ES2244957T3 - Oligonucleotidos modificados, su preparacion, asi como su empleo. - Google Patents

Oligonucleotidos modificados, su preparacion, asi como su empleo.

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ES2244957T3 ES95106230T ES95106230T ES2244957T3 ES 2244957 T3 ES2244957 T3 ES 2244957T3 ES 95106230 T ES95106230 T ES 95106230T ES 95106230 T ES95106230 T ES 95106230T ES 2244957 T3 ES2244957 T3 ES 2244957T3
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Abstract

Los oligonucleótidos según la invención presentan, en comparación con los oligonucleótidos naturales, una mejor afinidad de unión en la acumulación en ácidos nucleicos complementarios (ácidos nucleicos blanco). Para el uso terapéutico de estos oligonucleótidos es ventajoso cuando en ellos se pueden introducir modificaciones adicionales, por ejemplo de la espina dorsal del fosfato, la unidad de ribosa o los extremos del oligonucleótido. Por medio de modificaciones de la espina dorsal de azúcar-fosfato en sí conocidas, se protegen por ejemplo los oligonucleótidos según la invención aún mejor contra el ataque de nucleasas, lo cual es ventajoso. Por ello, se prefieren también compuestos de la fórmula I, en la que V, Y, Y¿ y W tienen el significado de tioxo, selenoxo, oxi, oxo, sulfandiílo, imino o metileno y U tiene el significado de hidroxi, mercapto o metilo. Se prefieren muy especialmente cuando R2 significa adicionalmente hidroxi o hidrógeno, en especial hidrógeno. Los compuestos de la fórmula I también representan una forma de realización preferida, en la que R1 y R 1a significan hidrógeno. Se prefieren muy especialmente compuestos de la fórmula I, en los que R 1 y/o R 1a es hidrógeno, R 2 es hidroxi o hidrógeno, U es hidroxi o mercapto y V, Y, Y¿ y W tienen el significado de tioxo, oxi, oxo o hidroxi.

Description

Oligonucleótidos modificados, su preparación, así como su empleo.
La presente invención se refiere a nuevos oligonucleótidos que contienen bases modificadas con valiosas propiedades físicas, biológicas y farmacológicas, a un procedimiento para su preparación, así como a su uso como inhibidores de la expresión genética (oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos en el sentido del marco de lectura y oligonucleótidos formadores de tríplex), como sondas para la detección de ácidos nucleicos, como agentes auxiliares en la biología molecular y como medicamento o agente de diagnóstico.
De la bibliografía se conocen numerosas modificaciones químicas de oligonucleótidos. Estas modificaciones pueden afectar la estructura azúcar-fosfato o las nucleobases. Por ejemplo, Uhlmann & Peyman, Chem. Rev. 1990, 90, 543 y Milligan et al., J. Med. Chem. 1993, 36, 1923, brindan una síntesis sobre el estado de la técnica.
Una modificación química de oligonucleótidos es generalmente necesaria, ya que los oligonucleótidos no modificados se degradan muy rápidamente por medio de las actividades nucleolíticas, tanto en las células como en el medio de cultivo celular. La estabilización contra la degradación nucleolítica puede realizarse por reemplazo de la espina dorsal fosfato-azúcar o por modificación del puente fosfato, del componente del azúcar o la nucleobase [Milligan et al., supra y Uhlmann & Peyman, supra].
Además de las modificaciones que llevan a oligonucleótidos con una mayor estabilidad frente a la degradación nucleolítica, resultan de interés modificaciones que alteran el comportamiento de hibridación de los oligonucleótidos modificados de modo que puedan formar, por ejemplo, complejos de hibridación más estables (dúplex) con ácidos nucleicos intracelulares (los así llamados ácidos nucleicos blanco). Una modificación de las propiedades de hibridación de oligonucleótidos es posible, por ejemplo, por modificación de las bases. Las propiedades de hibridación alteradas de estos oligonucleótidos modificados pueden reconocerse, por ejemplo, en la temperatura de fusión modificada (valor T_{m}) de los dúplex, en comparación con los oligonucleótidos no modificados.
De esta manera, en la solicitud de PCT WO 92/002258 se describen oligonucleótidos modificados con pirimidina, pero que, sin embargo, no presentan una afinidad de unión elevada, sino reducida respecto de los ácidos nucleicos blanco mono- y bicatenarios. Sin embargo, de la solicitud de PCT WO 93/10820 también se conocen oligonucleótidos que contienen bases de uracilo y citosina modificadas y que pueden formar, en comparación con los oligonucleótidos no modificados, estructuras de dúplex o tríplex más estables con los ácidos nucleicos blanco. Las propiedades de hibridación de dodecameroligonucleótidos sintéticos, que contienen el análogo de base piridopirimidina, también fueron probadas [Inoue et al. (1985), Nucleic Acid Res., 13, 7119-7129]. También se describieron mejores propiedades de hibridación para oligonucleótidos que contienen el análogo de base 2-aminoadenina [Chollet et al. (1988), Nucleic Acid Research, 16, 305-317]. Dr. Grünberger et al., Biochimica Biophysica Acta, volumen 161, N.º 1, 1968, páginas 147-155, divulga (pág. 149, tabla 1; resumen) 3',5'-di- y trinucleótidos modificados que contienen bases de 8-azapurina.
Por ello, es objeto de la presente invención poner a disposición nuevos oligonucleótidos con ventajosas propiedades.
Sorprendentemente, se halló que los oligonucleótidos que contienen al menos una base de 8-aza-purina, por ejemplo 8-azaguanina o 8-azaadenina, forman complejos de hibridación con los ácidos nucleicos blanco claramente más estables que los oligonucleótidos comparables, que presentan bases de purina no modificadas.
De esta manera, la invención se refiere a oligonucleótidos de la fórmula I
1
así como a sus sales fisiológicamente tolerables, en la que significan
R^{1}
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{2}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{2}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{3}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), un grupo protector usual en la química de los nucleótidos o un radical de la fórmula IIa
(IIa)Z --- 
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\para}
--- Z'
R^{1a}
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{2}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{2}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{3}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}) o un radical de la fórmula IIb
(IIb)Z --- 
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\para}
--- X
R^{2}
hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{18}, alqueniloxi C_{1}-C_{6}, halógeno, azido o NH_{2};
a
oxi o metileno;
n
un número entero de 3 a 99;
W
oxo, tioxo o selenoxo;
V
oxi, sulfandiílo o imino;
Y
oxi, sulfandiílo, imino o metileno;
Y'
oxi, sulfandiílo, imino, (CH_{2})_{m} o V(CH_{2})_{m}, en donde significan
m
un número entero de 1 a 18;
X
hidroxi o mercapto;
U
hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{8}, alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), NHR^{3}, NR^{3}R^{4} o un radical de la fórmula III
(III),(OCH_{2}CH_{2})_{p}O(CH_{2})_{q}CH_{2}R^{5}
\quad
en la que significan
R^{3}
alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), 2-(CH_{2})_{c}-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{6}R^{6}, en donde c es un número entero de 2 a 6 y d es un número entero de 0 a 6, y R^{6} es, de modo independiente entre sí, hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6} o alcoxi C_{1}-C_{4}-alquilo C_{1}-C_{6};
R^{4}
alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20} o aril (C_{6}-C_{10})-alquilo (C_{1}-C_{8}) o en el caso de NR^{3}R^{4} junto con R^{3} y el átomo de nitrógeno que llevan un anillo heterocíclico de 5-6 miembros que adicionalmente puede contener otro heteroátomo de la serie de O, S, N,
p
un número entero de 1 a 100,
q
un número entero de 0 a 22,
R^{5}
hidrógeno o un grupo funcional como, por ejemplo, hidroxi, amino, alquilamino C_{1}-C_{18}, COOH, CONH_{2}, COO-alquilo (C_{1}-C_{4}) o halógeno;
Z y Z' de modo independiente entre sí,
\quad
hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{22}, -O-(CH_{2})_{b}-NR^{6}R^{7}, en donde b es un número entero de 1 a 6, y R^{7} es alquilo C_{1}-C_{6} o R^{6} y R^{7} junto con el átomo de nitrógeno que llevan forman un anillo de 3-6 miembros, alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), aril (C_{6}-C_{14})-alcoxi (C_{1}-C_{8}), en donde arilo también significa heteroarilo y arilo está eventualmente sustituido con 1, 2 ó 3 radicales iguales o diferentes de la serie de carboxi, amino, nitro, alquilamino C_{1}-C_{4}, alcoxi C_{1}-C_{6}, hidroxi, halógeno y ciano, alquilmercapto C_{1}-C_{18}, NHR^{3}, NR^{3}R^{4}, un radical de la fórmula III o un
\quad
grupo que favorece la absorción intracelular o que sirve como marcación de una sonda de ADN o en la hibridación del análogo de oligonucleótido en el ácido nucleico blanco lo ataca bajo unión, reticulación con enlaces cruzados o separación,
\quad
en donde cada nucleótido puede estar presente en su configuración D o L y la base B se puede hallar en posición \alpha o \beta, en donde
B
es, de modo independiente entre sí, una base usual en la química de los nucleótidos, por ejemplo bases naturales tales como adenina, citosina, timina, guanina, uracilo, hipoxantina o bases no naturales tales como, por ejemplo, purina, 8-azapurina, 2,6-diaminopurina, 7-desazaadenina, 7-desazaguanina, N^{4}N^{4}etancitosina, N^{6}N^{6}-etano-2,6-diaminopurina, pseudoisocitosina, 5-metilcitosina, 5-fluoruracilo, 5-alquinil (C_{3}-C_{6})-uracilo, 5-alquinil (C_{3}-C_{6})-citosina, en donde al menos una B significa una base de la fórmula IV
2
en la que E y F significan, de modo independiente entre sí, H, OH o NH_{2}.
Se prefieren compuestos de la fórmula I, en la que E es igual a NH_{2} y F es igual a OH o E es igual a H y F es igual a NH_{2}.
Se prefieren especialmente compuestos de la fórmula I, en la que E es igual a NH_{2} y F es igual a OH.
También se prefieren compuestos de la fórmula I, en los que la base se halla en el azúcar en posición \beta, los nucleósidos en la configuración D, R^{2} está en posición 2' y a es oxi.
Los oligonucleótidos según la invención presentan, en comparación con los oligonucleótidos naturales, una mejor afinidad de unión en la acumulación en ácidos nucleicos complementarios (ácidos nucleicos blanco). Para el uso terapéutico de estos oligonucleótidos es ventajoso cuando en ellos se pueden introducir modificaciones adicionales, por ejemplo de la espina dorsal del fosfato, la unidad de ribosa o los extremos del oligonucleótido (J. S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology 12 (1989) Macmillan Press, E. Uhlmann et al., supra].
Por medio de modificaciones de la espina dorsal de azúcar-fosfato en sí conocidas, se protegen por ejemplo los oligonucleótidos según la invención aún mejor contra el ataque de nucleasas, lo cual es ventajoso.
Por ello, se prefieren también compuestos de la fórmula I, en la que V, Y, Y' y W tienen el significado de tioxo, selenoxo, oxi, oxo, sulfandiílo, imino o metileno y U tiene el significado de hidroxi, mercapto o metilo. Se prefieren muy especialmente cuando R^{2} significa adicionalmente hidroxi o hidrógeno, en especial hidrógeno.
Los compuestos de la fórmula I también representan una forma de realización preferida, en la que R^{1} y R^{1a} significan hidrógeno.
Se prefieren muy especialmente compuestos de la fórmula I, en los que R^{1} y/o R^{1a} es hidrógeno, R^{2} es hidroxi o hidrógeno, U es hidroxi o mercapto y V, Y, Y' y W tienen el significado de tioxo, oxi, oxo o hidroxi.
Por grupos protectores usuales en la química de los nucleótidos se entienden, por ejemplo, grupos amino, hidroxilo u otros grupos protectores, tal como se describen en [E. Sonveaux, 1986, Bioorganic Chemistry, 14, 274-325 o S. L. Beaucage et al., 1992, Tetrahedron, 48, 2223-2311].
Alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser de cadena lineal o ramificada.
Por cicloalquilo también se entienden anillos sustituidos con alquilo.
Arilo (C_{6}-C_{20}) es, por ejemplo, fenilo, naftilo o bifenilo, con preferencia fenilo.
Por heteroarilo se entienden en especial radicales que derivan de fenilo o naftilo, en los que uno o varios grupos CH están reemplazados por N y/o en los que al menos dos grupos CH adyacentes (con formación de un anillo aromático de cinco miembros) están reemplazados por S, NH u O. Además, también uno o ambos átomos del sitio de condensación de radicales bicíclicos (como en el indolizinilo) pueden ser átomos de N.
Como heteroarilo son válidos en especial furanilo, tienilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, indazolilo, quinolilo, isoquinolilo, ftalazinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo.
Por sales fisiológicamente tolerables de compuestos de la fórmula (I) se entienden tanto sales inorgánicas como sales orgánicas, tal como se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (17.ª edición, página 1418 (1985)).
En virtud de la estabilidad física y química y la solubilidad, se prefieren para grupos ácidos, sobre todo, sales de sodio, de potasio, de calcio y de amonio.
