TWI830718B - 核酸分子之製造方法 - Google Patents
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Abstract
一種單股RNA之製造方法，其包含使RNA連接酶對在5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及在3’末端具有羥基之第2單股RNA進行作用，將前述第1單股RNA與前述第2單股RNA進行連結之步驟。第1單股RNA為自5’末端側起依序由X1區域及Z區域所組成之單股RNA；第2單股RNA為自5’末端側起依序由X2區域、Y2區域、Ly連結子區域及Y1區域所組成之單股；X1區域與X2區域為彼此互補之至少2個核苷酸長之相同核苷酸數的核苷酸序列；Y1區域與Y2區域為彼此互補之至少2個核苷酸長之相同核苷酸數的核苷酸序列。
Description
本發明係關於核酸分子之製造方法。
本申請案係主張基於2018年2月9日於日本申請之日本專利特願2018-21799號之優先權，並將其內容援用於此。
在專利文獻1及2中，已揭示用於RNA干擾法中之單股RNA，作為該種化合物之製造方法，已知使用核酸合成裝置藉由多階段的化學反應加以製造之方法。
[專利文獻1]國際公開第2012/017919號
[專利文獻2]國際公開第2013/103146號
本發明之課題為提供單股RNA之簡便的製造方法。
本發明含括以下態樣。
本發明之一態樣所涉及之單股RNA之製造方法為一種單股RNA之製造方法，其包含使被分類至國際生化學聯盟所規定作為酵素編號之EC6.5.1.3且具有雙股切口修復活性之RNA連接酶對在5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及在3’末端具有羥基之第2單股RNA進行作用，將前述第1單股RNA與前述第2單股RNA進行連結之步驟，該製造方法具有以下a)~g)的特徵：a)前述第1單股RNA為自5’末端側起依序由X1區域及Z區域所組成之單股RNA；b)前述第2單股RNA為自5’末端側起依序由X2區域、Y2區域、Ly連結子區域及Y1區域所組成之單股；c)前述X1區域與前述X2區域為彼此互補之由2個以上相同數量的核苷酸所組成之核苷酸序列；d)前述Y1區域與前述Y2區域為彼此互補之由2個以上相同數量的核苷酸所組成之核苷酸序列；e)前述Z區域為包含任意核苷酸數的核苷酸序列之區域；f)前述Ly連結子區域為具有衍生自胺基酸之原子團之連結子區域；
g)藉由前述第1單股RNA與前述第2單股RNA的連結所生成之單股RNA為自5’末端側起由前述X2區域、前述Y2區域、前述Ly連結子區域、前述Y1區域、前述X1區域及前述Z區域所組成之連結單股RNA。
此外，本發明之一態樣所涉及之單股RNA之製造方法為在前述製造方法中，前述Z區域為自5’末端側起依序由Z1區域、Lz連結子區域及Z2區域所組成之區域，前述Lz連結子區域為具有衍生自胺基酸之原子團之連結子區域，前述Z1區域與前述Z2區域包含彼此互補的核苷酸序列，藉由前述第1單股RNA與前述第2單股RNA的連結所生成之單股RNA為自5’末端側起依序由前述X2區域、前述Y2區域、前述Ly連結子區域、前述Y1區域、前述X1區域及前述Z1區域、前述Lz連結子區域及Z2區域所組成之連結單股RNA。
此外，本發明之一態樣所涉及之單股RNA之製造方法為在前述製造方法中，前述Ly連結子區域為下述式(I)所示之二價基。
(式中，Y11及Y21各自獨立地表示碳數1~20的伸烷基，Y12及Y22各自獨立地表示氫原子或可經胺基取代之烷
基，或者Y12與Y22在其末端彼此鍵結而表示碳數3~4的伸烷基，鍵結至Y11之末端的氧原子係與前述Y1區域及前述Y2區域中之任一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結，鍵結至Y21之末端的氧原子係與前述Y1區域及前述Y2區域中之未與Y11鍵結之另一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結)。
此外，本發明之一態樣所涉及之單股RNA之製造方法為在前述製造方法中，前述Ly連結子區域為下述式(I)所示之二價基，前述Lz連結子區域為下述式(I’)所示之二價基。
(式中，Y11及Y21各自獨立地表示碳數1~20的伸烷基，Y12及Y22各自獨立地表示氫原子或可經胺基取代之烷基，或者Y12與Y22在其末端彼此鍵結而表示碳數3~4的伸烷基，鍵結至Y11之末端的氧原子係與前述Y1區域及前述Y2區域中之任一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結，鍵結至Y21之末端的氧原子係與前述Y2區域及前述Y1區域中之未與Y11鍵結之另一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結)。
(式中，Y’11及Y’21各自獨立地表示碳數1~20的伸烷基，Y’12及Y’22各自獨立地表示氫原子或可經胺基取代之烷基，或者Y’12與Y’22在其末端彼此鍵結而表示碳數3~4的伸烷基，鍵結至Y’11之末端的氧原子係與前述Z1區域及前述Z2區域中之任一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結，鍵結至Y’21之末端的氧原子係與前述Z2區域及前述Z1區域中之未與Y’11鍵結之另一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結)。
此外，本發明之一態樣所涉及之單股RNA之製造方法為在前述製造方法中，前述Ly連結子區域及前述Lz連結子區域各自獨立地為下述式(II-A)或(II-B)所示之結構的二價基。
(式中，n及m各自獨立地表示1至20中之任一整數)。
此外，本發明之一態樣所涉及之單股RNA之製造方法為在前述製造方法中，在由前述X1區域、前述Y1區域及前述Z區域所組成之W1區域以及由前述X2區域及前述Y2區域所組成之W2區域中之至少一者，包含抑制成為RNA干擾法之標的之基因的表現之核苷酸序列。
