CN104039961A - 具有氨基酸骨架的单链核酸分子 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提供可简便有效地生产并可抑制基因表达的新核酸分子。一种包含用于抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，所述分子的特征在于包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)。所述连接子区域(Lx)连接在区域(Xc)和区域(X)之间，区域(Xc)与区域(X)互补，区域(X)和区域(Xc)的至少之一包含表达抑制序列，和连接子区域(Lx)包含源自氨基酸的原子团。所述单链核酸分子可抑制靶基因的表达。

Description

具有氨基酸骨架的单链核酸分子
技术领域
本发明涉及抑制基因表达的单链核酸分子。更特别地，本发明涉及具有氨基酸骨架的单链核酸分子、包含其的组合物及其用途。
背景技术
作为抑制基因表达的技术，例如，RNA干扰(RNAi)是已知的(非专利文献1)。通过RNA干扰来抑制基因表达通常例如通过将短的双链RNA分子施用至细胞等来进行。前述双链RNA分子通常称为siRNA(小干扰RNA)。已报道基因表达还可通过具有由分子内退火而在其中部分形成的双链的环状RNA分子抑制(专利文献1)。
[文献列表]
[非专利文献]
非专利文献1：Fire等人，Nature,1998Feb19；391(6669):806-11
[专利文献]
专利文献1：US-A-2004-058886
发明内容
发明要解决的问题
然而，在前述各技术中，诱导基因表达抑制的RNA分子具有下列问题。
首先，为了生产前述siRNA，必须分别合成正义链和反义链，并在该过程结束时将这些链杂交。因此，存在低制造效力的问题。此外，当前述siRNA施用至细胞时，必须在抑制单链RNA解离的同时将siRNA施用至细胞，这需要大量设定操作siRNA的条件的工作。环状RNA分子具有合成困难的问题。
这些RNA分子基本上由核苷酸残基构成。目前，为了赋予前述RNA分子一些功能或标记，没有其它方法，只有修饰例如核苷酸残基中的组分即碱基、糖残基或磷酸基团中的任一种。因此，在利用RNA干扰的药品等的研发中，非常难以在维持RNA分子的抑制基因表达的功能的同时更改RNA分子来向其赋予进一步的功能或将其标记。
因此，本发明的目的为提供可简便有效生产且抑制基因表达的新的核酸分子。
用于解决问题的方案
为了实现前述目的，本发明的核酸分子为单链核酸分子，其包含抑制靶基因表达的表达抑制序列，并包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，其中前述连接子区域(Lx)连接在前述区域(X)和前述区域(Xc)之间，前述区域(Xc)与前述区域(X)互补，前述区域(X)和前述区域(Xc)的至少之一包含前述表达抑制序列，和前述连接子区域(Lx)包含源自氨基酸的原子团。
本发明的第一组合物为用于抑制靶基因表达的组合物，且其特征在于包含上述本发明的单链核酸分子。
本发明的第二组合物为药物学组合物，其特征在于包含上述本发明的单链核酸分子。
本发明的表达抑制方法为抑制靶基因表达的方法，其特征在于使用上述本发明的单链核酸分子。
本发明的表达诱导方法为诱导抑制靶基因表达的RNA干扰的方法，其中使用上述本发明的单链核酸分子。
本发明的治疗疾病的方法包括将上述本发明的单链核酸分子施用至患者的步骤，其中上述单链核酸分子具有抑制由上述疾病引起的基因的表达的序列作为上述表达抑制序列。
发明的效果
本发明的单链核酸分子可抑制基因表达。由于其不是环状的，其合成容易。由于其为不需要用于双链的退火的单链，其可有效地生产。此外，由于前述连接子区域包含前述非核苷酸残基，例如核苷酸残基的常规改变并不受限，但例如，诸如前述连接子区域等的修饰等的改变也是可能的。
本发明的发明人首先发现了基因表达可根据本发明的单链核酸分子的结构受到抑制。推测本发明单链核酸分子的基因表达抑制效果由类似于RNA干扰的现象所引起。然而，要注意的是，本发明中基因表达的抑制不受RNA干扰的限定或约束。
附图说明
图1示出说明本发明单链核酸分子的实例的示意图。
图2示出说明本发明单链核酸分子的另一实例的示意图。
图3示出说明本发明单链核酸分子的其它实例的示意图。
图4为示出本发明实施例中GAPDH基因的相对表达水平的图。
图5示出参考例中使用的ssRNA。
图6为示出参考例中GAPDH基因的相对表达水平的图。
图7为示出参考例中TGF-β1基因的相对表达水平的图。
图8为示出参考例中LAMA基因的相对表达水平的图。
图9为示出参考例中LMNA基因的相对表达水平的图。
图10示出参考例中使用的ssRNA。
图11为示出参考例中GAPDH基因的相对表达水平的图。
图12为示出本发明实施例中稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7中萤火虫荧光素酶基因表达抑制效果(荧光素酶的相对活性)的图。
具体实施方式
除非另有说明，否则本说明书中使用的术语意指其在本领域通常所指的含义。
1.ssPN分子
如上所述，本发明的单链核酸分子为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列且包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)的单链核酸分子，其中前述连接子区域(Lx)连接在前述区域(X)和前述区域(Xc)之间，前述区域(Xc)与前述区域(X)互补，前述区域(X)和前述区域(Xc)的至少之一包含前述表达抑制序列，前述连接子区域(Lx)包含源自氨基酸的原子团。
在本发明中，"靶基因的表达抑制"意指，例如抑制前述靶基因的表达。实现前述抑制的机理不特别限定，并可为例如下调或沉默。前述靶基因的表达抑制可通过例如源自靶基因的转录产物量的降低；前述转录产物活性的降低；或由前述靶基因产生的翻译产物量的降低；前述翻译产物活性的降低等来证实。前述蛋白质可为例如成熟蛋白质或者在进行加工或翻译后修饰之前的前体蛋白质等。
本发明的单链核酸分子在下文中还可称作本发明的"ssPN分子"。本发明的ssPN分子可用于抑制例如体内或体外靶基因的表达，并且还可称作"抑制靶基因表达用ssPN分子"或"靶基因表达抑制剂"。此外，本发明的ssPN分子可通过例如RNA干扰抑制前述靶基因的表达，并且还可称作"RNA干扰用ssNP分子"、"诱导RNA干扰用ssPN分子"或"RNA干扰剂或RNA干扰-诱导剂"。本发明还可抑制例如诸如干扰素诱导的副反应。
在本发明的ssPN分子中，5’端和3’端彼此不连接。因此，本发明的ssPN分子还可称作"线性单链核酸分子"。
在本发明的ssPN分子中，前述表达抑制序列为在本发明的ssPN分子体内或体外引入细胞时显示例如抑制前述靶基因表达的活性的序列。前述表达抑制序列不特别限定，并可根据靶基因的种类而适当设定。作为前述表达抑制序列，例如，由siRNA引起的RNA干扰中涉及的序列可作为适当使用。一般而言，RNA干扰为其中长的双链RNA(dsRNA)在细胞中被Dicer切割产生由约19至21个碱基对构成且具有突出的3’端的双链RNA(siRNA：小干扰RNA)，且单链RNA之一结合至靶mRNA以降解前述mRNA，从而抑制mRNA的翻译的现象。作为结合至前述靶mRNA的前述siRNA的单链RNA的序列，例如，已报道了用于各种靶基因的各种序列。在本发明中，例如，前述siRNA的单链RNA的序列可用作前述表达抑制序列。
应注意的是，本发明的焦点不在于用于前述靶基因的前述表达抑制序列的序列信息，而是在于例如由于细胞中的前述表达抑制序列而允许前述靶基因表达抑制活性功能的核酸分子的结构。因此，在本发明中，不仅可使用在提交本申请时已知的siRNA的单链RNA序列，而且还可使用未来将被识别的序列，例如作为前述表达抑制序列。
前述表达抑制序列与前述靶基因的预设区域例如优选至少90％互补，更优选95％互补，更加优选98％互补，并特别优选100％互补。当满足这种互补性时，例如可充分减少脱靶效应(off-target effect)。
作为具体实例，当靶基因为GAPDH基因时，例如，SEQ ID NO:5所示的19个碱基长的序列可用作上述表达抑制序列。当靶基因为TGF-β1时，例如，SEQ ID NO:15所示的21个碱基长的序列可用作上述表达抑制序列；当靶基因为LAMA1基因时，例如SEQ ID NO:16所示的19个碱基长的序列可用作上述表达抑制序列；当靶基因为LMNA基因时，例如，SEQ ID NO:17所示的19个碱基长的序列可使用。
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’(SEQ ID NO:5)
5’-AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3’(SEQ ID NO:15)
5’-AUUGUAACGAGACAAACAC-3’(SEQ ID NO:16)
5’-UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3’(SEQ ID NO:17)
推测例如通过RNA干扰实现通过本发明的ssPN分子的前述靶基因表达抑制。然而，应注意的是，本发明决不受限于该机理。不像所谓的siRNA，例如，本发明的ssPN分子不以由两个单链RNA构成的dsRNA的形式引入细胞等，并且不总是必须切出(cleave out)细胞中的前述表达抑制序列。因此，可以说，例如本发明的ssPN分子显示RNA干扰样功能(RNA interference-likefunction)。
本发明的ssPN分子可抑制例如副反应如体内干扰素诱导并显示优异的耐核酸酶性。
各前述连接子区域可仅由例如具有前述非核苷酸结构的一个(或多个)非核苷酸残基构成，或可包含具有前述非核苷酸结构的一个(或多个)非核苷酸残基和一个(或多个)核苷酸残基。
在前述连接子区域中，在前述“源自氨基酸的原子团”不特别限定的同时，其例如为由下式(IA)表示的原子团。
在前述式(IA)中，例如，X1为H2、O、S或NH，和原子团A为任选的但不包含肽键。
在本发明的ssPN分子中，前述连接子区域例如由下式(I)表示：
在前述式(I)中，例如，
其中，
X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
L1为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
前述区域(Xc)和(X)经-OR1-或-OR2-彼此连接至前述连接子区域(Lx)；
其中R1和R2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I)；和
A为任意原子团，下式(Ia)为前述氨基酸，下式(Ia)为除肽以外的氨基酸。
在前述式(I)中，例如，X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH。在前述式(I)中，"X1为H2"意指X1与X1所结合的碳原子一起形成CH2(亚甲基)。同样适用于X2。
在前述式(I)中，Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S。
在前述式(I)中，L1为具有n个碳原子的亚烷基链。一个(或多个)前述亚烷基碳原子上的一个(或多个)氢原子可以被或可以不被例如OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代。可选地，L1可为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。前述聚醚链为，例如聚乙二醇。当Y1为NH、O或S，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻。即，例如，当Y1为O，该氧原子和L1中的氧原子彼此不相邻，OR1中的氧原子和L1中的氧原子彼此不相邻。
在前述式(I)中，L2为具有m个碳原子的亚烷基链。一个(或多个)前述亚烷基碳原子上的一个(或多个)氢原子可以被或可以不被例如OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代。可选地，L2可为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。当Y2为NH、O或S，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻。即，例如，当Y2为O，该氧原子和L2中的氧原子彼此不相邻，OR2中的氧原子和L2中的氧原子彼此不相邻。
L1的n和L2的m不特别限定，并且例如它们各自的下限可为0，其上限不特别限定。例如，n和m可根据前述连接子区域(Lx)的期望长度适当地设定。例如，从制造成本和产量等的观点，n和m各自优选0至30，更优选0至20，并更加优选0至15。n和m可相同(n＝m)或不同。n+m为例如0至30，优选0至20，更优选0至15。
例如，Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基，并可相同或不同。前述取代基的实例包括羟基、羧基、磺基、卤素、卤化烷基(卤代烷基，如CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亚硝基、氰基、烷基(如甲基、乙基、异丙基、叔丁基)、烯基(如乙烯基)、炔基(如乙炔基)、环烷基(如环丙基、金刚烷基)、环烷基烷基(如环己基甲基、金刚烷基甲基)、环烯基(如环丙烯基)、环基烷基、羟烷基(如羟甲基、羟乙基)、环氧基烷基(如甲氧基甲基、乙氧基甲基、乙氧基乙基)、芳基(如苯基、萘基)、芳烷基(如苯甲基、苯乙基)、烷芳基(如对甲苯基)、杂芳基(如吡啶基、呋喃基)、杂芳基烷基(如吡啶基甲基)、杂环基(如哌啶基)、杂环基烯基、杂环基烷基(如吗啉基甲基(morpholylmethyl))、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤化烷氧基(如OCF3)、烯氧基(如乙烯基氧基、烯丙基氧基)、芳氧基(如苯氧基)、烷氧基羰基(如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基)、芳烷基氧基(如苄氧基)、氨基[烷氨基(如甲氨基、乙氨基、二甲氨基)、酰基氨基(如乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳烷基氨基(如苯甲基氨基、三苯甲基氨基)、羟氨基]、氨基烷基(如氨基甲基)、烷基氨基烷基(如二乙氨基甲基)、氨基甲酰基、氨磺酰基、氧基、甲硅烷基和甲硅烷氧基烷基等。这些取代基任选地被一种或多种另外的取代基或另外的保护基取代。在前述另外的取代基不特别限定的同时，例如其可为上述列举的取代基。前述另外的保护基不特别限定，例如其可为下述列举的保护基。下文同。
前述保护基(或前述另外的保护基)为使例如高反应性官能团失活的官能团。保护基的实例包括已知的保护基。关于前述保护基，例如，文献中的记载(J.F.W.McOmie,"Protecting Groups in Organic Chemistry",Plenum Press,London和New York,1973)可包括于此。前述保护基不特别限定，并且其实例包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、甲苯基磺酰基乙氧基甲基(TEM)和二甲氧基三苯甲基(DMTr)。当R3为OR4时，前述保护基不特别限定，其实例包括TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基。保护基的其它实例包括由稍后示出的化学式(P1)和(P2)表示的含甲硅烷基的基团。下文同样适用。
在前述式(I)中，氢原子各自独立地可由例如卤素如Cl、Br、F或I取代。
前述区域(Xc)和(X)各自经-OR1-或-OR2-连接至例如前述连接子区域(Lx)。R1和R2可以存在或可以不存在。当R1和R2存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或由前述式(I)表示的结构。当R1和/或R2为前述核苷酸残基时，前述连接子区域(Lx)由例如具有不包括核苷酸残基R1和/或R2的前述式(I)结构的前述非核苷酸残基和一个(或多个)前述核苷酸残基构成。当R1和/或R2为由前述式(I)表示的结构时，前述连接子区域(Xc)的结构为例如两个以上的具有前述式(I)的结构的前述非核苷酸残基彼此连接这样的结构。前述式(I)的结构数可为例如1、2、3或4。当连接子区域(Lx)包括多个前述结构时，前述(I)的结构可例如直接或经一个(或多个)前述核苷酸残基连接。另一方面，当R1和R2不存在时，前述连接子区域(Lx)仅由例如具有前述式(I)的结构的前述非核苷酸残基构成。
前述区域(Xc)和(X)与-OR1-和-OR2-的组合不特别限定，并且可为例如下列条件中的任一种。
条件(1)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构。
条件(2)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构。
在本发明的ssPN分子中，前述式(I)中的原子团A不特别限定且为任选的；然而，其为由下式(Ia)表示的氨基酸，其如上所述不是肽。
前述式(I)、(IA)或(Ia)中的原子团A可以包含或可以不包含例如选自由链式原子团、脂环式原子团和芳族性原子团组成的组的至少一种。当前述链式原子团不特别限定时，例如可提及烷基、烯基、炔基、卤烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨烷基、甲硅烷基和甲硅烷氧基烷基等。在当前述脂环式原子团不特别限定时，例如可提及环烷基、环烯基、环烷基烷基和环基烷基等。当前述芳族性原子团不特别限定时，例如可提及芳基、芳烷基、烷芳基、稠环芳基、稠环芳烷基和稠环烷芳基等。在前述式(I)、(IA)或(Ia)中的原子团A中，各前述原子团可以进一步具有或可以不进一步具有取代基或保护基。当前述取代基或保护基是多个时，它们可相同或不同。前述取代基为例如前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的那些，更具体地，例如卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基和咪唑基等。前述保护基例如与前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的那些相同。
在本发明中，“氨基酸”是指分子内含有至少一个氨基和至少一个羧基的任意有机化合物。“肽”是指具有其中2分子以上氨基酸经肽键键合的结构的有机化合物。前述肽键可为酰胺或酰亚胺结构。当多个氨基存在于前述式(Ia)表示的氨基酸分子中时，明示于前述式(Ia)中的氨基可为任意氨基。另外，当多个羧基存在于前述式(Ia)表示的氨基酸分子中时，明示于前述式(Ia)中的羧基可为任意羧基。
在本发明单链核酸的前述连接子区域中，前述氨基酸可为例如天然氨基酸或人工氨基酸。本发明中，“天然氨基酸”是指具有天然存在的结构或其光学异构体的氨基酸。前述天然氨基酸的生产方法不特别限定，例如其可从天然产物中提取，或可合成。此外，在本发明中，“人工氨基酸”是指具有不天然存在的结构的氨基酸。即，前述人工氨基酸为氨基酸，即含有氨基的羧酸衍生物(分子中含有至少一个氨基和至少一个羧基的有机化合物)且具有不天然存在的结构。前述人工氨基酸优选不含有例如杂环。前述氨基酸可为构成例如蛋白质的氨基酸。前述氨基酸可为例如甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷或氨基苯甲酸，并可以进一步具有或可以不进一步具有取代基或保护基。前述取代基的实例包括前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的取代基。更具体地，例如，可提及卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基和咪唑基等。前述保护基与例如前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的保护基相同。当前述式(Ia)的氨基酸，其不是肽，含有异构体如光学异构体、几何异构体和立体异构体等，可使用任何异构体。
在本发明的ssPN分子中，前述连接子区域(Lx)和下述连接子区域(Ly)不包含例如含有吡咯烷骨架的非核苷酸结构和含有哌啶骨架的非核苷酸结构。前述吡咯烷骨架的实例包括其中一个或多个构成吡咯烷5元环的碳被取代的吡咯烷衍生物的骨架，且取代的碳的实例包括除C-2碳以外的碳原子。前述碳可被例如氮、氧或硫取代。前述吡咯烷骨架在吡咯烷5元环中可含有例如碳-碳双键或碳-氮双键。在前述吡咯烷骨架中，构成吡咯烷5元环的碳和氮可键合至例如氢或前述取代基。前述吡咯烷骨架中前述连接子区域(Lx)可经任意原子键合至例如前述区域(X)和前述区域(Xc)。前述吡咯烷骨架键合至前述区域(X)和前述区域(Xc)的原子为例如前述5元环的任意一个碳原子或任意一个氮。更具体地，例如，其为前述5元环的2-位碳(C-2)或氮。前述吡咯烷骨架的实例包括脯氨酸骨架和脯氨醇骨架等。作为前述哌啶骨架，例如，可提及其中一个或多个构成哌啶6元环的碳被取代的哌啶衍生物的骨架。当碳被取代时，其为例如除C-2碳以外的碳原子。前述碳可例如被氮、氧或硫取代。前述哌啶骨架还可包含例如，在哌啶6元环中，例如碳-碳双键或碳-氮双键。在前述哌啶骨架中，构成哌啶6元环的碳和氮可键合至例如氢基或下述取代基。前述连接子区域(Lx)还可经前述哌啶骨架的任意原子键合至例如前述区域(X)和前述区域(Xc)。前述哌啶骨架键合至前述区域(X)和前述区域(Xc)的原子为例如前述6元环的任意一个碳原子或任意一个氮，更具体地，例如前述6元环的2-位碳(C-2)或氮。
