JPH08508493A

JPH08508493A - ７−デアザプリン修飾オリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH08508493A
Application number: JP6522134A
Authority: JP
Inventors: ディー．クック，フィリップ; ジェイ．デレッキ，ダニエル
Original assignee: スターリングウィンスロップインコーポレイティド
Priority date: 1993-03-30
Filing date: 1994-03-21
Publication date: 1996-09-10
Also published as: HU9501963D0; DE69403642D1; DK0691980T3; EP0691980A1; ES2105698T3; EP0691980B1; CA2159630A1; AU6589094A; GR3024597T3; ATE154029T1; WO1994022892A1; DE69403642T2

Abstract

(57)【要約】７−デアザヌクレオシドが取り込まれたオリゴヌクレオチドは、アンチセンス配列として、RNA 及びDNA の作用を阻害するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】７−デアザプリン修飾オリゴヌクレオチド発明の分野本発明は、７−デアザプリンヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチド配列、該７−デアザプリンヌクレオシドを取り込ませる、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解の阻害方法、細胞系における遺伝子発現の抑制方法、ならびに該修飾オリゴヌクレオチドを含む、遺伝子発現の抑制に有用な組成物に関する。情報開示の陳述 Seela and Kehne，Biochem.，26，2232-2238（1987）は、７−デアザデオキシアデノシン（９−β−２′−デオキシリボフラノシル−７−デアザアデニン）、ならびにパリンドロームEcoRＩエンドヌクレアーゼDNA認識配列d（GAATTC）を有するオクタ及びドデカヌクレオチド中への１個〜２個のこのようなヌクレオシドの取り込みを開示している。オリゴヌクレオチドは、EcoRＩによる分解に対するそれらの安定性の研究のために製造されたものである。 Seela and Driller，Nucl．Acid．Res.，17（3），901-910（1989）は、d（GC ）₃及びd（CG）₃ヌクレオチド単位を含むヘキサヌクレオチド配列の製造、ならびに７−デアザグアノシン（c⁷G_d）及び７−デアザ−８−アザグアノシン（c⁷z⁸ G₄）を含むこのような六量体を記載している。このようにして製造された自己相補的六量体はデュプレックスを形成するが、それらはデュプレックスの安定性及びＧ−Ｃ／Ｃ−Ｇ塩基対の各々に対するヘリックス−コイル転移の熱力学パラメーターを研究するために製造されたものである。 Tran-Thi et al.，Angew．Chem．Int．Ed．Engl.，21（5），367-368，（1982 ）は、７−デアザグアノシンの製造及び該７−デアザグアノシンからの環状グアノシンモノホスフェートの製造を開示している。 Seela and Kehne，Biochem.，24（26），7556-7561（1985）は、固相法及び適当に保護されたホスホルアミダイトを用いた自己相補的六量体及び十二量体の合成を記載しており、それらは、それらの融解曲線ならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼ及び一本鎖に特異的なヌクレアーゼSIに対するそれらの挙動によって反映されるような、塩基対合及び塩基スタッキング性の研究のために合成されたものである。 Seela and Driller，Nucl．Acid．Res.，13（3），911-926（1985）は、７− デアザ−２′−デオキシグアノシンの３′−ホスホルアミダイトの合成、及びグアノシン部分が７−デアザ−２′−デオキシグアノシンで置換されたd（CG）の自己相補的六量体の合成、ならびに得られるデュプレックスの性質の研究を記載している。 Winkeler and Seela，J．Org．Chem.，48，3119-3122（1983）は、７−デアザ −２′−デオキシグアノシンの全合成を報告しており、塩基対合及び酵素認識に関する情報を得るための、オリゴ及びポリヌクレオチドへのその取込みは現在進行中である。 Seela and Kehne，Tetrahedron，41（22），5387-5392（1985）は、３′−Ｏ −〔（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスファニル〕−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−７−デアザ−６−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシンと３′−Ｏ−（ｔ−ブチルメチルシリル）−７−デアザ−２′−デオキシアデノシンとの縮合及びＯ−メチル、Ｏ−ジメトキシトリチル及びＮ−ベンゾイル保護基の除去による、淡色性及びヌクレアーゼ分解に対する安定性の研究のための、２′−デオキシツベルシジリル（３′→５ ′）−２′−デオキシツベルシジン、すなわち、７−デアザ−２′−デオキシアデノシニル（３′→５′）−７−デアザ−２′−デオキシアデノシンの製造を開示している。 Winkeler and Seela，Liebigs Ann．Chem.，708-721（1984）は、７−デアザ −７−メチル−２′−デオキシグアノシン及び２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジンからのその合成を開示している。 Seela and Kehne，Liebigs Ann．