此外，本發明之一態樣所涉及之單股RNA之製造方法為在前述製造方法中，前述RNA連接酶為源自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2、源自KVP40之連接酶2、Trypanosoma brucei RNA連接酶、Deinococcus radiodurans RNA連接酶或Leishmania tarentolae RNA連接酶。
此外，本發明之一態樣所涉及之單股RNA之製造方法為在前述製造方法中，前述RNA連接酶為由與序列編號21、22或23所記載之胺基酸序列具有95%以上的同一性之胺基酸序列所組成之RNA連接酶。
此外，本發明之一態樣所涉及之單股RNA之製造方法為在前述製造方法中，前述RNA連接酶為源自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2或源自KVP40之RNA連接酶2。
根據本發明之製造方法，可簡便地製造單股
RNA。
[圖1]示出第1及第2單股RNA之各區域的鍵結順序之一例之模式圖。
[圖2]示出連結單股RNA之製造步驟之一例之模式圖。
[圖3]示出第1及第2單股RNA之各區域的鍵結順序之一例之模式圖。
[圖4]示出連結單股RNA之製造步驟之一例之模式圖。
[圖5]示出實施例1中所使用之第1及第2單股RNA以及所生成之連結單股RNA。
[圖6]示出實施例2中所使用之第1及第2單股RNA以及所生成之連結單股RNA。
本發明之一實施形態所涉及之製造方法為單股RNA之製造方法，其包含使被分類至國際生化學聯盟所規定作為酵素編號之EC6.5.1.3且具有雙股切口修復活性之RNA連接酶對在5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及在3’末端具有羥基之第2單股RNA進行作用，將前述第1單股RNA與前述第2單股RNA進行連結之步驟。藉由本實施形態之
製造方法所獲得之連結單股RNA為自5’末端側起由X2區域、Y2區域、Ly連結子區域、Y1區域、X1區域及Z區域所組成之單股RNA。前述Z區域亦可自5’末端側起由Z1區域、Lz連結子區域及Z2區域所組成，前述連結單股RNA亦可為由X2區域、Y2區域、Ly連結子區域、Y1區域、X1區域、Z1區域、Lz連結子區域及Z2區域所組成之單股RNA。前述連結單股RNA亦可在由Y1區域及X1區域及Z區域(或Z1區域)所組成之W1區域以及由X2區域及Y2區域所組成之W2區域中之至少一者，包含抑制成為RNA干擾法之標的之基因的表現之序列。
W1區域及W2區域中之任一者或兩者可具有2個以上針對相同標的基因之同一表現抑制序列，亦可具有2個以上針對相同標的之不同表現抑制序列，亦可具有2個以上針對不同標的基因之不同表現抑制序列。在W1區域具有2個以上表現抑制序列之情況，各表現抑制序列的配置處並無特別限制，可為X1區域及Y1區域中之任一區域或兩者，亦可為跨越兩者之區域。在W2區域具有2個以上表現抑制序列之情況，各表現抑制序列的配置處可為X2區域及Y2區域中之任一區域或兩者，亦可為跨越兩者之區域。表現抑制序列較佳係對標的基因之既定區域具有90%以上的互補性，更佳為95%，再佳為98%，特佳為100%。
該種連結單股RNA係藉由使連接酶對在5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及在3’末端具有羥基之第2單股RNA進行作用，將前述第1單股RNA與前述第2單股進行
連結之步驟予以製造(參照圖1至4)。
連結單股RNA在分子內具互補性之序列部分並列，可在分子內部分地形成雙股。連結單股RNA分子係如圖2所示，包含X1區域與X2區域彼此具有互補性之核苷酸序列，復包含Y1區域與Y2區域彼此具有互補性之核苷酸序列，在此等具有互補性之序列之間，形成雙股，Ly及Lz連結子區域係因應其長度而呈環結構。圖2及圖4徹底地示出前述區域的連結順序及形成雙股部之各區域的位置關係，例如各區域的長度、連結子區域(Ly及Lz)的形狀等並不限定於此。
由Y1區域及X1區域及Z區域(或Z1區域)所組成之W1區域以及由X2區域及Y2區域所組成之W2區域中之至少一者亦可包含至少一個抑制成為RNA干擾法之標的之基因的表現之序列。在連結單股RNA中，W1區域與W2區域可完全互補，亦可1或數個核苷酸非互補，較佳係完全互補。前述1或數個核苷酸為例如1~3個核苷酸，較佳為1或2個核苷酸。Y1區域具有對Y2區域的全部區域互補的核苷酸序列。Y1區域與Y2區域為彼此完全互補的核苷酸序列，其係由2個以上相同數量的核苷酸所組成之核苷酸序列。X1區域具有對X2區域的全部區域互補的核苷酸序列。X1區域與X2區域為彼此完全互補的核苷酸序列，其係由2個以上相同數量的核苷酸所組成之核苷酸序列。在本實施形態之製造方法中，Z區域為包含任意數量的核苷酸序列之區域，並非必需序列，可為核苷酸的數量為0之
態樣，亦可為包含1個以上核苷酸之態樣。Z區域亦可為自5’末端起連結Z1、Lz及Z2各區域而得者。
以下例示各區域的長度，但並不限定於此。在本說明書中，核苷酸數的數值範圍係例如為揭示所有屬於該範圍之正整數者，作為具體例，記載為「1~4個核苷酸」，係意味「1個核苷酸」、「2個核苷酸」、「3個核苷酸」及「4個核苷酸」所有的揭示(以下相同)。
在連結單股RNA分子中，W2區域的核苷酸數(W2n)與X2區域的核苷酸數(X2n)及Y2區域的核苷酸數(Y2n)之關係例如滿足下述式(1)之條件。W1區域的核苷酸數(W1n)與X1區域的核苷酸數(X1n)及Y1區域的核苷酸數(Y1n)之關係例如滿足下述式(2)之條件。
W2n=X2n+Y2n‧‧‧(1)
W1n≧X1n+Y1n‧‧‧(2)
在連結單股RNA分子中，X1區域的核苷酸數(X1n)與Y1區域的核苷酸數(Y1n)之關係並無特別限制，例如滿足下述式中之任一條件。
X1n=Y1n‧‧‧(3)
X1n<Y1n‧‧‧(4)
X1n>Y1n‧‧‧(5)
在本實施形態之方法中，X1區域的核苷酸數(X1n)，即X2區域的核苷酸數(X2n)，為2以上，較佳為4以上，更佳為10以上。