La invención no se limita a \alpha-, \beta-D- o L-ribofuranósidos, \alpha- y \beta-D- o L-desoxirribofuranósidos y análogos carbocíclicos de cinco anillos correspondientes, sino que también rige para análogos de oligonucleótidos que están compuestos por otros componentes se azúcares, por ejemplo, derivados de xilo- y arabinofuranosa, azúcares con anillos ampliados o reducidos, derivados de azúcares acíclicos, en puente u otros apropiados de una manera diferente. La invención tampoco se limita a los derivados del radical fosfato enumerado a modo de ejemplo en la fórmula I, sino que también se refiere a los conocidos defosfo-derivados.
Los oligonucleótidos según la invención también se pueden modificar de su estructura natural de múltiples formas. Tales modificaciones, que se introducen de acuerdo con métodos conocidos en sí, son por ejemplo:
a) Modificaciones del puente fosfato
Se mencionan como ejemplos: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, boranofosfato, éster fosfatometílico, éster fosfatoetílico, fenilfosfonato. Modificaciones preferidas del puente fosfato son fosforotioato, fosforoditioato y metilfosfonato.
b) Reemplazo del puente fosfato
Se mencionan como ejemplos: reemplazo por formacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetilhidrazo, dimetilensulfona, grupos sililo. Se prefiere el reemplazo por formacetales y 3'-tioformacetales.
c) Modificaciones del azúcar
Se mencionan como ejemplos: azúcares \alpha-anoméricas, 2'-O-metilribosa, 2'-O-butilribosa, 2'-O-alilribosa, 2'-fluoro-2'-desoxirribosa, 2'-amino-2'-desoxirribosa, \alpha-arabinofuranosa, análogos carbocíclicos de azúcar. La modificación preferida es por 2'-O-metilribosa y 2'-O-n-butilribosa.
d) Modificaciones del azúcar y el puente fosfato
Se mencionan como ejemplos los ácidos nucleicos peptídicos (PNA), en los que la espina dorsal de azúcar / fosfato está reemplazada por una espina dorsal de aminoetilglicina, así como los oligómeros de morfolino en puente carbamato.
e) Otras modificaciones de las bases, en especial de las bases de pirimidina
Se mencionan como ejemplos: 5-propinil-2'-desoxiuridina, 5-propinil-2'-desoxicitidina, 5-hexinil-2'-desoxiuridina, 5-hexinil-2'-desoxicitidina, 5-fluoro-2'-desoxicitidina, 5-fluoro-2'-desoxiuridina, 5-hidroximetil-2'-desoxiuridina, 5-metil-2'-desoxicitidina, 5-bromo-2'-desoxicitidina. Modificaciones preferidas son 5-propinil-2'-desoxiuridina, 5-hexinil-2'-desoxiuridina, 5-hexinil-2'-desoxicitidina y 5-propinil-2'-desoxicitidina.
f) Inversiones 3'-3' y 5'-5' [por ejemplo, M. Koga et al., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757].
g) Conjugados 5' y 3'.
Grupos, que favorecen la absorción intracelular, son distintos radicales lipofílicos tales como -O-(CH_{2})_{x}-CH_{3}, en donde x es un número entero de 6 a 18, -O-(CH_{2})_{n}-CH=CH-(CH_{2})_{m}-CH_{3}, en donde n y m son, de modo independiente entre sí, un número entero de 6 a 12, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{4}-(CH_{2})_{9}-CH_{3}, O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}-(CH_{2})_{13}-CH_{3} y -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{7}-
(CH_{2})_{15}-CH_{3}, pero también radicales esteroides tales como colesterilo o radicales de vitaminas tales como vitamina E, vitamina A o vitamina D y otros conjugados que aprovechan los sistemas de portadores naturales tales como ácido biliar, ácido fólico, 2-(N-alquil, N-alcoxi)-aminoantraquinona y conjugados de manosa y péptidos de los correspondientes receptores que llevan a la endocitosis de los oligonucleótidos mediada por receptores como EGF (factor de crecimiento epidérmico), bradiquinina y PDGF (factor de crecimiento plaquetario). Por grupos de marcación se deben entender grupos fluorescentes, por ejemplo de dansil-(= N-dimetil-1-aminonaftil-5-sulfonilo), derivados de fluoresceína o cumarina o grupos quimioluminiscentes, por ejemplo de derivados de acridina, así como el sistema de digoxigenina detectable por medio de ELISA, el grupo biotina detectable por medio del sistema biotina / avidina o también brazos de ligadores con grupos funcionales que permiten una derivación posterior con grupos informantes detectables, por ejemplo un ligador de aminoalquilo que se hace reaccionar con un éster activado de acridinio para la prueba de quimioluminiscencia. Típicos grupos marcación son:
3
4
5 
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x = 2-18, preferentemente 4
R = H o alquilo C_{1}-C_{4}
(= "fluoresceína" para x = 4 y R = CH_{3})
6
Los análogos de oligonucleótidos que se unen a ácidos nucleicos o se intercalan y/o separan o reticulan con enlaces cruzados, contienen conjugados de acridina, psoraleno, fenantridina, naftoquinona, daunomicina o cloroetilaminoarilo. Típicos radicales intercalantes y con enlaces cruzados son:
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8
9 
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13
14 
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15
Se mencionan a título de ejemplo para los grupos NR^{3}R^{4}, en los que R^{3} y R^{4} forman juntos con el átomo de nitrógeno que los lleva un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros que adicionalmente contiene otro heteroátomo, el radical morfolinilo y el radical imidazolidinilo.
También es objeto de la invención el compuesto de la fórmula V
16
en la que significan
V
oxi, sulfandiílo o imino;
a
oxi o metileno;
R^{1}
un grupo protector usual en la química de los nucleótidos;
R^{1b}
un radical de la fórmula IIc o IId
U --- 
\uelm{P}{\para}
--- Q 
\hskip1cm
(IIc) 
\hskip3cm
O 
\biequal
\melm{\delm{\para}{H}}{P}{\para}
--- O^{\ominus} 
\hskip1cm
(IId)
en las que significan
U
O-R^{7} o S-R^{7};
Q
un radical -NR^{8}R^{9};
R^{7}
-(CH_{2})_{2}-CN;
R^{8} y R^{9} son iguales o diferentes y son alquilo C_{1}-C_{6}, en especial isopropilo o etilo o juntos con el átomo de nitrógeno que los lleva, significan un anillo heterocíclico de 5-9 miembros que adicionalmente puede contener otro heteroátomo de la serie de O, S, N, en especial
\vskip1.000000\baselineskip
17
E' y F' son, de modo independiente entre sí, H, OH o NR^{10}R^{11},
en donde
R^{10} y R^{11} son iguales o diferentes y son hidrógeno o un grupo protector de amino usual en la química de los nucleótidos o R^{10} y R^{11} forman juntos un grupo protector de amino usuales en la química de los nucleótidos,
R^{12}
un grupo protector de hidroxilo usual en la química de los nucleótidos, como por ejemplo t-butil-dimetil-sililo, tri-isopropil-sililo, o-nitro-bencilo, p-nitro-bencilo, tris(1-metiletil)sililo o 2-fluorofenil-4-metoxipiperidin-4-ilo (FPMP).
Una forma de realización preferida es representada por los compuestos de la fórmula (V), en los que V, Y^{b} y a son oxi, R^{2b} es hidrógeno u OR^{12}, en especial hidrógeno y R^{1b} es un radical de la fórmula (IIc) o (IId), en donde U es O(CH_{2})_{2}-CN y R^{8} y R^{9} son iguales o diferentes y significan isopropilo o etilo.
Se prefieren muy especialmente, en caso de que adicionalmente la base en el azúcar se halle en posición \beta y R^{2b} se halle en posición 2'.
También son objeto de la invención los compuestos de la fórmula V, en los que la unión con el radical del azúcar se realiza a través del átomo de N_{2} de la base de 8-azapurina.
Grupos protectores de amino preferidos son, por ejemplo, grupos protectores de acilo o amidina.
La invención también se refiere a compuestos de la fórmula VI
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\newpage
en la que, de modo independiente entre sí,
U' = U'' = U''' es igual a hidroxilo o mercapto;
e y f son 0 ó 1;
R^{13}
es hidrógeno u OH y
E y F son H, OH o NH_{2},
en donde se excluyen compuestos de la fórmula VI, en los que U', U'', U''', R^{13} y F significan OH, E es igual a NH_{2} y e y f significan 1.
Se prefieren compuestos de la fórmula VI, en los que U' significa hidroxilo o mercapto, U'' = U''' significa hidroxilo y e y/o f es igual a 1.
También se prefieren compuestos de la fórmula VI, en los que
E
es igual a H y F es igual a NH_{2} o, en caso de que E sea igual a NH_{2} y F sea igual a OH, R^{13} es igual a H o, en caso de que
E
sea igual a NH_{2} y F, R^{13}, U', U'' y U''' sean iguales a OH, e y/o f es igual a 0, o en caso de que
E
sea igual a NH_{2} y F, R^{13}, U'' y U''' sean iguales a OH y e y f sean iguales a 1, U' es igual a mercapto.
Los compuestos de la fórmula VI según la invención pueden usarse como agentes auxiliares en la biología molecular, por ejemplo en reacciones de PCR (e = f = 1, R^{13} = OH) o para la secuenciación (e = f = 1; R^{13} = H u OH).
La obtención de los compuestos de la fórmula VI es posible a partir de los correspondientes nucleósidos de 8-azapurina y se realiza de acuerdo con métodos de conocimiento general. Con preferencia, se pueden preparar los compuestos de la fórmula VI de acuerdo con un procedimiento abreviado de Ludwig, en un solo recipiente, en presencia de 1,8-bis(dimetilamino)naftalina y trimetilfosfato [J. Ludwig et al., (1981) Acta Biochem. Biophys. Sci. Hung, 16, 131].
La invención también comprende todas las formas tautoméricas de los compuestos de la fórmula I, V y VI, en especial todas las formas tautoméricas de las bases de 8-azapurina de la fórmula IV.
Además, es objeto de la invención un procedimiento para la preparación de los compuestos de la fórmula I según la invención.
Se describe la preparación de difosfatos de trirribonucleódisos que contienen 8-azaguanina por vía enzimática o química / enzimática [Grünberger et al., Biochim. Biophys. Acta, (1968) 161, 147-155]. Bodnar et al. describen la síntesis enzimática de ADN de fagos bicatenarios que contienen 8-azaguanina por medio de ADN-polimerasa [Bodnar et al. (1983) J. Biol. Chem., 258, 15206-15213].
Debido al hecho de que la unión N-glucosídica de 8-azadesoxiguanosina es extremadamente estable a los ácidos (Seela et al. (1993), Helv. Chim. Acta. 76, 2388-2397], para la preparación de los oligonucleótidos según la invención que contienen 8-azapurina se pueden aplicar las condiciones estándar usuales en la síntesis química de los oligonucleótidos.
La obtención de los compuestos de la fórmula I según la invención se realiza en disolución o preferentemente en fase sólida, eventualmente con la ayuda de un equipo de síntesis automático. La conformación de los oligómeros de la fórmula I se puede realizar por etapas, condensando sucesivamente un mononucleótido con una nucleobase en un soporte correspondientemente derivado o una cadena de oligómeros creciente.
La conformación de los oligonucleótidos se realiza de acuerdo con procedimientos conocidos por el especialista, como es el método de triésteres, el método de H-fosfonatos o el método de fosforamiditas, [E. Sonveaux (1986), Bioorganic Chemistry, 14, 274-325; S. L. Beaucage et al. (1992), Tetrahedron, 48, 2223-2311]. Para introducir los derivados de 8-azapurina se usan preferentemente los componentes monoméricos de nucleótidos de la fórmula V, con preferencia especial los de la fórmula V, en la que E' es igual a NR^{10}R^{11} y F' es igual a OH.
La preparación de los compuestos de la fórmula V como componentes para la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos puede realizarse a partir de los correspondientes nucleósidos de 8-azapurina. Después de introducir grupos protectores apropiados para los grupos amino de las bases de 8-azapurina, así como del grupo 5'-hidroxilo libre del azúcar, se convierten los monómeros en los correspondientes derivados de fosfonato o fosforamidita. La introducción de grupos protectores apropiados, por ejemplo en forma de un grupo protector de formamidina ((dimetilamino)metilideno) o grupo protector de acilo se realiza de acuerdo con métodos de conocimiento general [L. J. Mc Bride et al. (1983), Tetrahedron Lett., 24, 2953, G. S. Ti et al. (1982), J. Am. Chem. Soc., 104, 1316; H. Schaller et al. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85, 3821], siendo ventajosa, en el caso de la acilación del grupo amino, la aplicación del método de peracilación según Schaller. Un grupo protector apropiado para el grupo 5'-OH libre del azúcar es, por ejemplo, 4,4'-dimetoxitritilo, cuya introducción también se realiza por medio de métodos conocidos [C. B. Reese (1978), Tetrahedron, 34, 3143; D. Flockerzi et al. (1981), Liebigs Ann. Chem., 1568]. Los monómeros protegidos de esta manera pueden hacerse reaccionar conforme a una disposición de Froehler et al. respecto de los correspondientes fosfonatos [B. C. Froehler et al. (1986), Nucl. Acid Res., 14, 5399]. La preparación de derivados de cianoetil-fosforamidita se puede llevar a cabo, por ejemplo, por reacción de los monómeros con cloro-\beta-cianoetoxi-(N,N-diisopropilamino)fosfano en diclorometano anhidro [N. D. Sinha et al., (1984) Nucl. Acid Res., 12, 4539].