Chem.，876-884（1983）は、７−デアザ−２ ′−デオキシアデノシンの製造を開示している。 Seela and Driller，Nucl．Acid．Res.，14，2319-2332（1986）は、EcoRＩエンドヌクレアーゼ認識部位及び７−デアザ−２′−デオキシグアニンを含むオクタデカヌクレオチドの、ヌクレオシドホスホルアミダイトを経た固相合成による製造、ならびにEcoRＩによるそれらの分解に関する動力学的研究を開示している。 Seela，Tran-Thi and Franzen，Biochem.，21，4338-4343（1982）は、淡色性、融解プロフィル及び円二色性スペクトルの研究のための、７−デアザグアノシンのポリマーの製造を開示している。 EPO Application 286，028，published October 12，1988は、式：〔式中、ＸはＮまたは＝CH基であり；ＷはＮまたは＝CR⁴基であり；Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³及びＲ⁴は同一であるかまたは異なり、水素、ハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、メルカプト、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、アリールアルキル、アリールアルコキシ、アリールオキシまたは一もしくは二置換アミノ基であり；Ｒ⁵は、水素またはヒドロキシであり；Ｒ⁶及びＲ⁷が水素であるか、または一方もしくは両方がハロゲン、シアノ、アジドまたは一もしくは二置換アミノ基であり、Ｘが−CH基である場合にはＲ⁶及びＲ⁷の一方はヒドロキシであることができ；さらに、Ｒ⁵とＲ⁷は一緒になってＣ₂′位とＣ₃′位との間の第２の結合であることができ；且つＹは水素またはモノ、ジもしくはトリホスフェートである〕の７−デアザプリンヌクレオシドを開示している。これらの化合物は核酸の配列決定において、また、抗ウィルス剤として有用であると述べられている。発明の背景アンチセンス（antisense）化合物は、核酸、RNAまたはDNA中のヌクレオチド配列に結合するかまたはそれとハイブリッド形成して、該核酸の作用または合成を阻害する化合物である。アンチセンス化合物はRNAとDNAの両者とハイブリッド形成できるため、転写、RNAプロセッシングまたは翻訳のレベルで遺伝子発現を妨害することができる。アンチセンス分子は、ゲノムDNAとハイブリッド形成して、RNA ポリメラーゼの作用を直接または間接的に阻害することによって、特定の遺伝子のmRNAへの転写を妨害するように、設計及び合成することができる。DNAを標的とする場合に理論上有利な点は、治療効果を達成するのに必要なアンチセンス化合物がごく少量でよいことである。あるいは、アンチセンス化合物はRNAとハイブリッド形成して、転写後修飾（RNAプロセッシング）または蛋白合成（翻訳）メカニズムを阻害するかまたはmRNAの安定性に影響を与えるように、設計及び合成することができる。標的RNAの例は、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、ヘテロ核RNA（hnRNA）などである。プロセッシング及び翻訳メカニズムの例としては、前mRNAのスプライシングによるイントロンの除去、mRNAの５′末端のキャッピング、細胞質への輸送、ハイブリッド形成の停止及びリボヌクレアーゼＨが介在するmRNA加水分解が挙げられる。しかしながら、現在のところ、アンチセンス技術の科学及び治療への応用は、数々の技術的問題によってその進展が妨げられている。合成アンチセンス分子は、標的細胞中に存在するヌクレアーゼによって急速に分解されやすい。アンチセンスDNAまたはRNAのオリゴヌクレオチド配列は、例えば、核酸の５′または３′ 末端において作用するエクソヌクレアーゼによって破壊される。さらに、エンドヌクレアーゼが個々のヌクレオチド間の内部ホスホジエステル結合においてDNA またはRNAを分解し得る。このような分解の結果、投与されるアンチセンス化合物の有効半減期は極めて短いため、大用量を短い間隔で投与しなければならない。もう一つの問題は、入手できるDNA半自動合成装置では、アンチセンスDNAまたはRNAの製造コストが非常に高いことである。さらに別の問題は、体及び細胞内の目的とする標的へのアンチセンス薬剤の送達に関するものである。ゲノムDNAを標的とするアンチセンス薬剤は核内に入らなければならない（すなわち、薬剤は原形質膜及び核膜を透過しなければならない）。膜透過性を増大しなければならない（疎水性を増大しなければならない）が、他方において、細胞質及び細胞サイトゾルのような体液区分においては水溶性が必要である（親水性を増大しなければならない）ので、そのいずれを優先するかを考えなければならない。さらに別の問題は、体内で遊離しているかまたは標的核酸に対してハイブリッド形成するかという、アンチセンス薬剤の安定性に関するものである。アンチセンスDNAのようなオリゴヌクレオチド配列は、キラール燐中心の回りで立体配置の変換を受けやすい。ヒトの治療において予測される次のステップは、遺伝子をアンチセンス薬剤の標的とすることである〔Armstrong，Business Week，1990年３月５日、p.88〕。しかしながら、疾病の治療にアンチセンス技術をうまく応用するには、前記問題の解決法を見い出さなければならない。安定で、ヌクレアーゼ抵抗性で、製造コストが安く、しかも体中の核酸標的に送達でき且つそれらとハイブリッド形成できるアンチセンス化合物を製造するための１つのアプローチは、相補的な各チミンまたはシトシン塩基とハイブリッド形成できるがエクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる攻撃を比較的受けにくいためにオリゴヌクレオチド配列を酵素分解に対して安定化する、修飾アデニンまたはグアニンプリン塩基が取り込まれたオリゴヌクレオチド配列を合成することである。本発明はこのようなアプローチに関する。