Y1區域的核苷酸數(Y1n)，即Y2區域的核苷酸數(Y2n)，為2以上，較佳為3以上，更佳為4以上。
Z1區域較佳係包含對Z2區域的全部區域或Z2區域的部分區域互補的核苷酸序列。Z1區域與Z2區域亦可1或數個核苷酸非互補，較佳係完全互補。
更詳細而言，Z2區域較佳係由比Z1區域短1個核苷酸以上之核苷酸序列所組成。在此情況，Z2區域之核苷酸序列全體係與Z1區域的任意部分區域之所有核苷酸呈互補。Z2區域之自5’末端至3’末端為止之核苷酸序列更佳為與Z1區域之自3’末端的核苷酸開始朝向5’末端之核苷酸序列具互補性之序列。
在連結單股RNA分子中，X1區域的核苷酸數(X1n)與X2區域的鹼基數(X2n)之關係、Y1區域的核苷酸數(Y1n)與Y2區域的核苷酸數(Y2n)之關係以及Z1區域的核苷酸數(Z1n)與Z2區域的核苷酸數(Z2n)之關係分別滿足下述式(6)、(7)及(8)之條件。
X1n=X2n‧‧‧(6)
Y1n=Y2n‧‧‧(7)
Z1n≧Z2n‧‧‧(8)
連結單股RNA的全長(核苷酸的總數)並無特別限制。在連結單股RNA中，核苷酸數之合計(全長的核苷酸數)，下限典型地為38，較佳為42，更佳為50，再佳為51，特佳為52，其上限典型地為300，較佳為200，更佳為150，再佳為100，特佳為80。在連結單股RNA中，排除連結子區域(Ly、Lz)之核苷酸數之合計，下限典型地為38，較佳為42，更佳為50，再佳為51，特佳為52，上限典
型地為300，較佳為200，更佳為150，再佳為100，特佳為80。
在連結單股RNA中，Ly及Lz連結子區域的長度並無特別限制。此等連結子區域較佳為例如X1區域與X2區域能夠形成雙股之長度，或Y1區域與Y2區域能夠形成雙股之長度。Ly及Lz各連結子區域為具有衍生自胺基酸之原子團之區域。此等連結子區域(Ly、Lz)通常為非核苷酸的連結子區域。
形成連結子區域的主鏈之原子的數量，其上限典型地為100，較佳為80，更佳為50。
Ly連結子區域係例如為下述式(I)所示之二價基，Lz係例如為下述式(I’)所示之二價基。
(式中，Y11及Y21各自獨立地表示碳數1~20的伸烷基，Y12及Y22各自獨立地表示氫原子或可經胺基取代之烷基，或者Y12與Y22在其末端彼此鍵結而表示碳數3~4的伸烷基，鍵結至Y11之末端的氧原子係與Y1區域及Y2區域中之任一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結，鍵結至Y21之末端的氧原子係與Y1區域及Y2區域中之未與Y11
鍵結之另一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結)。
(式中，Y’11及Y’21各自獨立地表示碳數1~20的伸烷基，Y’12及Y’22各自獨立地表示氫原子或可經胺基取代之烷基，或者Y’12與Y’22在其末端彼此鍵結而表示碳數3~4的伸烷基，鍵結至Y’11之末端的氧原子係與Z1區域及Z2區域中之任一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結，鍵結至Y’21之末端的氧原子係與Z1區域及Z2區域中之未與Y’11鍵結之另一區域之末端核苷酸之磷酸酯之磷原子進行鍵結)。
前述Y11及Y21以及Y’11及Y’21中之碳數1~20的伸烷基較佳為碳數1~10，更佳為碳數1~5。伸烷基可為直鏈狀，亦可為分枝鏈狀。
前述Y12及Y22以及Y’12及Y’22中之可經胺基取代之烷基較佳為碳數1~10，更佳為碳數1~5。烷基可為直鏈狀，亦可為分枝鏈狀。
作為Ly連結子及Lz連結子之合適例，可列舉下述式(II-A)或(II-B)所示之結構的二價基。
(式中，n及m各自獨立地表示1至20中之任一整數)。
n及m較佳為1~10中之任一整數，更佳為1~5中之任一整數。
在較佳態樣中，Ly連結子及Lz連結子各自獨立地表示式(II-A)或(II-B)中之任一二價基。
作為第1單股RNA及第2單股RNA之例，具體而言，可例示圖5及圖6中所記載者。
在本實施形態之製造方法中所實施之連結反應中，係使用被分類至國際生化學聯盟所規定作為酵素編號之EC6.5.1.3之RNA連接酶，其係具有雙股切口修復活性之RNA連接酶(以下，有時亦記為「本RNA連接酶」)。作為該種RNA連接酶，可例示例如源自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2。此RNA連接酶2可例如自(New England BioLabs)購入。再者，作為RNA連接酶，可例示源自弧菌噬菌體(vibriophage)KVP40之連接酶2、Trypanosoma brucei RNA連接酶、Deinococcus radiodurans RNA連接酶或Leishmania tarentolae RNA連接酶。該種RNA連接酶亦可使用例如以
非專利文獻(Structure and Mechanism of RNA Ligase,Structure,Vol.12,PP.327-339.)中所記載之方法自各生物進行萃取及精製所獲得者。
作為源自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2，亦能夠使用由與序列編號21所記載之胺基酸序列具有95%以上的同一性之胺基酸序列所組成之蛋白質，其係具有雙股切口修復活性之RNA連接酶。作為該種RNA連接酶2，除了序列編號21所記載之胺基酸序列的酵素以外，尚可例示屬於其變異體之T39A、F65A、F66A(參照RNA ligase structures reveal the basis for RNA specificity and conformational changes that drive ligation forward,Cell.Vol.127,pp.71-84.)等。該種RNA連接酶2能夠基於例如前述文獻的記載，以使用寄存於ATCC(American Type Culture Collection)作為ATCC(註冊商標)11303之Escherichia coli bacteriophage T4之方法或PCR等方法獲得。