La síntesis de oligorribonucleótidos se dificulta en comparación con la síntesis de desoxiribooligonucleótidos por medio del grupo 2'-OH adicional. La primera dificultad consiste en hallar una combinación de grupos protectores de 2'- y 5'-OH compatibles. De esta manera, el radical en la posición O-2' en la síntesis de los oligonucleótidos debe ser estable frente a las condiciones ácidas de la hidrólisis de los grupos protectores de tritilo. Además, se deben evitar condiciones que podrían llevar a una migración del radical fosfato de la posición 3' a la posición 2'. En la introducción del grupo protector se pretende una reacción regioselectiva.
Es ventajoso para la síntesis de los oligorribonucleótidos de la fórmula (I) según la invención el uso de cloruro de triisopropilsililo como grupo protector de 2'-OH, con el cual se pueden lograr altas selectividades con suficiente estabilidad y moderadas condiciones de separación (TBAF / THF). La selectividad de la reacción se puede aumentar aún más si, en lugar de imidazol, se aplica nitrato de plata como catalizador [F. Seela, K. Mersmann, J. A. Grasby, M. J. Gait, Helv. Chim. Acta 1993, 76, 1809].
Para la síntesis en fase sólida de oligorribonucleótidos son menos apropiados los componentes de fosforamidita, contrariamente a la síntesis en fase sólida de los desoxirribonucleótidos. Esto se debe sobre todo a que el impedimento estérico de la fosforamidita reactiva requiere tiempos de acoplamiento relativamente largos por el grupo protector bloqueante de 2'-sililo (N. Usman, R. T. Pon, K. K. Ogilviee, Tetrahedron Lett., 1985, 26, 4567] y, además, ocasiona un menor rendimiento de acoplamiento. En comparación con las fosforamiditas, los fosfonatos de ribonucleósidos son estables frente a la hidrólisis y la oxidación y presentan en la síntesis de oligonucleótidos tiempos de ciclos relativamente cortos.
Los fosfonatos de ribonucleótidos según la invención pueden prepararse según una disposición de Froehler [B. Froehler, P. G. Nug, M. O. Mateuci, Nucl. Acids Res. 1986, 14, 5399].
La síntesis de compuestos de la fórmula I, cuya parte de oligonucleótido está modificada en el extremo 3' y/o en el extremo 5', se realiza, según estas modificaciones, de acuerdo con procedimientos descritos en el documento EP-A 0 552 766.
Además, es objeto de la invención el uso de compuestos de la fórmula I según la invención para preparar un medicamento, así como un procedimiento para preparar un medicamento, caracterizado porque se mezclan los oligonucleótidos según la invención con un portador fisiológicamente aceptable, así como eventualmente aditivos y/o coadyuvantes apropiados.
Muy en general, la presente invención se refiere al uso de compuestos de la fórmula I como componentes terapéuticamente efectivos de un medicamento. Por derivados de oligonucleótidos terapéuticamente efectivos se entienden en general oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos formadores de triples hélices, aptámeros o ribozimas, en especial oligonucleótidos antisentido.
Más allá de ello, otro objeto de la presente invención es el uso de oligonucleótidos con al menos una 8-azapurina, preferentemente con 8-azaguanina o 8-azaadenina como agente de diagnóstico, por ejemplo para la detección de la presencia o la ausencia o la cantidad de una molécula de ácido nucleico específica bicatenaria o monocatenaria en una sonda biológica.
Los oligonucleótidos tienen, para el uso según la invención, una longitud de 4 a 100, preferentemente de aproximadamente 5-40, en especial de aproximadamente 6-30 nucleótidos. Por lo demás, aquí también rigen los intervalos de preferencia, las modificaciones o conjugaciones antes mencionados.
Los medicamentos de la presente invención pueden ser usados, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades que son causadas por virus, por ejemplo por VIH, HSV-1, HSV-2, gripe, VSV, hepatitis B o papilomavirus.
Los derivados de oligonucleótidos según la invención, también los oligonucleótidos antisentido, en los que al menos una base de purina está reemplazada por una base de 8-azapurina y que son efectivas con esos blancos, tienen por ejemplo la siguiente secuencia de bases:
\newpage
a) contra VIH, por ejemplo
100
b) contra HSV-1, por ejemplo
101
Los medicamentos de la presente invención también son apropiados, por ejemplo, para el tratamiento de cáncer. A modo de ejemplo, en este caso se pueden emplear secuencias de oligonucleótidos que están dirigidas contra blancos que son responsables del origen o el crecimiento del cáncer. Tales blancos son, a modo de ejemplo:
1)
Oncoproteínas nucleares, tales como, por ejemplo, c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, p120
2)
Oncoproteínas citoplasmáticas/asociadas a membrana, tales como, por ejemplo, EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl
3)
Receptores celulares tales como, por ejemplo, receptor EGF, c-erbA, receptores de retinoides, subunidad reguladora de la proteína quinasa, c-fms
4)
Citoquinas, factores de crecimiento, matriz extracelular como, por ejemplo, CSF-1, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, bFGF, mieloblastina, fibronectina.
Los oligonucleótidos antisentido de la fórmula I según la invención, que son efectivos contra esos blancos, tienen por ejemplo la siguiente secuencia de bases:
a) contra c-Ha-ras, por ejemplo
102
c) c-myc, por ejemplo
103
d) c-myb, por ejemplo
104
e) c-fos, por ejemplo
105
f) p120, por ejemplo
106
g) receptor EGF, por ejemplo
107 
\newpage
h) supresor tumoral p53, por ejemplo
108
Además, los medicamentos de la presente invención son apropiados, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades que son influenciadas por integrinas o receptores de adhesión célula-célula, por ejemplo por VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o ELAM.
Los derivados de oligonucleótidos antisentido según la invención, que son efectivos contra esos blancos, tienen por ejemplo la siguiente secuencia de bases:
a) VLA-4, por ejemplo
109
b) ICAM, por ejemplo
110
c) ELAM-1, por ejemplo
111
Los medicamentos de la presente invención también son apropiados, por ejemplo, para evitar la restenosis. En este caso, se pueden usar por ejemplo secuencias de oligonucleótidos que están dirigidas contra blancos que son responsables de la proliferación o la migración. Estos blancos son por ejemplo:
1)
proteínas transactivadoras nucleares y ciclinas tales como, por ejemplo, c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, ciclinas y cdc2-quinasa
2)
Mitógenos o factores del crecimiento, tales como, por ejemplo, PDGF, bFGF, EGF, HB-EGF y TGF-\beta.
3)
Receptores celulares tales como, por ejemplo, receptor bFGF, receptor EGF y receptor PDGF.
Los oligonucleótidos de la fórmula I según la invención, que son efectivos contra esos blancos, tienen por ejemplo la siguiente secuencia de bases:
a) c-myb
112
b) c-myc
113
c) cdc2-quinasa
114
d) PCNA (antígeno nuclear de células proliferativas de rata)
115 
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Los medicamentos pueden usarse, por ejemplo, en forma de preparados farmacéuticos, que se pueden administrar por vía oral, por ejemplo en forma de comprimidos, grageas, cápsulas de gelatina dura o blanda, disoluciones, emulsiones o suspensiones. La incorporación de los medicamentos en liposomas que eventualmente contienen otros componentes como proteínas, también constituye una forma de aplicación apropiada. También se pueden administrar por vía rectal, por ejemplo, en forma de supositorios, o por vía parenteral, por ejemplo, en forma de disoluciones para inyección. Para la obtención de preparados farmacéuticos se pueden elaborar estos compuestos en portadores orgánicos e inorgánicos terapéuticamente inertes. Ejemplos de estos portadores para comprimidos, grageas y cápsulas de gelatina duras son lactosa, almidón de maíz o derivados de ellos, sebo y ácido esteárico o sales de ellos. Portadores apropiados para la preparación de disoluciones son agua, polioles, sacarosa, azúcar invertida y glucosa. Portadores apropiados para disoluciones para inyección son agua, alcoholes, polioles, glicerol y aceites vegetales. Portadores apropiados para supositorios son aceites vegetales y endurecidos, ceras, grasas y polioles semilíquidos. Los preparados farmacéuticos también pueden contener conservantes, solubilizantes, estabilizantes, humectantes, emulsionantes, endulzantes, colorantes, saboreantes, sales para modificar la presión osmótica, tampones, agentes de recubrimiento, antioxidantes, así como eventualmente otros principios activos
terapéuticos.
Formas de administración preferidas son aplicaciones tópicas, aplicaciones locales tales como, por ejemplo, con la ayuda de un catéter, pero también inyecciones. Para la inyección se formulan los derivados de oligonucleótidos antisentido en una disolución acuosa, preferentemente en un tampón fisiológicamente aceptable, como por ejemplo disolución de Hank o disolución de Ringer. Los oligonucleótidos antisentido también pueden formularse de forma sólida y disolverse o suspenderse antes de usar. Las dosis preferidas para la administración sistemática son de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y por día.
Muy en general, la invención se refiere al uso de compuestos de la fórmula I como cebadores en el diagnóstico de ADN.
Ejemplos
Los compuestos (1) - (16) mencionados en los Ejemplos presentan la siguiente fórmula estructural.
19
20
21
22
R(a) R(b) R(c) R
(7) -COCH_{3} -COCH_{3} -COCH_{3} -NH-CO-C_{5}H_{19}
(8) -COCH_{3} -COCH_{3} -COCH_{3} NH_{2}
(9) OH OH OH NH_{2}
(10) OH OH OH -NH-CO-C_{6}H_{5}
(11) OH OH OH -N=CH-N(CH_{3})_{2}
(12) OH OH OH CH_{3}-N=CH-N(CH_{3})_{2}
(13) OH OH Dmt ''
(14) Tms OH Dmt ''
(15) OH Tms Dmt ''
(16) Tms TEP Dmt '' 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 5-Amino-3-(2-desoxi-\beta-D-eritro-pentofuranosil)-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-on-5'-O-trifosfato, sal de trietilamonio (5'-trifosfato de 8-aza-2'-desoxiguanosina)
Se solubilizó 3-(2-desoxi-\beta-D-eritro-pentofuranosil)-5-amino-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona (8-
aza-2'-desoxiguanosina (1)) (26 mg; 0,09 mmol) junto con 1,8-bis(dimetilamino)naftalina (33 mg, 0,15 mmol) en trimetilfosfato (0,25 ml) bajo ligero calentamiento. Después de enfriar hasta 0ºC, se realizó una adición de POCl_{3} recién destilado (12 \mul, 0,13 mmol). La reacción se mantuvo durante 4 h a 4ºC y luego se añadió una disolución de difosfato de tri-n-butilamonio (0,5 m en DMF, 1 ml) y tri-n-butilamina (100 \mul, 0,42 mmol). Tras agitar durante 3 min a 0ºC, se combinó la mezcla con tampón de TBK 1 M (10 ml) y se evaporó hasta sequedad. El residuo se cromatografió en DEAD Sephadex® (columna 1,5 x 20 cm, forma HCO_{3}). Después de lavar con aproximadamente 500 ml de H_{2}O, se cromatografió con un gradiente lineal de H_{2}O / tampón de TBK 0,9 M (cada uno 1 litro). En este caso, se obtuvo una zona principal con aproximadamente tampón de TBK 0,5 M (0,019 mM, 20%). CCD (gel de sílice, i-propanol/H_{2}O/NH_{3}, 3:1:1): R_{f} 0,2. UV (H_{2}O): \lambda_{máx} 256 nm.
^{31}P-RMN (Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, 100 mm de EDTA/D_{2}O): -10,27 (d, J = 19,3, P_{x}); -10,63 (td, J = 20,2 y 6,0, P_{\alpha}); -22,60 (t, J = 19,8, P_{\beta}).
Ejemplo 2 3-(2-Desoxi-\beta-D-eritro-pentofuranosil)-5-{[(dimetilamino)metiliden]amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona (2)
Se disolvió 3-(2-desoxi-\beta-D-eritro-pentofuranosil)-5-amino-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona (8-aza-2'-desoxiguanosina (1)) (290 mg; 1,06 mmol) en DMF absoluto (7 ml) y se mezcló con dietilacetal de N,N-dimetilformamida (5 ml). Después de agitar durante 24 horas a temperatura ambiente, la tanda se hizo rotar al vacío y se coevaporó con tolueno. La purificación del residuo se realizó por medio de cromatografía en gel de sílice (columna: 20 x 4 cm, 0,5 bar, CH_{2}Cl_{2}/MeOH 8:2). Se obtuvo el compuesto (2) (320 mg, 92%) en forma de espuma incolora que cristalizó en MeOH. Punto de fusión 236ºC.
CCD (CH_{2}Cl_{2}/MeOH 8:2): R_{f} 0,7. UV (MeOH): 301 (26500), 244 (15500).
^{1}H-RMN ((D_{6})DMSO: 8,66 (s, CH); 6,43 (t, J = 6,32, H-C(1')); 5,40 (br.s. OH-C(3')); 4,79 (br.s, OH-C(5')); 4,48 (m, H-C(3')); 3,85 (m, H-C(4')); 3,57 (m, H-C(5')); 3,19, 3,06 (2 s, 2CH_{3}); 2,90 (m, H_{\beta}-C(2')); 2,34 (m, H(_{\alpha})-C(2')).
C_{12}H_{17}N_{7}O_{4} (323,31) Calc. C 44,56, H 5,29, N 30,32
Exp. C 44,64, H 5,26, N 30,37.