作为含有吡咯烷骨架的前述非核苷酸结构或含有哌啶骨架的前述非核苷酸结构，例如可提及由下式(Ib)表示的结构。在本发明的ssPN分子中，前述连接子区域(Lx)和下述连接子区域(Ly)不包含例如含有吡咯烷骨架的非核苷酸结构和含有哌啶骨架的非核苷酸结构。
在前述式(Ib)中，例如X1、X2、Y1、Y2、L1、L2、R1和R2如前述式(I)所定义。
R3为键合至环A上的C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基。当R3为前述取代基时，取代基R3可为一个或多个，或可不存在。当R3存在多个时，它们可相同或不同。取代基R3为例如卤素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4和氧基(＝O)等。R4和R5例如各自独立地为取代基或保护基，并可相同或不同。
l为1或2；当l＝1时，环A为5元环，例如前述吡咯烷骨架。前述吡咯烷骨架为例如脯氨酸骨架或脯氨醇骨架等，并由其二价结构示例。当l＝2时，环A为6元环，例如，前述哌啶骨架。在环A中，环A上的除C-2以外的一个碳原子可被氮、氧或硫取代。环A可在环A中包含碳-碳双键或碳-氮双键。环A为例如L型或D型。在环A中，环A上的除上述C-2以外的一个碳原子可被氮、氧或硫取代，并可在上述环A中包含碳-碳双键或碳-氮双键。
前述式(I)的结构的实例包括下式(I-1)至(I-4)的结构。在下式中，n和m与前述式(I)相同。
在前述式(I-1)至(I-4)中，n和m不特别限定，且如上所述。其具体实例为前述式(I-1)，其中n＝11和m＝12。其结构示于下式(I-1a)。另一具体实例为前述式(I-1)，其中n＝5和m＝4。其结构示于下式(I-1b)。还有另一具体实例为前述式(I-4)，其中n＝5和m＝4。其结构示于下式(I-4a)。
在本发明的ssPN分子中，前述区域(Xc)与前述区域(X)互补。因此，在本发明的ssPN分子中，双链可通过前述区域(Xc)朝向区域(X)折回及前述区域(Xc)和(X)的自我退火来形成。本发明的ssPN分子可如上所述形成分子内双链。因此，ssPN分子的结构完全不同于例如通过两个单独的单链RNA退火获得的双链RNA如RNA干扰中通常使用的siRNA的结构。
在本发明的ssPN分子中，例如，仅前述区域(Xc)可与前述区域(X)折回形成双链，或另一双链可在另一区域形成。下文中，前一种ssPN分子，即其中双链形成发生在一个位点的ssPN分子，称作"第一ssPN分子"，后一种ssPN分子，即其中双链形成发生在两个位点的ssPN分子，称作"第二ssPN分子"。下面给出前述第一和第二ssPN分子的实例。然而，应注意，本发明不限于这些示例性实例。
(1)第一ssPN分子
前述第一ssPN分子为，例如包括前述区域(X)、前述区域(Xc)和前述连接子区域(Lx)的分子。
前述第一ssPN分子可从例如5’侧至3’侧以该顺序包括前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)和前述区域(X)，或者可从3’侧至5’侧以该顺序包括前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)和前述区域(X)。
在前述第一ssPN分子中，前述区域(Xc)与前述区域(X)互补。唯一必要的是前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列。优选前述区域(Xc)包括与区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列或由该序列构成。前述区域(Xc)可例如与前述区域(X)的整个区域或部分区域完全互补，或者区域(Xc)中的一个或几个碱基可与其是非互补的。优选区域(Xc)与其完全互补。前述表达"一个或几个碱基"意指例如1至3个碱基，优选1个碱基或2个碱基。
在前述第一ssPN分子中，前述表达抑制序列如上所述包括在前述区域(Xc)和(X)的至少之一。前述第一ssPN分子可包括例如一条上述表达抑制序列或两条以上的上述表达抑制序列。
在后一种情况中，前述第一ssPN分子可包括例如：针对同一靶基因的两个以上的相同表达抑制序列；针对同一靶基因的两个以上的不同表达抑制序列；或者针对不同靶基因的两个以上的不同表达抑制序列。当前述第一ssPN分子包括两个以上的上述表达抑制序列时，各表达抑制序列的位置不特别限定，并且它们可在选自前述区域(X)和(Xc)的一个区域或不同区域。当前述第一ssPN分子包括针对不同靶基因的两个以上的上述表达抑制序列，例如前述第一ssPN分子可抑制两种以上的不同靶基因的表达。
图1示出说明前述第一ssPN分子的实例的示意图。图1A为示出前述ssPN分子中各区域顺序的一个实例的示意图。图1B为示出双链在前述ssPN分子中形成的状态的示意图。如图1B所示，在前述ssPN分子中，双链形成于前述区域(Xc)和(X)之间，前述Lx区域具有取决于其长度的环结构。图1示出的示意图仅说明其中前述各区域彼此连接的顺序和形成双链的各区域的位置关系，且它们不限定例如各区域的长度和前述连接子区域(Lx)的形状等。
在前述第一ssPN分子中，各前述区域(Xc)和(X)中的碱基数不特别限定。下面给出各区域的长度的实例。然而，要注意的是，本发明决不意欲受限于此。本发明中，"碱基数"意指例如"长度"，且其还可称作"碱基长度"。本发明中，例如，关于碱基数的数值范围公开了落入该范围内的所有正整数。例如，"1至4个碱基"的描述公开了所有"1、2、3和4个碱基"(下文同样适用)。
前述区域(Xc)可例如与前述区域(X)的整个区域完全互补。在该情况下，意指例如前述区域(Xc)由与从前述区域(X)的5’端向3’端延伸的整个区域互补的碱基序列构成。换言之，意指前述区域(Xc)具有与前述区域(X)相同的碱基长度，且前述区域(Xc)中的所有碱基与前述区域(X)中的所有碱基互补。
此外，前述区域(Xc)可例如与前述区域(X)的部分区域完全互补。在该情况下，意指例如前述区域(Xc)由与前述区域(X)的部分区域互补的碱基序列构成。换言之，意指前述区域(Xc)由其碱基长度比前述区域(X)的碱基长度短1个以上的碱基的碱基序列构成，且前述区域(Xc)中的所有碱基与前述区域(X)的部分区域中的所有碱基互补。前述区域(X)的部分区域优选为前述区域(X)中具有由例如从前述区域(Xc)侧的末端的碱基(第一个碱基)开始的连续碱基构成的碱基序列的区域。
在前述第一ssPN分子中，前述区域(X)的碱基数(X)与前述区域(Xc)的碱基数(Xc)之间的关系满足例如下列条件(3)或(5)。例如，在前一种情况中，具体地满足下列条件(11)：
X>Xc···(3)
X-Xc＝1-10，优选1、2或3，
更优选1或2···(11)
X＝Xc···(5)
当前述区域(X)和/或前述区域(Xc)包括前述表达抑制序列时，前述区域可为例如仅由前述表达抑制序列构成的区域或包括前述表达抑制序列的区域。前述表达抑制序列的碱基数为例如19-30、优选19、20或21。在包括前述表达抑制序列的区域中，例如前述表达抑制序列可在其5’侧和/或3’侧进一步具有另外的序列。前述另外的序列的碱基数为例如1至31，优选1至21，更优选1至11。
前述区域(X)的碱基数不特别限定。当前述区域(X)包括前述表达抑制序列时，前述区域(X)的碱基数的下限为例如19，其上限为例如50，优选30，更优选25。具体地，前述区域(X)的碱基数为例如19-50，优选19-30，更优选19-25。
前述区域(Xc)的碱基数不特别限定。前述区域(Xc)的碱基数的下限为例如19，优选20，更优选21，其上限为例如50，更优选40，更加优选30。
在前述ssPN分子中，前述连接子区域(Lx)的长度不特别限定。前述连接子区域(Lx)的长度优选例如前述区域(X)和(Xc)可形成双链这样的长度。当前述连接子区域(Lx)包括除了前述非核苷酸残基以外的前述核苷酸残基时，前述连接子区域(Lx)的碱基数的下限为例如1，优选2，更优选3，其上限为例如100，优选80，更优选50。
前述第一ssPN分子的全长不特别限定。在前述第一ssPN分子中，总碱基数(全长ssPN分子中的碱基数)的下限为例如38，优选42，更优选50，更加优选51，特别优选52，其上限为例如300，优选200，更优选150，更加优选100，特别优选80。在前述第一ssPN分子中，不包括前述连接子区域(Lx)的总碱基数的下限为例如38，优选42，更优选50，更加优选51，特别优选52，其上限为例如300，优选200，更优选150，更加优选100，特别优选80。
(2)第二ssPN分子
前述第二ssPN分子为除了例如前述区域(X)、前述连接子区域(Lx)和前述区域(Xc)以外，进一步包括区域(Y)和与前述区域(Y)互补的区域(Yc)的分子。在前述第二ssPN分子中，内部区域(Z)由彼此连接的前述区域(X)和前述区域(Y)构成。除非另有说明，否则关于前述第一ssPN分子的描述也适用于前述第二ssPN分子。
前述第二ssPN分子可从5’侧至3’侧以该顺序包括例如前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)、前述区域(X)、前述区域(Y)和前述区域(Yc)。在该情况下，前述区域(Xc)还称作"5’侧区域(Xc)"；前述内部区域(Z)中的前述区域(X)还称作"内部5’侧区域(X)"；前述内部区域(Z)中的前述区域(Y)还称作"内部3’区域(Y)"；前述区域(Yc)还称作"3’侧区域(Yc)"。可选地，前述第二ssPN分子可从3’侧至5’侧以该顺序包括例如前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)、前述区域(X)、前述区域(Y)和前述区域(Yc)。在该情况中，前述区域(Xc)还称作"3’侧区域(Xc)"；前述内部区域(Z)中的前述区域(X)还称作"内部3’侧区域(X)"；前述内部区域(Z)中的前述区域(Y)还称作"内部5’区域(Y)"；前述区域(Yc)还称作"5’侧区域(Yc)"。
如上所述，前述内部区域(Z)由例如彼此连接的前述区域(X)和(Y)构成。例如，前述区域(X)和(Y)彼此直接连接，之间没有嵌入序列。前述内部区域(Z)定义为"由彼此连接的前述区域(X)和(Y)构成"，仅表明前述区域(Xc)和(Yc)之间的序列关系。该定义不意欲限定在前述ssPN分子的使用中，前述内部区域(Z)中的前述区域(X)和(Y)为离散独立区域。即，例如，当前述表达抑制序列包括在前述内部区域(Z)中时，前述表达抑制序列可横跨前述内部区域(Z)中的前述区域(X)和(Y)而设置。
在前述第二ssPN分子中，前述区域(Xc)与前述区域(X)互补。唯一必须的是，前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列。优选地，前述区域(Xc)包括与前述区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列或由其构成。前述区域(Xc)可例如与前述区域(X)的整个区域或部分区域完全互补，或者前述区域(Xc)中的一个或几个碱基可与其是非互补的。优选前述区域(Xc)与其完全互补。前述表达"一个或几个碱基"意指例如1至3个碱基，优选1个碱基或2个碱基。
在前述第二ssPN分子中，前述区域(Yc)与前述区域(Y)互补。唯一必须的是，前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的整个区域或部分区域互补的序列。优选前述区域(Yc)包括与前述区域(Y)的整个区域或部分区域互补的序列或由其构成。前述区域(Yc)可例如与前述区域(Y)的整个区域或部分区域完全互补，或者前述区域(Yc)中的一个或几个碱基可与其是非互补的。优选前述区域(Yc)优选与其互补。前述表达"一个或几个碱基"意指例如1至3个碱基，优选1个碱基或2个碱基。
在前述第二ssPN分子中，由前述区域(X)和(Y)构成的前述内部区域(Z)与前述区域(Xc)的至少之一包括例如前述表达抑制序列。此外，前述区域(Yc)还可包括前述表达抑制序列。当前述内部区域(Z)包括前述表达抑制序列，例如前述区域(X)和(Y)中的任一个可包括前述表达抑制序列，或者可包括前述表达抑制序列以横跨前述区域(X)和(Y)。前述第二ssPN分子可包括例如一个上述表达抑制序列，或者两个以上的上述表达抑制序列。
当前述第二ssPN分子包括两个以上的上述表达抑制序列时，各表达抑制序列的位置不特别限定。它们可在前述内部区域(Z)和前述区域(Xc)中的任一个位置，或者可在前述内部区域(Z)和前述区域(Xc)中的一个位置，和除了这些区域的任何区域。
在前述第二ssPN分子中，例如前述区域(Yc)和(Y)可彼此直接或间接连接。在前一种情况中，例如前述区域(Yc)和(Y)可通过磷酸二酯键等连接。在后一种情况中，前述第二ssPN分子可如此构造，使其在前述区域(Yc)和(Y)之间具有连接子区域(Ly)，且前述区域(Yc)和(Y)经前述连接子区域(Ly)连接。
当前述第二ssPN分子具有前述连接子区域(Ly)时，例如前述连接子区域(Ly)可为由前述核苷酸残基构成的连接子，或具有包含诸如上述的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少之一的非核苷酸结构的连接子。在后一种情况中，前述连接子区域(Ly)可由前述式(I)表示，例如，所有关于上面与前述连接子区域(Lx)有关的前述式(I)的记载也适用于前述连接子区域(Ly)。当前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)二者均由前述式(I)表示，前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)中的A、X1、X2、Y1、Y2、L1、L2、R1和R2可分别相同或不同。
前述区域(Yc)和(Y)例如经-OR1-或-OR2-各自连接至前述连接子区域(Ly)。前述连接子区域(Ly)中，R1和R2如上述连接子区域(Lx)中的，可以存在或可以不存在。
前述区域(Xc)和(X)与前述-OR1-和-OR2-的组合，前述区域(Yc)和(Y)与前述-OR1-和-OR2-的组合不特别限定，且可为例如下列条件中的任一项：
条件(1)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构；和
前述区域(Yc)和(Y)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构。
条件(2)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构；和
前述区域(Yc)和(Y)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构。
条件(3)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构；和
前述区域(Yc)和(Y)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构。
条件(4)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构；和
前述区域(Yc)和(Y)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构。
图2示出说明具有前述连接子区域(Ly)的前述第二ssPN分子的实例的示意图。图2A为示出从前述ssPN分子的5’侧至3’侧的各区域的顺序作为说明性实例的示意图。图2B为示出双链形成于前述ssPN分子中的状态的示意图。如图2B所示，在前述ssPN分子中，双链形成于前述区域(Xc)和(X)之间以及前述区域(Y)和(Yc)之间，前述Lx区域和前述Ly区域各自具有取决于它们长度的环结构。图2示出的示意图仅说明其中各区域连接的顺序和形成双链的各区域的位置关系，且它们不限定例如各区域的长度和连接子区域的形状等。此外，尽管图2中前述区域(Xc)在5’侧，但前述区域(Xc)的位置不特别限定，且前述区域(Xc)可以在3’侧。
在前述第二ssPN分子中，各前述区域(Xc)、(X)、(Y)和(Yc)的碱基数不特别限定。下面给出各区域的长度的实例。然而，要注意的是，本发明决不意欲受限于此。
如上所述，例如，前述区域(Xc)可与前述区域(X)的整个区域互补。在该情况中，优选例如前述区域(Xc)具有与前述区域(X)相同的碱基长度，且由与前述区域(X)的整个区域互补的碱基序列构成。更优选前述区域(Xc)具有与前述区域(X)相同的碱基长度，且前述区域(Xc)的所有碱基与前述区域(X)的所有碱基互补，即，例如区域(Xc)与区域(X)完全互补。然而，要注意的是，区域(Xc)的构造不限于此，例如如上所述，区域(Xc)中的一个或几个碱基可与区域(X)中相对应的碱基是非互补的。
此外，如上所述，前述区域(Xc)可与例如前述区域(X)的部分区域互补。在该情况中，优选例如前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的部分区域相同的碱基长度，即前述区域(Xc)由其碱基长度比前述区域(X)的碱基长度短一个以上的碱基的碱基序列构成。更优选前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的部分区域相同的碱基长度，且前述区域(Xc)的所有碱基与前述区域(X)的部分区域的所有碱基互补，即，例如区域(Xc)与区域(X)的部分区域完全互补。前述区域(X)的部分区域优选为前述区域(X)中具有由例如从前述区域(Xc)侧的末端的碱基(第一碱基)开始的连续碱基构成的碱基序列的区域。
如上所述，前述区域(Yc)可与例如前述区域(Y)的整个区域互补。在该情况下，优选例如前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)相同的碱基长度，且由与前述区域(Y)的整个区域互补的碱基序列构成。更优选前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)相同的碱基长度，且前述区域(Yc)的所有碱基与前述区域(Y)的所有碱基互补，即，例如区域(Yc)与区域(Y)完全互补。然而，要注意的是，区域(Yc)的构造不限于此，例如如上所述，区域(Yc)中的一个或几个碱基可与区域(Y)中相对应的碱基是非互补的。
此外，如上所述，前述区域(Yc)可与例如前述区域(Y)的部分区域互补。在该情况中，优选例如前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的部分区域相同的碱基长度，即前述区域(Yc)由其碱基长度比前述区域(Y)的碱基长度短一个以上的碱基的碱基序列构成。更优选前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的部分区域相同的碱基长度，且前述区域(Yc)的所有碱基与前述区域(Y)的部分区域的所有碱基互补，即，例如区域(Yc)与区域(Y)的部分区域完全互补。前述区域(Y)的部分区域优选为前述区域(Y)中具有由例如从前述区域(Yc)侧的末端的碱基(第一碱基)开始的连续碱基构成的碱基序列的区域。
在前述第二ssPN分子中，前述内部区域(Z)的碱基数(Z)与前述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Y)的碱基数(Y)的关系以及前述内部区域(Z)的碱基数(Z)与前述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Xc)的碱基数(Xc)的关系满足例如下列表达式(1)和(2)的条件。
Z＝X+Y···(1)
Z≥Xc+Yc···(2)
在前述第二ssPN分子中，前述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Y)的碱基数(Y)的关系不特别限定，并满足例如下列表达式的条件的任一项：
X＝Y···(19)
X<Y···(20)
X>Y···(21)。
在第二ssPN分子中，前述区域(X)的碱基数(X)与前述区域(Xc)的碱基数(Xc)之间的关系，以及前述区域(Y)的碱基数(Y)与前述区域(Yc)的碱基数(Yc)之间的关系满足例如下列条件(a)至(d)的任一项：
(a)满足下列表达式(3)和(4)的条件。
X>Xc···(3)
Y＝Yc···(4)
(b)满足下列表达式(5)和(6)的条件。
X＝Xc···(5)
Y>Yc···(6)
(c)满足下列表达式(7)和(8)的条件。
X>Xc···(7)
Y>Yc···(8)
(d)满足下列表达式(9)和(10)的条件。
X＝Xc···(9)
Y＝Yc···(10)
在上述条件(a)至(d)中，例如，前述区域(X)的碱基数(X)与前述区域(Xc)的碱基数(Xc)之差，以及前述区域(Y)的碱基数(Y)与前述区域(Yc)的碱基数(Yc)之差优选满足下列条件。
(a)满足下列表达式(11)和(12)的条件。
X-Xc＝1-10，优选1、2、3或4
更优选1、2或3···(11)
Y-Yc＝0···(12)
(b)满足下列表达式(13)和(14)的条件。
X-Xc＝0···(13)
Y-Yc＝1-10，优选1、2、3或4
更优选1、2或3···(14)
(c)满足下列表达式(15)和(16)的条件。
X-Xc＝1-10，优选1、2或3，
更优选1或2···(15)
Y-Yc＝1-10，优选1、2或3，
更优选1或2···(16)
(d)满足下列表达式(17)和(18)的条件。