源自KVP40之RNA連接酶2可以非專利文獻(Characterization of bacteriophage KVP40 and T4 RNA ligase 2,Virology,vol.319,PP.141-151.)中所記載之方法取得。具體而言，可以例如如以下般之方法取得。即，將萃取自噬菌體KVP40(例如寄存於JGI作為寄存編號Go008199)之DNA中之開放閱讀框(open reading frame)293藉由NdeI及BamHI進行限制酵素消化之後，藉由聚合酶連鎖反應進行增幅。將所獲得之DNA組入質體載體pET16b(Novagen)中。或者，亦可將該DNA序列藉由PCR進行人工
合成。在此處，可藉由DNA序列解析，獲得所期望之變異體。繼而，將所獲得之載體DNA組入E.coli BL21(DE3)中，在包含0.1mg/mL胺苄青黴素(ampicillin)之LB培養基中進行培養。以成為0.5mM之方式添加異丙基-β-硫代半乳糖苷，於37℃培養3小時。隨後之操作較佳係全部於4℃施行。首先，藉由離心操作使菌體沉澱，將沉澱物於-80℃進行保管。在已結凍之菌體中加入緩衝液A[50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.2M NaCl、10%蔗糖]。接著，加入溶菌酶及Triton X-100，藉由超音波將菌體打碎，使目標物溶出。然後，利用親和層析或尺寸排除層析等將目標物進行單離。接著，將所獲得之水溶液進行離心過濾，藉由將溶離液置換成緩衝液，便可使用作為連接酶。
依此方式，可獲得源自KVP40之RNA連接酶2。作為源自KVP40之RNA連接酶2，能夠使用由與序列編號22之胺基酸序列具有95%以上的同一性之胺基酸序列所組成之蛋白質，其係具有雙股切口修復活性之RNA連接酶。
Deinococcus radiodurans RNA連接酶可以非專利文獻(An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans,J Biol Chem.,Vol.279,No.49,PP.50654-61.)中所記載之方法取得。亦能夠自例如寄存於ATCC作為ATCC(註冊商標)BAA-816之生物學材料獲得前述連接酶。作為Deinococcus radiodurans RNA連接酶，能夠使用由與序列編號23之胺基酸序列具有95%以上的同一性之胺基酸序列所組成之蛋白質，其係具有雙股切口修復活性之RNA連接酶。作為該種
連接酶，具體而言，除了由序列編號23之胺基酸序列所組成之RNA連接酶以外，尚可例示由在序列編號23之RNA連接酶中具有K165A或E278A的變異之胺基酸序列所組成之RNA連接酶(An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans,J Biol Chem.,Vol.279,No.49,PP.50654-61)。
Trypanosoma brucei RNA連接酶可以非專利文獻(Assiciation of Two Novel Proteins TbMP52 and TbMP48 with the Trypanosoma brucei RNA Editing Complex,Vol.21,No.2,PP.380-389.)中所記載之方法取得。
Leishmania tarentolae RNA連接酶可以非專利文獻(The Mitochondrial RNA Ligase from Leishmania tarentolae Can Join RNA Molecules Bridged by a Complementary RNA,Vol.274,No.34,PP.24289-24296)中所記載之方法取得。
使用本RNA連接酶之本實施形態之製造方法之反應條件只要是本RNA連接酶發揮機能之條件，即無特別限定，作為一典型例，可列舉將第1核酸鏈、第2核酸鏈、包含ATP、氯化鎂及DTT之Tris-HCl緩衝液(pH7.5)以及純水進行混合，在該混合液中加入本RNA連接酶，然後於該連接酶發揮機能之溫度(例如37℃)使其反應既定時間(例如1小時)之條件。
或者，本實施形態之製造方法亦可按照非專利文獻(Bacteriophage T4 RNA ligase 2(gp24-1)exemplifies a
family of RNA ligases found in all,Proc.Natl.Acad.Sci,2002,Vol.99,No.20,PP.12709-12714.)中所記載之條件施行。
藉由使用本RNA連接酶之第1單股RNA及第2單股RNA的連結反應所獲得之粗生成物通常可藉由使用將RNA進行沉澱、萃取及精製之方法而予以單離。
具體而言，可採用藉由在連結反應後之溶液中加入乙醇或異丙醇等對RNA溶解性較低的溶媒而使RNA沉澱之方法，或將苯酚/氯仿/異戊醇(例如苯酚/氯仿/異戊醇=25/24/1)之混合溶液加至連結反應後之溶液中並將RNA萃取至水層中之方法。
作為將連結RNA進行精製之方法，可列舉逆相管柱層析或陰離子交換管柱層析、親和管柱層析、凝膠過濾管柱層析等公知的方法，可適宜組合使用此等方法，自粗生成物中單離出已連結之RNA。
第1單股RNA可藉由例如固相合成法予以調製。更具體而言，可基於亞磷醯胺法，使用核酸合成機(NTS M-4MX-E(日本Techno Service股份有限公司製)予以調製。亞磷醯胺法為將去封閉(deblocking)、偶合(coupling)及氧化3個階段作為1個循環，反覆進行此循環直至獲得期望的鹼基序列為止之方法。關於各試劑，可例如使用多孔質玻璃作為固相擔體，使用二氯醋酸甲苯溶液作為去封閉溶液，使用5-苄基巰基-1H-四唑作為偶合劑，使用碘溶液作為氧化劑，使用醋酸酐溶液及N-甲基咪唑溶液作為封端