発明の要約生成物の側面において、本発明は、所定のDNAまたはRNA塩基配列とのハイブリッド形成に必要な配列中に正常のDNA塩基、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の配列を含み、該正常塩基の１個またはそれ以上が修飾７−デアザアデニンまたは７−デアザグアニンで置換されたオリゴヌクレオチドに関する。方法の側面において、本発明は正常なDNA塩基配列中に１個またはそれ以上の修飾７−デアザアデニンまたは７−デアザグアニンヌクレオシドを取り込ませることを含んでなるオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解を阻害する方法に関する。別の方法の側面において、本発明は、１個またはそれ以上の修飾７−デアザアデニンまたは７−デアザグアニンヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを含む組成物を細胞系に導入することを含んでなる細胞系における遺伝子発現の抑制方法に関する。組成物の側面において、本発明は、１個またはそれ以上の修飾７−デアザアデニンまたは７−デアザグアニンヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを医薬として許容され得る担体中に含んでなる、遺伝子発現抑制用組成物に関する。好ましい実施態様の説明さらに詳しくは、本発明は、所定のDNAまたはRNA塩基配列とのハイブリッド形成に必要な配列中に、正常なDNA塩基、すなわち、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンのヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該正常塩基の１個またはそれ以上が式：の７−デアザアデニン−β−Ｄ−リボフラノシルもしくはβ−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシルヌクレオシド、または式：の７−デアザグアニン−β−Ｄ−リボフラノシル−もしくはβ−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシルヌクレオシド〔式中、Ｒ′₂は水素またはヒドロキシであり；且つＲ₇は水素または低級アルキルである〕で置換されたもの（ただし、オリゴヌクレオチド配列は（１）EcoR Ｉエンドヌクレアーゼ認識部位、（２）反復GCもしくはCG配列、及び（３）反復 ATもしくはTA配列を含まない）に関する。本発明の範囲内の好ましいオリゴヌクレオチドは、ポリマー中に式ＩａまたはＩｂの７−デアザアデニンまたは７−デアザグアニンヌクレオシドを１〜４個含むものである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、７−デアザアデニンまたは７−デアザグアニンヌクレオシドがオリゴマーの３′及び５′末端のいずれかまたは両者の３個のヌクレオチド単位内に取り込まれたものであり、これらのオリゴマーはエクソヌクレアーゼ分解に対して特に安定である。さらに他の好ましいオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列の内部に７−デアザアデニンまたは７−デアザグアニンヌクレオシドが取り込まれたものであり、これらのオリゴヌクレオチドはエンドヌクレアーゼ分解に対して特に安定である。特に好ましいオリゴマーは、式ＩａにおいてＲ′₂及びＲ₇が水素であるヌクレオシド、すなわち、７−デアザ−２′−デオキシアデノシン（９−β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシル− ７−デアザアデニン）から誘導されたヌクレオチド（以下において、ヌクレオチドＷとして識別）；式ＩａにおいてＲ′₂がヒドロキシであり且つＲ₇が水素であるヌクレオシド、すなわち、７−デアザアデノシン（９−β−Ｄ−リボフラノシル−７−デアザアデニン）から誘導されたヌクレオチド（以下において、ヌクレオチドＷ′として識別）；式ＩａにおいてＲ′₂が水素であり且つＲ₇が低級アルキルであるヌクレオシド、すなわち、７−デアザ−２′−デオキシ−７−メチルアデノシン（９−β−Ｄ −２′−デオキシリボフラノシル−７−デアザ−７−メチルアデニン）から誘導されたヌクレオチド（以下において、ヌクレオチドＸとして識別）；及び式ＩａにおいてＲ′₂がヒドロキシであり且つＲ₇が低級アルキルであるヌクレオシド、すなわち、７−デアザ７−メチルアデノシン（９−β−Ｄ−リボフラノシル−７−デアザ−７−メチルアデニン）から誘導されたヌクレオチド（以下において、ヌクレオチドＸ′として識別）；ならびに式ＩｂにおいてＲ′₂及びＲ₇が水素であるヌクレオシド、すなわち、７−デアザ−２′−デオキシグアノシン（９−β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシル− ７−デアザグアニン）から誘導されたヌクレオチド（以下において、ヌクレオチドＹとして識別）；式ＩｂにおいてＲ′₂がヒドロキシであり且つＲ₇が水素であるヌクレオシド、すなわち、７−デアザグアノシン（９−β−Ｄ−リボフラノシル−７−デアザグアニン）から誘導されたヌクレオチド（以下において、ヌクレオチドＹ′として識別）；式ＩｂにおいてＲ′₂が水素であり且つＲ₇が低級アルキルであるヌクレオシド、すなわち、７−デアザ−２′−デオキシ−７−メチルグアノシン（９−β−Ｄ −２′−デオキシリボフラノシル−７−デアザ−７−メチルグアニン）から誘導されたヌクレオチド（以下において、ヌクレオチドＺとして識別）；及び式ＩｂにおいてＲ₂がヒドロキシであり且つＲ₇が低級アルキルであるヌクレオシド、すなわち、７−デアザ−７−メチルグアノシン（９−β−Ｄ−リボフラノシル−７−デアザ−７−メチルグアニン）から誘導されたヌクレオチド（以下において、ヌクレオチドＺ′として識別）を含むものである。