Ejemplo 3 3-(2-Desoxi-5-O-(4,4'-dimetoxitritil-\beta-D-eritro-pentofuranosil]-5-{[(dimetilamino)metiliden)-amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona (3)
La 8-aza-2'-desoxiguanosina (2) protegida con amino del Ejemplo 2 (170 mg, 0,53 mmol) se trató por medio de varias evaporaciones con piridina absoluta y luego se tomó en 6 ml de ella. A temperatura ambiente se añadió cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (260 mg, 0,7 mmol) y se agitó durante 3 horas. La disolución se vertió luego en NaHCO_{3} al 5% (40 ml) y se extrajo dos veces con 30 ml de CH_{2}Cl_{2} por vez. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se hicieron girar al vacío. El residuo se cromatografió en gel de sílice (columna: 15 x 4 cm, 0,5 bar, CH_{2}Cl_{2}/MeOH 95:5). El rendimiento era de 270 mg (82%), espuma incolora.
CCD (CH_{2}Cl_{2}/MeOH 95:5) R_{f} 0,3. UV (MeOH): 302 (24600), 235 (35000).
^{1}H-RMN ((D_{6})DMSO): 12,03 (s, NH); 8,66 (s, CH); 7,39 - 6,70 (2 m, H aromát.); 6,48 (m, H-C(1')); 4,57 (m, H-C(3')); 3,97 (m, H-C(4')); 3,69 (s, 2 OCH_{3}); 3,37 (m, H-C(5')), 3,22, 3,07 (2s, 2CH_{3}); 2,90 (m, H_{\beta}-C(2')); 2,40 (m, H_{(\alpha)} C(2')).
C_{33}H_{35}N_{7}O_{6} (625,68) Calc. C 63,34, H 5,64, N 15,67
Exp. C 63,42, H 5,72, N 15,71
Ejemplo 4 3-(2-Desoxi-5-O-(4,4'-dimetoxitritil)-\beta-D-eritro-pentofuranosil]-5-{[(dimetilamino)metiliden]-amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona 3'-(fosfonato de trietilamonio) (4)
A una disolución de PCl_{3} (200 \mul, 0,22 mmol), así como N-metilmorfolina (2,7 ml, 2,24 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml) se añadió 1,2,4-triazol (0,54 g, 7,56 mmol). Se dejó la disolución bajo agitación durante 30 min y luego se enfrió hasta 0ºC. El compuesto de 5'-O-dimetoxitritilo 3 del Ejemplo 3 (220 mg, 0,35 mmol) se secó por evaporación con MeCN seco y luego se añadió disuelto en CH_{2}Cl_{2} (5 ml). Tras agitar durante 10 min, se vertió la mezcla en (Et_{3}NH)HCO_{3} 1 M (tampón de TBK, pH 8,0, 30 ml), se agitó dos veces con CH_{2}Cl_{2} y se separaron las fases. Las disoluciones orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron. La cromatografía se realizó en gel de sílice (columna: 4 x 15 cm, 0,5 bar, 1. CH_{2}Cl_{2}/Et_{3}N 98:2; 2. CH_{2}Cl_{2}/MeOH/Et_{3}N 88:10:2). La sustancia de la zona principal se tomó en CH_{2}Cl_{2} (10 ml) y se agitó varias veces con tampón de TBK 0,1 M (pH 8,0). Se obtuvo el H-fosfonato 4 (240 mg, 85%) en forma de espuma incolora. CCD (CH_{2}Cl_{2} / MeOH / Et_{3}N 88:10:2): R_{f} 0,3. UV (MeOH): 285 (sh, 14900), 303 (18400).
^{1}H-RMN ((D_{6})DMSO): 11,68 (s, NH); 8,83 (s, CH); 7,77, 5,45 (d, J = 585, HP); 7,24-6,69 (2 m, H aromát.); 6,53 (m, J = 4,5, H-C(1')); 5,22 (m, H-C(3')); 4,09 (m, H-C(4')); 3,67 (s, 2 OCH_{3}); 3,07, 3,23 (s, 2 CH_{3}, H-C(5')); 2,97 (m, CH_{3}CH_{2}); 2,56 (m, H-C(2')); 1,13 (m, CH_{3}CH_{2}).
^{31}P-RMN ((D_{6})DMSO): 1,16 (^{1}J(P,H) = 585); ^{3}J(P,H-C(3') = 8,90.
C_{39}H_{51}N_{8}O_{8}P_{1} (790,87) Calc. C 59,23, H 6,49, N 14,17
Exp. C 59,33, H 6,79, N 13,95
Ejemplo 5 3-(2-Desoxi-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-\beta-D-eritro-pentofuranosil)-5-{[(dimetilamino)metiliden]-amino}-3H-1,2,3- triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)ona 3'[(2-cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita (5)
A una disolución del compuesto (3) del Ejemplo 3 (50 mg, 0,08 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml) se añadió (i-Pr)_{2}EtN (56 \mul, 0,27 mmol), así como cloro-(2-cianoetoxi)(diisopropilamino)-fosfano (115 \mul, 0,51 mmol). La tanda se agitó a temperatura ambiente bajo argón durante 2 horas. Luego se vertió la mezcla en NaHCO_{3} al 5% (3 ml) y se extrajo dos veces con CH_{2}Cl_{2} (30 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se hicieron rotar hasta sequedad. La cromatografía se realizó en gel de sílice (columna: 7 x 2 cm, 0,5 bar, CH_{2}Cl_{2}/AcOEt/Et_{3}N 45:45: 10). Se podían identificar dos zonas superpuestas de diastereoisómeros de fosforamidita (5), que se obtuvieron como espuma incolora (35 mg, 55%).
CCD (CH_{2}Cl_{2}/AcOEt/Et_{3}N 45:45:10): R_{f} 0,4.
^{31}P-RMN ((D_{6})DMSO): 149,4, 148,9.
Ejemplo 6 2-[2-Desoxi-5-O-(4,4-dimetoxitritil)-3'-O-succinil-\beta-d-eritro-pentofuranosil]-5-{[(dimetilamino)metiliden]amino}- 3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona (6)
A una disolución del nucleósido protegido (3) del Ejemplo 3 (110 mg, 0,18 mmol) en piridina (5 ml) se añadieron 4-dimetil-aminopiridina (30 mg, 0,23 mmol), así como anhídrido de ácido succínico (90 mg, 0,88 mmol). Se dejó la tanda bajo agitación durante 48 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con la adición de 2 ml de agua. Después de evaporar hasta sequedad, se coevaporó con tolueno para eliminar la piridina restante. El residuo se disolvió en un poco de CH_{2}Cl_{2} y se lavó con una disolución acuosa al 10% de ácido cítrico y agua. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró al vacío. Tras disolver en CH_{2}Cl_{2}/piridina (95:5, 2 ml) se añadió rápidamente n-pentano/éter (1:1, 30 ml). El sobrenadante se filtró y quedó un polvo incoloro (85 mg, 66%). CCD (CH_{2}Cl_{2} / MeOH 9:1): R_{f} 0,25.
^{1}H-RMN ((D_{6})DMSO): 8,71 (s, CH); 7,28-6,75 (2 m, H aromát.); 6,46 (m, J = 4,1, H-C(1')); 5,48 (m, H-C(3')); 4,21 (m, H-C(4')); 3,36 (s, 2 OCH_{3}); 3,18, 3,05 (2 s, 2 CH_{3}); 3,10 (m, H-C(5')); 2,51 (m, H-C(2'), 2 CH_{2}).
Ejemplo 7 7-(Benzoilamino)-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina
Se evapora 8-azaadenina (200 mg, 1,47 mmol) tres veces en piridina seca, luego se extrae en 5 ml de piridina seca. A continuación se vierte gota a gota cloruro de benzoílo (0,28 ml, 2,20 mmol) y se agita durante 3 horas a 60ºC. Luego se hierve a reflujo durante otra hora más. Se deja reposar la mezcla de reacción durante la noche y se concentra hasta aproximadamente 1 ml. A esta mezcla se añaden 15 ml de agua fría, se deja bajo agitación durante 5 min y se filtra el precipitado producido por succión. El precipitado ligeramente amarillento se lava dos veces con 1 ml de agua fría y 1 ml de acetonitrilo frío por vez. Se obtienen 0,30 g (85%) de cristales incoloros (MeOH). Pf = 263ºC (descomposición).
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2} / MeOH = 8:2); R_{f} = 0,6.
UV (metanol) \lambda_{máx} (\varepsilon) = 242 (12100); 291 (16000).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 7,58; 7,69; 8,13 (H_{5} arom.), 8,89 (s, H-5), 11,99 (s-N_{6}-H).
C_{11}H_{8}N_{6}O Calc. C 54,99 H 3,36 N 34,99.
Exp. C 55,10 H 3,34 N 35,04.
Ejemplo 8 7-(Nonanoilamino)-3-[(2,3,5-tri-O-acetil)-\beta-D-ribofuranosil]-3H-1,2,3-triazolo-[4,5-d]pirimidina (7)
Se evaporan 500 mg (1,81 mmol) de 7-nonanoilamido-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina tres veces hasta sequedad en piridina seca. El residuo se toma en 20 ml de acetonitrilo seco. Se añaden 0,58 g (1,81 mmol) de 1,2,3,5-tetra-O-acetil-\beta-D-ribofuranosa, 0,64 ml (5,43 mmol) de tetracloruro de estaño y la mezcla de reacción se agita durante 24 horas a temperatura ambiente. La disolución de reacción se añade luego a 25 ml de disolución saturada de hidrógeno-carbonato de sodio y se extrae cuatro veces con 15 ml de diclorometano. Después de secar sobre sulfato de sodio, las fases orgánicas combinadas se evaporan hasta sequedad. Se obtienen 0,81 g de un residuo oleoso. La separación de la mezcla del producto se realiza a través de cromatografía en columna (columna 5,5 x 30 cm, gel de sílice. Eluyente: CH_{2}Cl_{2}/ MeOH 95:5). De la zona de curso rápido se obtienen 0,27 g (28%) de nucleósido incoloro.
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/ MeOH); R_{f} = 0,75.
UV (metanol) \lambda_{máx} (\varepsilon) = 275 (16800).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 0,82 (m, -CH_{3}-9''); 1,22 (m, -(CH_{2})_{5}-); 1,62 (m, J = 6,8 Hz, -CH_{2}-3''); 1,93; 2,08; 2,11 (3s, O = CCH_{3}); 2,61 (t, J = 7,2 Hz, -CH_{2}-2''); 4,26 (m, H-5'); 4,52 (m, H-4'); 5,77 (m, H-3'); 6,12 (m, H-2'); 6,63 (d, J = 3,4 Hz, H-1'); 8,89 (s, H-5); 11,48 (s, br, N^{6}-H).
Ejemplo 9 Glucosilación de 7-amino-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina con 1,2,3,5-tetra-O-acetil-\beta-D-ribofuranosa.
Se suspenden 340 mg (2,5 mmol) de 7-amino-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina y 800 mg (2,5 mmol) de 1,2,3,5-tetra-O-acetil-\beta-D-ribofuranosa en 10 ml de acetonitrilo seco. A esta mezcla se añaden gota a gota bajo argón 0,88 ml (7,5 mmol) de tetracloruro de estaño en un lapso de 5 min y se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. La disolución producida se vierte cuidadosamente en 32 ml de disolución saturada de NaHCO_{3}. El precipitado producido se filtra por succión y se lava dos veces con 10 ml de agua. El filtrado y el agua de lavado se extraen cuatro veces con 15 ml de cloruro de metileno por vez. Tras secar sobre Na_{2}SO_{4} y extraer el disolvente, se obtienen 0,87 g de una espuma ligeramente amarillenta. La separación de los productos de reacción se realiza a través de cromatografía en columna (columna: 5,5 x 20 cm, gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/ MeOH 98:2-90:10).
Ejemplo 10 7-Amino-3-{(2,3,5-tri-O-acetil)-\beta-D-ribofuranosil}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina (8)
La zona de curso más rápido da como resultado 0,34 g (34%) de una espuma incolora.
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2} / MeOH 9:1): R_{f} = 0,45
UV (metanol) \lambda_{máx} (\varepsilon) = 280 (10900).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 1,89; 2,10; 2,11 (3s, 2',3',5'-O-C = O); 4,20 (m, H_{2}-5'); 4,48 (m, H-4'); 5,74 (t, J = 5,5 Hz, H-3'); 6,07 (t, J = 3,7 Hz, H-2'); 6,48 (d, J = 2,8, H-1'); 8,25; 8,6 (2s, N^{6}-H_{2}), 8,34 (s, H-5).
C_{15}H_{18}N_{6}O_{7} Calc. C 45,68 H 4,61 N 21,31
Exp. C 45,98 H 4,72 N 21,40.
Ejemplo 11 7-Amino-2-[{2,3,5-tri-O-acetil)-\beta-D-ribofuranosil]-2H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina
De la zona de curso más rápido de la elaboración cromatográfica se obtienen 0,46 g (47%) de una espuma incolora.
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2} / MeOH): R_{f} = 0,35
UV (metanol) \lambda_{máx} (\varepsilon) = 253 (3900), 300 (10400).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 1,94; 2,07; 2,11 (3s, 2',3',5'-O-C = O); 4,25 (m, H_{2}-5'); 4,52 (m, H-4'); 5,74 (t, J = 6,0, H-3'); 5,91 (d, J = 3,4, H-2'); 6,53 (s, H-1'); 8,3; 8,45 (2s, N^{6}-H_{2}); 8,34 (H-5).
C_{15}H_{18}N_{6}O_{7} Calc. C 45,68 H 4,61 N 21,31.
Exp. C 45,86 H 4,71 N 21,22.