溶液而施行。固相合成後之自固相擔體的切出及脫保護可依照例如國際公開第2013/027843號中所記載之方法施行。即，加入氨水溶液及乙醇而施行鹼基部分及磷酸基的脫保護以及自固相擔體的切出之後，將固相擔體進行過濾，然後，使用氟化四丁基銨施行2’-羥基的脫保護，便可調製RNA。
作為該種固相合成法中所使用之亞醯胺(amidite)，並無特別限制，亦可使用例如下述結構式(III-a)中之R1經第三丁基二甲基矽烷(TBDMS)基、雙(2-乙醯氧基)甲(ACE)基、(三異丙基矽烷氧基)甲(TOM)基、(2-氰基乙氧基)乙(CEE)基、(2-氰基乙氧基)甲(CEM)基、對-甲苯基磺醯基乙氧基甲(TEM)基、(2-氰基乙氧基)甲氧基甲(EMM)基等保護之TBDMS亞醯胺(TBDMS RNA Amidites，商品名，ChemGenes Corporation)、ACE亞醯胺、TOM亞醯胺、CEE亞醯胺、CEM亞醯胺、TEM亞醯胺(Chakhmakhcheva的總論：Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides,Russian Journal of Bioorganic Chemistry,2013,Vol.39,No.1,pp.1-21.)、EMM亞醯胺(記載於國際公開第2013/027843號)等。
此外，針對Ly連結子區域及Lz連結子區域，可以國際公開第2012/017919號之實施例A4之方法使用下述結構式(III-b)所示之具有脯胺酸骨架之亞醯胺。此外，可藉由使用下述結構式(III-c)、(III-d)及(III-e)中之任一者所示之亞醯胺(參照國際公開第2013/103146號之實施例
A1~A3)，同樣地以核酸合成機進行調製。
在5’末端之5’位的磷酸化中，亦可以固相合成使用5’末端的磷酸化用之亞醯胺。5’末端的磷酸化用之亞醯胺可使用市售的亞醯胺。此外，可藉由以固相合成預先合成5’末端之5’位為羥基或經保護之羥基之RNA分子，適宜施行脫保護後，以市售的磷酸化劑進行磷酸化而調製在5’末端具有磷酸基之單股RNA。作為磷酸化劑，已知下述結構式(III-f)所示之市售的Chemical Phosphorylation Reagent(Glen Research)(專利文獻EP0816368)。
在式(III-a)中，R2表示可經保護基保護之核酸鹼基，R1表示保護基。
第2單股RNA可基於固相合成法，即亞磷醯胺法，使用核酸合成機，同樣地予以製造。
構成核苷酸之鹼基通常為構成核酸，典型地
RNA之天然的鹼基，亦可視情況使用非天然的鹼基。作為該種非天然的鹼基，可例示天然或非天然的鹼基之修飾類似物。
作為鹼基之例，可列舉例如腺嘌呤及鳥嘌呤等嘌呤鹼基，胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶等嘧啶鹼基等。鹼基係除此以外，尚可列舉肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、異鳥苷(isoguanisine)、殺結核菌素(tubercidine)等。前述鹼基可列舉例如2-胺基腺嘌呤、6-甲基化嘌呤等烷基衍生物；2-丙基化嘌呤等烷基衍生物；5-鹵尿嘧啶及5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶及6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、5-鹵尿嘧啶、5-(2-胺基丙基)尿嘧啶、5-胺基烯丙基尿嘧啶；8-鹵化、胺基化、硫醇化、硫烷基化、羥基化及其他8-取代嘌呤；5-三氟甲基化及其他5-取代嘧啶；7-甲基鳥嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮雜嘧啶；N-2、N-6及O-6取代嘌呤(包含2-胺基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；二氫尿嘧啶；3-去氮-5-氮雜胞嘧啶；2-胺基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷基鳥嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-去氮腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二胺基嘌呤；5-胺基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代1,2,4-三唑；2-吡啶酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧基醋酸；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲基胺基甲基-2-硫尿嘧
啶；3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙醯基胞嘧啶；2-硫胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-異戊基腺嘌呤；2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤；N-甲基鳥嘌呤；O-烷基化鹼基等。此外，在嘌呤鹼基及嘧啶鹼基中，包含例如美國專利第3,687,808號；「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」,858~859頁，Kroschwitz J.I.編，John Wiley & Sons,1990；及Englisch等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30卷，p.613中所揭示者。