X-Xc＝0···(17)
Y-Yc＝0···(18)
关于满足前述条件(a)至(d)的第二ssPN分子，它们结构的实例分别示于图3的示意图中。图3示出包括前述连接区域(Lx)和(Ly)的ssPN分子。图3A示出满足前述条件(a)的ssPN分子的实例；图3B示出满足前述条件(b)的ssPN分子的实例；图3C示出满足前述条件(c)的ssPN分子的实例；和图3D示出满足前述条件(d)的ssPN分子的实例。图3中，虚线表示通过自我退火形成双链的状态。示于图3的ssPN分子全部针对于其中前述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Y)的碱基数(Y)之间的关系满足前述表达式(20)的"X<Y"的实例。然而，要注意的是，该关系不限于此，且前述表达式(19)的"X＝Y"或前述表达式(21)的"X>Y"可满足如上所述。图3所示示意图仅说明前述区域(X)和(Xc)之间的关系以及前述区域(Y)和(Yc)之间的关系，且它们不限定例如各区域的长度和形状以及连接子区域(Ly)的存在与否等。
上述(a)至(c)的ssPN分子为具有不与前述内部区域(Z)中的前述区域(Xc)和(Yc)二者对齐的碱基的构造，这是由于例如前述区域(Xc)和(X)，以及区域(Yc)和(Y)各自形成双链。它们还可为具有不形成双链的碱基的所述构造。在前述内部区域(Z)中，不对齐的前述碱基(也称作不形成双链的碱基)在下文中称作"未配对碱基"。在图3中，前述未配对碱基的区域由"F"示出。前述区域(F)的碱基数不特别限定。对于前述(a)的ssPN分子，前述区域(F)的碱基数(F)为"X-Xc"的碱基数；对于上述(b)的ssPN分子为"Y-Yc"的碱基数；对于前述(c)的ssPN分子为"X-Xc"的碱基数与"Y-Yc"的碱基数的合计。
另一方面，将满足前述条件(d)的ssPN分子构建成以使例如前述内部区域(Z)的整个区域与前述区域(Xc)和(Yc)对齐，换言之，前述内部区域(Z)的整个区域形成双链。在满足前述条件(d)的ssPN分子中，前述区域(Xc)的5’端和前述区域(Yc)的3’端彼此不连接。
前述内部区域(Z)的前述区域(Xc)的碱基、前述区域(Yc)的碱基和前述未配对碱基(F)的总数等于前述内部区域(Z)的碱基数。因此，前述区域(Xc)的长度和前述区域(Yc)的长度可根据例如前述内部区域(Z)的长度、前述未配对碱基数和未配对碱基的位置而适当确定。
前述内部区域(Z)的碱基数为例如19以上。碱基数的下限为例如19、优选20、更优选21。前述碱基数的上限为例如50、优选40、更优选30。前述内部区域(Z)的碱基数的具体实例为19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。当前述内部区域(Z)包括前述表达抑制序列时，例如优选此类条件。
当前述内部区域(Z)包括前述表达抑制序列时，前述内部区域(Z)可为例如仅由前述表达抑制序列构成的区域或包括前述表达抑制序列的区域。前述表达抑制序列的碱基数为例如19至30，优选19、20或21。当前述内部区域(Z)包括前述表达抑制序列时，前述表达抑制序列进一步可在其5’侧和/或3’侧具有另外的序列。前述另外的序列的碱基数为例如1至31、优选1至21、更优选1至11、更加优选1至7。
前述区域(Xc)的碱基数为例如1至29，优选1至11，更优选1至7，更加优选1至4，特别优选1、2或3。前述内部区域(Z)或前述区域(Yc)包括前述表达抑制序列时，例如优选如上所述的碱基数。具体实例如下：当前述内部区域(Z)的碱基数为19至30(如19)，前述区域(Xc)的碱基数为例如1至11，优选1至7，更优选1至4，更加优选1、2或3。
当前述区域(Xc)包括前述表达抑制序列时，前述区域(Xc)可为例如仅由前述表达抑制序列构成的区域或包括前述表达抑制序列的区域。例如，前述表达抑制序列的长度如上所述。当前述区域(Xc)包括前述表达抑制序列时，前述表达抑制序列进一步可在其5’侧和/或3’侧具有另外的序列。前述另外的序列的碱基数为例如1至11，优选1至7。
前述区域(Yc)的碱基数为例如1至29，优选1至11，更优选1至7，更加优选1至4，特别优选1、2或3。当前述内部区域(Z)或前述区域(Xc)包括前述表达抑制序列时，例如优选如上所述的碱基数。具体实例如下：当前述内部区域(Z)的碱基数为19至30(如19)时，前述区域(Yc)的碱基数为例如1至11，优选1至7，更优选1、2、3或4，更加优选1、2或3。
当前述区域(Yc)包括前述表达抑制序列时，前述区域(Yc)可为例如仅由前述表达抑制序列构成的区域或包括前述表达抑制序列的区域。前述表达抑制序列的长度为例如如上所述。当前述区域(Yc)包括前述表达抑制序列时，前述表达抑制序列进一步可在其5’侧和/或3’侧具有另外的序列。前述另外的序列的碱基数为例如1至11，优选1至7。
如上所述，前述内部区域(Z)的碱基数、前述区域(Xc)的碱基数和前述区域(Yc)的碱基数之间的关系可由例如前述表达式(2):"Z≥Xc+Yc"表示。具体地，由"Xc+Yc"表示的碱基数例如等于前述内部区域(Z)的碱基数，或低于前述内部区域(Z)的碱基数。在后一种情况中，"Z-(Xc+Yc)"为例如1-10，优选1-4，更优选1、2或3。前述"Z-(Xc+Yc)"对应于例如前述内部区域(Z)中未配对碱基区域(F)的碱基数(F)。
在前述第二ssPN分子中，前述连接子区域(Lx)和(Ly)的长度不特别限定。前述连接子区域(Lx)如上所述。当前述连接子区域(Ly)的构成单元包括一个(或多个)碱基时，前述连接子区域(Ly)碱基数的下限为例如1、优选2、更优选3，其上限为例如100、优选80、更优选50。各前述连接子区域的碱基数具体为1至50、1至30、1至20、1至10、1至7、1至4，例如但不限于这些实例。
前述连接子区域(Ly)可例如与前述连接子区域(Lx)相同或不同。
前述第二ssPN分子的全长不特别限定。在前述第二ssPN分子中，总碱基数(全长ssPN分子的碱基数)的下限为例如38、优选42、更优选50、更加优选51、特别优选52，其上限为例如300、优选200、更优选150、更加优选100、特别优选80。在前述第二ssPN分子中，不包括前述连接子区域(Lx)和(Ly)的碱基数的总碱基数的下限为例如38、优选42、更优选50、更加优选51、特别优选52，其上限为例如300、优选200、更优选150、更加优选100、特别优选80。
在本发明的ssPN分子中，唯一必须的是前述连接子区域(Lx)如上所述具有前述非核苷酸结构，其它构成单元不特别限定。前述构成单元的实例包括核苷酸残基。前述核苷酸残基的实例包括核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。前述核苷酸残基可为例如不修饰的核苷酸残基(未修饰的核苷酸残基)或已修饰的核苷酸残基(修饰的核苷酸残基)。通过构造本发明的ssPN分子以包括前述修饰的核苷酸残基，例如可改进ssPN分子对核酸酶的抗性，从而使ssPN分子的稳定性得到改进。此外，本发明的ssPN分子进一步可包括例如除前述核苷酸残基以外的非核苷酸残基。
前述核苷酸残基优选作为前述区域(Xc)、前述区域(X)、前述区域(Y)和前述区域(Yc)各自的构成单元。各前述区域由例如下列残基(1)至(3)的任一项构成：
(1)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(2)修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(3)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
前述连接子区域(Lx)可仅由例如一个(或多个)前述非核苷酸残基构成，或可由一个(或多个)前述非核苷酸残基和一个(或多个)前述核苷酸残基构成。前述连接子区域(Lx)由例如下列残基(4)至(7)的任一项构成：
(4)一个(或多个)非核苷酸残基
(5)一个(或多个)非核苷酸残基和未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(6)一个(或多个)非核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(7)一个(或多个)非核苷酸残基、未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
前述连接子区域(Ly)的构成单元不特别限定，其实例如上所述包括前述核苷酸残基和前述非核苷酸残基。各前述连接子区域可由例如仅一个(或多个)前述核苷酸残基、仅一个(或多个)前述非核苷酸残基、或者一个(或多个)前述核苷酸残基和一个(或多个)前述非核苷酸残基二者构成。各前述连接子区域由例如下列残基(1)至(7)的任一项构成：
(1)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(2)修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(3)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(4)一个(或多个)非核苷酸残基
(5)一个(或多个)非核苷酸残基和未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(6)一个(或多个)非核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(7)一个(或多个)非核苷酸残基、未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
本发明的不包括前述连接子区域(Lx)的ssPN分子的实例包括仅由前述核苷酸残基构成的分子；和除前述核苷酸残基以外包括前述非核苷酸残基的分子。在本发明的ssPN分子中，如上所述，例如前述核苷酸残基可为仅前述未修饰的核苷酸残基；仅前述修饰的核苷酸残基；或前述未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基二者。当前述ssPN分子包括前述未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基二者时，前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基的数量不特别限定，并为例如"1至几个"，具体例如1至5、优选1至4、更优选1至3、最优选1或2。当本发明的ssPN分子包括一个(或多个)前述非核苷酸残基时，一个(或多个)前述非核苷酸残基的数量不特别限定，并为例如"1至几个"，具体例如1或2。
在本发明的ssPN分子中，例如前述核苷酸残基优选核糖核苷酸残基。在该情况中，本发明的ssPN分子还称作"ssRNA分子"或"P-ssRNA分子"。不包括前述连接子区域(Lx)的前述ssRNA分子的实例包括由仅前述核糖核苷酸残基构成的分子；和除前述核糖核苷酸残基以外包括一个(或多个)前述非核苷酸残基的分子。如上所述，作为前述核糖核苷酸残基，例如前述ssRNA分子可包括：仅前述未修饰的核糖核苷酸残基；仅前述修饰的核糖核苷酸残基；或前述未修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基二者。
当前述ssRNA分子除了前述未修饰的核糖核苷酸残基以外包括例如前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基时，前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基的数量不特别限定，并为例如"1至几个"，具体例如1至5、优选1至4、更优选1至3、最优选1或2。与前述未修饰的核糖核苷酸残基相反的前述修饰的核糖核苷酸残基可为例如通过用脱氧核糖残基取代核糖残基获得的前述脱氧核糖核苷酸残基。当前述ssRNA分子除前述未修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基以外包括例如一个(或多个)前述脱氧核糖核苷酸残基时，一个(或多个)前述脱氧核糖核苷酸残基的数量不特别限定，并为例如"1至几个"，具体例如1至5、优选1至4、更优选1至3、最优选1或2。
本发明的ssPN分子可包括例如标记物质，并可用前述标记物质标记。前述标记物质不特别限定，并可为例如荧光物质、染料或同位素等。前述标记物质的实例包括：荧光团如芘、TAMRA、荧光素、Cy3染料和Cy5染料。前述染料的实例包括Alexa染料如Alexa488。前述同位素的实例包括稳定同位素和放射性同位素。其中，优选稳定同位素。例如，前述稳定同位素具有低辐射暴露风险且它们不需要专用设备。因此，稳定同位素的可操作性优异，并可有助于减少成本。此外，例如前述稳定同位素不改变被其标记的化合物的物理性质，因而具有作为示踪物的优异性质。前述稳定同位素不特别限定，其实例包括2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S和36S。
在本发明的ssPN分子中，如上所述，优选将例如前述标记物质引入至前述非核苷酸结构、优选至前述连接子区域(Lx)的一个(或多个)前述非核苷酸残基。例如，标记物质向一个(或多个)前述非核苷酸残基的引入可简便低成本地进行。
如上所述，本发明的ssPN分子可抑制前述靶基因的表达。因此，本发明的ssPN分子可用作例如治疗由基因引起的疾病的治疗剂。当前述ssPN分子包括抑制引起前述疾病的基因的表达的序列作为前述表达抑制序列时，例如可通过抑制前述靶基因的表达治疗前述疾病。本发明中，术语"治疗"包括：例如前述疾病的预防；疾病的改善；和预后的改善，并且其可意指其中任一种。
本发明的ssPN分子的使用方法不特别限定。例如，前述ssPN分子可施用至具有前述靶基因的对象。
本发明的ssPN分子的前述施用对象的实例包括细胞、组织和器官等。前述施用对象的实例还包括人和非人动物等如非人哺乳动物，即不包括人的哺乳动物。前述施用可例如在体内或体外进行。前述细胞不特别限定，其实例包括：各种培养细胞如HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞和COS细胞；干细胞如ES细胞和造血干细胞；和从活生物体分离的细胞如原代培养细胞。
本发明中，其表达受到抑制的前述靶基因不特别限定，任何期望的基因可设为靶基因。前述表达抑制序列可根据前述基因而适当设计。
本发明的ssPN分子的具体实例包括但不限于下述。当前述靶基因为GAPDH基因时，前述ssPN分子的碱基序列为例如由SEQ ID NO:4或18示出的碱基序列，其可包括1至几个缺失、取代和/或添加，并且当前述靶基因为TGF-β1时，ssPN分子列举为由SEQ ID NO:19–23显示的碱基序列，其可包括1至几个缺失、取代和/或添加。在下列SEQ ID NOs:4和18的序列中，下划线部分GUUGUCAUACUUCUCAUGG(SEQ ID NO:5)为与GAPDH基因表达抑制相关的区域。在下列SEQ ID NO:19–23中，“*”示出未配对碱基。下列SEQ ID NO:4和18–23中，Lx和Ly的结构不特别限定，并可为例如下面提及的实例中所示的结构(Lg)。
(SEQ ID NO:18)
5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-Lx-GGCUGUUGUCAUACUUCU CAUGGUU-3’
(SEQ ID NO:19)
(SEQ ID NO:20)
(SEQ ID NO:21)
(SEQ ID NO:22)
(SEQ ID NO:23)
关于本发明的ssPN分子的使用，可参考后述根据本发明的下列关于组合物、表达抑制方法和治疗方法等的描述。
由于本发明的ssPN分子如上所述可抑制靶基因的表达，例如其用作药品、诊断剂、农药和进行医学科学和生命科学等研究的工具。
本发明中，术语"烷基"包括例如直链和支化的烷基。前述烷基的碳原子数不特别限定，并为例如1至30、优选1至6或1至4。前述烷基的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。其中，例如优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基和异己基等。
本发明中，术语"烯基"包括例如直链或支化的烯基。前述烯基的实例包括具有一个或多个双键的前述烷基。前述烯基的碳原子数不特别限定，并例如与前述烷基的碳原子数相同，优选2-8。前述烯基的实例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基和3-甲基-2-丁烯基。
本发明中，术语"炔基"包括例如直链或支化的炔基。前述炔基的实例包括具有一个以上的三键的前述烷基。前述炔基的碳原子数不特别限定，并例如与前述烷基的碳原子数相同，优选2-8。前述炔基的实例包括乙炔基、丙炔基和丁炔基。前述炔基可进一步包括例如一个以上的双键。
本发明中，术语"芳基"包括例如单环芳族烃基和多环芳族烃基。前述单环芳族烃基的实例包括苯基。前述多环芳族烃基的实例包括1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基和9-菲基。其中，例如优选苯基，和萘基如1-萘基和2-萘基等。
本发明中，术语"杂芳基"包括例如单环芳族杂环基和稠合芳族杂环基。前述杂芳基的实例包括呋喃基(如2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(如2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(如1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(如1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(如1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三唑基(如1,2,4-三唑-1-基、1,2,4-三唑-3-基、1,2,4-三唑-4-基)、四唑基(如1-四唑基、2-四唑基、5-四唑基)、噁唑基(如2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、异噁唑基(如3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噻唑基(如2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻二唑基、异噻唑基(如3-异噻唑基、4-异噻唑基、5-异噻唑基)、吡啶基(如2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、哒嗪基(如3-哒嗪基、4-哒嗪基)、嘧啶基(如2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋咕基(furazanyl)(如3-呋咕基)、吡嗪基(如2-吡嗪基)、噁二唑基(如1,3,4-噁二唑-2-基)、苯并呋喃基(如2-苯并[b]呋喃基、-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(如2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、苯并咪唑基(如1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、二苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹喔啉基(如2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、6-喹喔啉基)、噌啉基(如3-噌啉基、4-噌啉基、5-噌啉基、6-噌啉基、7-噌啉基、8-噌啉基)、喹唑啉基(如2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(如2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、酞嗪基(如1-酞嗪基、5-酞嗪基、6-酞嗪基)、异喹啉基(如1-异喹啉基、3-异喹啉基、4-异喹啉基、5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、嘌呤基、蝶啶基(如2-蝶啶基、4-蝶啶基、6-蝶啶基、7-蝶啶基)、咔唑基、菲啶基、吖啶基(如1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(如1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、异吲哚基、吩嗪基(如1-吩嗪基、2-吩嗪基)和吩噻嗪基(如1-吩噻嗪基、2-吩噻嗪基、3-吩噻嗪基、4-吩噻嗪基)。
本发明中，例如，术语"环烷基"是指环状饱和烃基，环烷基的碳原子数为例如3-15，前述环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、桥接环烃基和螺烃基。其中，优选环丙基、环丁基、环戊基、环己基和桥接环烃基等。
本发明中，"桥接环烃基"的实例包括二环[2.1.0]戊基、二环[2.2.1]庚基、二环[2.2.2]辛基和二环[3.2.1]辛基、三环[2.2.1.0]庚基、二环[3.3.1]壬烷、1-金刚烷基和2-金刚烷基。
本发明中，"螺烃基"的实例包括螺[3.4]辛基。
