H)、7.16-7.21(m,1H)、6.79-6.85(m,4H)、3.79(s,6H)、3.58-3.65(m,2H)、3.48-3.54(m,1H)、3.36-3.43(m,1H)、3.11-3.22(m,1H)、3.01(2H,t,J＝6.6Hz)、2.26-2.32(m,2H)、1.50-1.68(m,8H)、1.39-1.49(m,2H)1.19-1.38(m,20H)
[〔10〕化合物(5b)的合成]
在共沸干燥的化合物4b(2.4g，3.4mmol)的乙腈溶液(8mL)中加入二异丙基四唑化铵(DIPAT)(0.69g，1.2eq.)。加入2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.2g，1.2eq.)的乙腈溶液(2mL)，在室温下搅拌2小时。加入二氯甲烷并用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。将残渣供于使用了氨基二氧化硅的硅胶柱色谱法(展开溶剂：正己烷-乙酸乙酯(1：1)、0.1％三乙胺)，得到目标物质2.4g(收率80％)。
31P-NMR(CDCl3)：δ＝147.810
ESI-Mass m/z：937.56[M+Na]+,1016.70[M+TEA+H]+
[〔11〕化合物(1c)的合成]
将Fmoc-L-脯氨酸(3.0g、8.9mmol)溶解于脱水乙腈(75mL)与脱水N,N-二甲基甲酰胺(15mL)的混合溶剂中。加入10-氨基-1-癸醇(1.8g、1.2eq)和N,N'-二环己基碳酰二亚胺(2.2g、1.2eq)、1-羟基苯并三唑(3.3g、2.4eq)，在氩气气氛下、在室温下搅拌整夜。将反应结束后沉淀物过滤，对于滤液在减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。使用二异丙醚进行了研磨。进行减压干燥，得到固体物质4.0g(收率93％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.72-7.78(m,2H)、7.50-7.62(m,2H)、7.35-7.42(m,2H)、7.26-7.33(m,2H)，4.54-4.33(m,2H)，4.12-4.33(m,2H)，3.57-3.62(m,2H)、3.34-3.54(m,2H)、3.06-3.26(m,2H)、1.80-2.04(m,3H)、1.13-1.47(m,17H)
[〔12〕化合物(2c)的合成]
使用脱水吡啶，将化合物1c(3.9g，8.0mmol)共沸干燥。将残渣溶解于脱水吡啶(50mL)中。在0℃下加入4,4-二甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl)(3.2g，1.2eq.)并在室温下搅拌整夜。通过TLC确认原料消失后，加入甲醇搅拌30分钟。在减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。进行减压干燥，得到油状物质6.2g。
[〔13〕化合物(3c)的合成]
将化合物2c(6.2g，7.8mmol)溶解于脱水N,N-二甲基甲酰胺(50mL)中。加入哌啶(7.7mL)，在氩气气氛下、在室温下搅拌整夜。反应结束后，对于反应混合物在减压下蒸馏除去溶剂。将得到的残渣供于硅胶柱色谱法(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(15：1)、0.05％吡啶)，得到目标物质3.4g(收率76％、2阶段)。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.38-7.42(m,2H)、7.21-7.31(m,6H)、7.13-7.18(m,1H)、6.75-6.80(m,4H)、3.79(s,6H)、3.72(dd，1H,J＝9.2Hz，5.7Hz)、3.21(q,2H,J＝6.9Hz)、2.98-3.03(m,3H)、2.80-2.88(m,1H)、2.05-2.15(m,1H)、1.83-1.91(m,1H)、1.66-1.74(m,2H)、1.52-1.59(m,2H)、1.38-1.48(m,2H)、1.16-1.34(m,12H)
[〔14〕化合物(4c)的合成]
将化合物3c(2.4g、4.2mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中。将12-羟基十二烷酸(1.1g、1.2eq)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(0.96g、1.2eq)、1-羟基苯并三唑(1.5g、2.4eq)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中。在0℃下加入化合物3c的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在氩气气氛下、在室温下搅拌整夜。反应结束后，对于反应混合物在减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。将得到的残渣供于硅胶柱色谱法(展开溶剂：正己烷-乙酸乙酯(1：3)、0.05％吡啶)，得到目标物质2.1g(收率66％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.41-7.45(m,2H)、7.25-7.34(m,6H)、7.17-7.22(m,1H)、6.79-6.83(m,4H)、3.79(s,6H)、3.58-3.67(m,2H)、3.47-3.56(m,1H)、3.35-3.44(m,1H)、3.09-3.29(m,1H)、3.02(2H,t,J＝6.6Hz)、2.25-2.35(m,2H)、1.53-1.65(m,9H)、1.18-1.39(m,29H)
[〔15〕化合物(5c)的合成]
在共沸干燥的化合物4c(2.0g，2.6mmol)的乙腈溶液(8mL)中加入二异丙基四唑化铵(DIPAT)(0.53g，1.2eq.)。加入2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.94g，1.2eq.)的乙腈溶液(2mL)，在室温下搅拌2小时。加入二氯甲烷并用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水清洗。用硫酸钠干燥有机相后，蒸馏除去溶剂。将残渣供于使用了氨基二氧化硅的硅胶柱色谱法(展开溶剂：正己烷-乙酸乙酯(1：1)、0.1％三乙胺)，得到目标物质1.9g(收率76％)。
31P-NMR(CDCl3)：δ＝147.821
ESI-Mass m/z：989.67[M+H2O+H]+,1072.78[M+TEA+H]+
(实施例6)sgRNA的合成
使用实施例2～5中合成的化合物5、10、15、5a、5b和5c、及本身公知的脯氨酸二酰胺亚酰胺、赖氨酸二酰胺亚酰胺、甘氨酸二酰胺亚酰胺、对苯二甲酸二酰胺亚酰胺和甘氨酰基甘氨酸二酰胺亚酰胺，利用与实施例1同样的方法合成了表2-1～表4所示的sgRNA。下述序列中，下划线表示与靶核苷酸序列互补的引导区域，氨基酸衍生物连接子如表5所示用简写表示。
[表2-1]
Figure GDA0001817942680000691
[表2-2]
Figure GDA0001817942680000701
[表2-3]
Figure GDA0001817942680000711
[表3-1]
Figure GDA0001817942680000721
[表3-2]
Figure GDA0001817942680000731
[表4]
Figure GDA0001817942680000741
[表5]
氨基酸亚酰胺
简称 氨基酸 通式 n m 实施例的化合物
X 甘氨酰基甘氨酸(GlyGly) I-4 5 4
X7 对苯二甲酸(TP) I-6 4 4
X8 甘氨酸(Gly) I-1 5 4
X10 苯基丙氨酸(P) IV-1 5 4 化合物5
X11 亮氨酸(L) IV-2 5 4 化合物10
X12 谷氨酸(E) IV-3 5 4 化合物15
P 脯氨酸(P) II-8 5 4
P13 脯氨酸(P) II-8 7 6 化合物5a
P14 脯氨酸(P) II-8 9 8 化合物5b
P15 脯氨酸(P) II-8 11 10 化合物5c
K 赖氨酸(K) I-7 5 4
(试验例3)以KRAS基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性评价-2