藉由本實施形態之方法所獲得之自5’末端側起由X1區域、Y1區域、Ly區域、Y2區域、X2區域及Z區域所組成之單股RNA核酸分子，其5’末端與3’末端未連結，亦可稱為線狀單股核酸分子。該種單股RNA核酸分子可在例如in vivo或in vitro，使用於標的基因之表現抑制，可藉由RNA干擾，使用於標的基因之表現抑制。所謂「標的基因之表現抑制」，係意味例如阻礙標的基因的表現。前述抑制的機制並無特別限制，可為例如向下調節(down regulation)或靜默化(silencing)。
標的基因之表現抑制可藉由例如來自標的基因之轉錄產物的生成量減少、轉錄產物的活性減少、來自標的基因之轉譯產物的生成量減少或轉譯產物的活性減少等加以確認。作為轉譯產物之蛋白質，可列舉例如成熟蛋白質，或者經受加工或轉譯後修飾前之前驅物蛋白質等。
以下，詳細說明依據本實施形態之實施例，但本發明並不限定於此。
作為實施例1之鏈I的RNA，係合成以下所示之單股RNA(表2之序列1；p-序列編號1)。前述鏈I係由13個鹼基長所組成，對應於第1單股RNA。
鏈I(序列1)：5’-pGUGUACUCUGCUU-3’
前述單股RNA係基於亞磷醯胺法，使用核酸合成機(商品名NTS M-4MX-E，日本Techno Service股份有限公司)自3’側朝向5’側加以合成。在前述合成中，係使用國際公開第2013/027843號之實施例2中所記載之尿苷EMM亞醯胺、實施例3中所記載之胞苷EMM亞醯胺、實施例4中所記載之腺苷EMM亞醯胺、實施例5中所記載之鳥苷EMM亞醯胺作為RNA亞醯胺，以及5’磷酸化係使用Chemical Phosphorylation Reagent(Glen Research)，使用多孔質玻璃作為固相擔體，使用高純度三氯醋酸甲苯溶液作為去封閉溶液，使用5-苄基巰基-1H-四唑作為縮合劑，使用碘溶液作為氧化劑，使用苯氧基醋酸溶液及N-甲基咪唑溶液作為封端溶液而施行。固相合成後之自固相擔體的切出及脫保護係依照國際公開第2013/027843號中所記載之方法。即，加入氨水溶液及乙醇，靜置片刻之後，將固相
擔體進行過濾，然後，使用氟化四丁基銨施行羥基的脫保護。使用注射用蒸餾水以成為所期望之濃度之方式溶解所獲得之RNA。
作為實施例1之鏈II的RNA，係合成以下所示之單股RNA(表2之序列2；序列編號2-K-序列編號3)。前述鏈II係由36個鹼基長所組成，對應於第2單股RNA。
鏈II(序列2)：5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACCKGGUAUAUGCUGU-3’
前述單股RNA係基於亞磷醯胺法，藉由核酸合成機(商品名NTS M-4MX-E，日本Techno Service股份有限公司)加以合成。在前述合成中，係使用國際公開第2013/027843號之實施例2中所記載之尿苷EMM亞醯胺、實施例3中所記載之胞苷EMM亞醯胺、實施例4中所記載之腺苷EMM亞醯胺及實施例5中所記載之鳥苷EMM亞醯胺以及國際公開第2012/017919號之實施例A3中所記載之離胺酸亞醯胺(Ie)作為RNA亞醯胺。固相合成後之自固相擔體的切出及脫保護係依照國際公開第2013/027843號中所記載之方法。藉由注射用蒸餾水以成為所期望之濃度之方式溶解所獲得之RNA。
其次，以160units/mL T4 RNA連接酶2、50mM Tris-
HCl(pH7.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP的組成，以反應規模7.9mL施行第1 RNA鏈及第2 RNA鏈的接合反應。
將所獲得之連結單股RNA示於下述(序列15；序列編號17-K-序列編號18)。
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACCKGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
具體而言，首先，以第1 RNA鏈成為5.5μM，第2 RNA鏈成為5.0μM之方式，在包含含500mM Tris-HCl(pH7.5)、20mM MgCl2及10mM DTT之4000μM的ATP緩衝液(10×緩衝液)790μL以及注射用蒸餾水之15mL管內加入第1 RNA鏈及第2 RNA鏈，靜置於65℃水浴中10分鐘。然後，以成為上述組成及反應規模之方式加入T4 RNA連接酶2(New England BioLabs製)，於25℃保溫培養24小時。反應後，將反應液以下述表1中所記載之條件，藉由管柱層析施行精製。將所獲得之部分各自以HPLC進行分析。收集並混合純度90%以上的部分。其結果，可以純度90%，總產率11%獲得目標物。在此處，所謂總產率，係將接合反應後之生成物進行精製所獲得之單股RNA的量相對於所饋入之RNA鏈的量之比例。前述RNA的量係基於波長260nm的紫外線的吸光度予以求出。其係將吸光度顯示1之情況之RNA的濃度設為33μg/mL所求出之值。對所獲得之試料藉由質量分析測定進行測定之結果，與計算值一致，因而可確認獲得目標物(測定值：15715.2464，理論值：
15715.2075)。
將所獲得之連結單股RNA示於下述(序列16；序列編號19-P-序列編號20-PG)。
5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3’
作為實施例2之鏈I的RNA，係合成表3所示之鏈I(序列3)的單股RNA(表2之序列3；序列編號4)。前述鏈I係由16個鹼基長所組成，對應於第1單股RNA。
前述單股RNA係基於亞磷醯胺法，使用核酸合成機(商品名NTS M-4MX-E，日本Techno Service股份有
限公司)加以合成。在前述合成中，係使用國際公開第2013/027843號之實施例2中所記載之尿苷EMM亞醯胺、實施例3中所記載之胞苷EMM亞醯胺、實施例4中所記載之腺苷EMM亞醯胺及實施例5中所記載之鳥苷EMM亞醯胺以及國際公開第2012/017919號之實施例A3中所記載之脯胺酸亞醯胺(Ib)作為RNA亞醯胺。5’磷酸化係使用Chemical Phosphorylation Reagent(Glen Research)(以下相同)。固相合成後之自固相擔體的切出及脫保護係依照國際公開第2013/027843號中所記載之方法。使用注射用蒸餾水以成為所期望之濃度之方式溶解所獲得之RNA。