本发明中，术语"环烯基"包括例如不饱和环状脂族烃基，环烯基的碳原子数为例如3-7。前述基团的实例包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基和环庚烯基。其中，优选环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基和环己烯基等。前述术语"环烯基"还包括例如在其环中具有不饱和键的桥接环烃基和螺烃基。
本发明中，"芳烷基"的实例包括苯甲基、2-苯乙基和萘甲基。"环烷基烷基"和"环基烷基"的实例包括环己基甲基和金刚烷基甲基。"羟烷基"的实例包括羟基甲基和2-羟基乙基。
本发明中，"烷氧基"包括例如由任一前述烷基和氧构成的基团(烷基-O-基团)，其实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基。"烷氧基烷基"的实例包括甲氧基甲基。"氨烷基"的实例包括2-氨基乙基。
本发明中，"杂环基"的实例包括1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、吡咯烷酮、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、咪唑烷酮、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、哌啶酮、哌啶子基(piperidino)、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、哌嗪酮、2-吗啉基、3-吗啉基、吗啉代、四氢吡喃基和四氢呋喃基。
本发明中，"杂环基烷基"的实例包括哌啶基甲基和哌嗪基甲基。"杂环基烯基"的实例包括2-哌啶基乙烯基。"杂芳烷基"的实例包括吡啶基甲基和喹啉-3-基甲基。
本发明中，术语"甲硅烷基"包括由式R3Si-表示的基团，其中R独立地可选自前述烷基、芳基和环烷基。甲硅烷基的实例包括三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基。"甲硅烷氧基"的实例包括三甲基甲硅烷氧基。"甲硅烷氧基烷基"的实例包括三甲基甲硅烷氧基甲基。
本发明中，"亚烷基"的实例包括亚甲基、亚乙基和亚丙基。
本发明中，上述各种基团可被取代。前述取代基的实例包括羟基、羧基、磺基、卤素、卤化烷基(卤代烷基，如CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亚硝基、氰基、烷基(如甲基、乙基、异丙基、叔丁基)、烯基(如乙烯基)、炔基(如乙炔基)、环烷基(如环丙基、金刚烷基)、环烷基烷基(如环己基甲基、金刚烷基甲基)、环烯基(如环丙烯基)、环基烷基、羟烷基(如羟甲基、羟乙基)、烷氧基烷基(如甲氧基甲基、乙氧基甲基、乙氧基乙基)、芳基(如苯基、萘基)、芳烷基(如苯甲基、苯乙基)、烷芳基(如对甲苯基)、杂芳基(如吡啶基、呋喃基)、杂芳烷基(如吡啶基甲基)、杂环基(如哌啶基)、杂环基烯基、杂环基烷基(如吗啉基甲基)、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤化烷氧基(如OCF3)、烯氧基(如乙烯基氧基、烯丙基氧基)、芳氧基(如苯氧基)、烷氧基羰基(如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基)、芳烷氧基(如苯甲基氧基)、氨基[烷基氨基(如甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基)、酰基氨基(如乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳烷基氨基(如苯甲基氨基、三苯甲基氨基)、羟基氨基]、氨烷基(如氨基甲基)、烷基氨烷基(如二乙基氨基甲基)、氨基甲酰基、氨磺酰基、氧基、甲硅烷基和甲硅烷氧基烷基等。
2.核苷酸残基
前述核苷酸残基包括例如糖、碱基和磷酸作为其组分。如上所述，前述核苷酸残基可为例如核糖核苷酸残基或脱氧核糖核苷酸残基。前述核糖核苷酸残基具有例如核糖残基作为糖；腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或脲嘧啶(U)作为碱基。前述脱氧核糖残基具有例如脱氧核糖残基作为糖；腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)作为碱基。
前述核苷酸残基可为例如未修饰的核苷酸残基或修饰的核苷酸残基。前述未修饰的核苷酸残基的前述组分与例如天然存在的核苷酸残基的组分相同或基本上相同。优选组分与人体内天然存在的核苷酸残基的组分相同或基本上相同。
前述修饰的核苷酸残基为例如通过修饰前述未修饰的核苷酸残基获得的核苷酸残基。例如，前述修饰的核苷酸残基可为修饰前述未修饰的核苷酸残基的任一组分的修饰的核苷酸残基。本发明中，"修饰"意指例如取代、添加和/或缺失任一前述组分；和取代、添加和/或缺失前述组分中的原子和/或官能团。还可称作"改变"。前述修饰的核苷酸残基的实例包括天然存在的核苷酸残基和人工修饰的核苷酸残基。关于前述天然来源的修饰的核苷酸残基，可查阅例如Limbach等人(Limbach等人，1994,Summary:the modifiednucleosides of RNA,Nucleic Acids Res.22:pp.2183至2196)。前述修饰的核苷酸残基可为例如前述核苷酸残基的代替物的残基。
前述核苷酸残基的修饰的实例包括核糖-磷酸骨架(下文中称作"核糖磷酸(ribophosphate)骨架")的修饰。
在前述核糖磷酸骨架中，例如核糖残基可被修饰。在前述核糖残基中，例如，2’-位碳可被修饰。具体地，结合至例如2’-位碳的羟基键可被氢或氟取代。通过用氢取代结合至前述2’-位碳的羟基键，可用脱氧核糖残基取代核糖残基。例如前述核糖残基可用其立体异构体取代，并可用例如阿拉伯糖残基取代。
前述核糖磷酸骨架可被例如具有非核糖残基和/或非磷酸的非核糖磷酸骨架取代。前述非核糖磷酸骨架可为例如修饰为不带电的前述核糖磷酸骨架。前述核苷酸残基中通过用前述非核糖磷酸骨架取代核糖磷酸骨架获得的代替物的实例包括吗啉代、环丁基和吡咯烷。前述代替物的其它实例包括人工核酸单体残基。其具体实例包括PNA(肽核酸)、LNA(锁定核酸)(LockedNucleic Acid)和ENA(2’-O,4’-C-亚乙基桥接核酸)。其中，优选PNA。
在前述核糖磷酸骨架中，例如，可修饰磷酸基。在前述核糖磷酸骨架中，在与糖残基距离最近的磷酸基称为"α-磷酸基"。前述α-磷酸基带负电，电荷均匀分布在不与糖残基相连的两个氧原子上。在前述α-磷酸基的四个氧原子中，核苷酸残基之间的磷酸二酯键中不与糖残基相连的两个氧原子在下文中称作"非结合(non-linking)氧"。另一方面，与前述核苷酸残基之间的磷酸二酯键中糖残基相连的两个氧原子在下文中称作"结合氧"。例如，前述α-磷酸基优选修饰为不带电，或者使前述非结合原子之间的电荷分布不对称。
在前述磷酸基中，例如一个(或多个)前述非结合氧可被取代。前述氧可被例如选自S(硫)、Se(硒)、B(硼)、C(碳)、H(氢)、N(氮)和OR(R为例如烷基或芳基)的任意原子取代，并优选被S取代。优选例如两个前述非结合氧都被取代，并更优选两个非结合氧都被S取代。前述修饰的磷酸基的实例包括硫代磷酸基(phosphorothioate)、二硫代磷酸基、硒酸磷酸基(phosphoroselenates)、硼酸磷酸基(boranophosphates)、硼酸磷酸酯基、氢膦酸基、氨基磷酸基、烷基或芳基膦酸基和磷酸三酯基。特别地，优选其中前述两个非结合氧均被S取代的二硫代磷酸基。
在前述磷酸基中，例如一个(或多个)前述结合氧可被取代。前述氧可被例如选自S(硫)、C(碳)和N(氮)的任意原子取代。前述修饰的磷酸基的实例包括：由被N取代产生的桥接的氨基磷酸基；由被S取代产生的桥接的硫代磷酸基；和由被C取代产生的桥接的亚甲基膦酸基。优选前述结合氧的取代在例如本发明的ssPN分子的5’端核苷酸残基和3’端核苷酸残基的至少之一中进行。当取代在5’侧进行时，优选用C取代。当在3’侧进行取代时，优选用N取代。
前述磷酸基可被例如前述无磷酸基的连接子取代。前述连接子可包含硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸酯、磺胺、硫甲缩醛(thioformacetal)、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼或亚甲氧基甲基亚氨基等。优选地，连接子可包含亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
在本发明的ssPN分子中，例如，3’端核苷酸残基和5’端核苷酸残基的至少之一可被修饰。例如，3’端和5’端任一处的核苷酸残基可被修饰，或3’端和5’端两处的核苷酸残基均可被修饰。前述修饰可为例如如上所述，并优选修饰末端的磷酸基。例如，整个前述磷酸基可被修饰，或者前述磷酸基的一个以上的原子可被修饰。在前一种情况中，例如整个磷酸基可被取代或删除。
前述末端的核苷酸残基的修饰可为例如任何其它分子的添加。前述其它分子的实例包括功能性分子如如上所述的标记物质和保护基。前述保护基的实例包括S(硫)、Si(硅)、B(硼)和含酯基团。功能性分子如前述标记物质可用于例如本发明的ssPN分子的检测等。
前述其它分子可例如添加至前述核苷酸残基的磷酸基或可经间隔子添加至前述磷酸基或前述糖残基。例如，前述间隔子的末端原子可添加至或取代前述磷酸基的前述结合氧或者糖残基的O、N、S或C中的任一个。前述糖残基的结合位点优选为例如3’-位C、5’-位C或与之结合的任意原子。例如，前述间隔子还可添加至或取代前述核苷酸代替物如PNA的末端原子。
前述间隔子不特别限定，其实例包括-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、无碱性糖(abasic sugars)、酰胺、羧基、胺、羟基胺(oxyamine)、羟基亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺胺和吗啉代，以及生物素试剂和荧光素试剂。在前述式中，n为正整数，优选n＝3或6。
要添加至末端的前述分子的其它实例包括染料、嵌入剂(如吖啶)、交联剂(如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉类(TPPC4、德萨非丁(texaphyrin)、赛普非丁(sapphyrin))、多环芳烃(如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切酶(如EDTA)、亲脂性载体(如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基(geranyloxyhexyl group)、六癸基甘油、茨醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或酚苯并黄质(phenoxathiine))、肽复合物(如触足(Antennapedia)肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG(如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(如生物素)、转运/吸收促进剂(如阿司匹林、维生素E、叶酸)、和合成核糖核酸酶(如咪唑、二咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑复合物、四氮杂大环(tetraazamacrocycles)的Eu3+复合物)。
在本发明的ssPN分子中，例如前述5’端可被磷酸基或磷酸基类似物修饰。前述磷酸化作用的实例包括：
5’-单磷酸((HO)2(O)P-O-5’)；
5’-二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；
5’-三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；
5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化，7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；
5’-腺苷帽(Appp)；
任何修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；
5’-单硫代磷酸(硫代磷酸：(HO)2(S)P-O-5’)；
5’-单二硫代磷酸(二硫代磷酸：(HO)(HS)(S)P-O-5’)；
5’-硫代磷酸((HO)2(O)P-S-5’)；
硫取代的单磷酸、二磷酸和三磷酸(如5’-α-硫代三磷酸和5’-γ-硫代三磷酸等)；
5’-氨基磷酸((HO)2(O)P-NH-5’,(HO)(NH2)(O)P-O-5’)；
5’-烷基磷酸(如RP(OH)(O)-O-5’,(OH)2(O)P-5’-CH2，其中R为烷基(如甲基、乙基、异丙基或丙基等))；和
5’-烷基醚磷酸(如RP(OH)(O)-O-5’，其中R为烷基醚(如甲氧基甲基或乙氧基甲基等))。
在前述核苷酸残基中，前述碱基不特别限定。前述碱基可为例如天然碱基或非天然碱基。前述碱基可为例如天然来源的碱基或合成碱基。作为前述碱基，例如可使用常用碱基和其修饰类似物等。
前述碱基的实例包括：嘌呤碱基如腺嘌呤和鸟嘌呤；嘧啶碱基如胞嘧啶、脲嘧啶和胸腺嘧啶。前述碱基的其它实例包括肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、次黄苷(nubularine)、异鸟苷和块菌素(tubercidine)。前述碱基的实例还包括：2-氨基腺嘌呤、烷基衍生物如6-甲基化嘌呤；烷基衍生物如2-丙基化嘌呤；5-卤代脲嘧啶和5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基脲嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮脲嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-脲嘧啶(假脲嘧啶)、4-硫代脲嘧啶、5-卤代脲嘧啶、5-(2-氨基丙基)脲嘧啶、5-氨基烯丙基脲嘧啶；8-卤化、胺化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化和其它8-取代嘌呤；5-三氟甲基化和其它5-取代嘧啶；7-甲基鸟嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮嘧啶；N-2、N-6和O-6取代嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基脲嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；二氢脲嘧啶；3-脱氮-5-氮胞嘧啶；2-氨基嘌呤；5-烷基脲嘧啶；7-烷基鸟嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-脱氮腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；5-氨基-烯丙基-脲嘧啶；N3-甲基脲嘧啶；取代的1,2,4-三唑；2-吡咯烷酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基脲嘧啶；脲嘧啶-5-氧乙酸；5-甲氧基羰基甲基脲嘧啶；5-甲基-2-硫代脲嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫代脲嘧啶；5-甲基氨基甲基-2-硫代脲嘧啶；3-(3-氨基-3-羧基丙基)脲嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙酰胞嘧啶；2-硫代胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-异戊基腺嘌呤；2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤；N-甲基鸟嘌呤；和O-烷基化碱基。嘌呤和嘧啶的实例包括美国专利3,687,808号、Kroschwitz J.I,John Wiley& Sons编辑的“Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering",pp.858-859,1990和Englisch等人的Angewandte Chemie,International Edition,1991,vol.30,p.613中公开的那些。
前述修饰的核苷酸残基的其它实例包括不具有碱基的那些，即具有无碱性的核糖磷酸骨架。此外，作为前述修饰的核苷酸残基，可使用例如美国临时申请60/465,665号(提交日期：2003年4月25日)和国际申请PCT/US04/07070(提交日期：2004年3月8日)中记载的那些并将这些文献引入于此以作参考。
3.本发明的ssPN分子的合成方法
本发明的ssPN分子的合成方法不特别限定，并可采用常规已知的方法。前述合成方法的实例包括根据遗传工程步骤的合成方法和化学合成法。遗传工程步骤的实例包括：利用体内转录的合成法；使用载体的方法；和使用PCR盒进行的方法等。前述载体不特别限定，其实例包括非病毒载体如质粒和病毒载体，其不限于此。前述化学合成法不特别限定，其实例包括亚磷酰胺法(phosphoramidite method)和H-磷酸法。前述化学合成法可例如使用商购可得的自动核酸合成仪进行。在前述化学合成法中，通常使用酰胺(amidite)。前述酰胺不特别限定。商购可得的酰胺的实例包括RNA氨基磷酸(2’-O-TBDMSi，商品名，Samchully Pharm.Co.,Ltd.)、ACE酰胺、TOM酰胺、CEE酰胺、CEM酰胺和TEM酰胺。在本发明的ssPN分子的合成中，优选使用例如下述本发明的单体用于合成由前述式(I)表示的连接子区域。
4.组合物
根据本发明的表达抑制组合物，如上所述，为用于抑制靶基因表达的包含前述本发明的ssPN分子的组合物。本发明的组合物的特征在于其包含前述本发明的ssPN分子，且决不限定其它构成。本发明的表达抑制组合物还可称作例如表达抑制试剂。
根据本发明，例如，通过向其中存在前述靶基因的对象施用，可抑制前述靶基因的表达。
此外，如上所述，根据本发明的药物学组合物包含前述本发明的ssPN分子。本发明的组合物的特征在于其包含前述本发明的ssPN分子，且决不限定其它构成。本发明的药物学组合物还可称作例如药品。
根据本发明，例如，患有由基因引起的疾病的患者的施用可抑制前述基因的表达，从而治疗前述疾病。本发明中，术语"治疗"包括，如上所提及的，例如前述疾病的预防；疾病的改善；和预后的改善，并且其可指它们中的任一种。
本发明中，要治疗的疾病不特别限定，其实例包括由基因表达引起的疾病。根据前述疾病的种类，引起疾病的基因可设定为前述靶基因，另外，根据前述靶基因，前述表达抑制序列可适当设定。
具体实例如下。通过设定前述TGF-β1基因为前述靶基因并将前述基因用表达抑制序列并入前述ssPN分子，ssPN分子可用于例如炎性疾病、具体为极性肺伤害等的治疗。
根据本发明的表达抑制组合物和药物学组合物(下文中，两种组合物均简称为"组合物")的使用方法不特别限定，其实例包括将前述ssPN分子施用至具有前述靶基因的对象。
施用本发明的ssPN分子的前述对象的实例包括细胞、组织和器官等。前述对象的实例还包括人和非人动物等如非人哺乳动物即不包括人的哺乳动物。前述施用可例如在体内或体外进行。前述细胞不特别限定，并且其实例包括：各种培养细胞如HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞和COS细胞；干细胞如ES细胞和造血干细胞；和从活生物体分离的细胞如原代培养细胞。
前述施用方法不特别限定，并可例如根据对象适当确定。当前述对象为培养细胞时，施用方法可为例如使用转染试剂或电穿孔法等的方法。当前述施用在体内进行时，施用可例如为口服施用或肠胃外施用。前述肠胃外施用的实例包括注射、皮下施用和局部施用。
例如，本发明的各组合物可仅包含本发明的ssPN分子或可进一步包含除ssPN分子以外的添加剂。前述添加剂不特别限定，并优选例如药物学可接受的添加剂。前述添加剂的种类不特别限定，并可根据例如对象种类而适当选择。
本发明的组合物中，例如前述ssPN分子可与前述添加剂形成复合物。前述添加剂还可称作例如复合化剂。前述复合物使例如前述ssPN分子有效传递。前述ssPN分子与前述复合化剂之间的键不特别限定，其实例包括非共价键等。前述复合物可为例如包合复合物(inclusion complex)等。
前述复合化剂不特别限定，其实例包括聚合物、环糊精和金刚石合金(adamantine)。前述环糊精包括线性环糊精共聚物和线性氧化环糊精共聚物。
前述添加剂的其它实例包括载体、结合至靶细胞的结合物质、缩合剂和融合剂(fusogenic agent)。
例如，前述载体优选聚合物、更优选生物聚合物。优选前述载体为例如生物可降解的。前述载体的实例包括：蛋白质如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)和球蛋白；糖类诸如葡萄聚糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精和透明质酸等；和脂质。作为前述载体，还可使用例如合成聚合物如合成聚氨基酸。前述聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)、聚-L-天冬氨酸、聚-L-谷氨酸、苯乙烯马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物和聚磷嗪(polyphosphazine)。