本明細書中において使用する用語「低級アルキル」は、炭素数１〜４の飽和、脂肪族、直鎖または分枝鎖炭化水素基であり、その例としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル及びブチルが挙げられる。本発明の実施において有用なオリゴマーは、１個またはそれ以上のヌクレオシドが式ＩａまたはＩｂの修飾７−デアザアデニン及び７−デアザグアニンヌクレオシドによって置換された、塩基数が約６〜200、好ましくは約12〜約24、最も好ましくは15の配列を含んでなる。本発明のオリゴヌクレオチドは、公知の方法〔Sinha et al.,Nucl.Acid Res., 12, 4539-4557（1984）〕に従って、式：〔式中、Ｂは、塩基アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）または式Ｉａ及びＩｂのヌクレオシド中の塩基に対応する修飾７−デアザアデニンもしくは７−デアザグアニン塩基を表し； DMTはジメトキシトリチル基（すなわち、４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル基）を表し；且つＲ′₂は前述の意味を有し；且つ各グアニン／７−デアザグアニン、アデニン／７−デアザアデニン部分の２− アミノまたは６−アミノ基はベンゾイルまたはイソブチリル基のような保護基で保護されている〕の保護９−〔３′−Ｏ−〔（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）（Ｒ′₃ −オキシ）ホスファニル〕−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）プリンヌクレオシドから固相合成によって製造する。特に好ましい固相合成は、Ma tteucci and Caruthers，J．Am．Chem．Soc.，103，3185-3191（1981）及びGait ，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Ed．by M.J．Gait，35- 81，IRL Press，Washington，D.C．1984に記載されたようなものである。固相合成の最初の工程は、固体支持体、好ましくは気孔制御ガラス（controll ed pore glass，CPG）支持体へのヌクレオシドの結合である。ヌクレオシドは、ヌクレオシドの３′−ヒドロキシ位においてスクシネート結合を介してCPGに結合させるのが好ましい。ヌクレオシドを固体支持体に結合させる他の手段は公知であり、オリゴヌクレオチド合成技術の熟練者には容易にわかる。第１のヌクレオシドを固体支持体に結合させた後、５′−ヒドロキシ保護基の除去、ホスホルアミダイト試薬の存在下における５′−ヒドロキシ基の活性化、所望のヌクレオシドの添加、未反応ヌクレオシドのキャッピング及び燐結合の酸化という一連の工程によって、鎖伸張が起こる。結合したヌクレオシドの５′− ヒドロキシ位の保護基、好ましくはDMTは酸、好ましくはトリクロロ酢酸で除去する。この方法に従って使用できる活性化試薬は当業者にはよく知られたものである。好ましい活性化試薬は、テトラゾール及び活性化因子金である（Beckman Inst r．Inc.，Palo Alto，CA）。活性化工程は、添加したヌクレオシド及びトリチルジオールシアノホスフィン化合物の存在下で起こり、トリチルジオールシアノホスフィン化合物は常用の合成法のヌクレオシドホスホルアミダイトに代わるものである。未反応鎖は終了させるか、または無水酢酸及びＮ−メチルイミダゾールのようなキャッピング試薬でキャッピングする。不安定な三価燐（phosphorus）結合は、好ましくはヨウ素によって、オリゴヌクレオチドの安定な五価ホスホジエステル結合に酸化する。所期のオリゴヌクレオチド鎖アセンブリーが完成後、燐酸保護基を除去し、鎖を固体支持体から分離し、塩基保護基を常法によって除去する。（Gaits，上記、67〜70）。本発明の化合物は、遺伝子発現メカニズムの変化に伴う遺伝疾患または遺伝病を持つ哺乳類の治療に有用である。このような疾病の例は、HIV、サイトメガロウィルス、単純ヘルペス、Ｂ型肝炎、パピローマウィルス及びピコルナウィルスのようなウィルス感染；肺、結腸、子宮頸、乳房及び卵巣の癌；炎症性疾患；ならびに免疫系の疾患、たとえば、後天性免疫不全症候群（AIDS）、血液腫瘍及び過増殖性疾患である。〔Armstrong，上記、89；Klausner，Biotechnology 8，30 3，304（1990）〕。本発明のオリゴマーの製造に必要な式IIの保護プリンヌクレオシドは、Seela and Kehne（1987）前記；Seela and Kehne，Tetrahedron 41（22），5387-5892 （1985）；Seela and Driller（1989）前記；ならびにSeela and Driller（1985 ）前記に記載された方法によって製造でき、これらの方法は、式Ｉａ及びＩｂの未保護ヌクレオシドまたはアデニン、グアニンもしくはシトシンの未保護７−デアザプリンヌクレオシド中の未保護アミノ基のベンゾイル化、５′−ジメトキシトリチルエーテルの形成、ならびに生成物の３−ホスホルアミダイトへの転化を含む。式Ｉａ及び式Ｉｂの対応する未保護７−デアザプリンヌクレオシドは、Se ela and Kehne（1987）前記、Seela and Driller（1989）前記、Tran-Thi前記、 Seela and Driller（1985）前記、Winkeler and Seela（1983）前記、Wink eler and Seela（1984）前記、ならびにSeela and Kehne（1983）前記によって記載された方法によって製造できる。７−デアザ−２′−デオキシ−７−低級アルキルアデニン（式Ｉａ、Ｒ₂＝Ｈ）は以下の反応式によって製造できる。前記反応式において、Ｒ₇は低級アルキルであり、且つTolはｐ−トルオイル基である。