按照随附的操作手册，使组入了具有人KRAS基因(基因库登录号No.NM_004985.3)的G12V突变的序列(NCBI Refference Sequence NP_0049762)的质粒DNA(pCMV6-Entry-KRAS(G12V)，OriGene Technologies)与限制性内切酶Tth111I(TaKaRa)进行了反应。反应结束后，按照常规方法进行纯化，以最终浓度成为100ng/μL的方式溶解于TE缓冲剂(10mMTris-HCl，pH8，1mM EDTA)中作为基质DNA。
使用Cas9 Nuclease，S.pyogenes(New England Biolabs)中随附的试剂，将上述基质DNA与sgRNA和Cas9如下所示进行了混合；
100ng基质DNA+0.5ng sgRNA+0.3pmol Cas9(总量10μL)
在37℃下孵育15分钟后，进而在70℃下孵育10分钟使Cas9失活。然后进行电泳，溴化乙锭染色后使用凝胶成像系统PXi4(SYNGENE公司)测定了谱带强度。
基于测定结果，利用下述等式计算出切断效率。
切断效率＝裂解谱带强度的总和/(裂解谱带强度与未裂解谱带强度的总和)
将该结果示于图3～6。凝胶下的数值表示利用上述计算式求出的切断效率。进而，将作为参考例的天然型sgRNA(SG-0001)的切断效率设为1时的本实施例的人工sgRNA的相对切断效率示于图7。
可知的是，本实施例的人工sgRNA的大部分显示出与作为参考例的天然型sgRNA同等或高于天然型sgRNA的切断效率，通过各部位的氨基酸衍生物的置换是有效的。
(试验例4)以BCL-2基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性评价-2
按照随附的操作手册，使组入了人BCL-2基因(基因库登录号No.NM_000633)的质粒DNA(pCAGGSHB2)与限制性内切酶HindIII(TaKaRa)进行反应。反应结束后，按照常规方法进行纯化，以最终浓度成为100ng/μL的方式溶解于TE缓冲剂(10mM Tris-HCl,pH8，1mMEDTA)中作为基质DNA。
使用Cas9 Nuclease,S.pyogenes(NewEnglandBiolabs)中随附的试剂，将上述基质DNA与sgRNA和Cas9如下所示进行了混合；
100ng基质DNA+10ng sgRNA+0.3pmol Cas9(总量10μL)
在37℃下孵育30分钟后，进而在70℃下孵育10分钟使Cas9失活。然后进行电泳，溴化乙锭染色后使用凝胶成像系统PXi4(SYNGENE公司)测定了谱带强度。
基于测定结果，利用下述等式计算出切断效率。
切断效率＝裂解谱带强度的总和/(裂解谱带强度与未裂解谱带强度的总和)
将该结果示于图8。凝胶下的数值表示利用上述计算式求出的切断效率。进而，将作为参考例的天然型sgRNA(SG-0017)的切断效率设为1时的本实施例的人工sgRNA的相对切断效率示于图9。
可知的是，本实施例的人工sgRNA显示出与作为参考例的天然型sgRNA同等或高于天然型sgRNA的切断效率，通过各部位的氨基酸衍生物的置换是有效的。
(试验例5)以BRAF基因为靶向的sgRNA在体外的切断活性评价
按照随附的操作手册，使组入了具有人BRAF基因(基因库登录号No.NM_004333)的V600E突变的序列的质粒DNA(pCMV6-Entry-BRAF(V600E)，OriGene Technologies)与限制性内切酶Tth111I(TaKaRa)进行了反应。反应结束后，按照常规方法进行纯化，以最终浓度成为100ng/μL的方式溶解于TE缓冲剂(10mM Tris-HCl,pH8，1mM EDTA)中作为基质DNA。
使用Cas9 Nuclease,S.pyogenes(New England Biolabs)中随附的试剂，将上述基质DNA与sgRNA和Cas9如下所示进行了混合；
100ng基质DNA+0.5ng sgRNA+0.3pmol Cas9(总量10μL)
在37℃下孵育15分钟后，进而在70℃下孵育10分钟使Cas9失活。然后进行电泳，溴化乙锭染色后使用凝胶成像系统PXi4(SYNGENE公司)测定了谱带强度。
基于测定结果，利用下述等式计算出切断效率。
切断效率＝裂解谱带强度的总和/(裂解谱带强度与未裂解谱带强度的总和)
将该结果示于图10。凝胶下的数值表示利用上述计算式求出的切断效率。进而，作为参考例的天然型sgRNA(SG-0090)的切断效率设为1时的本实施例的人工sgRNA的相对切断效率示于图11。
可知的是，本实施例的人工sgRNA显示出与作为参考例的天然型sgRNA同等或高于天然型sgRNA的切断效率，通过各部位的氨基酸衍生物的置换是有效的。
(试验例6)以BCL-2基因为靶向的sgRNA在细胞内切断活性评价
将Jurkat细胞(2×105个)收集至微型管中用PBS清洗后，使用将6μg GeneArtPlatinum Cas9 Nuclease(Thermo Fisher Scientific公司)和1.2μg sgRNA加入Neon 10μL tip(Thermo Fisher Scientific公司)随附带ReSuspension buffer R中得到的被检物质溶液10μL，从而使细胞悬浮。将细胞悬浮液吸入Neon 10μL顶端，在脉冲电压1700V、脉冲宽度20ms、脉波次数1次的条件下使用电转化仪Neon(Thermo Fisher Scientific公司)进行了转染。使用包含10％胎牛血清(MP Biomedicals)的RPMI1640培养基(Thermo FisherScientific公司)500μL将得到的细胞接种在24孔板(Thermo Fisher Scientific公司)中。在37℃、5％CO2下培养48小时后回收细胞并用PBS清洗后，使用GeneArt(注册商标)GenomicCleavage Detection Kit(Thermo Fisher Scientific公司)对基因组DNA进行了纯化。将得到的基因组DNA的一部分作为模板，使用人BCL-2基因扩增用引物试剂盒：5’-ATCAAGTGTTCCGCGTGATTGAAGA-3’/5’-CTCACATCACCAAGTGCACCTACCC-3’，根据GeneArt(注册商标)Genomic Cleavage Detection Kit随附的方案进行了PCR。使用得到的PCR产物，按照GeneArt(注册商标)Genomic Cleavage Detection Kit中随附的操作手册进行染色体in-del检测反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳，对于经溴化乙锭染色的凝胶使用凝胶成像系统PXi4(SYNGENE公司)测定了谱带强度。
基于测定结果，利用下述等式计算出切断效率。
切断效率＝1-[(1-裂解分数)1/2]
裂解分数＝裂解谱带强度的总和/(裂解谱带强度与未裂解谱带强度的总和)
将该结果示于图12。凝胶下的数值表示利用上述计算式求出的切断效率。进而，将作为参考例的天然型sgRNA(SG-0017)的切断效率设为1时的本实施例的人工sgRNA的相对切断效率示于图13。
在本实施例的人工sgRNA中，在细胞内也显示出与作为参考例的天然型sgRNA同等或高于天然型sgRNA的切断效率。
(试验例7)以BRAF基因为靶向的sgRNA的细胞内切断活性评价
将A-375细胞(5.6×104个)收集至微型管中用PBS清洗后，使用将6μg GeneArtPlatinum Cas9 Nuclease(Thermo Fisher Scientific公司)和1.2μg sgRNA加入Neon 10μL tip(Thermo Fisher Scientific公司)随附的ReSuspension buffer R中而得到的被检物质溶液10μL，从而使细胞悬浮。将细胞悬浮液吸入Neon 10μL tip，在脉冲电压1400V、脉冲宽度20ms、脉波次数2次的条件下使用电转化仪Neon(Thermo Fisher Scientific公司)进行了转染。使用包含10％胎牛血清(MP Biomedicals)的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(High Glucose)(Sigma Aldrich公司)500μL将得到的细胞接种在24孔板(ThermoFisher Scientific公司)中。在37℃、5％CO2下培养48小时后细胞用PBS清洗后，使用GeneArt(注册商标)Genomic Cleavage Detection Kit(Thermo Fisher Scientific公司)对基因组DNA进行了纯化。将得到的基因组DNA的一部分作为模板，使用人BRAF基因扩增用引物试剂盒：5’-CGCCCAGGAGTGCCAAGAGAATATC-3’/5’-CAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAAT-3’，根据GeneArt(注册商标)Genomic Cleavage Detection Kit随附的方案进行了PCR。使用得到的PCR产物，根据GeneArt(注册商标)Genomic Cleavage Detection Kit中随附的方案进行染色体in-del检测反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳，对于经溴化乙锭染色的凝胶使用凝胶成像系统PXi4(SYNGENE公司)测定了谱带强度。