前述结合物质的实例包括促甲状腺激素、促黑色素细胞激素、凝集素、糖蛋白、表面蛋白A、粘蛋白型糖(mucin carbohydrate)、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰-葡萄糖胺、多价甘露糖、多价果糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、二磷酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素、萘普生(Neproxin)、RGD肽和RDG肽模拟物(peptide mimetic)。
前述融合剂和缩合剂的实例包括聚氨基链如聚乙烯亚胺(PEI)。例如PEI可为线性或支化的，还可为合成或天然存在的。前述PEI可例如被烷基或脂质取代。作为前述融合剂，还可使用例如聚组氨酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙烯亚胺、蜂毒肽(mellitin)或聚缩醛物质(如阳离子聚缩醛等)等。前述融合剂可具有例如α-螺旋结构。前述融合剂可为例如膜破坏剂如蜂毒肽。
对于根据本发明的组合物，例如，将美国专利6,509,323号、美国专利公报2003/0008818号和PCT/US04/07070等中关于前述复合物的形成等的记载引入于此以作参考。
前述添加剂的其它实例包括两性分子等。前述两性分子为例如具有疏水区和亲水区的分子。前述分子为例如优选聚合物。前述聚合物可具有例如二级结构，优选重复二级结构。具体地，例如优选多肽，更优选α-螺旋多肽等。
前述两性聚合物可为例如具有两个以上的两性亚基的聚合物。前述亚基的实例包括含具有至少一个亲水基团和一个疏水基团的环状结构的亚基等。前述亚基可包含例如类固醇如胆酸和芳族结构等。前述聚合物包含例如环状结构亚基如芳族亚基和氨基酸二者。
5.表达抑制方法
根据本发明的表达抑制方法为，如上所述，用于抑制靶基因表达的方法，其中使用前述本发明的ssPN分子。本发明的表达抑制方法的特征在于其中使用前述本发明的ssPN分子，但决不限定其它步骤和条件。
在本发明的表达抑制方法中，前述基因表达受抑制的机理不特别限定，其实例包括通过RNA干扰抑制表达等。本发明的表达抑制方法为例如用于诱导抑制前述靶基因表达的RNA干扰的方法，并且其还可指特征在于将前述本发明的ssPN分子用于其中的诱导表达用方法。
本发明的表达抑制方法包括例如将前述ssPN分子施用至其中存在前述靶基因的对象的步骤。通过前述施用步骤，例如使前述ssPN分子与前述对象相接触来施用ssPN分子。施用本发明的ssPN分子的前述对象的实例包括细胞、组织和器官等。前述对象的实例还包括还包括人和非人动物等如非人哺乳动物即不包括人的哺乳动物。前述施用可例如在体内或体外进行。
在本发明的表达抑制方法中，例如，前述ssPN分子可单独施用，或者可施用包含前述ssPN分子的本发明的前述组合物。前述施用方法不特别限定，并例如可根据对象的种类适当选择。
6.治疗方法
如上所述，根据本发明疾病的治疗方法包括施用前述本发明的ssPN分子至患者的步骤，前述ssPN分子包括能抑制引起前述疾病的基因表达的序列作为前述表达抑制序列。本发明的治疗方法的特征在于其中使用前述本发明的ssPN分子，且决不限定其它步骤和条件。关于本发明的前述表达抑制方法的描述还适用于例如本发明的治疗方法。
7.ssPN分子的用途
根据本发明的用途为前述本发明的ssPN分子用于前述靶基因表达抑制的用途。另外，根据本发明的用途为前述本发明的ssPN分子用于诱导RNA干扰的用途。
根据本发明的核酸分子为用于治疗疾病的核酸分子。前述核酸分子为前述本发明的ssPN分子，前述ssPN分子包括抑制引起前述疾病的基因表达的序列作为前述表达抑制序列。
8.单体
根据本发明的单体为具有下式(II)的结构的核酸合成用单体。除非另有说明，否则关于前述本发明的ssPN分子的描述还适用于本发明的单体。
通过例如在前述本发明的ssPN分子的合成中使用本发明的单体，由前述式(I)表示的连接子区域(Lx)和(Ly)可容易合成。本发明的单体可使用例如自动核酸合成用酰胺，并适合于例如通用自动核酸合成仪。前述合成方法的实例包括亚磷酰胺法和H-膦酸酯法。
在前述式中，
X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
R11和R21各自独立地为H、保护基或磷酸保护基。
L1为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR21的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
A为任意原子团，下式(Ia)为前述氨基酸，下式(Ia)为除肽以外的氨基酸。
对于前述式(II)和前述式(I)之间的通用部分，上述关于前述式(I)的描述也适用于前述式(II)。具体地，在前述式(II)中，对于X1、X2、Y1、Y2、L1、L2、m、n和环A，适用于例如上述关于前述式(I)指出的所有关于它们的描述。
在前述式(II)中，如上所述，R11和R21各自独立地为H、保护基或磷酸保护基。
前述保护基为例如如上所述关于前述式(I)。具体地，例如，保护基可选自组I。前述组I包括，例如二甲氧基三苯甲基(DMTr)、TBDMS、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基、TEM基和由下式(P1)或(P2)表示的含甲硅烷基的基团。特别地，优选保护基为DMtr基或任一前述含甲硅烷基的基团。
前述磷酸保护基可例如由下式表示：
-P(OR6)(NR7R8)
在前述式中，R6为氢原子或任意取代基。例如，取代基R6优选为烃基，前述烃基可以被或可以不被吸电子基团取代。取代基R6的实例包括卤素、卤烷基、杂芳基、羟烷基、烷氧基烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳烷基，和烃如烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基和环基烷基，其可以被或可以不被吸电子基团取代。取代基R6的具体实例包括β-氰基乙基、硝基苯基乙基和甲基。
R7和R8各自为氢原子或任意取代基，并且它们可相同或不同。取代基R7和R8优选例如烃基，前述烃基可以进一步被取代基取代或可以不进一步被取代基取代。前述烃基的实例与上述关于R6的记载中所列出的那些相同，烃基优选甲基、乙基或异丙基。在该情况中，-NR7R8的具体实例包括二异丙基氨基、二乙基氨基和乙基甲基氨基。可选地，取代基R7和R8任选同与之键合的氮原子一起连接形成(即整体上为-NR7R8)含氮环(如哌啶基或吗啉基等)。
具体地，前述磷酸保护基可选自例如下述组II。组II包括例如-P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)和-P(OCH3)(N(i-Pr)2)。在前述式中，i-Pr表示异丙基。
在前述式(II)中，例如，R1和R2之一为H或保护基，其它为H或磷酸保护基。例如，优选当R1为前述保护基时，R2为H或前述磷酸保护基。具体地，优选当R1选自前述组I时，R2为H或选自前述组II。另外，优选例如当R1为前述磷酸保护基时，R2为H或前述保护基。具体地，优选当R1选自前述组II，R2为H或选自前述组I。
前述式(II)的结构的实例包括下式(II-1)至(II-4)。在下式中，n和m与前述式(II)中的相同。
在前述式(II-4)中，R101独立地来自R11和R21、H、保护基或磷酸保护基。前述R101的保护基和前述磷酸保护基不特别限定，且可例如与R11和R21一样、全氟烷醇基如Tfa(三氟乙酰基)等和Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)。
在前述式(II-1)-(II-4)中，n和m不特别限定并如上所述。其具体实例为前述式(II-1)，其中n＝11和m＝12,，其结构由下式(II-1a)表示。另一具体实例为前述式(II-1)，其中n＝5和m＝4，其结构由下式(II-1b)表示。还有另一具体实例为前述式(II-4)，其中n＝5和m＝4，其结构由下式(II-4a)表示。
本发明中的单体的生产方法不特别限定，例如如下列流程1所示，下列化合物(Ic)可由化合物(Ib)生产，其中前述氨基酸(Ia)的氨基通过缩合反应被保护基R31保护，(IIa)由(Ic)生产，且(IIa)转化为(II)。下列流程1为实例且本发明不限于此。在下列化学式(Ib)和(Ic)中，保护基R31为例如Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)、Z(苄氧基羰基)和BOC(叔丁氧基羰基)等。在下列化学式(Ib)、(Ic)和(IIa)中，Y1、Y2、L1、L2、R11和R21如前述式(II)的所述。下列化合物(IIa)为前述式(II)的化合物，其中X1为O和X2为O。下式(II)中的羰基氧可适当地转化为前述式(II)中的X1和X2。当转化不是必须的时候，下列化合物(IIa)可直接用作化合物(II)。
本发明中的单体及其制造方法进一步由下列流程2具体示例。然而，下列流程2为实例，本发明不限于此。在下列流程2中，“Fmoc”为9-芴基甲氧基羰基，“iPr”为异丙基，“Tr”为三苯甲基或三苯基甲基，和“ODMTr”为4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基。下文中相同。
本发明的单体优选包括例如前述标记物质。特别优选本发明的单体包括前述稳定同位素。前述标记物质如上所述。
当本发明的单体包括同位素如前速稳定同位素时，前述同位素可容易引入前述本发明的ssPN分子。包括同位素的前述单体可由例如已引入前述同位素的氨基酸(Ia)的原料合成。本发明中，获得已引入前述同位素的氨基酸(Ia)的方法不特别限定。例如，可通过适当方法制造，或可使用商购可得的产品。
作为引入稳定同位素的氨基酸，例如，如下列流程3所示，引入重氢(D)的氨基酸可通过用LiAlD4处理氨基酸(Ia)来制造，并进一步氧化所得OH基。
作为引入其它稳定同位素的氨基酸，例如，如下式所示，引入重氧(18O)的氨基酸可通过使氨基酸(Ia)的甲基酯与H2 18O在碱性条件下反应来制造。
另外，包括引入重氮(15N)或重碳(13C)等的氨基酸(Ia)的制造方法不特别限定，且其可通过适当的方法制造。
具有稳定同位素引入其中的单体可以上述方式合成。通过使用前述单体作为合成用酰胺，可合成其中稳定同位素引入前述连接子区域的核酸分子。
下文中，将参考实施例等详细描述本发明。然而，要注意的是本发明决不受限于此。
实施例
(实施例A1)
根据下列流程5，合成十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二烷氨基亚磷酰胺(6)。化合物(6)为本发明前述单体的一个实施方案。下列流程5中的“Gly”为由下式表示的结构，即具有其中氨基的一个氢原子与羧基的OH从甘氨酸中除去的结构的原子团。下面，除非另有说明，否则“Gly”显示下式的结构。下列流程5中，Gly的NH侧键合至Fmoc或羰基碳，Gly的羰基碳(CO)侧键合至OH或N原子。
(Gly)
―HN-CH2-CO―
(1)12-三氟三氟乙酰氨基十二烷醇(化合物1)
12-氨基十二烷醇(4.81g,23.9mmol)和乙基三氟乙酸酯(6.79g,47.8mmol)在乙醇中的溶液(100mL)室温下搅拌过夜。反应混合物在减压下浓缩，从而给出为无色浆液的12-三氟乙酰氨基十二烷醇(1)(6.98g,q.)。
(2)12-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)十二酰胺(化合物2)
化合物1(3.00g,10.08mmol)用无水吡啶共沸干燥三次。4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(4.32g,12.1mmol)和无水吡啶(50mL)通过共沸添加至残留物，并室温下搅拌混合物过夜。甲醇(10mL)添加至所得反应混合物中并室温下搅拌30min，并在室温减压下将溶剂蒸发至约30mL。其后，添加二氯甲烷(200mL)，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，并进一步用饱和盐水洗涤。经硫酸钠干燥后，减压下蒸发溶剂。向由此获得的未纯化的残留物在甲醇中的溶液(100mL)添加氢氧化钠(2.02g,50.40mmol)并室温下过夜搅拌混合物。将反应混合物减压下浓缩至约30mL，添加水(100mL)和二氯甲烷(200mL)，并分离有机层。分离的有机层用饱和盐水洗涤并经硫酸钠干燥。其后，通过过滤分离干燥剂(硫酸钠)并在减压下蒸发溶剂。所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(95:5)+0.05％吡啶)，从而给出12-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)十二酰胺(2)(5.19g,q.)。下面示出12-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)十二酰胺(2)的仪器分析值。
12-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)十二酰胺(2)；
1H-NMR(CDCl3):δ＝7.45-7.43(2H,m),7.34-7.25(6H,m),7.21-7.20(1H,m),6.83-6.79(4H,m),3.78(6H,s),3.04-3.01(2H,t,J＝6.3Hz),2.70-2.67(2H,t,J＝6.8Hz),1.61-1.54(6H,m),1.33-1.24(14H,m).
(3)Fmoc-甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二酰胺(化合物3)
室温下在氩气气氛下向Fmoc-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH，购自Wako PureChemical Industries,Ltd.)(2.00g,6.73mmol)、二环己基碳化二亚胺(1.66g,8.07mmol)和1-羟基苯并三唑一水合物(2.31g,16.14mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(70mL)添加化合物2(4.07g,8.07mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(30mL)，并在氩气气氛下将混合物室温搅拌过夜。将所得沉淀物通过过滤分离，并将滤液在35℃减压下浓缩。将二氯甲烷(200mL)添加至所得残留物，并将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次。将有机层分馏并经硫酸钠干燥，并在减压下蒸发溶剂。所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(95:5)+0.05％吡啶)，从而给出为无色浆料的Fmoc-甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁基十二酰胺(3)(5.88g,q.)。
(4)甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二酰胺(化合物4)
室温下向化合物3(5.88g,6.73mmol)添加N,N-二甲基甲酰胺(10mL)和哌啶(4.8mL)，并将混合物室温过夜搅拌。将反应混合物中的溶剂在减压下蒸发，所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(9:1)+0.05％吡啶)，从而给出甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二酰胺(4)(3.44g,91％)。下面示出甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二酰胺(4)的仪器分析值。
甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二酰胺(4)；
1H-NMR(CDCl3):δ＝7.47-7.44(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.21-7.20(1H,m),6.83-6.80(4H,m),3.79(6H,s),3.34(2H,s),3.30-3.25(2H,t,J＝6.6Hz),3.06-3.02(2H,t,J＝6.3Hz),1.64-1.50(6H,m),1.38-1.25(14H,m).
(5)羟基十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二酰胺(化合物5)
化合物4(3.15g,5.62mmol)与无水吡啶共沸干燥三次，在室温下氩气气氛下添加12-羟基月桂酸(3.41g,6.74mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(1.29g,6.74mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(2.06g,13.48mmol)和无水二氯甲烷(50mL)，搅拌混合物10min。三乙胺(2.05g,20.22mmol)添加至由此获得的混合物，并在氩气气氛下将混合物室温搅拌过夜。将二氯甲烷(200mL)添加至所得反应混合物，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，并进一步用饱和盐水洗涤一次。分离有机层并经硫酸钠干燥，并在减压下蒸发溶剂。所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(95:5)+0.05％吡啶)，从而给出为无色浆料的羟基十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二酰胺(5)(2.97g,70％)。下面示出羟基十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二酰胺(5)的仪器分析值。
羟基十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二酰胺(5)；
1H-NMR(CDCl3):δ＝7.42-7.40(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.22-7.21(1H,m),6.83-6.80(4H,m),3.84(2H,s),3.79(6H,s),3.64-3.61(2H,t,J＝6.3Hz),3.26-3.24(2H,t,J＝6.1Hz),3.08-3.06(2H,t,J＝5.6Hz),2.28-2.24(2H,t,J＝6.8Hz),1.69-1.52(12H,m),1.44-1.39(26H,m).
(6)十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二烷氨基亚磷酰胺(化合物6)
化合物5(2.78g,3.76mmol)与无水吡啶共沸干燥三次。然后，添加二异丙基四唑化铵(772mg,4.51mmol)，并在减压下将混合物除去空气并用氩气填充，并添加无水乙腈(3mL)。此外，添加2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基磷酰二胺(1.36g,4.51mmol)在无水乙腈-二氯甲烷中的溶液(3mL)，并在氩气气氛下将混合物室温下搅拌4hr。向所得反应混合物添加二氯甲烷(150mL)，将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次，并进一步用饱和盐水洗涤一次。有机层分离并经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。残留物进行使用氨基二氧化硅的柱层析(洗脱液：正己烷-丙酮(7:3)+0.05％吡啶)，从而给出十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二烷氨基亚磷酰胺(6)(2.72g,77％,HPLC98.5％)。下面示出十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二烷氨基亚磷酰胺(6)的仪器分析值。
十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基十二烷氨基亚磷酰胺(6)；
1H-NMR(CDCl3):δ＝7.41-7.49(m,2H),7.26-7.30(m,6H),7.17-7.19(m,1H),6.80-6,83(m,4H),6.46-6.62(m,2H),4.07-4.29(m,2H),3.89(d,J＝5.4Hz,2H),3.75-3.87(m,4H),3.67(s,6H),3.47-3.70(m,4H),3.20-3.26(m,2H),3.02(t,J＝6.4Hz,2H,CH2),2.63(t,6.4Hz,2H,CH3),1.56-1.63(m,6H),1.47-1.51(m,2H),1.24-1.33(m,26H),1.13-1.20(m,12H):
P-NMR(CDCl3):δ＝146.62.