Ejemplo 12 7-Amino-3-(\beta-D-ribofuranosil]-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]-pirimidina (8-azaadenosina, 9)
Se agitan 2,04 g (5,17 mmol) del compuesto (8) en 5 ml de metanol y 5 ml de amoníaco acuoso (25%) durante dos horas a temperatura ambiente. Después de evaporar hasta sequedad y la recristalización en 3 ml de agua, se obtienen 1,04 g (75%) de cristales incoloros que se descompusieron a 217ºC.
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/ MeOH = 8:2)): R_{f} = 0,45.
UV: \lambda_{máx} (pH 7) = 279 (11600); \lambda_{máx} (pH 1) = 263, \lambda_{máx} (pH 14) = 279.
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 3,56 (m, H_{2}-5'); 4,01 (m, H-4'), 4,29 (m, 3'); 4,85 (m, H-2'); 5,01 (t, J = 5,9 Hz, HO-5'); 5,28 (d, J = 5,7, HO-3'); 5,56 (d, J = 6,0 HO-2'); 6,15 (d, J= 5,2 Hz, H-1'); 8,31 (s, H-5); 8,53; 8,19 (2s, N^{7}H_{2}).
Ejemplo 13 7-Amino-2-(\beta-O-ribofuranosil]-2H-1,2,3-triazolo[4,5-d]-pirimidina
Se agitan a temperatura ambiente 0,81 g (2,05 mmol) del compuesto del Ejemplo 11 en 5 ml de metanol y 5 ml de amoníaco acuoso (25%) durante dos horas. Tras evaporar hasta sequedad y recristalizar en 2,5 ml de agua, se obtienen 0,32 g (59%) de cristales incoloros que se descomponen a 209ºC.
CCCD (CH_{2}Cl_{2} / MeOH = 8:2): R_{f} = 0,20
UV (metanol) \lambda_{máx} (\varepsilon) = 255 (4400), 263 (4100), 297 (10400).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 3,59 (m, H_{2}-5'); 4,06 (m, H-4'); 4,33 (m, H-3'); 4,61 (m, H-2'); 4,76 (t, J = 5,3 Hz, HO-5'); 5,27 (d, J = 5,8 Hz, HO-3'); 5,68 (d, J = 5,5 Hz, HO-2'); 6,08 (s, J = 3,4 Hz, H-1'); 8,31 (s, H-5); 8,12 (s, N^{7}-H_{2}).
Ejemplo 14 7-Benzoilamino-3-(\beta-D-ribofuranosil)-3H-1,2,3-triazolo-[4,5-d]pirimidina (10)
Se disponen 100 mg (0,37 mmol) de 7-amino-3-\beta-D-ribofuranosil-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina en 5 ml de piridina seca. A esta disolución se vierten gota a gota bajo una atmósfera de argón 0,47 ml (3,7 mmol) de cloruro de trimetilsililo. Después de agitar durante media hora a temperatura ambiente (control con CCD), se vierten gota a gota 0,25 ml (2,0 mmol) de cloruro de benzoílo y se agita durante cuatro horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfría hasta 0-5ºC, se mezcla con 1 ml de agua, a los 5 min se combina con 2 ml de amoníaco acuoso (25%) y se agita nuevamente durante 30 min. El disolvente se extrae y se evapora luego con tolueno. El residuo se toma en 15 ml de disolución saturada de NaHCO_{3}, se extrae una vez con 25 ml de cloruro de metileno y varias veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secan con Na_{2}SO_{4}.
Después de extraer el disolvente por succión, se obtienen 0,05 g (36%) de una sustancia cristalina incolora que se funde con descomposición después de la cristalización en metanol a 188ºC.
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/ MeOH = 9:1): R_{f} = 0,25
UV (metanol) \lambda_{máx} (\varepsilon) = 242 (9400), 282 (20300).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 3,56 (m, H_{2}-5'); 4,04 (m, H-4'); 4,36 (m, H-3'); 4,84 (t, HO-5'); 4,92 (m, H-2'); 5,33 (d, J = 5,2 Hz, HO-3'); 5,66 (d, J = 5,4 Hz, HO-2'); 6,30 (d, J = 4,3 Hz, 1'); 7,54-8,11 (m, H_{5} arom.); 8,94 (s, H-5); 11,99 (s, br, N^{6}-H).
C_{16}H_{16}N_{6}O_{6} Calc. C 51,60 H 4,34 N 22,57.
Exp. C 51,49 H 4,43 N 22,74.
Ejemplo 15 7-{[(Dimetilamino)metiliden]amino}-3-(\beta-D-ribofuranosil)-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina (11)
Se agitan 100 mg (0,37 mmol) de 7-amino-3-\beta-D-ribofuranosil-(3H)-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina durante la noche en 2 ml de DMF seca y 0,25 ml (1,85 mmol) de N,N-dimetilacetal de dimetilformamida a temperatura ambiente. A esta mezcla de reacción se añaden luego 4 ml de metanol. Después de agitar durante dos horas, la tanda se evapora hasta sequedad, se coevapora con tolueno y se cromatografía en gel de sílice (columna: 3x20 cm, eluyente CH_{2}Cl_{2}/ MeOH 98:2-90:10). En la zona principal se obtienen 0,06 g (52%) de una sustancia incolora, vítrea, solidificada.
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/ MeOH = 9:1): R_{f} = 0,25
UV \lambda_{máx} (\varepsilon) = 235, 325.
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 3,21; 3,27 (2s, N (CH_{3})_{2}); 3,55 (m, H_{2}-5'), 4,00 (m, H-4'); 4,31 (m, H-3'); 4,87 (m, H-2'); 4,96 (t, HO-5'); 5,32 (d, HO-3'); 5,60 (d, HO-2'); 6,19 (d, J = 4,7 Hz, H-1'); 8,57 (s, H-5); 9,06 (s, N = CH).
Ejemplo 16 7-{[1-(Dimetilamino)etiliden]amino}-3-(\beta-D-ribofuranosil)-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina (12)
Se mezclan 500 mg (1,86 mmol) de 9 en 10 ml de metanol p.a. con 0,91 ml (5,59 mmol) de dimetilacetal de N,N-dimetilcetamida. Se deja la suspensión bajo agitación durante 14 horas a temperatura ambiente. La disolución que se produce se libera del disolvente en el evaporador rotativo y se coevapora con tolueno. El residuo se mezcla nuevamente con 10 ml de metanol y se agita durante dos horas a temperatura ambiente. Después de separar el disolvente, se cromatografía el residuo en gel de sílice (columna 4 x 20 cm, eluyente CH_{2}Cl_{2}/ MeOH 98:2-90:10). Rendimiento: 0,48 g (76%) de una espuma incolora.
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2} / MeOH = 9:1): R_{f} = 0,35
UV (metanol) UV \lambda_{máx} (\varepsilon) = 233 (9300), 270 (3600), 324 (26100).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 2,28 (s, N = C-CH_{3}); 3,20 (s, N(CH_{3})_{2}); 3,55 (m, H_{2}-5'); 4,00 (m, H-4'); 4,30 (m, H-3'); 4,86 (m, H-2'); 4,98 (t, HO-5'); 5,29 (d, J = 5,2 Hz, HO-3'); 5,57 (d, J = 5,9 Hz, HO-2'), 6,18 (d, J = 5,2 Hz, H-1'); 8,54 (s, H-5).
\newpage
C_{13}H_{19}N_{7}O_{4} Calc. C 46,28 H 5,69 N 29,07.
Exp. C 46,45 H 5,63 N 28,97.
Ejemplo 17 7-{[1-{Dimetilamino)etiliden]amino}-3-[5-O-{4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-\beta-D-ribofuranosil]-3H-1,2,3-triazolo[4, 5-d]pirimidina (13)
Para secar se evaporan 0,34 g (1,00 mmol) de 12 dos veces en piridina seca. La sustancia se disuelve en 4 ml de piridina seca, se mezcla con 0,41 g (1,20 mmol) de cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo y se agita durante dos horas a 40ºC. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, se añaden 5 ml de metanol p.a. y se agita durante otros 30 minutos. La disolución de reacción se concentra hasta aproximadamente la mitad de su volumen. Luego se mezcla con 8 ml de disolución saturada de hidrógeno-carbonato de sodio y se extrae cuatro veces con 10 ml de cloruro de metileno por vez. Las fases orgánicas combinadas se agitan con 15 ml de disolución saturada de cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de sodio, y se evapora. El residuo (0,73 g de espuma de color amarillo pálido) se sigue purificando por cromatografía en columna (columna: 2 x 20 cm, gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/ MeOH 95:5). Rendimiento: 0,52 g (81%) de espuma incolora.
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/ MeOH = 9:1): R_{f} = 0,45
UV (metanol) UV \lambda_{máx} (\varepsilon) = 234 (29900), 275 (13800), 324 (24800).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 2,24 (s, N = CCH_{3}); 3,10 (m, H_{2}-5'); 3,19 (s, N(CH_{3})_{2}); 3,69 (s, (OCH_{3})_{2}); 4,14 (m, H-4'); 4,51 (m, H-3'); 4,86 (m, H-2'); 5,28 (d, J = 6,2 Hz, HO-3'); 5,68 (d, J = 5,1 Hz, HO-2'); 6,25 (d, H-1'); 6,71-7,26 (m, 13 H arom.); 8,54 (s, H-5).
C_{34}H_{37}N_{7}O_{6} Calc. C 63,83 H 5,84 N 15,33.
Exp. C 63,64 H 5,84 N 15,31.
Ejemplo 18 7-{[1-(Dimetilamino)etiliden]amino}-3-{5-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-2-O-[tris(1-metiletillsilil]-\beta-D-ribofurano- sil}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina (14)
Se disponen 0,35 g (0,55 mmol) del compuesto seco de tritilo 13 en 4 ml de piridina seca. A esta disolución se añaden 140 mg (0,82 mmol) de nitrato de plata y bajo argón 145 \mul (0,69 mmol) de cloruro de triisopropilo que antes se había disuelto en 5 ml de tetrahidrofurano. Excluyendo la luz, se deja la mezcla bajo agitación a temperatura ambiente. Al cabo de 24 horas se añaden otros 120 \mul (0,55 mmol) de cloruro de triisopropilsililo y se agita nuevamente durante 48 horas a temperatura ambiente. El cloruro de plata producido se filtra, se lava con un poco de tetrahidrofurano y el filtrado se mezcla con 10 ml de disolución de carbonato de hidrógeno saturado. Se extrae cuatro veces con 10 ml de diclorometano por vez y las fases orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de sodio. Después de evaporar hasta sequedad, se obtienen 0,60 g de un aceite ligeramente amarillento. La purificación y separación de los productos de reacción se realiza por medio de cromatografía en columna (columna 3 x 20 cm, gel de sílice, eluyente acetato de etilo / éter de petróleo 8:2). De la zona principal de más rápida migración se obtienen 0,31 g (71%) de una espuma incolora.
CCD (gel de sílice, acetato de etilo / éter de petróleo 9:1): R_{f} = 0,30
UV (metanol) \lambda_{máx} (\varepsilon) = 234 (29600), 274 (6800), 325 (25900).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 0,83-0,97 (m, Si-[CH(CH_{3})_{2}]); 2,24 (s, N = CCH_{3}), 3,10 (m, H_{2}-5'); 3,19 (s, N(CH_{3})_{2}); 3,70 (s, (O-CH_{3})_{2}); 4,19 (m, H-4'); 4,43 (m, H_{3}'); 5,21 (t, J = 4,4 Hz, H-2'); 5,27 (d, J= 6,3 Hz, HO-3'); 6,30 (d, J = 4,3 Hz, H-1'); 6,75-7,35 (m, 13 H arom.); 8,53 (s, H-5).
C_{43}H_{57}N_{7}O_{6} Calc. C 64,87 H 7,23 N 12,23.
Exp. C 64,94 H 7,37 N 12,13.
Ejemplo 19 7-{[1-(Dimetilamino)etiliden]amino}-3-{5-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil}-3-O-[tris(1-metiletil)silil]-\beta-D-ribofurano- sil}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidina (15)
De la zona de curso más lento de la cromatografía en columna descrita más arriba para el compuesto 14 se obtienen 0,08 g (18%) de una espuma incolora.
CCD (gel de sílice, acetato de etilo / éter de petróleo 9:1): R_{f} = 0,15.
UV (metanol) \lambda_{máx} (\varepsilon) = 234 (29800), 274 (7400), 327 (24700).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 0,98 (s, Si[CH(CH_{3})_{2}]_{3}); 2,19 (s, N =CCH_{3}); 3,10 (m, H_{2}-5'); 3,18 (s, N(CH_{3})_{2}); 3,68 (s, (OCH_{3})_{2}), 4,17 (m, H-4'); 4,92 (m, H-3', H-2'); 5,64 (d, J= 5,1 Hz, HO-2'); 6,27 (d, J= 6,0 Hz, H-1'); 6,70-7,20 (m, 13 H arom.); 8,55 (s, H-5).