前述のように、６−アミノ−２−チオウラシル（III）は、有機溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（以下において、DMF）またはアセトン中で塩基、例えば、アルカリ金属炭酸塩の存在下において、アルキル化剤、例えば、硫酸ジメチル、臭化メチルまたはヨウ化メチルで処理する。得られた２−メチルチオ−４− アミノ−６−ヒドロキシピリミジン（IV）は、前記のWinkeler and Seela（1984 ）に記載された方法を用いて、以下のようにして式VIIの化合物に転化する：アルカリ金属炭酸塩及びテトラ低級アルキルアンモニウムハライドの存在下において式IVの化合物を適当な２−クロロ低級アルカナールと反応させ、式Ｖの得られた４−ヒドロキシ−２−メチルチオ−５−低級アルキル−７Ｈ−ピロロ〔２，３ −ｄ〕ピリミジンを対応する式VIの４−クロロ−２−メチルチオ−５−低級アルキル−７Ｈ−ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンに転化し、式VIの化合物を塩基の存在下において１−クロロ−２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（ｐ−トルオイル）−α−Ｄ−エリスローペントフラノースを反応させて、式VIIの４−クロロ− ２−メチルチオ−５−低級アルキル−７−〔２′−デオキシ−３′，５′−ジ− Ｏ−（ｐ−トルオイル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル〕−７Ｈ−ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンを生成する。次いで、反応条件下において不活性な適当な有機溶媒、例えば、低級アルカノール中の式VIIの化合物を、オートクレーブ中でアンモニアと共に加熱して、式VIIIの４−アミノ−２−メチルチオ−５ −低級アルキル−７−〔２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル〕−７Ｈ−ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン（あるいは、９−β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシル−２−メチルチオ−７−デアザ−７−低級アルキルアデニン）を生成する。不活性有機溶媒、例えば、低級アルカノール中の式VIIIの化合物をラネーニッケル上において還元的デチオメチル化して、式Ｉａ（Ｒ′₂は水素である）の目的とする９−β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシル−７−デアザ−７−低級アルキルアデニンを生成する。この化合物は、前述のようにして式 IIの保護７−デアザ−７−低級アルキルアデニンに転化できる。同様にして、以下の反応式によって、式Ｉｂの９−β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシル−７−デアザ−７−低級アルキルグアニンを製造できる：次いで、これらは、前述のようにして、式IIの９−β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシル−７−デアザ−７−低級アルキルグアニンに転化できる。本発明の医薬組成物は、本発明の１種またはそれ以上の化合物を１種またはそれ以上の無毒性の生理的に許容され得る担体、補助剤または賦形剤（本明細書中においてはこれらをひとまとめにして担体と称する）と共に非経口注射用、固体または液体の形態の経口投与用、直腸または局所投与用などの組成物に製剤化したものを含む。組成物は、ヒト及び動物に経口、直腸、非経口（静脈内、筋肉内または皮下）、槽内、膣内、腹腔内、局所（散剤、軟膏剤または点滴剤）投与することもできるし、頬または鼻用噴霧剤として投与することもできる。非経口注射に適当な組成物は、生理的に許容され得る水性または非水性の滅菌溶液、分散液、懸濁液または乳濁液及び滅菌注射溶液もしくは分散液に再構成される滅菌散剤を含むことができる。適当な水性及び非水性担体、希釈剤、溶剤または賦形剤の例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの適当な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒度の保持、及び界面活性剤の使用によって保持できる。これらの組成物はまた、補助剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散助剤を含むことができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実に防止できる。等張化剤、たとえば、糖、塩化ナトリウムなどを添加するのも望ましい。注射用剤形の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを用いれば可能である。望ましくは、また、分布をより有効にするためには、化合物は徐放出系または標的送達系、たとえば、ポリマーマトリックス、リポソーム及び微小球に取り込ませることもできる。それらは、例えば、細菌固定フィルターを通して濾過することによって、または、使用直前に滅菌水もしくは他のいくつかの滅菌注射用基材中に溶解できる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を取り入れることによって滅菌できる。