基于测定结果，利用下述等式计算出切断效率。
切断效率＝1-[(1-裂解分数)1/2]
裂解分数＝裂解谱带强度的总和/(裂解谱带强度与未裂解谱带强度的总和)
将该结果示于图14。凝胶下的数值表示利用上述计算式求出的切断效率。进而，将作为参考例的天然型sgRNA(SG-0090)的切断效率设为1时的本实施例的人工sgRNA的相对切断效率示于图15。
在本实施例的人工sgRNA中，在细胞内也显示出与作为参考例的天然型sgRNA同等或高于天然型sgRNA的切断效率。
以上参照实施方式对本发明进行了说明，但本发明不限定于上述实施方式。本发明的特征详细内容能在本发明的保护范围内进行本领域技术人员可理解的各种变更。
对于包括此处叙述的专利和专利申请说明书在内的所有刊物中记载的内容，是通过在此引用而将其全部公开内容同等程度地引入该说明书中。
本申请以2016年1月30日在日本申请的特愿2016-016743作为基础，在此通过提及将其内容全部引入本说明书中。
产业上的可利用性
本发明的人工sgRNA能够容易地以低成本来合成，且在与Cas9组合时，保持与天然型sgRNA同等或高于天然型sgRNA的DSB活性，同时使在生物体内的稳定性提高，因此对于基因组编集效率、特别是在体内的基因组编集效率的改善是有用的。
序列表
<110> 株式会社博纳克（BONAC CORPORATION）
<120> 人工单导RNA及其用途
<130> 092550
<150> JP 2016-016743
<151> 2016-01-30
<160> 83
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 源自酿脓链球菌的crRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> crRNA的引导区域
<400> 1
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 2
<211> 69
<212> RNA
<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(69)
<223> 源自酿脓链球菌的tracrRNA
<400> 2
aaacagcaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga 60
gucggugcu 71
<210> 3
<211> 98
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 源自酿脓链球菌的sgRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> sgRNA的引导区域
<400> 3
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuu 100
<210> 4
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> sgRNA SG-0001特异性结合人KRAS基因
<400> 4
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 101
<210> 5
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0002特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 5
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 6
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0012特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<400> 6
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 7
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0013特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子连接
<400> 7
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 8
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<223> 修饰的sgRNA SG-0014特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 8
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
<210> 9
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0015特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 9
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
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<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0016特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用脯氨酸衍生物连接子修饰第1位“g”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 10
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
<210> 11
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> sgRNA SG-0017特异性结合人BCL-2基因
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aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 101
<210> 12
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0018特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 12
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 13
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0019特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<400> 13
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 14
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0020特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子连接
<400> 14
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
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<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0021特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 15
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