Ejemplo 20 7-{(1-(Dimetilamino)etiliden]amino}-3-{5-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-2-O-[tris(1-metiletilisilil)-\beta-D-ribofurano- sil}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-3-O-fosfonato, sal de trietilamonio (16)
A una disolución de 114 \mul (1,3 mmol) de tricloruro de fósforo y 1,43 ml (13,0 mmol) de N-metilmorfolina en 10 ml de diclorometano seco se añaden 0,67 g (9,75 mmol) de 1,2,4-triazol bajo una atmósfera de argón. Después de agitar durante 30 min a temperatura ambiente, se enfría la mezcla de reacción hasta 0ºC y en un lapso de 10 min se añade gota a gota el compuesto de sililo (14), disuelto en 2,5 ml de diclorometano seco. La mezcla de reacción se agita durante otros 20 min a 0ºC y luego se hidroliza con tampón de TBK 1 M. La fase acuosa se extrae tres veces con 20 ml de diclorometano por vez. Las fases orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de sodio, y se evaporan hasta sequedad. El residuo se cromatografía en una columna de gel de sílice (3 x 10 cm, CH_{2}Cl_{2}, MeOH / TEA 88:10:2). Las fracciones que contienen el producto se evaporan juntas, se toman en 20 ml de diclorometano, se agitan cuatro veces con 5 ml de tampón de TBK 0,1 M por vez, se secan sobre sulfato de sodio y se liberan del disolvente. Rendimiento 0,21 g (83%) de una espuma incolora.
CCD (gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/ MeOH / TEA 88:10:2): R_{f} = 0,6.
UV (metanol) \lambda_{máx} (\varepsilon) = 234 (27300), 274 (11700), 325 (16400).
^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO) \delta: 0,75-0,95 (m, Si[CH(CH_{3})_{2}]_{3}); 1,15; 2,99 (m, (CH_{3}CH_{2})_{3}N); 2,24 (s, N = CCH_{3}); 3,20 (s, N(CH_{3})_{2}); (H_{2}-5' cubierto); 3,69 (s, (O-CH_{3})_{2}); 4,40 (m, H-4'); 4,79 (m, H-3'); 5,44 (m, H-2'); 5,50 y 7,91 (d, ^{1}J = 602 Hz, P-H); 6,27 (d, J = 6,0 Hz, H-1'); 6,76-7,40 (m, 13 H arom.); 8,50 (s, H-5); 10,90 (s, br, N^{+}-H).
^{31}P-RMN \delta: 2,55 (dd, ^{1}P_{PH} = 602 H_{2}, ^{3}J_{PH} = 9,5 H_{2}).
Ejemplo 21 Síntesis en fase sólida del oligorribonucleótido según el método del fosfonato
La síntesis de los oligorribonucleótidos se prepara en escala de 1 \mumol por aplicación de la técnica del fosfonato en un sintetizador de ADN de la empresa Applied Biosystems, Weiterstadt. La oxidación final se realiza de forma manual.
1.
La separación de los oligorribonucleótidos del portador de CPG se logra por 16 horas de acción de amoníaco (disolución acuosa al 25% / etanol 3:11) en la columna portadora.
2.
Separación de los grupos de protección de bases
La disolución amoniacal de oligómeros se calienta durante 16 horas a 55ºC en baño de agua en el caso de la secuencia (AU)_{6} no modificada y se calienta durante 3 horas hasta 40ºC en el caso de los dodecámeros que contienen 8-azaadenosina. Las disoluciones se evaporan hasta sequedad en temperatura ambiente y se coevaporan con etanol absoluto.
3.
Los grupos protectores de 2'-sililo se separaron por acción de la disolución 1 M de TBAF/THF durante 16 horas a temperatura ambiente.
Ejemplo 22 Síntesis de 5'-(z^{8}A-U)_{6}-3' (17)
El 3'-fosfonato de la 8-azaadenosina se emplea para la síntesis del oligorribonucleótido 5'-(z^{8}A-U)_{6}-3' (17). En este caso, se emplean el compuesto (16) junto con 3'-fosfonatos protegidos con 5'-(MeO)_{2}Tr,2'-t-BuMe_{2}Si de la uridina. Los oligonucleótidos se sintetizan en un Controlled Pore Glass (CPG) en dirección 3' a 5', en donde el nucleósido protegido 3'-terminal se une covalentemente a través de un espaciador de succinilo a la fase sólida. Al comienzo se separa el grupo 5'Dmt del nucleósido unido al soporte con ácido dicloroacético al 2,5% en diclorometano. Luego se produce el acoplamiento con el fosfonato activado con cloruro de pivaloílo. Para evitar secuencias erróneas, se hacen reaccionar grupos 5'-OH que no reaccionaron con fosfito de isopropilo.
Ejemplo 23 Purificación de oligorribonucleótidos 1.) Desalinización previa
Con ayuda de columnas de intercambio aniónico Qiagen tipo 500. Se equilibra una columna ®Qiagen con 5 ml de tampón de TBK 0,1 M, se carga con la disolución oligomérica y se lava con 5 ml de tampón de TBK 0,1 M. Luego se eluyen los oligómeros con tampón de TBK 1 M de la columna. La detección de las fracciones de producto se logra por medio de placas UV/CCD. Las fracciones que contienen el oligómero se liberan de las disoluciones tamponadas con una centrífuga ®Speed Vac al vacío.
2.) HPLC preparativa
Los oligómeros se aislaron con ayuda de HPLC en fase inversa en una columna RP 18 ®LiChrosorb. Para ello se toma el oligómero en 400 \mul de una disolución acuosa al 1% de dietilpirocarbonato (DEPC), se calienta la muestra durante 2-3 min hasta 95ºC y se enfría rápidamente hasta 0ºC para impedir la formación de estructuras secundarias. DEPC es un inhibidor de Rnasa. Luego se rocía una muestra (10 \mul) para calcular los tiempos de retención. A continuación se vierte la disolución en porciones de 50 - 100 \mul en una columna RP-18, se separa el pico principal y se concentran las fracciones combinadas hasta un volumen de aproximadamente 5 ml.
Fases móviles
A: TEAA 0,1 M (estéril, pH 7,5) / CH_{3}CN 95:5
B: CH_{3}CN
Sistema I: 20 min 0-20% de B en A
Sistema II: 30 min 0-20% de B en A
Tiempos de retención del oligómero 17
Oligómero Tiempo de retención (min) Sistema
(z^{8}A-U)_{6} 28,6 II
Velocidad de flujo: 1 ml/min
3. Desalinización
Los 5 ml de disolución oligomérica se colocan en la columna previamente sometida a autoclave y equilibrada con 5 ml de CH_{3}CN, 5 ml de tampón de TEAA 0,05 M (pH 7,0)/CH_{3}CN 1:1, así como con 5 ml de tampón de TEAA 0,05 M (Millipore, Eschborn), se lavan con 5 ml de disolución de TEAA 0,05 M y los oligonucleótidos se eluyen con una mezcla de MeOH/CH_{3}CN/H_{2}O 1:1:1 en porciones de 1 ml nuevamente de la columna. Las fracciones que contienen los oligómeros se calculan con HPLC. Después de liofilizar en el concentrador ®Speed Vac, se conservan los oligorribonucleótidos a -25ºC.
Ejemplo 24 Hidrólisis total de los oligorribonucleótidos
Se disuelven 0,2 unidades de A_{260} de oligómeros en 200 \mul de tampón de tris-HCl (pH 8,3), se mezclan con 4 \mug (2 \mul) de fosfordiesterasa de veneno de víbora (Boehringer Mannheim) y se incuban durante 30 min a 37ºC. Después de añadir 3 \mug (5 \mul) de fosfatasa alcalina, la disolución se mantiene a 37ºC durante otros 15 min. La composición de nucleósido de la disolución de reacción se determina luego por HPLC (columna RP-18, fase móvil: tampón de TEAA 0,1 M / CH_{3}CN 95:5. Velocidad de flujo 1 ml/min).
Tiempos de retención de los nucleósidos:
A = 11,4 min z^{8}A = 10,0 min I = 4,8 min U = 3,6 min
Las superficies de los picos de HPLC se dividen por medio de los correspondientes coeficientes de extinción y se relacionan entre sí.
\newpage
Coeficientes de extinción a 260 nm:
\varepsilon (A) = 15300, \varepsilon (z^{8}A) = 7100, \varepsilon (U) = 10200, \varepsilon (I) = 7400
Ejemplo 25 N^{8}-8-Aza-2'-desoxiguanosina unida a Fractosil®
A una disolución del 3'-O-succinato (6) del Ejemplo 6 (30 mg, 0,04 mmol) y 1,4-dioxano/5% piridina (1 ml) se añadieron p-nitrofenol (7 mg, 0,05 mmol) y N,N-diciclohexilcarbodiimida (10 mg, 0,048 mmol). Al cabo de 2 horas de agitación a temperatura ambiente, se vertió el filtrado de la disolución en una suspensión de Fractosil 200® (80 mg, 450 \mumol/g; Merck) en DMF (1 ml). Después de añadir trietilamina (100 \mul) se agitó la mezcla durante 4 horas, realizándose intercaladamente una adición de anhídrido de ácido acético (20 \mul). El portador polimérico se filtró, se lavó con 30 ml de DMF, etanol y éter por vez y se secó al vacío. Para determinar el rendimiento del nucleósido unido a polímero, se tomó la sustancia con ácido p-toluensulfónico 0,1 M (5 ml) en MeCN. De la extinción a 498 nm se pudo calcular la carga del portador por espectrofotometría UV (Dmt = 70000) con 64 \mumol de 8-aza-2'-desoxiguanosina / g de Fractosil®.
Ejemplo 26 Síntesis en fase sólida de los oligodesoxirribonucleótidos de acuerdo con el método de fosfonato
Las síntesis de los oligodesoxirribonucleótidos se realizaron en escala de 1 \mumol por medio de la técnica del fosfonato en un sintetizador automatizado de ADN modelo 380 B (Applied Biosystems, Weiterstadt) en fase sólida (CPG: ®Controlled Pore Glass), en donde se sintetizó el fragmento de ADN en dirección 3'-5'. El ciclo de oxidación (destritilación, acoplamiento, capeado y oxidación) siguió en este caso un programa desarrollado para la química de los fosfonatos (H. Köster. K. Kulikowsky, T. Liese, W. Heikens, V. Kohli, Tetrahedron 1981, 37, 363). El oligonucleótido protegido con bases y Dmt en el grupo 5'-hidroxilo se separó del soporte por medio de amoníaco acuoso al 25% en un lapso de 30 min. Después de seguir añadiendo amoníaco acuoso (1 ml, 25%), se separaron los grupos protectores en los heterociclos en un lapso de 24 horas a 60ºC. Las muestras se concentraron con adición de una gota de trietilamina (se evita la separación prematura del grupo protector 5'-OH) en un concentrador Speed-Vac® hasta aproximadamente 200 \mul. Así se pueden conservar a -25ºC durante algunos meses.
Ejemplo 27 Síntesis en fase sólida de los oligodesoxirribonucleótidos de acuerdo con el método de fosforamidita
Las síntesis de oligodesoxirribonucleótidos en escala de 1 \mumol por medio de la técnica de la fosforamidita en fase sólida en un sintetizador automatizado de ADN modelo 380 B (Applied Biosystems, Weiterstadt) se llevó a cabo con la ayuda de ®CPG (Controlled Pore Glass) o ®Fractosil, que mantiene unida la primera unidad de nucleósido a través del extremo 3'. En este caso, se llevaron a cabo las siguientes etapas:
1.
Lavado con acetonitrilo abs.
2.
Tratamiento con ácido tricloroacético al 3% en diclorometano
3.
Lavado con acetonitrilo abs.
4.
Condensación con 10 \mumol de 5'-O-dimetoxitritinucleósido-3'-ácido fosfórico-\beta-cianoetiléster-diisopropilamidita y 50 \mumol de tetrazol en 0,3 ml de acetonitrilo abs.
5.
Lavado con acetonitrilo
6.
Capeo con 20% de acetanhídrido en THF con 40% de lutidina y 10% de dimetilaminopiridina
7.
Lavado con acetonitrilo
8.
Oxidación con yodo (1,3 g en THF/agua/piridina; 70:20:5 = v:v:v)
Las etapas 1 a 8, denominadas de ahora en más ciclo de reacción de ADN, se repiten según la secuencia por sintetizar para la formación del oligonucleótido, en donde en la etapa 4 se empleó 5'-O-dimetoxitritil(nucleobase)-3'-ácido fosfórico-\beta-cianoetiléster-diisopropilamidita correspondiente a la secuencia. Una vez finalizada la síntesis, se produce la elaboración tal como se describió en el Ejemplo 8.
Ejemplo 28 Síntesis de d(Cz^{8}GCGCG)
La síntesis se realizó tal como se describió en el Ejemplo 25, partiendo de 5'-O-dimetoxitritil-2'-desoxiguanosina unida a CPG. Los primeros tres nucleótidos se realizaron con 5'-O-dimetoxitritil(nucleobase)-3'-Hfosfosfonatos que se obtienen en el comercio. Para introducir la 8-aza-2'-desoxiguanosina, se empleó en el cuarto ciclo de condensación la 3-{2-desoxi-5-O-(4,4'dimetoxitritil)-\beta-D-eritro-pentofuranosil}-5-{[(dimetilamino)metiliden]amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona 3'(fosfonato de trietilamonio) (4) del Ejemplo 4.
Ejemplo 29 Síntesis de d(Cz^{8}GCz^{8}GCG)
La síntesis se realizó análogamente a lo descrito en el Ejemplo 28, en donde para introducir la 8-aza-2'-desoxiguanosina en el segundo y cuarto ciclo de condensación, se empleó en cada caso la 3-[2-desoxi-5-O-(4,4'-dimetoxitritil)-\beta-D-eritro-pentofuranosil}-5-{[(dimetilamino)metiliden]-amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]-pirimidin-7-(6H)-ona 3'(fosfonato de trietilamonio) (4) del Ejemplo 4.