(实施例B1)RNA的固相合成
合成具有本发明连接子的RNA(本发明的单链核酸分子)。RNA通过核酸合成仪(商品名：ABI Expedite(注册商标)8909核酸合成系统，AppliedBiosystems)由3’侧向5’侧基于亚磷酰胺法合成。对于前述合成，RNA亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名，Samchully Pharm.Co.,Ltd.)用作RNA酰胺(下文相同)。前述酰胺通过常规方法脱保护，合成的RNA通过HPLC合成。下述实施例中，除非另有说明，否则RNA以相同方式合成。
具体来说，单链RNA(ssRNA)，其中连接子区域(Lx)和(Ly)的结构各自由下述化学式Lg表示，通过使用前述流程5的前述化合物(6)作为本发明单体来合成作为本实施例的RNA(Ex)。
(Lg[Lx或Ly的结构])
-O(CH2)11CO-Gly-NH(CH2)12O-
首先，合成具有下述SEQ ID NO:1所示的序列的RNA。然后，将前述化合物6连接至前述RNA的5’端。接着，将具有下述SEQ ID NO:2所示的序列的RNA经前述化合物6连接至前述SEQ ID NO:1所示的RNA的5’侧。此外，前述化合物6连接至前述SEQ ID NO:2所示的RNA的5’侧。此外，实施例的ssRNA通过将下述SEQ ID NO:3所示的序列的RNA经前述化合物6连接至前述SEQ ID NO:2所示的RNA的5’侧来合成。
5’-GAA-3’(SEQ ID NO:1)
5’-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUC-3’(SEQ ID NO:2)
5’-CAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3’(SEQ ID NO:3)
如上所提及合成的实施例的ssRNA在下文中称作PK-0054。前述PK-0054具有其中如下述SEQ ID NO:4所示的从5’侧以前述SEQ ID NO:3的RNA、前述SEQ ID NO:2的RNA和前述SEQ ID NO:1的RNA的顺序排列的结构，前述SEQ ID NO:3的RNA(对应于Xc)和前述SEQ ID NO:2的RNA(对应于内部区域Z)经连接子Lx(前述结构Lg)连接，前述SEQ ID NO:2的RNA(对应于内部区域Z)和前述SEQ ID NO:1的RNA(对应于Yc)经连接子Ly(前述结构Lg)连接。此外，如下述序列所述，前述SEQ ID NO:2的RNA序列与前述SEQ ID NO:1和3的RNA序列互补。因此，如下式所示，前述PK-0054进行自我退火来具有茎结构。在下述序列中，下划线部分"GUUGUCAUACUUCUCAUGG"(SEQID NO:5)为GAPDH基因表达抑制中涉及的区域。
PK-0054的表达抑制区域(SEQ ID NO:5)
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’
除了使用下述SEQ ID NO:6的RNA代替前述SEQ ID NO:2所示的RNA，使用下述SEQ ID NO:7的RNA代替前述SEQ ID NO:3所示的RNA以外，以与PK-0054的相同的方式，合成实施例的其它ssRNA。下文中这称作PK-0055。
5’-GAA-3’(SEQ ID NO:1)
5’-GGCUUUCACUUAUCGUUGAUGGCUUC-3’(SEQ ID NO:6)
5’-CCAUCAACGAUAAGUGAAAGCC-3’(SEQ ID NO:7)
前述PK-0055具有其中如下述SEQ ID NO:8所示的从5’侧以前述SEQ IDNO:7所示的RNA、前述SEQ ID NO:6所示的RNA和前述SEQ ID NO:1所示的RNA的顺序排列的结构，前述SEQ ID NO:7所示的RNA(对应于Xc)和前述SEQ ID NO:6所示的RNA(对应于内部区域Z)经连接子Lx(前述结构Lg)连接，前述SEQ ID NO:6所示的RNA(对应于内部区域Z)和前述SEQ ID NO:1所示的RNA(对应于Yc)经连接子Ly(前述结构Lg)连接。另外，如下述序列所示，前述SEQ ID NO:6所示的RNA序列与前述SEQ ID NO:1和7所示的RNA序列互补。因此，如下式所示，前述PK-0055进行自我退火来具有茎结构。
(实施例A2)
根据下述流程6，合成丁酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰氨基亚磷酰胺(11)。化合物(11)为前述本发明单体的一个实施方案。另外，化合物(11)对应于化合物(6)(流程5，实施例A1)，其中直接键合至-CO-Gly-NH-的两端的亚甲基链具有不同碳数。
(1)Fmoc-甘氨酸-丁酰胺(化合物7)
向Fmoc-甘氨酸(4.00g,13.45mmol)、二环己基碳化二亚胺(3.33g,16.15mmol)和1-羟基苯并三唑一水合物(4.94g,32.29mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺的溶液(100mL)中添加4-氨基丁醇(1.44g,16.15mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(30mL)，并在氩气气氛下将混合物室温搅拌过夜。所得沉淀物通过过滤分离，并将滤液在减压下浓缩。将二氯甲烷(200mL)添加至所得残留物，并将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，并进一步用饱和盐水洗涤。经硫酸钠干燥后,减压下蒸发溶剂。所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(95:5))，从而给出Fmoc-甘氨酸-丁酰胺(7)(4.30g,87％)。下面示出Fmoc-甘氨酸-丁酰胺(7)的仪器分析值。
Fmoc-甘氨酸-丁酰胺(7)；
1H-NMR(CDCl3):δ＝7.78-7.76(2H,d,J＝7.3Hz),7.65-7.63(2H,d,J＝7.3Hz),7.42-7.41(2H,t,J＝7.6Hz),7.34-7.30(2H,td,J＝7.6,1.1Hz),4.42-4.40(2H,d,J＝7.3Hz),4.25-4.22(1H,t,J＝6.8Hz),3.83(2H,s),3.60-3.55(2H,m),3.30-3.25(2H,m),1.61-1.55(4H,m).
(2)Fmoc-甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(化合物8)
化合物7(4.20g,11.40mmol)与无水吡啶共沸干燥三次。4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(5.80g,17.10mmol)和无水吡啶(80mL)通过共沸添加至残留物，并将混合物室温搅拌过夜。将甲醇(20mL)添加至所得反应混合物并将混合物室温搅拌30min，减压下蒸发溶剂。其后，添加二氯甲烷(200mL)，将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，并进一步用饱和盐水洗涤。经硫酸钠干燥后，减压下蒸发溶剂，从而给出未纯化的Fmoc-甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(8)(11.40g)。
(3)甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(化合物9)
室温下向未纯化的化合物8(11.40g,16.99mmol)添加N,N-二甲基甲酰胺(45mL)和哌啶(11.7mL)，并将混合物室温搅拌过夜。减压下蒸发反应混合物中的溶剂，所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(9:1)+0.05％吡啶)，从而给出甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(9)(4.90g,96％,2步)。下面示出甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(9)的仪器分析值。
甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(9)；
1H-NMR(CDCl3):δ＝7.44-7.42(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.21-7.20(1H,m),6.83-6.80(4H,m),3.79(6H,s),3.49(2H,s),3.30-3.28(2H,t,J＝6.3Hz),3.09-3.06(2H,t,J＝5.9Hz),1.61-1.55(4H,m).
(4)羟基己酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(化合物10)
化合物9(4.80g,10.70mmol)与无水吡啶共沸干燥三次，在氩气气氛的室温下添加6-羟基己酸(1.70g,12.84mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(2.46g,12.84mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(3.93g,25.69mmol)和无水二氯甲烷(60mL)，并搅拌混合物10min。将三乙胺(3.90g,38.53mmol)添加至所得混合物，在氩气气氛下将混合物室温搅拌过夜。将二氯甲烷(200mL)添加至所得反应混合物，混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，并进一步用饱和盐水洗涤一次。分离有机层并经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(95:5)+0.05％吡啶)，从而给出羟基己酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(10)(4.80g,80％)。下面示出羟基己酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(10)的仪器分析值。
羟基己酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰胺(10)；
1H-NMR(CDCl3):δ＝7.43-7.40(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.22-7.20(1H,m),6.83-6.80(4H,m),3.85(2H,s),3.78(6H,s),3.63-3.60(2H,t,J＝6.3Hz),3.26-3.23(2H,t,J＝6.1Hz),3.07-3.05(2H,t,J＝5.6Hz),2.26-2.22(2H,t,J＝7.3Hz),1.68-1.52(8H,m),1.41-1.36(2H,m).
(5)羟基己酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰氨基亚磷酰胺(化合物11)
将化合物10(4.70g,8.35mmol)与无水吡啶共沸干燥三次。然后，添加二异丙基四唑化铵(1.72g,10.02mmol)，并在减压下将混合物除去空气并用氩气填充，并添加无水乙腈(5mL)。此外，添加2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基磷酰二胺(3.02g,10.02mmol)在1:1的无水乙腈-二氯甲烷中的溶液(4mL)，并在氩气气氛下将混合物室温下搅拌4hr。向所得反应混合物添加二氯甲烷(150mL)，将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次，并进一步用饱和盐水洗涤一次。有机层分离并经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。残留物进行使用氨基二氧化硅的柱层析(洗脱液：正己烷-丙酮(3:2)+0.1％三乙胺)，从而给出羟基己酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰氨基亚磷酰胺(11)(4.50g,71％,HPLC98.2％)。下面示出羟基己酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰氨基亚磷酰胺(11)的仪器分析值。
羟基己酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基丁酰氨基亚磷酰胺(11)；
1H-NMR(CDCl3):δ＝7.43-7.40(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.22-7.20(1H,m),6.83-6.80(4H,m),3.85-3.81(4H,s),3.78(6H,s),3.63-3.61(2H,t,J＝6.3Hz),3.26-3.23(2H,t,J＝6.1Hz),3.05-2.97(4H,m),2.64-2.62(2H,t,J＝6.4Hz),2.25-2.23(2H,t,J＝7.3Hz),1.68-1.52(8H,m),1.40-1.38(2H,m),1.13-1.20(12H,m).
31P-NMR(CDCl3):δ＝146.57.
(实施例A3)
根据下述流程7，合成为赖氨酸衍生物的单体(11)。在下述流程7中，“Tfa”为三氟乙酰基。
(1)化合物(13)的合成
向6-羟基己酸(化合物12)(6g,15.1mmol)在吡啶中的溶液(124mL)添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(20g,1.3eq.)和二甲基氨基吡啶(0.5g,0.1eq.)，并将混合物室温搅拌20hr。反应完成后，添加甲醇(10mL)，搅拌混合物10min，并蒸发溶剂。反应混合物用乙酸乙酯稀释，用TEAA缓冲液(pH8-9)洗涤三次，并用饱和盐水洗涤一次。有机层经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂，从而给出为浅黄色油性物质的化合物13(31g，含吡啶)。
(2)化合物(15)的合成
向化合物14(2.7g,7.9mmol)、二环己基碳化二亚胺(1.9g,1.2eq.)和1-羟基苯并三唑一水合物(2.6g,2.4eq.)在乙腈中的溶液(45mL)添加4-氨基-1-丁醇(0.86g,1.2eq.)在乙腈中的溶液(5mL)，将混合物室温搅拌16hr。反应完成后，通过过滤收集沉淀物，并通过蒸发器蒸发滤液中的溶剂。将二氯甲烷添加至所得残留物，混合物用乙酸酯缓冲液(pH4)洗涤三次并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次。有机层经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。所得粗制品通过硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝10/1)纯化，从而给出为白色固体的化合物(15)(2.8g，产率85％)。下面示出化合物(15)的仪器分析值。
化合物(15)；
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.07(br,1H),6.72(t,J＝5.6Hz,1H),4.03(m,1H),3.66(d,J＝4.9Hz,2H),3.37(dd,J＝12.9,6.3Hz,2H),3.29(dd,J＝12.4,6.3Hz,2H),1.83(s,2H),1.66-1.60(m,6H),1.44(s,9H),1.41-1.37(m,2H)
(3)化合物(16)的合成
室温下将化合物15(2.5g,6.1mmol)在盐酸/四氢呋喃溶液(4M,45mL)中搅拌2hr。反应完成后，减压下蒸发溶剂。所得残留物溶解于乙醇中，并与甲苯共沸。蒸发溶剂，从而给出为白色固体的化合物(16)(1.9g)。下面示出化合物(16)的仪器分析值。
化合物(16)；
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:3.85-3.81(m,1H),3.59-3.56(m,2H),3.32-3.20(m,2H),1.94-1.80(m,2H),1.66-1.58(m,6H),1.46-1.40(m,2H)
(4)化合物(17)的合成
向化合物13(含吡啶，24g,35.5mmol)、二环己基碳化二亚胺(8.8g,1.2eq.)和1-羟基苯并三唑一水合物(7.2g,1.5eq.)的溶液(150mL)添加三乙胺(4.5mL,0.9eq.)，进一步添加化合物16(10g,0.9eq.)在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(30mL)，将混合物室温搅拌20hr。反应完成后，通过过滤收集沉淀物，并通过蒸发器蒸发滤液中的溶剂。将二氯甲烷添加至所得残留物，混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次。有机层经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。所得粗制品通过硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝20/1+0.05％吡啶)纯化，从而给出为浅黄色固体的化合物(17)(16g，产率70％)。下面示出化合物(17)的仪器分析值。
化合物(17)；
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.43-7.40(m,2H),7.32-7.26(m,6H),7.21-7.17(m,1H),6.81(d,J＝8.8Hz,4H),4.39-4.37(m,1H),3.78(s,6H),3.64-3.61(m,2H),3.33-3.22(m,4H),3.03(t,J＝6.6Hz,2H),2.19(t,J＝7.6Hz,2H),1.79-1.54(m,12H),1.40-1.34(m,4H)
(5)化合物(18)的合成
向通过乙腈共沸干燥的化合物(17)(1.26g,1.73mmol)在无水乙腈中的溶液(3.5mL)添加二异丙基四唑化铵(394mg,1.3eq.)和2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基磷酰二胺(700mg,1.3eq.)，并将混合物室温搅拌2.5hr。添加二氯甲烷，将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤，并经硫酸钠干燥，并蒸发溶剂。所得粗制品通过硅胶柱层析(氨基二氧化硅，洗脱液：正己烷/乙酸乙酯＝2/3)纯化，从而给出为白色固体的化合物(18)(1.3g，产率78％)。下面示出化合物(18)的仪器分析值。
化合物(18)；
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.43-7.41(m,2H),7.32-7.17(m,7H),6.81(dt,J＝9.3,2.9Hz,4H),4.42-4.37(m,1H),3.78(s,6H),3.88-3.54(m,6H),3.32-3.20(m,4H),3.03(t,J＝6.3Hz,2H),2.19(t,J＝7.6Hz,2H),1.83-1.53(m,12H),1.42-1.31(m,4H),1.28-1.24(m,2H),1.18-1.16(m,12H)
31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ:146.9
(实施例B3)RNA的固相合成
除了将前述流程7中的前述化合物(18)代替前述流程5中的前述化合物(6)用作本发明单体，使用鸟苷代替前述SEQ ID NO:1所示的RNA，使用下述SEQ ID NO:63所示的RNA代替前述SEQ ID NO:2所示的RNA，并使用下述SEQ ID NO:64所示的RNA代替前述SEQ ID NO:3所示的RNA以外，以与前述实施例B1中的相同方式，固相合成实施例的RNA。以该方式合成的实施例的RNA为单链RNA(ssRNA)，其中连接子区域(Lx)和(Ly)各自具有由下述化学式L1表示的结构。下文中该实施例中RNA的连接子区域(Lx)(由下述化学式L1表示)称作“Lx”’，从而与前述实施例B1的连接子区域(Lx)(由前述化学式Lg表示)相区别。类似地，下文中该实施例中RNA的连接子区域(Ly)(由下述化学式L1表示)称作“Ly”’，从而与前述实施例B1的连接子区域(Ly)(由前述化学式Lg表示)相区别。
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’(SEQ ID NO:63)
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-3’(SEQ ID NO:64)
(Ll[Lx’或Ly’的结构])
-O(CH2)5CO-Lys-NH(CH2)4O-
前述连接子的结构L1中，“Lys”为下述化学式表示的结构。
因此，前述连接子的结构L1由下述化学式表示。
该如上所提及合成的实施例的ssRNA在下文中称作PK-0100。前述PK-0100具有其中如下述SEQ ID NO:65所示的从5’侧以前述SEQ ID NO:64所示的RNA、前述SEQ ID NO:63所示的RNA和鸟苷的顺序排列的结构。前述SEQ ID NO:64所示的RNA(对应于Xc)和前述SEQ ID NO:63所示的RNA(对应于内部区域Z)经连接子Lx’(前述结构Ll)连接，前述SEQ ID NO:63所示的RNA(对应于内部区域Z)和鸟苷(对应于Yc)经连接子Ly’(前述结构Ll)连接。另外，如下述序列所示，前述SEQ ID NO:63所示的RNA序列与前述SEQ ID NO:64所示的RNA序列鸟苷互补。因此，如下式所示，前述PK-0100进行自我退火来具有茎结构。
(参考例A1)
根据下述流程8制造含脯氨酸骨架的单链核酸的合成材料单体。
(1)Fmoc-羟基氨基-L-脯氨酸(化合物104)化合物102(Fmoc-L-脯氨酸)，其为前述流程8的起始材料，购自Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd。该化合物102(10.00g,29.64mmol)、4-氨基-1-丁醇(3.18g,35.56mmol)和1-羟基苯并三唑(10.90g,70.72mmol)混合在一起。前述混合物在减压下除去空气并用氩气填充。室温下将无水乙腈(140mL)添加至前述混合物，并将二环己基碳化二亚胺(7.34g,35.56mmol)在无水乙腈中的溶液(70mL)进一步添加至其中。其后，室温下在氩气气氛下将其搅拌15小时。反应完成后，通过过滤出去所产生的沉淀物，并在减压下蒸发所收集的滤液中的溶剂。将二氯甲烷(200mL)添加至所得残留物，并将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)洗涤。然后，收集有机层并经硫酸镁干燥。其后，过滤前述有机层，并在减压下蒸发所得滤液中的溶剂。将二乙醚(200mL)添加至残留物，从而将残留物转换成粉末。由此获得的粉末通过过滤收集。因此，获得无色粉末形式的化合物104(10.34g，产率84％)。下面示出关于前述化合物104的仪器分析结果。
Fmoc-羟基氨基-L-脯氨酸(104)；
1H-NMR(CDCl3):δ7.76-7.83(m,2H,Ar-H),7.50-7.63(m,2H,Ar-H),7.38-7.43(m,2H,Ar-H),7.28-7.33(m,2H,Ar-H),4.40-4.46(m,1H,CH),4.15-4.31(m,2H,CH2),3.67-3.73(m,2H,CH2),3.35-3.52(m,2H,CH2),3.18-3.30(m,2H,CH2),2.20-2.50(m,4H),1.81-2.03(m,3H),1.47-1.54(m,2H)；
MS(FAB+):m/z409(M+H+).
(2)Fmoc-t-丁基-二甲基甲硅烷氧基氨基-L-脯氨酸(化合物118)
Fmoc-羟基氨基-L-脯氨酸(化合物104)(2.00g,30mmol)、叔丁基-二甲基甲硅烷基氯(1.11g,35mmol)和咪唑(10.90g,71mmol)混合在一起。前述混合物在减压下除去空气并用氩气填充。室温下将无水乙腈(20mL)添加至前述混合物，并在氩气气氛下将其室温下搅拌过夜。反应完成后，将二氯甲烷(150mL)添加至前述混合物。将所得混合物用水然后用饱和盐水洗涤三次。收集有机层并经硫酸镁干燥。其后，过滤前述有机层。将所得滤液中的溶剂在减压下蒸发，并将残留物用于硅胶柱层析(洗脱液：CH2Cl2:CH3OH＝95:5)。因此，获得无色浆液形式的化合物118(2.35g，产率92％)。下面示出关于前述化合物118的仪器分析结果。
Fmoc-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基氨基-L-脯氨酸(118)；
1H-NMR(CDCl3):δ7.76-7.78(m,2H,Ar-H),7.50-7.63(m,2H,Ar-H),7.38-7.42(m,2H,Ar-H),7.29-7.34(m,2H,Ar-H),4.10-4.46(m,4H,CH2),3.47-3.59(m,4H,CH2),3.20-3.26(m,2H,CH),1.85-1.95(m,2H),1.42-1.55(m,6H),0.96(s,9H,t-Bu),0.02(s,6H,SiCH3)；
MS(FAB+):m/z523(M+H+).