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<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0022特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
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aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0023特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用脯氨酸衍生物连接子修饰第1位“a”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
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aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
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<212> RNA
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<223> 修饰的sgRNA SG-0024特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物(P13)连接子连接
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aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0025特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物(P14)连接子连接
<400> 19
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0026特异性结合人KRAS基因
<220>
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<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物(P15)连接子连接
<400> 20
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0027特异性结合人KRAS基因
<220>
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<222> (32)..(33)
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guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0028特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过亮氨酸衍生物连接子连接
<400> 22
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 23
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0029特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过谷氨酸衍生物连接子连接
<400> 23
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 24
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0030特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
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<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 24
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 25
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0031特异性结合人KRAS基因
<220>
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<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
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<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过脯氨酸衍生物(P13)连接子连接
<220>
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<222> (63)..(64)
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cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0032特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
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<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过脯氨酸衍生物(P14)连接子连接
<220>
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<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
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guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0033特异性结合人KRAS基因
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<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过脯氨酸衍生物(P15)连接子连接
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<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 27
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 28
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0034特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过苯丙氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 28
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 29
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0035特异性结合人KRAS基因
<220>
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<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
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<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过亮氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 29
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 30
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0036特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过谷氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 30
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 31
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0050特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过甘氨酸衍生物连接子连接
<400> 31
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 32
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0051特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过对苯二甲酸衍生物连接子连接
<400> 32
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 33
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0052特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过甘氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 33
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 34
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0053特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过对苯二甲酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
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guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
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<212> RNA
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<223> 修饰的sgRNA SG-0075特异性结合人KRAS基因
<220>
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<222> (32)..(33)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过赖氨酸衍生物连接子连接
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guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
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<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0076特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子连接
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guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
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<212> RNA
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<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0077特异性结合人KRAS基因
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<222> (32)..(33)
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<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过甘氨酸衍生物连接子连接
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guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
<210> 38
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0078特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过对苯二甲酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过对苯二甲酸衍生物连接子连接
<400> 38
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0079特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过苯丙氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过苯丙氨酸衍生物连接子连接
<400> 39
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
<210> 40
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0080特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过亮氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过亮氨酸衍生物连接子连接
<400> 40
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
<210> 41
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0081特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过谷氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过谷氨酸衍生物连接子连接
<400> 41
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
<210> 42
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0082特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 42
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 43
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0083特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用赖氨酸衍生物连接子修饰第1位“g”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<400> 43
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
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<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0084特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子修饰第1位“g”.