経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤及び顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形の場合には、活性化合物は、少なくとも１種の常用の不活性賦形剤（または担体）、たとえは、クエン酸ナトリウムもしくは燐酸二カルシウムまたは（ａ）充填剤または増量剤、例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び珪酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及びアラビアゴム、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、たとえば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種の複合珪酸塩及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール、（ｈ）吸着剤、たとえば、カオリン及びベントナイト、ならびに（ｉ）滑沢剤、たとえば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムまたはそれらの混合物と混合する。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合には、剤形はさらに緩衝剤を含むことができる。化合物の分子構造は、nmr、赤外及び質量スペクトルの研究に基づいて確認し、それらの純度はHPLC及びそれらの元素に関する化学分析によって確認した。ヌクレアーゼ安定性本発明に従って修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それらの安定性に関して、20mM HEPES緩衝液を含むRPMI 1640細胞培養培地（完全培地）中で1 0％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（FBS）の存在下において評価した。FBS及びヒト血清は、３′→５′エクソヌクレアーゼ活性を示すことが知られている。これは、 FBS、ヒト血清及びヒト血漿中で検出することができた唯一のヌクレアーゼ活性である。オリゴヌクレオチドサンプルを完全培地中で37℃において６時間にわたってインキュベートし、出発化合物の量を、HPLCに基づく方法を用いて測定した。DNA／DNAデュプレックス融解温度の測定 Warsaw，Cantor，and Tinoco〔CRC Handbook of Biochemistryand Molecular Biology（G.D．Fasman，editor）1：589（1975）〕によって提示された方法及び値を用いて計算された260nmにおける吸光係数を用いて、オリゴヌクレオチド濃度を分光光度法によって測定した。等モル濃度のオリゴヌクレオチドとその相補的配列を合し（0.1mM EDTA、10mM燐酸ナトリウム、0.1 Ｍ NaCl、pH 7.0中）、8 0℃に加熱し、室温で徐々に冷却させた。サンプルを室温に約2.5時間放置した。次いで、サンプルをサーモスタット制御ヒートブロック中で0.5℃／分（25℃〜7 5℃）の速度で加熱し、Perkin Elmer Lambda 4C UV分光光度計を用いて260nmにおいて吸光度を監視した。Ａ₂₆₀測定値を15秒毎に取った。データを、RS／１データ分析ソフトウェアを用いる、データ分析用のDEC VAXに移した。dA260／dT対温度のプロットからTmを求めた。TmはdA260／dTが極大である温度である。ウサギα−グロビンmRNA翻訳の阻害アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加による、ウサギグロビン mRNA（Bethesda Res．Labs，Gaithersburg，MD）＋／−6.5単位／５μＬ E．col i RNase H（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）の無細胞翻訳を、ウサギ網状赤血球ライセート（Promega，Madison，WI）を総容量50μＬで用いて実施した。各翻訳反応に35Ｓ−メチオニン（New England Nuclear，Boston，MA）25μC iを添加した。翻訳を30℃において10分間インキュベートし、次いで、サンプルをドライアイス上でスナップフリーズした。α及びβグロビン鎖を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離した。電気泳動緩衝液（0.1Ｍ燐酸ナトリウム、pH 7.2、SDS 1.0ｇ／Ｌ含有）を用いて15cmのゲルを調製した。それらは、アクリルアミド12.5％及びビスアクリルアミド0.6％を含んでいた。翻訳反応のアリコート（１μＬ）を、電気泳動緩衝液、２−メルカプトエタノール1. 1％、グリセロール2.5％及びブロモフェノールブルーからなるローディング緩衝液11μＬで希釈した。サンプルを100℃に３分間加熱することによって変性させてから、ゲル上にローディングした。ゲルを用いて30mAMPにおいて18時間実験した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーで染色し、乾燥させ、−70℃において 16時間、オートラジオグラフィーを行った。 α−グロビンの合成に対するα−グロビンに関連したアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の定量を、AT&T PC6300 コンピュータに連結されたUltrascan XL レーザーデンシトメーター（LKB／Bromma）を用いてオートラジオグラフを走査することによって行った。データを採取し、表示し、Gelscan XLデータ分析ソフトウェアパッケージ（LKB／Bromma）を用いて積分した。オリゴマーの蛋白合成に対する作用を、対照αグロビン合成のパーセントとして表した。以下の例は本発明をさらに説明するものであるが、本発明を限定するものではない。長さ及び配列が異なるオリゴヌクレオチドを製造するために、開示された実施態様を標準方法によって容易に修正できることは当業者ならばわかるであろう。合成の標的は通常、ヌクレアーゼ分解から保護すべき配列中またはブロックすべき配列に相補的な配列中において式ＩａまたはＩｂの７−デアザアデニンまたは７−デアザグアニンヌクレオシドを代わりに用いることによって選択するものとする。