(3)叔丁基-二甲基甲硅烷氧基氨基-L-脯氨酸(化合物119)
向以上获得的前述Fmoc-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基氨基-L-脯氨酸(化合物118)(1.18g,2.5mmol)添加无水乙腈(5mL)和哌啶(2.4mL)，并将其室温下搅拌1小时。反应完成后，将乙腈(50mL)添加至前述混合物，并将不溶性物质通过过滤除去。将所得滤液中的溶剂在减压下蒸发。将所得残留物用于硅胶柱层析(洗脱液：CH2Cl2:CH3OH＝9:1)。因此，获得无色浆料形式的化合物119(0.61g，产率90％)。下面示出关于前述化合物119的仪器分析结果。
叔丁基-二甲基甲硅烷氧基氨基-L-脯氨酸(119)；
1H-NMR(CDCl3):δ3.71(dd,1H,J＝9.0Hz,5.2Hz,CH),3.61-3.64(m,2H,CH2),3.22-3.28(m,2H,CH2),2.98-3.04(m,1H,CH),2.86-2.91(m,1H,CH),2.08-2.17(m,1H,CH),1.86-1.93(m,1H,CH),1.66-1.75(m,2H,CH2),1.52-1.57(m,4H),0.89(s,9H,t-Bu),0.05(s,6H,SiCH3)；
MS(FAB+)；m/z301(M+H+).
(4)叔丁基-二甲基甲硅烷氧基氨基羟基氨基-L-脯氨酸(化合物120)
将以上获得的上述叔丁基-二甲基甲硅烷氧基氨基-L-脯氨酸(化合物119)(550mg,1.8mmol)、6-羟基己酸(300mg,2.3mmol)、EDC(434mg,2.3mmol)和1-羟基苯并三唑(695mg,4.5mmol)在无水二氯甲烷中的溶液(20mL)混合。在氩气气氛下在室温下将三乙胺(689mg,6.8mmol)添加至前述混合物，然后将其在氩气气氛下在室温下搅拌过夜。用饱和盐水洗涤前述混合物。收集有机层，前述有机层经硫酸钠干燥。其后，过滤前述有机层。减压下蒸发所得滤液中的溶剂。所得残留物用于硅胶柱层析(洗脱液：CH2Cl2:CH3OH＝9:1)。因此，获得无色浆料形式的化合物120(696mg，产率92％)。下面示出关于前述化合物120的仪器分析结果。
叔丁基-二甲基甲硅烷氧基氨基羟基氨基-L-脯氨酸(120)；
1H-NMR(CDCl3):δ4.54(d,1H,CH),3.58-3.67(m,5H),3.52-3.56(m,1H,CH),3.32-3.39(m,1H),3.20-3.25(m,2H),2.40-2.43(m,1H,CH),2.33(t,J＝7.3Hz,2H,CH2),2.05-2.25(m,2H),1.93-2.03(m,1H,CH),1.75-1.85(m,1H,CH),1.50-1.73(m,8H),1.37-1.46(m,2H,CH2),0.87(s,9H,t-Bu),0.04(s,6H,SiCH3)；
MS(FAB+):m/z415(M++1).
(5)DMTr-羟基二氨基-L-脯氨酸(化合物121)
以上获得的前述叔丁基-二甲基甲硅烷氧基氨基羟基氨基-L-脯氨酸(化合物120)(640mg,1.54mmol)与无水吡啶(1mL)混合，并将其在室温下共沸干燥。向所得残留物添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(657mg,1.85mmol)、DMAP(2mg)和无水吡啶(5mL)，并将其在室温下搅拌4小时。其后，将甲醇(1mL)添加于其中，并将其在室温下搅拌30分钟。前述混合物用二氯甲烷稀释，并将其用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。收集有机层并经硫酸钠干燥。其后，过滤前述有机层。将所得滤液中的溶剂在减压下蒸发。向所得残留物添加无水乙腈(5mL)和1mol/L含四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1.42mL，四丁基氟化铵1.42mmol)，并将其在室温下搅拌过夜。反应完成后，将乙酸乙酯(100mL)添加至前述混合物。所得混合物用水然后用饱和盐水洗涤。收集有机层并经硫酸钠干燥。其后，过滤前述有机层。所得滤液中的溶剂在减压下蒸发。将所得残留物用于硅胶柱层析(洗脱液：CH2Cl2:CH3OH＝95:5，含有0.05％吡啶)。因此，获得无色浆料形式的化合物121(680mg，产率73％)。下面示出关于前述化合物121的仪器分析结果。
DMTr-羟基二氨基-L-脯氨酸(121)；
1H-NMR(CDCl3):δ7.41-7.44(m,2H,Ar-H),7.26-7.33(m,4H,Ar-H),7.18-7.21(m,2H,Ar-H),7.17-7.21(m,1H,Ar-H),6.80-6.84(m,4H,Ar-H),4.51-4.53(d,6.8Hz,1H,CH),3.79(s,6H,OCH3),3.61(dd,2H,J＝11Hz,5.4Hz,CH2),3.50-3.54(m,1H,CH),3.36-3.43(m,1H,CH),3.20-3.26(m,2H,CH2),3.05(t,J＝6.4Hz,2H,CH2),2.38-2.45(m,1H,CH),2.30(t,J＝7.8Hz,2H,CH2),2.05-2.25(m,1H,CH),1.92-2.00(m,1H,CH),1.75-1.83(m,1H,CH),1.52-1.67(m,8H),1.35-1.45(m,2H,CH2)；
MS(FAB+):m/z602(M+),303(DMTr+).
(6)DMTr-二氨基-L-脯氨酸酰胺型B(化合物122)
以上获得的前述DMTr-羟基二氨基-L-脯氨酸(化合物121)(637mg,1.06mmol)与无水乙腈混合，并将所得混合物在室温下共沸干燥。向所得残留物添加二异丙基四唑化铵(201mg,1.16mmol)，并将所得混合物在减压下除去空气并用氩气填充。将无水乙腈(1mL)添加至前述混合物，并将2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基磷酰二胺(350mg,1.16mmol)的无水乙腈溶液(1mL)进一步添加入其中。该混合物室温下在氩气下搅拌4小时。前述混合物用二氯甲烷稀释，并将其用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。收集有机层并经硫酸钠干燥。其后，过滤前述有机层。减压下蒸发所得滤液中的溶剂。将所得残留物用于使用氨基二氧化硅作为填料的柱层析(洗脱液：己烷:丙酮＝7:3)。因此，获得无色浆料形式的化合物122(680mg，纯度：95％，产率76％)。下面示出关于前述化合物122的仪器分析结果。
DMTr-二氨基-L-脯氨酸酰胺(122)；
1H-NMR(CDCl3):δ7.41-7.43(m,2H,Ar-H),7.25-7.32(m,4H,Ar-H),7.17-7.22(m,2H,Ar-H),6.80-6.83(m,4H,Ar-H),4.53(d,J＝7.8Hz,1H,CH),3.75-3.93(m,3H),3.79(s,6H,OCH3),3.46-3.68(m,5H),3.34-3.41(m,1H,CH),3.10-3.31(m,1H,CH),3.05(t,J＝6.3Hz,2H,CH2),2.62(t,J＝6.3Hz,2H,CH2),2.39-2.46(m,1H,CH),2.29(t,7.3Hz,2H,CH2),2.03-2.19(m,1H,CH),1.90-2.00(m,1H,CH),1.70-1.83(m,1H,CH),1.51-1.71(m,8H),1.35-1.45(m,2H,CH2),1.18(d,J＝6.4Hz,6H,CH3),1.16(d,J＝6.4Hz,6H,CH3)；
P-NMR(CH3CN)δ146.90；MS(FAB+):m/z803(M++1),303(DMTr+).
(参考例B1)RNA的固相合成
除了前述流程5中使用前述化合物122代替前述化合物6(本发明中的单体)，对应于连接子区域(Lx)和(Ly)的部分的结构为下述Lp代替前述Lg以外，以与前述实施例B1中的PK―0054相同的方式，合成单链RNA(ssRNA)。
如上所提及合成的ssRNA在下文中称作PK-0004。前述PK-0004具有其中下述SEQ ID NO:9所示的从5’侧以前述SEQ ID NO:3所示的RNA、前述SEQID NO:2所示的RNA和前述SEQ ID NO:1所示的RNA的顺序排列的结构，且各RNA经前述结构Lp连接。另外，如前述实施例B1中所述，前述SEQ ID NO:2所示的RNA序列与前述SEQ ID NO:1和3所示的RNA序列互补。因此，如下式所示，前述PK-0004进行自我退火来具有茎结构。如前述PK-0054，下划线部分GUUGUCAUACUUCUCAUGG(SEQ ID NO:5)为GAPDH基因表达抑制中涉及的区域。
5’-GAA-3’(SEQ ID NO:1)
5’-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUC-3’(SEQ ID NO:2)
5’-CAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3’(SEQ ID NO:3)
Ex:PK-0004(SEQ ID NO:9)
5’-CAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-Lp-GGCUGUUGUCAUACU UCUCAUGGUUC-Lp-GAA-3’
PK-0004的表达抑制区域(SEQ ID NO:5)
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’
除了使用下述SEQ ID NO:6的RNA代替前述SEQ ID NO:2所示的RNA，使用下述SEQ ID NO:7的RNA代替前述SEQ ID NO:3所示的RNA以外，以与PK-0004的相同的方式，合成参考例的其它ssRNA。下文中这称作PK-0003。
5’-GAA-3’(SEQ ID NO:1)
5’-GGCUUUCACUUAUCGUUGAUGGCUUC-3’(SEQ ID NO:6)
5’-CCAUCAACGAUAAGUGAAAGCC-3’(SEQ ID NO:7)
前述PK-0003具有其中如下述SEQ ID NO:10所示的从5’侧以前述SEQID NO:7所示的RNA、前述SEQ ID NO:6所示的RNA和前述SEQ ID NO:1所示的RNA的顺序排列的结构，各RNA经前述结构Lp连接。另外，如前述实施例B1中的PK-0055，前述SEQ ID NO:6所示的RNA序列与前述SEQ IDNO:1和7所示的RNA序列互补。因此，如下式所示，前述PK-0003进行自我退火来具有茎结构。
PK-0003(SEQ ID NO:10)
5’-CCAUCAACGAUAAGUGAAAGCC-Lp-GGCUUUCACUUAUCGUUGAUGGCUUC-Lp-GAA-3’
(参考例B2)
除了前述流程7中使用前述化合物22代替前述化合物18(本发明中的单体)，对应于连接子区域(Lx)和(Ly)的部分的结构为前述Lp(前述参考例B1)代替前述Ll以外，以与前述实施例B3的PK-0100相同的方式，合成单链RNA(ssRNA)。
如上所提及合成的ssRNA在下文中称作PK-0071。前述PK-0061具有其中如下述SEQ ID NO:66所示的从5’侧以前述SEQ ID NO:64所示的RNA、前述SEQ ID NO:63所示的RNA和鸟苷的顺序排列的结构，各RNA和鸟苷经前述结构Lp连接。另外，还如前述实施例B3所述，前述SEQ ID NO:63所示的RNA序列与前述SEQ ID NO:64所示的RNA序列互补。因此，如下式所示，前述PK-0071进行自我退火来具有茎结构。
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’(SEQ ID NO:63)
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-3’(SEQ ID NO:64)
Ex:PK-0071(SEQ ID NO:66)
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Lp-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Lp-G-3’
(实施例C1)HCT116细胞中对GAPDH基因表达的抑制效果
使用本发明的RNA，检测体内GAPDH基因表达的抑制。
(1)材料与方法
作为本实施例的RNA(Ex)，使用前述实施例B1的ssRNA(PK-0054和PK-0055)。作为参考例的RNA，还使用前述参考例B1的ssRNA(PK-0004和PK-0003)。RNA溶液通过将各前述RNA溶解在注射用蒸馏水(OtsukaPharmaceutical Co.,Ltd.，下文相同)中制备，从而获得期望的浓度(10μmol/L)。
HCT116细胞(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.)用作细胞。10％含FBS的McCoy’s5A(Invitrogen)培养基用作培养基。培养条件设为37℃和5％CO2。
首先，HCT116细胞在前述培养基中培养，并将培养基分散于24-孔板，以使各孔含有400μL的培养基以获得2×104细胞/孔的密度。前述孔中的细胞培养另外24小时。其后，将细胞用前述RNA使用转染试剂脂质体2000(Invitrogen)，根据前述转染试剂的方案转染。具体地，转染通过设定每孔组成如下来进行。前述孔中前述RNA的终浓度设为1nmol/L、5nmol/L或25nmol/L。
表1
转染后，将前述孔中的细胞培养48小时，然后使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Netherlands)，根据其中所附方案收集RNA。随后，使用反转录酶(商品名：SuperScript III,Invitrogen)，根据其中所附方案由前述RNA合成cDNA。然后，如下所示，使用前述合成的cDNA作为模板进行PCR，测定GAPDH基因的表达水平和作为内标的β-肌动蛋白基因的表达水平。前述GAPDH基因的表达水平参考上述提及的β-肌动蛋白基因的表达水平标准化。
前述PCR使用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(商品名，Roche)作为试剂、Light Cycler DX400(商品名，Roche)作为仪器(下文相同)来进行。前述GAPDH基因和β-肌动蛋白基因分别使用下列引物对扩增。
GAPDH基因的PCR引物对
5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’(SEQ ID NO:11)
5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’(SEQ ID NO:12)
β-肌动蛋白基因的引物对
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’(SEQ ID NO:13)
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’(SEQ ID NO:14)
作为对照1，对于仅添加了100μL前述溶液(B)的细胞，也测定了基因的表达水平(-)。此外，作为对照2，对于除了不添加前述RNA溶液但添加前述(B)和1.5μL前述(A)以使(A)和(B)的总量为100μL以外、如上所述进行相同的转染步骤的细胞，也测定了基因的表达水平(模拟)。
对于标准化的GAPDH基因的表达水平，基于设为1的对照细胞(-)中的表达水平来测定引入各RNA的细胞的表达水平的相对值。
(2)结果
其结果示于图4。图4为示出GAPDH基因的相对表达水平的图，纵轴表示相对基因表达水平。
如图4所示，PK-0004和PK-0054由于它们并入了靶向人GAPDH的序列而显示表达抑制效果。相反，具有不同序列的PK-0003和PK-0055与PK-0004和PK-0054相比显示低的表达抑制效果。即，这些RNA对靶碱基序列的反应特异性是优异的。
另外，由于PK-0054为ssRNA(单链RNA)，其可简便有效地制造并且与siRNA(双链RNA)相比可操作性优异。
此外，作为实施例的ssRNA的PK-0054显示同样与作为参考例的ssRNA的PK-0004相等的表达抑制效果。PK-0004的合成起始材料为L-脯氨酸，PK-0054的为甘氨酸，PK-0054的原料容易更经济地获得。因此，在便利性和制造成本方面有着压倒性的优势。
(实施例C2)萤火虫荧光素酶基因的表达抑制效果
使用本发明的RNA，检测体外萤火虫荧光素酶基因的表达抑制。
(1)材料与方法
作为本实施例的RNA(Ex)，使用前述实施例B3的ssRNA(PK-1000)。作为参考例的RNA，还使用前述参考例B2的ssRNA(PK-0071)。RNA溶液通过将各前述RNA溶解在注射用蒸馏水(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.下文相同)中制备，从而获得期望的浓度(10μmol/L)。
使用稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7，使用10％RPMI1640(Invitrogen)+10％FCS作为培养基。培养条件设为37℃和5％CO2。
更具体地，如下培养稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7。
[1]在培养基中培养前述细胞，通过50μL至1×104细胞/孔来将培养基分散于96孔板。
[2]然后，孔中的前述细胞通过使用转染试剂脂质体2000(Invitrogen)，根据所附方案用RNA样品转染。具体地，添加50μL/孔的前述RNA样品和前述转染试剂的复合物至总量为100μL，前述RNA样品的终浓度为0.1、1或10nmol/L。作为对照1，制备未添加前述RNA样品和前述转染试剂的细胞(-)，作为对照2，制备转染中未添加前述RNA样品但单独添加前述转染试剂的细胞(模拟)。
[3]将细胞在前述转染后进一步培养24hr。
如下测定荧光素酶活性。荧光素酶活性测定为由稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7持有的萤火虫荧光素酶基因的表达抑制效果的测定。
[1]首先，使用Steady-Glo(商品名)荧光素酶分析系统(Promega)，由多标记阅读器ARVO X2(PerkinElmer)根据所附方案测定荧光素酶的发光强度。
[2]前述[1]中的荧光素酶活性测定的结果以未添加RNA样品和转染试剂(-)的细胞(前述对照1，非添加细胞群)为1的相对活性呈现。
(2)结果
结果示于图12。图12为示出荧光素酶活性的相对值的图。
如图12所示，PK-0100(实施例的ssRNA)可降低荧光素酶的相对活性至约0.7–约0.3。即，PK-0100显示对由稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7持有的萤火虫荧光素酶基因的优异的表达抑制效果。另外，PK-0100还显示对作为参考例的ssRNA的PK-0071相等或更多的表达抑制效果。
(参考例1)
使用在不同位置具有未配对碱基的ssRNAs，检测体外GAPDH基因的表达抑制。
(1)材料与方法
作为RNA，使用图5所示的ssRNA。图5中，右侧的数字表示序列序号。图5中，从5’侧，用下划线小写字母表示的区域为前述区域(Xc)；用下划线大写字母表示的区域为前述内部区域(Z)；用下划线小写字母表示的区域为前述区域(Yc)。前述Xc和Z之间的区域为连接子区域(Lx)，前述Z和Yc之间的区域为连接子区域(Ly)。另外，"Xc/Yc"表示前述区域(Xc)的碱基长度(Xc)与前述区域(Yc)的碱基长度(Yc)之比。图5中，"*"表示未配对碱基。
在各ssRNA中，内部区域(Z)的碱基长度设为26，连接子区域(Lx)的碱基长度设为7，连接子区域(Ly)的碱基长度设为4。在NK-0036和NK-0040中，前述区域(Xc)和(Yc)的总碱基数(Xc+Yc)设为26。在除NK-0036和NK-0040以外的ssRNA中，前述区域(Xc)和(Yc)的总碱基数(Xc+Yc)设为25。接着，在这些条件下，改变前述区域(Xc)和(Yc)的碱基长度。结果，NK-0036和NK-0040变成没有未配对碱基的分子。此外，除NK-0036和NK-0040以外的各ssRNA变成其中前述内部区域(Z)仅包括一个未配对碱基而不形成双链且前述未配对碱基在前述内部区域(Z)中的位置从3’侧移至5’侧的分子。
除了使用前述RNA以外，向HCT116细胞的转染、培养、RNA的收集、cDNA的合成和PCR以与前述实施例C1相同的方式进行，并确定GAPDH基因的相对表达水平。转染时的RNA浓度设为10nmol/L。
(2)结果和思考
其结果示于图6。图6为示出在各RNA以10nmol/L的终浓度使用时GAPDH基因的相对表达水平的图。如从图6中可见，发现所有具有前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的变化长度的ssRNA抑制了GAPDH基因的表达。
特别地，发现，因为前述区域(Xc)的碱基长度与前述区域(Yc)的碱基长度之差，基因的表达水平相对降低，即表达抑制效果增加。也就是说，发现通过将前述内部区域(Z)中未配对碱基的位置设为相对于前述内部区域的中部接近于5’侧或3’侧，可改善前述表达抑制活性。