Ejemplo 30 Síntesis de d(GCz^{8}GCGC)
La síntesis se realizó análogamente a lo descrito en el Ejemplo 29, partiendo de un portador de CPG cargado con citidina, en donde para introducir la 8-aza-2'desoxiguanosina en el tercer ciclo de condensación se empleó la 3-(2-desoxi-5-O-(4,4'-dimetoxitritil)-\beta-D-eritro-pentofuranosil]-5-{{(dimetilamino)metiliden]amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona 3'(fosfonato de trietilamonio) (4) del Ejemplo 4.
Ejemplo 31 Síntesis de d(Tz^{8}GGGGT)
La síntesis se realizó análogamente a lo descrito en el Ejemplo 28, partiendo de 5'-O-dimetoxitritil-timidina unida a CPG, en donde para introducir la 8-aza-2'-desoxiguanosina en el cuarto ciclo de condensación se usó la 3-[2-desoxi-5-O-(4,4'-dimetoxitritil)-\beta-D-eritro-pentofuranosil]-5-{[(dimetilamino)metiliden]amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona 3'(fosfonato de trietilamonio) (4) del Ejemplo 4.
Ejemplo 32 Síntesis de d(TGz^{8}GGGT)
La síntesis se realizó análogamente a lo descrito en el Ejemplo 30, partiendo de 5'-O-dimetoxitritil-timidina unida a CPG, en donde para introducir la 8-aza-2'-desoxiguanosina en el tercer ciclo de condensación se empleó la 3-[2-desoxi-5-O-(4,4'-dimetoxitritil)-\beta-D-eritro-pentofuranosil]-5-{[(dimetilamino)metiliden)amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)-ona 3'(fosfonato de trietilamonio) (4) del Ejemplo 4.
Ejemplo 33 Síntesis de d(Tz^{8}Gz^{8}Gz^{8}Gz^{8}GT)
La síntesis se realizó análogamente a lo descrito en el Ejemplo 30, partiendo de 5'-O-dimetoxitritil-timidina unida a CPG, en donde para introducir la 8-aza-2'-desoxiguanosina en el ciclo de condensación uno a cuatro se usó en cada caso la 3-(2-desoxi-5-O-(4,4'-dimetoxitritil)-\beta-D-eritro-pentofuranosil]-5-{[(dimetilamino)metiliden]-amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)ona 3'[fosfonato de trietilamonio) (4) del Ejemplo 4.
Ejemplo 34 Síntesis de d(GTAz^{8}GAATTCTAG)
La síntesis se realizó análogamente a lo descrito en el Ejemplo 26, partiendo de 5'-O-dimetoxitritil-2'-desoxiguanosina unida a CPG. Para introducir la 8-aza-2'-desoxiguanosina se empleó en el octavo ciclo de condensación la 3-[2-desoxi-5-O-(4,4'-dimetoxitritil)-\beta-D-eritro-pentofuranosil]-5-{[(dimetilamino)metiliden]-amino}-3H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-7-(6H)ona 3'(fosfonato de trietilamonio) (4) del Ejemplo 4.
Ejemplo 35 Purificación de los oligonucleótidos protegidos con tritilo y desprotegidos por HPLC
Los oligómeros protegidos con Dmt se purificaron en una primera etapa de purificación a través de HPLC en una columna RP-18 con gel de sílice [sistema de eluyentes I) y se evaporaron hasta sequedad al vacío a 40ºC. El posterior tratamiento de 20 minutos con 250 \mul de ácido acético al 80% llevó a la separación del grupo 5'-tritilo. En una segunda etapa de purificación, se purificaron los oligómeros totalmente desprotegidos una segunda vez a través de RP-18 HPLC (sistema de eluyentes II). Las zonas principales reunidas se evaporaron, el residuo se disolvió en aproximadamente 500 \mul de agua y se desalinizaron a través de una columna corta RP-18 (sistema de eluyentes III). Después de la liofilización se extrajeron los oligómeros (5-20 unidades A_{260}) en 100 \mul de agua y se almacenaron a -25ºC.
Se usaron los siguientes sistemas de eluyentes, compuestos por:
-
acetato de trietilamonio 0,1 M, pH 7,0 / 5% de acetonitrilo (A)
-
acetonitrilo (B)
-
agua (C)
-
metanol / agua (3:2)
I:
20 min (0-20% de B) en A
II:
20 min (15-40% de B) en A
III:
15 min de C, 10 min de D
IV:
100% de A
V:
100% de B
Se observaron los siguientes tiempos de retención de los oligómeros:
Oligómero Ejemplo Tiempo de retención [min] Eluyente
d(Cz^{8}GCGCG) 10 15,1 (12,5) I (II)
d(Cz^{8}GCz^{8}GCG) 11 15,8 (12,9) I (II)
d(GCz^{8}GCGC) 12 15,5 (12,5) I (II)
d(Tz^{8}GGGGT) 13 13,4 (12,2) I (II)
d(TGz^{8}GGGT) 14 13,5 (12,1) I (II)
d(Tz^{8}Gz^{8}Gz^{8}Gz^{8}GT) 15 13,6 (12,4) I (II)
d(GTAz^{8}GAATTCTAG) 16 15,0 (12,4) I (II)
Ejemplo 36 Caracterización de los oligodesoxirribonucleótidos por hidrólisis enzimática
0,2 unidades A_{260} de los oligómeros se disolvieron en tampón de tris/HCl 0,1 M (pH 8,3, 200 \mul) y se incubaron con fosfodiesterasa de veneno de víbora (EC 3.1.4.1, Crotallus durissus, Boehringer Mannheim; 6 \mug) a 37ºC durante 45 min y con fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1, hígado de ternero, Boehringer Mannheim; 2 \mug) durante 30 min a 37ºC. Los productos de hidrólisis se detectaron por medio de HPLC en fase inversa (RP-18, eluyente IV) a 260 nm. En base a las superficies de los picos y los coeficientes de extinción de los nucleótidos (260: dA 15400, dC 7300, dG 11700, dT 8800, z^{8}G_{d} 12000) se pudo cuantificar la composición de los oligodesoxirribonucleótidos.
Ejemplo 37 Determinación de la hipocromicidad enzimática
La absorción UV a 260 nm de aproximadamente 0,2 unidades A_{260} de los oligómeros se determinó en tampón de tris/HCl 0,1 M (pH 8,3, 200 \mul) antes y después de la adición de fosfodiesterasa de veneno de víbora (10 \mug). Teniendo en cuenta la absorción enzimática, resulta la hipocromicidad de acuerdo con la relación:
H_{enzim}. = [(_{monómero} - _{oligómero}) (_{monómero})^{-1}] \times 100
Ejemplo 38 Determinación por espectroscopia UV y DC de los valores T_{m} y cálculo de los datos termodinámicos
El cálculo de los valores T_{m} de los oligómeros se realizó en un espectrofotómetro Cary 1 UV-Vis (Varian, Melbourne, Australia). La temperatura se modificó linealmente con 0,5ºC o bien 1,0ºC por minuto. Para ensayar la temperatura de fusión, se usaron concentraciones de oligómeros de entre 0,2-0,8 unidades A_{260} en 1 ml de tampón 60 mM de cacodilato de sodio (pH 7,5, NaCl 1 M, 100 mM de MgCl_{2}). La concentración monocatenaria era de 0,2-0,6 DO en los experimentos con oligonucleótidos no autocomplementarios. La hipocromicidad de fusión en % resulta de la modificación de la absorción antes y después de la fusión, de acuerdo con la siguiente ecuación:
H_{f} = [(A_{e}-A_{t})A_{e}^{-1}) \times 100
El análisis de las curvas de fusión se realizó con un programa partiendo de un modelo de dos estados ("stacked/unstacked") de acuerdo con la ecuación:
In \ K = In \ [(E^{S} - E)/(E^{U} - E)] = S/R - H/RT
con E = absorción en la correspondiente longitud de onda, S "stacked" y U = "unstacked"). Los espectros DC dependientes de la temperatura se registraron en el espectropolarímetro Jasco 600 con una cubeta de cuarzo atemperable en un intervalo de longitudes de onda de 200-350 nm. El aumento de la temperatura se realizó a intervalos de 5-10ºC en un intervalo de 5 - 80ºC en concentraciones de 3 - 15 \muM en 60 mM de tampón de cacodilato de sodio, así como en NaCl 0,1 M, 1 y 4 M.
Ejemplo 39 Valores T_{m} y datos de hipocromicidad para la formación en dúplex a)
Oligómero T_{m} [ºC] Hipocromicidad [%]
d(CGCGCG) 45 22
d(GCGCGC) 45 29
d(Cz^{8}GCGCG) 49 23
d(Cz^{8}GCz^{8}GCG) 52 21
d(GCz^{8}GCGC) 47 27
a) Medido en NaCl 1 M, 100 mM de MgCl_{2}, 60 mM de tampón de cacodilato, pH 7,0.
Ejemplo 40 Verificación de la estabilidad de la nucleasa
Se disuelven 10 nmol del oligonucleótido por ensayar en 450 \mul de suero fetal de ternero al 20% en medio RPMI y 50 ml de agua bidestilada, y se incuban a 37ºC. Luego se extraen, inmediatamente y al cabo de 1, 2, 4, 7 y 24 horas, muestras de 10 \mul para la electroforesis en gel o muestras de 20 \mul para HPLC, se mezclan con 5 \mul o 10 \mul de formamida para iniciar la reacción y se calientan durante 5 minutos a 95ºC. Para la electroforesis en gel se aplican las muestras sobre un gel de poliacrilamida al 15% (2% BIS) y se deja evolucionar durante aproximadamente 3000 horas completas. Las bandas se hacen visibles por coloración plateada. Para el análisis de HPLC se rocían las muestras en una columna de HPLC Gen-Pak Fax (Waters/Millipore) y se cromatografían a 1 ml/min con 5 a 50% de tampón A en B (tampón A: 10 mM de dihidrógeno-fosfato de sodio, NaCl 0,1 M en acetonitrilo/agua 1:4 (v:v) pH 6,8; tampón B: como A, pero NaCl 1,5 M).
Ejemplo 41 Ensayo de actividad antiviral
La actividad antiviral de las sustancias de ensayo contra distintos herpesvirus patógenos humanos se ensaya en el sistema de ensayo de cultivos celulares. Para el ensayo se siembran células de riñón de mono (Vero, 2 x 10^{5} ml) en MEM de Dulbecco con contenido de suero (suero fetal de ternero al 5% FCS) en placas de microtitulación de 96 pocillos y se incuban durante 24 h a 37ºC y 5% de CO_{2}. El medio que contiene suero se extrae luego por filtración y las células se enjuagan dos veces con MEM de Dulbecco sin suero (-FCS). Las sustancias de ensayo se diluyen previamente en H_{2}O hasta una concentración de 600 \muM y se conservan a 18ºC. Para el ensayo se realizan otras etapas de dilución en medio esencial mínimo de Dulbecco (MEM). Cada 100 \mul de cada una de las diluciones de sustancia de ensayo se vierten junto con 100 \mul de MEM de Dulbecco sin suero (-FCS) a las células enjuagadas. Al cabo de 3 h de incubación a 37ºC y 5% de CO_{2}, se infectan las células con Herpes simplex Virus tipo 1 (ATCC VR733, HSV-1 cepa F) o con Herpes simplex Virus tipo 2 (ATCC VR734, HSV-2 cepa G) en concentraciones en las que el cultivo celular se destruye por completo en un lapso de 3 días. En el caso de HSV-1, la potencia de la infección es de 500 unidades formadoras de placa (PFU) por cavidad. En el caso de HSV-2, 350 PFU/cavidad. Las tandas de ensayo contienen sustancia de ensayo en concentraciones de 80 \muM a 0,04 \muM en MEM, suplementado con 100 U/ml de penicilina G y 100 mg/l de estreptomicina. Todos los ensayos se realizan como determinación doble, a excepción de los controles que se efectúan ocho veces por placa. Las tandas de ensayo se incuban durantes 17 h a 37ºC y 5% de CO_{2}. La citoto-
xicidad de las sustancias de ensayo se determina a las 20 h de tiempo de incubación total por dictamen microscópico de los cultivos celulares. Como dosis máxima tolerada (DTM) se designa la máxima concentración del preparado que no provoca daños celulares detectables microscópicamente en las condiciones de ensayo mencionadas. Después se produce la adición de FCS hasta una concentración final de 4% con posterior incubación durante 55 h a 37ºC y 5% de CO_{2}.
Los controles no tratados de infección muestran un efecto citopático completo (CPE). Después del dictamen microscópico de los cultivos celulares, se colorean con rojo neutro de acuerdo con el procedimiento de coloración vital según
Finter (1966). La actividad antiviral de una sustancia de ensayo se define como la concentración mínima de inhi-
bición (MHK) que se necesita para proteger el 30-60% de las células del efecto citopatógeno originado por los virus.