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子连接
<400> 44
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
<210> 45
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0085特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用甘氨酸衍生物连接子修饰第1位“g”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过甘氨酸衍生物连接子连接
<400> 45
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
<210> 46
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0086特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过对苯二甲酸衍生物连接子连接
<400> 46
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
<210> 47
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0087特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用苯丙氨酸衍生物连接子修饰第1位“a”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
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<400> 47
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
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<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0088特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用亮氨酸衍生物连接子修饰第1位“g”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过亮氨酸衍生物连接子连接
<400> 48
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
<210> 49
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0089特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用谷氨酸衍生物连接子修饰第1位“g”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过谷氨酸衍生物连接子连接
<400> 49
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
<210> 50
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0004特异性结合人KRAS基因
<400> 50
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cg 64
<210> 51
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0054特异性结合人KRAS基因
<400> 51
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu 82
<210> 52
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0055特异性结合人KRAS基因
<400> 52
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggc 55
<210> 53
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0056特异性结合人KRAS基因
<400> 53
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau 50
<210> 54
<211> 45
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0057特异性结合人KRAS基因
<400> 54
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguu 45
<210> 55
<211> 97
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0058特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(56)
<223> 第55位“c”和第56位“g”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 55
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcguccg 60
uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuu 99
<210> 56
<211> 96
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0059特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(88)
<223> 第87位“g”和第88位“c”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 56
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgcgg ugcuuu 98
<210> 57
<211> 89
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0060特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(30)
<223> 第29位“g”和第30位“c”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 57
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60
uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 91
<210> 58
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0061特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“a”和第69位“g”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 58
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucagg caccgagucg gugcuuu 89
<210> 59
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0062特异性结合人KRAS基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(30)
<223> 第29位“g”和第30位“c”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(53)
<223> 第52位“g”和第53位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(54)
<223> 第53位“a”和第54位“g”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 59
guaguuggag cuguuggcgu guuuuagagc aaguuaaaau aaggcuaguc cgaggcaccg 60
agucggugcu uu 74
<210> 60
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0037特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物(P13)连接子连接
<400> 60
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 61
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0038特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (352)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物(P14)连接子连接
<400> 61
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 62
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0039特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物(P15)连接子连接
<400> 62
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 63
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0040特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过苯丙氨酸衍生物连接子连接
<400> 63
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 64
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0041特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过亮氨酸衍生物连接子连接
<400> 64
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 65
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0042特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过谷氨酸衍生物连接子连接
<400> 65
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 66
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0043特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 66
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 67
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0044特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过脯氨酸衍生物(P13)连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 67
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 68
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0045特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过脯氨酸衍生物(P14)连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 68
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 69
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0046特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过脯氨酸衍生物(P15)连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 69