作為實施例2之鏈II的RNA，係合成表3所示之鏈II(序列4)的單股RNA(表2之序列4；序列編號5、6)。前述鏈II係由37個鹼基長所組成，對應於第2單股RNA。
第2單股RNA鏈的合成，脫保護以後之操作係與第1單股RNA的合成同樣地施行。
其次，以58units/mL T4 RNA連接酶2、50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP的組成，以反應規模10mL施行第1 RNA鏈及第2 RNA鏈的接合反應。
具體而言，首先，以第1 RNA鏈成為4.4μM，
第2 RNA鏈成為4.0μM之方式，在已加入含500mM Tris-HCl(pH7.5)、20mM MgCl2及10mM DTT之4000μM ATP緩衝液(10×緩衝液)0.96mL以及注射用蒸餾水之溶液中加入第1RNA鏈及第2 RNA鏈，靜置於65℃水浴中10分鐘。然後，以成為上述組成及反應規模之方式加入T4 RNA連接酶2(New England BioLabs)，於25℃保溫培養24小時。反應後，將反應液使用表1中所記載之條件，進行管柱層析精製。將所獲得之部分藉由HPLC進行分析，收集並混合純度90%以上的部分(相對於在層析中所檢測出之峰值的總面積而言，目標物的峰值面積所佔之比率成為90%以上的比例之部分)。其結果，可以純度94%，總產率14%獲得目標物。此外，對所獲得之試料藉由質量分析測定進行測定之結果，與計算值一致，因而可確認獲得目標物(測定值：17025.4858，理論值：17025.4672)。
以下，在實施例3-6中，除了各自藉由核酸合成機合成表3中所記載之鏈I(對應於第1單股RNA)及鏈II(對應於第2單股RNA)並加以使用以外，與實施例2同樣地使用T4RNA連接酶2施行反應，將反應生成物進行管柱層析精製，將所獲得之部分藉由HPLC進行分析。針對實施例3-6各者，收集並混合純度90%以上的部分(前述同樣的定義)，各自求出純度及總產率。將其結果總結示於表2。
為了合成與實施例2相同的連結單股RNA(序列16)，除了以核酸合成機合成表3所示之鏈I(序列13)及鏈II(序列14)並加以使用以外，以與實施例2同樣的操作實施。此時之鏈II(序列14)中之對應於Y1區域之區域的核苷酸數為1個。將接合反應後之反應液以HPLC進行分析，結果鏈I及鏈II的峰值並未發現變化，此外，在連結單股RNA的溶出位置並未檢測出峰值，因而可確認連結反應並未進行。
將在實施例及參考例中所使用之鏈I及鏈II的RNA的序列總結示於下表3。
各自使用作為第1 RNA鏈及第2 RNA鏈示於表3之鏈I(序列11)及鏈II(序列12)，以58units/mL KVP40 RNA連接
酶2、50mM Tris-HCl(pH7.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP的組成，以反應規模15mL施行第1 RNA鏈及第2 RNA鏈的接合反應。
以第1 RNA鏈(序列11)成為2.6μM，第2 RNA鏈(序列12)成為2.4μM之方式，在由含500mM Tris-HCl(pH7.0)、20mM MgCl2及10mM DTT之4000μM ATP緩衝液(10×緩衝液)166μL以及注射用蒸餾水所組成之溶液中加入第1 RNA鏈及第2 RNA鏈，靜置於37℃水浴中10分鐘。然後，以成為上述組成及反應規模之方式加入KVP40 RNA連接酶2(ProteinExpress)，於25℃保溫培養24小時。反應後，在反應液中加入0.2M乙二胺四醋酸鈉水溶液1mL，藉由於65℃水浴中加熱10分鐘而使酵素去活化。依原樣使用表1之條件以HPLC進行分析。
接合反應後，第1單股RNA及第2單股RNA減少，觀察到滯留時間延遲之新峰值。將此溶出峰值藉由質量分析測定確認分子量，結果與連結單股RNA的計算值一致，因而可確認藉由接合反應生成目標連結單股RNA。
將所獲得之部分以表1所示之條件施行HPLC分析之後，將以純度95%以上所獲得之物進行混合。其結果，可以純度98%，總產率16%獲得目標物。
作為比較例，係如以下基於亞磷醯胺法，使用核酸合成機(商品名NTS M-4MX-E，日本Techno Service股份有限
公司)自3’側朝向5’側合成與實施例2中所合成之連結單股RNA(序列16)相同的核苷酸序列的單股RNA。在前述合成中，係使用國際公開第2013/027843號之實施例2中所記載之尿苷EMM亞醯胺、實施例3中所記載之胞苷EMM亞醯胺、實施例4中所記載之腺苷EMM亞醯胺、實施例5中所記載之鳥苷EMM亞醯胺作為RNA亞醯胺，以及5’磷酸化係使用Chemical Phosphorylation Reagent(Glen Research)，使用多孔質玻璃作為固相擔體，使用高純度三氯醋酸甲苯溶液作為去封閉溶液，使用5-苄基巰基-1H-四唑作為縮合劑，使用碘溶液作為氧化劑，使用苯氧基醋酸溶液及N-甲基咪唑溶液作為封端溶液而施行。固相合成後之自固相擔體的切出及脫保護係依照國際公開第2013/027843號中所記載之方法。即，加入氨水溶液及乙醇，靜置片刻之後，將固相擔體進行過濾，然後，使用氟化四丁基銨施行羥基的脫保護。使用注射用蒸餾水以成為所期望之濃度之方式溶解所獲得之RNA。
然後，將所獲得之RNA的粗生成體依照表1之條件以管柱層析進行精製。將所獲得之精製部分各自藉由HPLC進行分析。其中，並未獲得純度90%以上的部分。對純度最高的部分進行分析之結果，為純度87%，產率5%。
圖5係示出實施例1中所使用之第1單股RNA及第2單股RNA，以及藉由前述單股RNA之接合反應所生成之連結單股RNA。圖6係示出實施例2中所使用之第1單股RNA及第2單股RNA，以及藉由前述單股RNA之接合反
應所生成之連結單股RNA。序列1~16以及圖5及圖6中之「A」、「G」、「U」及「C」各縮寫符號係意味下述所示之包含核糖環之RNA的單元結構。
A係以下述式表示。
G係以下述式表示。
C係以下述式表示。