保護ヌクレオシドの合成製造１ 60％水素化ナトリウム0.8ｇ（20ミリモル）のヘキサン分散液中攪拌懸濁液をデカントし、乾燥させ、乾燥アセトニトリル100ml中に再懸濁させ、懸濁液を４ −クロロ−５−メチル−２−メチルチオピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン3.21ｇ（15ミリモル）で処理した〔Kondo et al.，Agric．Biol．Chem．4（8），1501- 1507（1977）〕。混合物を室温で窒素下において１時間攪拌した後、少しずつ添加した１−クロロ−２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（ｐ−トルオイル）−α− Ｄ−エリスロペントフラノース 5.9ｇ（15ミリモル）で処理した。アセトニトリルをさらに40ml添加し、混合物を50℃において約３時間半、攪拌し、次いで、濾過し、固体をアセトニトリルで洗浄し、乾燥させて、４−クロロ−５−メチル− ２−メチルチオ−７−〔α−Ｄ−エリスロペントフラノシル〕ピロロ〔２，３− ｄ〕ピリミジン 6.1ｇ（72％）を得た（m.p．163〜163.5℃）。この化合物（11.0ｇ、19.4ミリモル）を、アンモニアで飽和された無水メタノールの溶液225ml中に懸濁させ、混合物をオートクレーブ中で125℃において19時間、攪拌しながら加熱した。反応混合物を氷／水浴中で冷却し、減圧乾固させ、残渣をジエチルエーテル、クロロホルム及びアセトンで順次こね、固体を採取し、乾燥させて、４−アミノ−５−メチル−２−メチルチオ−７−〔α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル〕ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン 2.65ｇ（45％）を得た（m.p．187〜189℃）。ｎ−プロパノール45ml中に懸濁させた生成物（0.47ｇ、1.5ミリモル）を湿潤ラネーニッケル3.1ｇで処理し、混合物を７時間半、還流させながら加熱し、次いで、冷却し、濾過した。濾液を乾固させ、残渣を水から再結晶させて、７−デアザ−２′−デオキシ−７−メチルアデノシン 0.26ｇ（72％）を得た（m.p．213 .5〜214.5℃）。乾燥ピリジン 8.5ml中の生成物0.22ｇ（0.83ミリモル）の懸濁液を氷／メタノール浴中で冷却した後、数分間にわたってトリメチルクロロシラン0.5ml（約５当量）を滴下して処理した。混合物を塩化ベンゾイル約 0.5mlで処理し、室温で窒素下において約２時間攪拌し、氷浴中で再び冷却し、水1.65ml及び濃水酸化アンモニウム 1.7mlで処理し、周囲温度で窒素下において約30分間攪拌し、次いで、乾固させた。粗製生成物を水、次いで、シクロヘキサンでこねて、６−ジベンゾイル−７−デアザ−２′−デオキシ−７−メチルアデノシン 0.4ｇを生成した。この化合物 6.5ｇ（11.35ミリモル）を、エタノール中１Ｎ水酸化ナトリウムの50％溶液 200mlで処理してから、２Ｎ塩酸で酸性にすることによって加水分解して、モノ６−ベンゾイル−７−デアザ−２′−デオキシ−７−メチルアデノシンを生成した。こうして生成物が3.61ｇ（86％）得られた（m.p．172〜175℃）。乾燥ピリジン約50ml中のこの化合物（1.75ｇ、4.75ミリモル）を４，４′−ジメトキシトリチルクロリド1.86ｇ（5.23ミリモル）で処理し、混合物を周囲温度で窒素下において約４時間攪拌し、メタノール17mLを添加してから、減圧乾固させた。生成物をシリカゲル上のクロマトグラフィーで精製し、生成物をクロロホルム中３％メタノールで溶離させた。こうして、６−ベンゾイル−７−デアザ−２′−デオキシ−７−メチル−５′−ジメトキシトリチルアデノシン 1.97ｇ（62％）が得られた（m.p．112〜115℃）。生成物 0.9ｇ（1.3ミリモル）の乾燥 THF 7.5ml中溶液をジイソプロピルアミン 1.0ml（5.7ミリモル）で処理し、窒素下で攪拌しながら約40分間にわたってクロロ−β−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン 1.0ml （4.5ミリモル）を滴下しながら、この溶液を処理した。次いで、混合物を周囲温度で窒素下において約40分間攪拌し、減圧乾固させて、粗製生成物を得た。この粗製生成物をシリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製し、生成物をヘリウム飽和酢酸エチルで溶離させた。こうして、６−ベンゾイル−７−デアザ− ２′−デオキシ−７−メチル−３′−Ｏ−〔（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ） −β−シアノエトキシホスファニル〕−５′−ジメトキシトリチルアデノシン 0. 62ｇ（55％）が得られた（m.p.73〜76℃）。製造２製造１に記載した４−クロロ−５−メチル−２−メチルチオ−７−（α−Ｄ− エリスロ−ペントフラノシル）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンとDMF中ナトリウム２−プロペニルオキシドとの反応によって、５−メチル−２−メチルチオ− ４−（２−プロペニルオキシ）−７−（α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンを生成する。これを塩化メチレン中２モル当量の３−クロロ過安息香酸で酸化して、５−メチル−２−メチルスルホニル−４− （２−プロペニルオキシ）−７−（α−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンを生成する。この生成物とヒドラジンとを反応させて、５−メチル−２−ヒドラジノ−４−（２−プロペニルオキシ）−７−（α− Ｄ−エリスロ −ペントフラノシル）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンを生成する。この生成物を、例えば、ラネーニッケルで還元させて、７−デアザ−２′−デオキシ−７− メチルグアノシンを生成する。