(参考例2)
使用在不同位置具有未配对碱基的ssRNA，检测体外TGF-β1基因的表达抑制。
(1)材料与方法
作为RNA，使用如下所示ssRNA。在下述序列中，"*"表示未配对序列。
NK-0033(SEQ ID NO:42)
NK-0061(SEQ ID NO:43)
NK-0055(SEQ ID NO:44)
NK-0062(SEQ ID NO:45)
(1.2)基因表达的抑制
RNA溶液通过将各已低温贮藏的前述RNA溶解于注射用蒸馏水中制备，从而获得20μmol/L的浓度。接着，除了使用前述RNA溶液以外，前述ssRNA向Hepal-6细胞的转染、RNA的收集、cDNA的合成和PCR以与前述实施例C1相同的方式进行。确定TGF-β1基因的相对表达水平。转染时的RNA浓度设为1nmol/L。
(2)结果
其结果示于图7。图7为示出TGF-β1基因的相对表达水平的图。如从图7中可见，这些ssRNA所有都显示基因表达抑制活性。此外，其中分别从前述内部区域(Z)的3’端起的第2碱基和第3碱基为未配对碱基的NK-0055和NK-0062显示出比其中分别从前述内部区域(Z)的3’端起的第4碱基和第5碱基为未配对碱基的NK-0033和NK-0061高的表达抑制活性。这些结果与针对不同靶基因的前述参考例1中显示的现象相一致。
(参考例3)
使用在不同位置具有未配对碱基的ssRNA，检测体外LAMA1基因的表达抑制。
(1)材料与方法
作为RNA，使用如下所示的ssRNA。在下述序列中，"*"表示未配对碱基。
NK-0043(SEQ ID NO:46)
NK-0064(SEQ ID NO:47)
除了使用各前述RNA以外，向293细胞的转染以与前述实施例C1相同的方式进行，并将前述细胞培养48小时。转染时的RNA浓度设为10nmol/L。接着，除了使用如下所示LAMA1基因的引物对作为引物以外，RNA的收集、cDNA的合成和PCR以与前述实施例C1相同的方式进行，并测定LAMA1基因的表达水平以及作为内标的β-肌动蛋白基因的表达水平。使前述LAMA1基因的表达水平相对于作为内标的β-肌动蛋白基因的表达水平标准化。
LAMA1基因的引物对
5’-AAAGCTGCCAATGCCCCTCGACC-3’(SEQ ID NO:48)
5’-TAGGTGGGTGGCCCTCGTCTTG-3’(SEQ ID NO:49)
对照1(-)和对照2(模拟)的表达水平也以与前述实施例C1相同的方式测定。对于LAMA1基因的标准化表达水平，基于设为1的对照细胞(-)中的表达水平来确定引入各RNA的细胞的表达水平的相对值。
(2)结果
其结果示于图8。图8为示出LAMA1基因在293细胞中的相对表达水平的图。由图8可见，这些ssRNA所有都显示基因表达抑制活性。此外，其中从前述内部区域(Z)的3’端起的第2碱基为未配对碱基的NK-0064显示出比其中从前述内部区域(Z)的3’端起的第4碱基为未配对碱基的NK-0043高的表达抑制活性。这些结果与针对不同靶基因的前述参考例1和2中显示的现象相一致。
(参考例4)
使用在不同位置具有未配对碱基的ssRNA，检测体外LMNA基因的表达抑制。
(1)材料与方法
作为RNA，使用如下所示ssRNA。在下述序列中，"*"表示未配对碱基。
NK-0063(SEQ ID NO:50)
NK-0066(SEQ ID NO:51)
除了使用各前述RNA以外，向A549细胞的转染以与前述实施例C1相同的方式进行，并将前述细胞培养48小时。转染时的RNA浓度设为3nmol/L。接着，除了使用如下所示LMNA基因的引物对作为引物以外，RNA的收集、cDNA的合成和PCR以与前述实施例C1相同的方式进行，并测定LMNA基因的表达水平以及作为内标的β-肌动蛋白基因的表达水平。使前述LMNA基因的表达水平相对于作为内标的β-肌动蛋白基因的表达水平标准化。
LMNA基因的引物对
5’-CTGGACATCAAGCTGGCCCTGGAC-3’(SEQ ID NO:52)
5’-CACCAGCTTGCGCATGGCCACTTC-3’(SEQ ID NO:53)
对照1(-)和对照2(模拟)的表达水平也以与前述实施例C1相同的方式测定。对于LMNA基因的标准化表达水平，基于设为1的对照细胞(-)中的表达水平来确定引入有各RNA的细胞中的相对值。
(2)结果
其结果示于图9。图9为示出LAMA1基因在A549细胞中的相对表达水平的图。如从图9中可见，这些ssRNA所有都显示基因表达抑制活性。此外，其中从前述内部区域(Z)的3’端起的第2碱基为未配对碱基的NK-0066显示比其中从前述内部区域(Z)的3’端起的第4碱基为未配对碱基的NK-0063高的表达抑制活性。这些结果与针对不同靶基因的前述参考例1至3中显示的现象相一致。
从参考例1至4中获得的结果明确了例如关于未配对碱基的位置，无论靶基因的种类和靶基因的表达抑制序列如何都显示类似的现象。此外，前文已经描述了前述实施例C1显示与参考例的那些类似的现象。
(参考例5)
使用各前述内部5’侧区域(X)、前述5’侧区域(Xc)、前述内部3’侧区域(Y)和前述3’侧区域(Yc)的长度变化的ssRNA，检测体外GAPDH基因的表达抑制。
(1)材料与方法
作为RNA，使用图10所示的ssRNA。图10中，右侧的数字表示序列序号。图10中，从5’侧起，用下划线小写字母表示的区域为前述区域(Xc)；用下划线大写字母表示的区域为前述内部区域(Z)；用下划线小写字母表示的区域为前述区域(Yc)。另外，"Xc+Yc/X+Y"表示前述区域(Xc)和(Yc)的总碱基长度和前述区域(X)和(Y)的总碱基长度之差。图10中，"*"表示未配对碱基。
在各ssRNA中，连接子区域(Lx)的碱基长度设为7，连接子区域(Ly)的碱基长度设为4，前述区域(Yc)的碱基长度设为1，从前述内部区域(Z)的3’侧起第2碱基设为未配对碱基。接着，改变前述内部区域(Z)的碱基长度和前述区域(Xc)的碱基长度。
除非另有说明，否则前述RNA向HCT116细胞中的转染、培养、RNA的收集、cDNA的合成和PCR以与前述实施例C1相同的方式进行，并计算GAPDH基因的表达水平的相对值。在前述转染的条件下，前述每孔的组成与下表2相同。
表2
(2)结果和思考
其结果示于图11。图11为示出在以1nmol/L的浓度使用各RNA时，GAPDH基因的相对表达水平的图。如从图11中可见，发现具有不同长度的前述区域(X)、(Xc)、(Y)和(Yc)的所有ssRNA均抑制了GAPDH基因的表达。
在以上参考示例性实施方案描述本发明的同时，本发明决不受限于此。在不偏离本发明范围的情况下，可对本发明的构成和细节进行对于本领域熟练技术人员而言显而易见的各种改变。
产业上的可利用性
本发明的ssPN分子可抑制基因表达。由于其不是环状的，其合成容易。由于其为不需要用于双链的退火的单链，其可有效地生产。此外，由于前述连接子区域包含前述非核苷酸残基，因此，例如核苷酸残基的常规替换不是受限部分，但例如，诸如前述连接子区域等的修饰等的替换也是可能的。因此，由于本发明的ssPN分子可如上所述抑制靶基因的表达，其用作例如药品、诊断剂、农药和进行医学科学和生命科学等研究的工具。

Claims (57)

1.一种单链核酸分子，其包括抑制靶基因表达的表达抑制序列，并包括区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，其中
所述连接子区域(Lx)连接在所述区域(X)和所述区域(Xc)之间，
所述区域(Xc)与所述区域(X)互补，
所述区域(X)和所述区域(Xc)的至少之一包含所述表达抑制序列，和
所述连接子区域(Lx)包含源自氨基酸的原子团。
2.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述连接子区域(Lx)由下式(I)表示：
其中，
X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
L1为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代所述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
所述区域(Xc)和所述区域(X)经-OR1-或-OR2-彼此连接至所述连接子区域(Lx)；
R1和R2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或所述结构(I)；和
A为任意原子团，下式(Ia)为所述氨基酸，下式(Ia)为除肽以外的氨基酸：
3.根据权利要求2所述的单链核酸分子，其中，在式(I)中，
A包括选自由链式原子团、脂环式原子团和芳族性原子团组成的组的至少之一，各所述原子团可以进一步具有或可以不进一步具有取代基或保护基。
4.根据权利要求1至3任一项所述的单链核酸分子，其中所述氨基酸为天然氨基酸或人工氨基酸。
5.根据权利要求1至3任一项所述的单链核酸分子，其中所述氨基酸为构成蛋白质的氨基酸。
6.根据权利要求1至3任一项所述的单链核酸分子，其中所述氨基酸为甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷或氨基苯甲酸，其任选地进一步具有取代基或保护基。
7.根据权利要求1至6任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(X)的碱基数(X)与所述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)满足下式(3)或(5)的条件：
X>Xc···(3)
X＝Xc···(5)。
8.根据权利要求7所述的单链核酸分子，其中所述区域(X)的碱基数(X)与所述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)满足下式(11)的条件：
X-Xc＝1、2或3···(11)。
9.根据权利要求1至8任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xc)的碱基数(Xc)为19至30。
10.根据权利要求1至9任一项所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子进一步包括区域(Y)和区域(Yc)，其中所述区域(Yc)与所述区域(Y)互补，内部区域(Z)由彼此连接的所述区域(X)和所述区域(Y)构成。
11.根据权利要求10所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子进一步包括连接子区域(Ly)，所述连接子(Ly)连接在所述区域(Y)和所述区域(Yc)之间。
12.根据权利要求11所述的单链核酸分子，其中所述连接子区域(Ly)由下式(I)表示：
其中
X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
L1为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代所述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
所述区域(Yc)和所述区域(Y)经-OR1-或-OR2-彼此连接至所述连接子区域(Ly)；
R1和R2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或所述结构(I)；和
A为任意原子团，下式(Ia)为除肽以外的氨基酸，
和当所述连接子区域(Lx)由式(I)表示时，所述连接子区域(Lx)和所述连接子区域(Ly)的A、X1、X2、Y1、Y2、L1、L2、R1和R2可分别相同或不同。
13.根据权利要求12所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xc)和所述区域(X)与所述由式(I)表示的连接子区域(Lx)的结构的连接，和
所述区域(Yc)和所述区域(Y)与所述由式(I)表示的连接子区域(Ly)的结构的连接各自满足下列条件(1)-(4)中任一项：
条件(1)：
所述区域(Xc)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至所述式(I)的结构；和
所述区域(Yc)和(Y)分别经-OR1-和-OR2-连接至所述式(I)的结构，
条件(2)：
所述区域(Xc)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至所述式(I)的结构；和
所述区域(Yc)和(Y)分别经-OR2-和-OR1-连接至所述式(I)的结构，
条件(3)：
所述区域(Xc)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至所述式(I)的结构；和
所述区域(Yc)和(Y)分别经-OR1-和-OR2-连接至所述式(I)的结构，
条件(4)：
所述区域(Xc)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至所述式(I)的结构；和
所述区域(Yc)和(Y)分别经-OR2-和-OR1-连接至所述式(I)的结构。
14.根据权利要求2至13任一项所述的单链核酸分子，其中，在式(I)中，L1为聚醚链，和所述聚醚链为聚乙二醇。
15.根据权利要求2至14任一项所述的单链核酸分子，其中，在式(I)中，L1的原子数(n)和L2的原子数(m)的合计(m+n)在0至30的范围内。
16.根据权利要求2至15任一项所述的单链核酸分子，其中所述式(I)的结构为下式(I-1)至(I-4)的任一，在下式中，n为0-30的整数和m为0-30的整数
17.根据权利要求16所述的单链核酸分子，其中，在式(I-1)中，n＝11且m＝12。
18.根据权利要求16所述的单链核酸分子，其中，在式(I-1)中，n＝5且m＝4。
19.根据权利要求16所述的单链核酸分子，其中，在式(I-4)中，n＝5且m＝4。
20.根据权利要求7至19任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(X)的碱基数(X)、所述区域(Y)的碱基数(Y)、所述区域(Xc)的碱基数(Xc)和所述区域(Yc)的碱基数(Yc)满足下式(2)的条件：
Z≥Xc+Yc···(2)。
21.根据权利要求7至20任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(X)的碱基数(X)、所述区域(Xc)的碱基数(Xc)、所述区域(Y)的碱基数(Y)和所述区域(Yc)的碱基数(Yc)满足下列条件(a)至(d)的任一项：
(a)满足下式(3)和(4)的条件；
X>Xc···(3)
Y＝Yc···(4)
(b)满足下式(5)和(6)的条件；
X＝Xc···(5)
Y>Yc···(6)
(c)满足下式(7)和(8)的条件；
X>Xc···(7)
Y>Yc···(8)
(d)满足下式(9)和(10)的条件；
X＝Xc···(9)
Y＝Yc···(10)。
22.根据权利要去21所述的单链核酸分子，其中，在所述条件(a)至(d)中，所述区域(X)的碱基数(X)和所述区域(Xc)的碱基数(Xc)之差、所述区域(Y)的碱基数(Y)和所述区域(Yc)的碱基数(Yc)之差满足下列条件：
(a)满足下式(11)和(12)的条件；
X-Xc＝1、2或3···(11)
Y-Yc＝0···(12)
(b)满足下式(13)和(14)的条件；
X-Xc＝0···(13)
Y-Yc＝1、2或3···(14)
(c)满足下式(15)和(16)的条件；
X-Xc＝1、2或3···(15)
Y-Yc＝1、2或3···(16)
(d)满足下式(17)和(18)的条件；
X-Xc＝0···(17)
Y-Yc＝0···(18)。
23.根据权利要求7至22任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xc)的碱基数(Xc)为1至11。
24.根据权利要求23所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xc)的碱基数(Xc)为1至7。
25.根据权利要求23所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xc)的碱基数(Xc)为1至3。
26.根据权利要求7至25任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(Yc)的碱基数(Yc)为1至11。
27.根据权利要求26所述的单链核酸分子，其中所述区域(Yc)的碱基数(Yc)为1至7。
28.根据权利要求26所述的单链核酸分子，其中所述区域(Yc)的碱基数(Yc)为1至3。
29.根据权利要求1至28任一项所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子包括至少一种修饰的残基。
30.根据权利要求1至29任一项所述的单链核酸分子，其进一步包括标记物质。
31.根据权利要求1至30任一项所述的单链核酸分子，其进一步包括稳定同位素。
32.根据权利要求1至31任一项所述的单链核酸分子，其为RNA分子。
33.根据权利要求1至32任一项所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子的总碱基数为50以上。
34.根据权利要求1至33任一项所述的单链核酸分子，其中所述基因的表达受RNA干扰的抑制。
35.一种组合物，其用于抑制靶基因表达，所述组合物包括：
根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
36.一种药物学组合物，其包括：
根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
37.根据权利要求36所述的药物学组合物，其用于治疗炎症。
38.一种用于抑制靶基因表达的方法，其包括使用根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
39.根据权利要求38所述的方法，其包括下列步骤：
将所述单链核酸分子施用至细胞、组织或器官。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述单链核酸分子在体内或体外施用。
41.根据权利要求38至40任一项所述的方法，其中所述基因的表达受RNA干扰的抑制。
42.一种诱导抑制靶基因表达的RNA干扰的方法，其包括使用根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
43.根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子用于抑制靶基因表达的用途。
44.根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子用于诱导RNA干扰的用途。
45.一种核酸分子，其用于治疗疾病，其中
所述核酸分子为根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子，和
所述单链核酸分子包括抑制引起所述疾病的基因的表达的序列作为表达抑制序列。
46.一种单体，其用于核酸分子合成，并具有下式(II)的结构：
其中
X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
R11和R21各自独立地为H、保护基或磷酸保护基；
L1为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代所述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR11的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR21的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
A为任意原子团，下式(Ia)为不是肽的氨基酸：
47.根据权利要求46所述的单体，其中所述式(II)的结构为下式(II-1)至式(II-4)的任一，在下式中，n为0–30的整数，和m为0–30的整数：
其中，在式(II-4)中，R101，独立于R11和R21，为H、保护基或磷酸保护基。
48.根据权利要求47所述的单体，其中，在式(II-1)中，n＝11和m＝12。
49.根据权利要求47所述的单体，其中，在式(II-1)中，n＝5和m＝4。
50.根据权利要求47所述的单体，其中，在式(II-4)中，n＝5和m＝4。
51.根据权利要求46至50任一项所述的单体，其中，在式(II)中，L1为聚醚链，所述聚醚链为聚乙二醇。
52.根据权利要求46至51任一项所述的单体，其中，在式(II)中，L1的原子数(n)和L2的原子数(m)的合计(m+n)在0至30的范围内。
53.根据权利要求46至52任一项所述的单体，其进一步包括标记物质。
54.根据权利要求46至53任一项所述的单体，其进一步包括稳定同位素。
55.根据权利要求46至54任一项所述的单体，其用于自动核酸合成。
56.一种核酸分子的生产方法，其包括使用根据权利要求46至55任一项所述的单体。
57.根据权利要求56所述的生产方法，其中所述核酸分子为根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
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