U係以下述式表示。
惟，在圖5及圖6中，僅RNA鏈之3’側的末端部分，核糖之3位成為羥基，而磷酸酯部分則無。
序列1~16以及圖5及圖6中之「P」及「K」的縮寫符號係各自意味下述所示之結構的具有衍生自胺基酸之原子團之連結子區域的結構。
P係以下述式表示。
K係以下述式表示。
序列1~16以及圖5及圖6中之「p」的縮寫符號係意味核糖環之5’位為磷酸基[-O-P(=O)(OH)2]。
本發明所涉及之單股RNA之製造方法可利用作為單股RNA之簡便的製造方法。
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<212> PRT
<213> 抗輻射奇異球菌
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Claims (8)
- 一種單股RNA之製造方法，其包含使被分類至國際生化學聯盟所規定作為酵素編號之EC6.5.1.3且具有雙股切口修復活性之RNA連接酶對在5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及在3’末端具有羥基之第2單股RNA進行作用，將前述第1單股RNA與前述第2單股RNA進行連結之步驟，該製造方法具有以下a)~g)的特徵：a)前述第1單股RNA為自5’末端側起依序由X1區域及Z區域所組成之單股RNA；b)前述第2單股RNA為自5’末端側起依序由X2區域、Y2區域、Ly連結子區域及Y1區域所組成之單股；c)前述X1區域與前述X2區域為彼此互補之由11個以上相同數量的核苷酸所組成之核苷酸序列；d)前述Y1區域與前述Y2區域為彼此互補之由2個以上相同數量的核苷酸所組成之核苷酸序列；e)前述Z區域為包含任意核苷酸數的核苷酸序列之區域，前述Z區域為自5’末端側起依序由Z1區域、Lz連結子區域及Z2區域所組成之區域，前述Lz連結子區域為下述式(I’)所示之二價基，前述Z1區域與前述Z2區域包含彼此互補的核苷酸序列；f)Ly連結子區域為下述式(I)所示之二價基； g)藉由前述第1單股RNA之5’末端與前述第2單股RNA之3’末端的連結所生成之單股RNA為自5’末端側起依序由前述X2區域、前述Y2區域、前述Ly連結子區域、前述Y1區域、前述X1區域、前述Z1區域、前述Ly連結子區域及前述Z2區域所組成之連結單股RNA，
- 如申請專利範圍第1項之製造方法，其中，前述Ly連結子區域及前述Lz連結子區域各自獨立地為下述式(II-A)或(II-B)所示之結構的二價基；
- 如申請專利範圍第1或2項之製造方法，其中，在由前述X1區域、前述Y1區域及前述Z區域所組成之W1區域以 及由前述X2區域及前述Y2區域所組成之W2區域中之至少一者，包含抑制成為RNA干擾法之標的之基因的表現之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1或2項之製造方法，其中，前述RNA連接酶為源自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2、源自KVP40之連接酶2、Trypanosoma brucei RNA連接酶、Deinococcus radiodurans RNA連接酶或Leishmania tarentolae RNA連接酶。
- 如申請專利範圍第1或2項之製造方法，其中，前述RNA連接酶為由與序列編號21、22或23所記載之胺基酸序列具有95%以上的同一性之胺基酸序列所組成之RNA連接酶。
- 如申請專利範圍第1或2項之製造方法，其中，前述RNA連接酶為源自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2或源自KVP40之RNA連接酶2。
- 一種具有申請專利範圍第1或2項中定義之a)~g)之特徵的前述第1單股RNA與前述第2單股RNA之組合。
- 一種使用於如申請專利範圍第1或2項之製造方法的選自由下述序列1~12中之序列所成之單股RNA， 序列1：pGUGUACUCUGCUU(p-序列編號1)；序列2：GCAGAGUACACACAGCAUAUACCKGGUAUAUGCUGU(序列編號2-K-序列編號3)；序列3：pGUGUACUCUGCUUCPG(p-序列編號4-PG)；序列4：AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGU(序列編號5-P-序列編號6)；序列5：pCUGUGUGUACUCUGCUUCPG(p-序列編號7-PG)；序列6：AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUG(序列編號8-PGGUAUAUG)；序列7：pUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG(p-序列編號9-PG)；序列8：AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUA(序列編號10-PGGUAUA)；序列9：pUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG(p-序列編號11-PG)；序列10：AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUA(序列編號12-PGGUA)；序列11：pUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG(p-序列編號13-PG)；序列12：AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGG(序列 編號14-PGG)；[序列1~12中，p表示核糖環之5’位為磷酸基[-O-P(=O)(OH)2]；P表示下述式(P)所示之結構；K表示下述式(K)所示之結構]，
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