前記製造１に記載したのと同様な手順で、この７−デアザ−２′−デオキシ− ７−メチルグアノシンを、最初にピリジンの存在下でトリメチルクロロシランで、次に、無水イソ酪酸で、次いで、濃水酸化アンモニウムで順次処理して、２− イソブチリル−７−デアザ−２′−デオキシ−７−メチルグアノシンを生成する、これを乾燥ピリジンの存在下で１モル当量の塩化トリチルと反応させて、２− イソブチリル−７−デアザ−２′−デオキシ−７−メチル−５′−トリチルグアノシンを生成する。これを１モル当量のクロロ−β−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ− ジイソプロピルアミノホスフィンと反応させて、２−イソブチリル−７−デアザ −２′−デオキシ−７−メチル−３′−Ｏ−〔（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスファニル〕−５′−トリチルグアノシンを生成する。オリゴマーの製造例１〜８以下の例１〜８のオリゴマー及び対照サンプルを、Applied Biosystems model 380B DNA合成装置上で標準法を用いて合成して、下記のDNA オリゴマーを生成した。全ての無事完了したカップリングにおいて、適当な保護ヌクレオシドモノマーを10倍過剰で用いた。例中、アルファベットＡ，Ｇ，Ｗ，Ｘ，Ｃ及びＴは以下の核酸塩基を意味する：Ａ：アデニンＧ：グアニンＷ：７−デアザアデニンＸ：７−メチル−７−デアザアデニンＣ：シトシンＴ：チミン前記各オリゴマーに関して融解温度を、以下の表２に示す。本発明のオリゴマーの３−エクソヌクレアーゼに対する安定性を、対照に比較して、以下の表３に示す。例６のオリゴマーは、RNase Hの不存在下では対照の13±４％、RNase Hの存在下では５±１％まで翻訳を阻害することが判明した。これに比べて、対応する未修飾のオリゴマーはRNase Hの不存在下で対照の21±４％、RNase H の存在下で1 4％まで翻訳を阻害した。

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｉａの７−デアザアデニンもしくは７−デアザ−７−低級アルキルアデニンヌクレオシドまたは式Ｉｂの７−デアザグアニンもしくは７−デアザ−７− 低級アルキルグアニンヌクレオシドから誘導された１種またはそれ以上のヌクレオチドを含む６〜200個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列：〔式中、Ｒ′₂は水素またはヒドロキシであり；且つＲ₇は水素または低級アルキルである〕であるが、（１）EcoRＩエンドヌクレアーゼ認識部位及び（２）反復GCまたはCG 配列を含まないオリゴヌクレオチド配列。２．Ｒ′₂及びＲ₇が水素であるか；Ｒ′₂がヒドロキシであり且つＲ₇が水素であるか；Ｒ′₂が水素であり且つＲ₇が低級アルキルであるか；またはＲ′₂がヒドロキシであり且つＲ₇が低級アルキルである式Ｉａのヌクレオシドから誘導されるヌクレオチド、ならびにＲ′₂及びＲ₇が水素であるか；Ｒ′₂がヒドロキシであり且つＲ₇が水素であるか；Ｒ′₂がヒドロキシであり且つＲ₇が低級アルキルであるか；またはＲ′₂が水素であり且つＲ₇が低級アルキルである式Ｉｂのヌクレオシドから誘導されるヌクレオチドである請求の範囲第１項に係るオリゴヌクレオチド。３．Ｒ′₂が水素である請求の範囲第２項に係るオリゴヌクレオチド。４．Ｒ′₂がヒドロキシである請求の範囲第２項に係るオリゴヌクレオチド。５．12〜24個の塩基を含む請求の範囲第３項に係るオリゴヌクレオチド。６．15個の塩基を含む請求の範囲第５項に係るオリゴヌクレオチド。７．12〜24個の塩基を含む請求の範囲第４項に係るオリゴヌクレオチド。８．15個の塩基を含む請求の範囲第７項に係るオリゴヌクレオチド。９．オリゴマーの３′及び５′−末端のいずれかまたは両者の３個のヌクレオチド単位内に修飾プリンヌクレオシドが取り込まれた請求の範囲第６項に係るオリゴヌクレオチド。 10．オリゴマーの３′及び５′−末端のいずれかまたは両者の３個のヌクレオチド単位内に修飾プリンヌクレオシドが取り込まれた請求の範囲第８項に係るオリゴヌクレオチド。 11．オリゴマーの３′及び５′−末端のいずれかもしくは両者の３個のヌクレオチド単位内に、またはオリゴマーのヌクレオチド配列の内部に修飾プリンヌクレオシドが取り込まれた請求の範囲第６項に係るオリゴヌクレオチド。 12．オリゴマーの３′及び５′−末端のいずれかもしくは両者の３個のヌクレオチド単位内に、またはオリゴマーのヌクレオチド配列の内部に修飾プリンヌクレオシドが取り込まれた請求の範囲第８項に係るオリゴヌクレオチド。 13．AAA AAA AAA AAA AWA AAA AAA AAA AAA WWA AAA AAA AAA AAA AXA AAA AAA AAA AAA XXA AAA AAA AAA AAA XAA 〔式中、Ａはアデニンであり、Ｗは７−デアザアデニンであり、Ｘは７−メチル −７−デアザアデニンである〕からなる群から選ばれる請求の範囲第９項に係るオリゴヌクレオチド。 14．XXC GTT GXG GGG CXT CCT TCT CXG TCG GXT WWC GTT GWG GGG CWT 〔式中、Ｇはグアニンであり；Ｗは７−デアザアデニンであり；Ｘは７−メチル７−デアザアデニンであり；Ｃはシトシンであり；且つＴはチミンである〕からなる群から選ばれる請求の範囲第11項に係るオリゴヌクレオチド。 15．オリゴヌクレオチド内に、請求の範囲第１項に係る修飾７−デアザアデニンまたは７−デアザグアニンヌクレオシドを取り込ませることを含んでなる、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解の阻害方法。 16．細胞系に、有効量の請求の範囲第１項に係るオリゴヌクレオチドを導入することを含んでなる、細胞系における遺伝子発現の抑制方法。 17．医薬として許容され得る担体中に請求の範囲第１項に係るオリゴヌクレオチドを含んでなる遺伝子発現抑制用組成物。