Abreviaturas
A
adenosina
bz
benzoílo
br
amplio
calc.
calculado
DC
dicroísmo circular
d
duplete
CCD
cromatografía en capa delgada
dG
2'-desoxiguanosina
dA
2'-desoxiadenosina
dC
2'-desoxicitidina
dT
2'-desoxitimidina
DEPC
dietilpirocarbonato
DMA
dimetilacetamidina
(D_{6})DMSO
dimetilsulfóxido, 6 veces deuterado
DMF
dimetilformamida
ADN
ácido desoxirribonucleico
Dmt
4,4'-dimetoxitritilo (4,4'-dimetoxitrifenilmetilo)
EDTA
etilendiamintetraacetato
EtOAc
acetato de etilo
Et_{3}N
trietilamina
CF
cromatografía flash
G
entalpía libre
exp.
experimental
sec.
secado
h
hora
H
entalpía de la formación en dúplex
HPLC
cromatografía líquida de alta presión
Hip.
hipocromicidad
I
inosina
ibu
isobuturilo
J
constante de acoplamiento
K_{m}
constante de Michaelis-Menten
RMN
resonancia magnética nuclear
PAGE
electroforesis en gel de poliacrilamida
PCR
reacción de polimerasa en cadena
ppm
partes por millón
2-PrOH
isopropanol
R_{f}
retención en la CCD respecto del frente de eluyente
ARN
ácido ribonucleico
RP
fase inversa
TA
temperatura ambiente
s
singulete
S
entropía de la formación en dúplex
Pf
punto de fusión
SVPD
fosfodiesterasa de veneno de víbora
t
triplete
TBAF
fluoruro de tetrabutilamonio
TBK
bicarbonato de trietilamonio
TEP
fosfonato de trietilamonio
Tms
tris (1-metiletil)sililo
Tris
tris(hidroximetil)aminometano
T_{m}
temperatura de fusión en oligómeros
U
uridina
UV
ultravioleta
v_{máx}
velocidad máxima de reacción
z^{8}A
8-azaadenosina
z^{8}G
8-aza-2'-desoxiguanosina
\lambda
longitud de onda
\varepsilon
coeficiente molar de extinción.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Hoechst Aktiengesellschaft
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: -
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
LUGAR: Francfurt del Meno
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO FEDERADO: -
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 65926
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 069-305-6031
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 069-35 7175
\vskip0.500000\baselineskip
(I)
TELEX: 41234700 hod
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA SOLICITUD: Oligonucleótidos modificados, su preparación, así como su uso
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
CANTIDAD DE SECUENCIAS: 30
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
COMPUTADORA: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1,25 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: VIH
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..20
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACACCCAATT CTGAAAATGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: VIH
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..20
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGTCCCTGT TCGGGGCGCCA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: VIH
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..28
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGACACCC AATTCTGAAA ATGGATAA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: VIH
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..25
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTATGTCGA CACCCAATTC TGAAA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: VIH
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGTCGCTGT CTCCGCTTCT TCTTCCTGCC A 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: VIH
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGTCTCCGC TTCTTCTTCC TGCCATAGGA G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: VIH-1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..20
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGGGCTCC ATGGGGGTCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "c-Ha-ras"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCTGCAAC CCAGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "c-myc"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCTGCTGGA GCGGGGCACA C 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "c-myc"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACGTTGAGG GGCAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "c-myb"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACGTTGAGG GGCAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "c-myb"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGCCGGGGT CTTCGGGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: ratón
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "c-myb"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGTCGGGGT CTCCGGGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "c-fos"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGAACATC ATGGTCGAAA G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..22
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "c-fos"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGAGAACA TCATGGTCGA AG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "c-fos"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGAAAGCC CGGCAAGGGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "p-120"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCCGCCTT GGCCTCCCAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "receptor EGF"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGACTCCGG CGCAGCGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "receptor EGF"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCAAACTTT CTTTTCCTCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "supersor tumoral p53"
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGAAGGAGG AGGATGAGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "supresor tumoral p53"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCAGTCATC CAGCTTCGGA G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "cdc2-quinasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCTTCCATA GTTACTCA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "PCNA (antígeno nuclear de células proliferativas)"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCAGGCGT GCCTCAAA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..18
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "VLA-4"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGTAAGCA TCCATATC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "ICAM"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCCCACCAC TTCCCCTCTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "ICAM"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCCCCACC ACTTCCCCTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "ICAM"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGGGAGCC ATAGCGAGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "ELAM-1"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTGCTGCCT CTTGTCTCAG G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PRIMER ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..22
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "ELAM-1"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAATCAATGA CTTCAAGAGT TC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: / nota= "N = 8-azaguanina"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTANAATTCT AG 
\hfill

Claims (16)

1. Oligonucleótido de la fórmula I
23
así como sus sales fisiológicamente tolerables, en la que significan
R^{1}
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{2}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{2}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{3}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), un grupo protector usual en la química de los nucleótidos o un radical de la fórmula IIa
(IIa)Z --- 
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\para}
--- Z'
R^{1a}
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{2}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{2}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{3}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}) o un radical de la fórmula IIb
(IIb)Z --- 
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\para}
--- X
R^{2}
hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{18}, alqueniloxi C_{1}-C_{6}, halógeno, azido o -NH_{2};
a
oxi o metileno;
n
un número entero de 3 a 99;
W
oxo, tioxo o selenoxo;
V
oxi, sulfandiílo o imino;
Y
oxi, sulfandiílo, imino o metileno;
Y'
oxi, sulfandiílo, imino, (CH_{2})_{m} o V(CH_{2})_{m}, en donde significan
m
un número entero de 1 a 18;
X
hidroxi o mercapto;
U
hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{8}, alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), NHR^{3}, NR^{3}R^{4} o un radical de la fórmula III
(III),(OCH_{2}CH_{2})_{p}O(CH_{2})_{q}CH_{2}R^{5}
en la que significan
R^{3}
alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), 2-(CH_{2})_{c}-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{6}R^{6}, en donde c es un número entero de 2 a 6 y d es un número entero de 0 a 6, y R^{6} es, de modo independiente entre sí, hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6} o alcoxi C_{1}-C_{4}-alquilo C_{1}-C_{6};
R^{4}
alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20} o aril (C_{6}-C_{10})-alquilo (C_{1}-C_{8}) o, en el caso de NR^{3}R^{4} junto con R^{3} y el átomo de nitrógeno que llevan, un anillo heterocíclico de 5-6 miembros que adicionalmente puede contener otro heteroátomo de la serie de O, S, N,
p
un número entero de 1 a 100,
q
un número entero de 0 a 22,
R^{5}
hidrógeno o hidroxi, amino, alquilamino C_{1}-C_{18}, COOH, CONH_{2}, COO-alquilo (C_{1}-C_{4}) o halógeno;
Z y Z' de modo independiente entre sí,
\quad
hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{22}, -O-(CH_{2})_{b}-NR^{6}R^{7}, en donde b es un número entero de 1 a 6, y R^{7} es alquilo C_{1}-C_{6} o R^{6} y R^{7} junto con el átomo de nitrógeno que llevan forman un anillo de 3-6 miembros, alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), aril (C_{6}-C_{14})-alcoxi (C_{1}-C_{8}), en donde arilo también significa heteroarilo y arilo está eventualmente sustituido con 1, 2 ó 3 radicales iguales o diferentes de la serie de carboxi, amino, nitro, alquilamino C_{1}-C_{4}, alcoxi C_{1}-C_{6}, hidroxi, halógeno y ciano, alquilmercapto C_{1}-C_{18}, NHR^{3}, NR^{3}R^{4}, un radical de la fórmula III o un grupo que
a) favorece la absorción intracelular, es decir, radicales lipofílicos tales como -O-(CH_{2})_{x}-CH_{3}, en donde x es un número entero de 6 a 18, -O-(CH_{2})_{n}-CH=CH-(CH_{2})_{m}-CH_{3}, en donde n y m son, de modo independiente entre sí, un número entero de 6 a 12, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{4}-(CH_{2})_{9}-CH_{3}, O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}-(CH_{2})_{13}-CH_{3} y -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{7}-(CH_{2})_{15}-CH_{3}, radicales esteroides tales como colesterilo o radicales de vitaminas tales como vitamina E, vitamina A o vitamina D y otros conjugados que aprovechan los sistemas de portadores naturales tales como ácido biliar, ácido fólico, 2-(N-alquil, N-alcoxi)-aminoantraquinona y conjugados de manosa y péptidos de los correspondientes receptores que llevan a la endocitosis de los oligonucleótidos mediada por receptores como EGF (factor de crecimiento epidérmico), bradiquinina y PDGF (factor de crecimiento plaquetario), o
b) sirve como marcación de una sonda de ADN, es decir, grupos fluorescentes, por ejemplo de dansil-(=N-dimetil-1-aminonaftil-5-sulfonil-), derivados de fluoresceína o cumarina o grupos quimioluminiscentes, preferentemente derivados de acridina, el sistema de digoxigenina, el grupo biotina o también brazos de ligadores con grupos funcionales que permiten una derivación posterior con grupos informantes detectables, preferentemente un ligador de aminoalquilo que se hace reaccionar con un éster activado de acridinio para la prueba de quimioluminiscencia, o
c) en la hibridación del análogo de oligonucleótido en el ácido nucleico blanco lo ataca bajo unión, reticulación con enlaces cruzados o separación, es decir, conjugados de acridina, psoraleno, fenantridina, naftoquinona, daunomicina o cloroetilaminoarilo,
en donde cada nucleótido puede estar presente en su configuración D o L y la base B se puede hallar en posición \alpha o \beta, en donde B es, de modo independiente entre sí, una base usual en la química de los nucleótidos, en donde al menos una B significa una base de la fórmula IV
24
en la que E y F significan, de modo independiente entre sí, H, OH o NH_{2}.
2. Oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la base B se halla en posición \beta, los nucleótidos están en la configuración D, R^{2} se halla en la posición 2' y a es oxi.
3. Oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque
R^{1}
es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6} o un radical de la fórmula IIa;
R^{1a}
es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6} o un radical de la fórmula IIb;
R^{2}
es hidrógeno, alcoxi C_{1}-C_{6}, alqueniloxi C_{1}-C_{6} o hidroxi;
n
es un número entero de 4 a 39;
m
es un número entero de 1 a 6;
U
es hidroxi, mercapto, alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{6}, NR^{3}R^{4} o NHR^{3}, en donde
R^{3}
es alquilo C_{1}-C_{8} o metoxietilo;
\quad
y B, W, V, Y, Y', X y Z tienen el significado mencionado en la reivindicación 1.
4. Oligonucleótido de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque V, Y e Y' tienen el significado de oxi, sulfandiílo o imino.
5. Oligonucleótido de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque W tiene el significado de oxo o tioxo.
6. Oligonucleótido de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque U tiene el significado de hidroxi, metilo o mercapto.
7. Oligonucleótido de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque R^{1} y/o R^{1a} son hidrógeno.
8. Procedimiento para la preparación de oligonucleótidos de la fórmula I, así como sus sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque se condensa sucesivamente un nucleótido con una nucleobase en un portador derivado correspondiente o una cadena oligomérica creciente.
9. Uso de los oligonucleótidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-7 para la preparación de un medicamento o agente de diagnóstico.
10. Procedimiento para la preparación de un medicamento o agente de diagnóstico, caracterizado porque se mezcla al menos un oligonucleótido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-7 con un portador fisiológicamente aceptable, así como eventualmente aditivos y/o coadyuvantes apropiados.
11. Medicamento o agente de diagnóstico, que contiene uno o varios compuestos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-7, eventualmente junto con portadores y/o coadyuvantes fisiológicamente aceptables.
12. Monómero de nucleótidos de la fórmula V
25
en la que Y y R^{2} se definen como en la reivindicación 1;
V
es oxi, sulfandiílo o imino;
a
es oxi o metileno;
R^{1}
es un grupo protector usual en la química de los nucleótidos;
R^{1b}
es un radical de la fórmula IIc o IId
U --- 
\uelm{P}{\para}
--- Q 
\hskip1cm
(IIc) 
\hskip3cm
O 
\biequal
\melm{\delm{\para}{H}}{P}{\para}
--- O^{\ominus} 
\hskip1cm
(IId)
en las que significan
U
O-R^{7} o S-R^{7};
Q
un radical -NR^{8}R^{9};
R^{7}
-(CH_{2})_{2}-CN;
R^{8} y R^{9} son iguales o diferentes y son alquilo C_{1}-C_{6}, en especial isopropilo o etilo o, juntos con el átomo de nitrógeno que llevan, significan un anillo heterocíclico de 5-9 miembros que adicionalmente puede contener otro heteroátomo de la serie de O, S, N, en especial
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
E' y F' son, de modo independiente entre sí, H, OH o NR^{10}R^{11};
R^{10} y R^{11} son iguales o diferentes y son hidrógeno o un grupo protector de amino usual en la química de los nucleótidos o R^{10} y R^{11} forman juntos un grupo protector de amino usual en la química de los nucleótidos;
R^{12}
es un grupo protector de hidroxilo usual en la química de los nucleótidos.
13. Procedimiento para la preparación de un monómero de nucleótidos de la fórmula V de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque los correspondientes monómeros de nucleósidos de la fórmula V se convierten, después de la introducción de grupos protectores de amino o grupos protectores de hidroxilo apropiados, en los correspondientes derivados de fosfonato o fosforamidita.
14. Uso de un monómero de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 12 para la preparación de oligonucleótidos, que forman híbridos estables junto con sus ácidos nucleicos blanco.
15. Compuesto de la fórmula VI
27 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que, de modo independiente entre sí,
U' = U'' = U''' es igual a hidroxilo o mercapto;
e y f son 0 ó 1;
R^{13}
es hidrógeno u OH y
E y F son H, OH o NH_{2},
en donde se excluyen compuestos de la fórmula VI, en los que
U', U'', U''', R^{13} y F significan OH, E es igual a NH_{2} y e y f significan 1.
16. Uso de un oligonucleótido de la fórmula I de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-7 como cebadores en el diagnóstico del ADN.
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