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 70
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0047特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过苯丙氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 70
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 71
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0048特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过亮氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 71
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 72
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0049特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过谷氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 72
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 73
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0063特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<400> 73
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
<210> 74
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0064特异性结合人BCL-2基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用赖氨酸衍生物连接子修饰第1位“a”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<400> 74
aagcgucccc gcgcggugaa guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
<210> 75
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> sgRNA SG-0090特异性结合人BRAF基因
<400> 75
uagcuacaga gaaaucucga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 101
<210> 76
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0093特异性结合人BRAF基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 76
uagcuacaga gaaaucucga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuaa guggcaccga gucggugcuu u 93
<210> 77
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0096特异性结合人BRAF基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 77
uagcuacaga gaaaucucga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 78
<211> 95
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0097特异性结合人BRAF基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<400> 78
uagcuacaga gaaaucucga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 97
<210> 79
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0098特异性结合人BRAF基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 79
uagcuacaga gaaaucucga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 80
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0099特异性结合人BRAF基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> 第58位“g”和第59位“a”通过甘氨酰基甘氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(64)
<223> 第63位“u”和第64位“a”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 80
uagcuacaga gaaaucucga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccgaa 60
cuuaaguggc accgagucgg ugcuuu 88
<210> 81
<211> 92
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0100特异性结合人BRAF基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(69)
<223> 第68位“u”和第69位“a”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<400> 81
uagcuacaga gaaaucucga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuka aguggcaccg agucggugcu uu 94
<210> 82
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0101特异性结合人BRAF基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用脯氨酸衍生物连接子修饰第1位“u”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<400> 82
uagcuacaga gaaaucucga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96
<210> 83
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> scRNA
<223> 修饰的sgRNA SG-0102特异性结合人BRAF基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用赖氨酸衍生物连接子修饰第1位“u”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 第32位“a”和第33位“u”通过脯氨酸衍生物连接子连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(94)
<223> 第93位“u”和第94位“u”通过赖氨酸衍生物连接子连接
<400> 83
uagcuacaga gaaaucucga guuuuagagc uauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60
aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuu 96

Claims (22)

1.一种单导RNA，其是由下式(A)表示的单导RNA，
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式(A)中，Xa是由下式(II~1)~式(II~9)的任一者所表示的氨基酸衍生物连接子、或者由下式(III-1)~(III-3)的任一者所表示的氨基酸衍生物连接子：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
各式(II~1)~式(II~9)中，n和m分别独立地为0~15的整数，q为0~10的整数，
Figure DEST_PATH_IMAGE006
(III-1)
Figure DEST_PATH_IMAGE008
(III-2)
Figure DEST_PATH_IMAGE010
(III-3)
各式(III-1)~(III-3)中、n和m分别独立地为0~15的整数，
式(A)中，Xb和Y分别独立地为1个至5个任意的核苷酸连接子，
式(A)中，Xc和Xd任选存在或不存在，Xc和Xd存在时，是由所述式(II-8)表示的氨基酸衍生物连接子，式(II-8)中，n=5和m=4，
式(A)中，(n)20各自独立地是由作为A、G、C或U的20±5个核苷酸残基构成的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的单导RNA，其中，所述Xa由所述式(II-8)表示，且该式中，n=5和m=4、n=7和m=6、n=9和m=8、或n=11和m=10。
3.根据权利要求2所述的单导RNA，其中，所述式(II-8)中，n=5和m=4。
4.根据权利要求3所述的单导RNA，其中，所述Xb和Y分别为GAAA和UUAUC。
5.根据权利要求4所述的单导RNA，其中，所述Xc和Xd为所述式(II-8)表示的氨基酸衍生物连接子，式(II-8)中，n=5和m=4。
6.根据权利要求4所述的单导RNA，其中，所述Xc和Xd不存在。
7.根据权利要求1所述的单导RNA，其中，所述Xa由下式(III-1)~(III-3)中的任一者表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
(III-1)
Figure DEST_PATH_IMAGE008A
(III-2)
Figure DEST_PATH_IMAGE010A
(III-3)
各式中，n=5和m=4。
8.根据权利要求7所述的单导RNA，其中，所述Xb和Y分别为GAAA和UUAUC。
9.根据权利要求8所述的单导RNA，其中，所述Xc和Xd不存在。
10.一种CRISPR/Cas9系统，其是组合权利要求1~9中任一项所述的单导RNA和Cas9而成的。
11.根据权利要求10所述的CRISPR/Cas9系统，其中，Cas9源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
12.根据权利要求10所述的CRISPR/Cas9系统，其中，Cas9是蛋白质的形态、编码该Cas9的mRNA的形态、或包含编码该Cas9的DNA的表达载体的形态。
13.一种用于非疾病治疗或诊断目的的双链DNA的体外识别方法，其包括使权利要求10所述的CRISPR/Cas9系统与靶双链DNA接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，Cas9蛋白质具有双链DNA切断活性。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述双链DNA的切断在细胞内进行。
16.根据权利要求15所述的方法，其用于敲除靶基因。
17.根据权利要求15所述的方法，其用于突变靶基因内的碱基、或用于在该基因内插入外源性基因。
18.根据权利要求10所述的CRISPR/Cas9系统在制备用于通过以下方法识别双链DNA的试剂中的用途，所述方法包括使权利要求10所述的CRISPR/Cas9系统与靶双链DNA接触。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，Cas9蛋白质具有双链DNA切断活性。
20.根据权利要求19所述的用途，其中，所述双链DNA的切断在细胞内进行。
21.根据权利要求20所述的用途，其用于敲除靶基因。
22.根据权利要求20所述的用途，其用于突变靶基因内的碱基、或用于在该基因内插入外源性基因。
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