JP3739785B2 - 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形 - Google Patents

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Description

技術分野
本発明は、一般にヌクレオモノマーおよびオリゴマーの類似体、および一本鎖または二本鎖の核酸標的配列へのオリゴヌクレオチドの類似体の結合によるオリゴヌクレオチドに基づく治療および診断に関する。さらに詳しくは、本発明は、ある種の５−置換ピリミジン塩基の残基を含有するオリゴマーおよびそれらの合成における中間体に関する。
背景の技術
一本鎖RNAおよびDNAおよび二重らせんDNAの両者へのオリゴヌクレオチドの配列特異的結合は実証された。一本鎖標的への結合のための適当な配列の認識はよく知られている：二重らせんの成形のＡ−ＴおよびＧ−Ｃ対成形の特性は、DNAの複製および転写のための基礎として確立された。
より最近、オリゴヌクレオチドは配列特異的な方法で二重らせんDNAに結合して三重らせんを成形することが示された。一本鎖核酸、主としてRNAは、「アンチセンス」のメカニズムにより遺伝子の発現を阻害するために使用されるオリゴヌクレオチドのための標的分子である(Uhlmann,E.ら、Chem.Reviews(1990)90:543-584;van der Krol,A.R.ら、Biotechniques(1988)6:958-976)。アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、相補的RNA配列とハイブリダイゼーションすることによって、標的遺伝子の発現に対して作用を発揮すると推定される。このモデルにおいて、ハイブリッドのRNA−オリゴヌクレオチドの二重らせんは、プロセシング、翻訳および代謝回転を包含するRNAの代謝の１または２以上の面を妨害する。化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、それらのヌクレアーゼ安定性を増強するために使用されてきている。
二重らせんDNAは、認識可能なヌクレオモノマーの配列に基づくオリゴマーにより特異的に認識されることができる。２つの主要な認識のモチーフが認識された。「CT」モチーフの初期の説明において、プロトン化シトシン残基はＧ−Ｃ塩基対を認識するが、チミン残基は二重らせんにおいてＡ−Ｔ塩基対を認識する。これらの認識のルールはMaher III,L.J.ら、Science(1989)245:725-730;Moser,H.E.ら、Science(1987)238:645-650により概説されている。より最近、「GT」認識と呼ばれる追加のモチーフが記載された（Beal,P.A.ら、Science(1992)251:1360-1363;Cooney,M.ら、Science(1988)241:456-459;Hogan,M.E.ら、欧州特許（EP）公開第375408号）。Ｇ−Ｔモチーフにおいて、Ａ−Ｔ対はアデニンまたはチミンにより認識された、そしてＧ−Ｃ対はグアニン残基により認識される。
これらの結合のモチーフの両者において、オリゴマーの認識配列は二重らせんのプリン鎖の相補的配列と整列しなくてはならない；こうして、例えば、Ａ−Ｔ対のチミンによる認識は二重らせんのプリン鎖に沿ったアデニル残基の位置に依存する。前述の例外はGriffin,L.C.ら、Science(1989)245:967-971による最近の報告であり、すなわち、制限された数のグアニン残基はピリミジンに富んだオリゴマー内に提供されそしてチミン−アデニン塩基対を特異的に認識することができる；これは少なくとも制限された数のピリミジン残基のホモプリン標的の中への封入を可能とする。
２つのモチーフは、二重らせんの中のホモプリン標的鎖に関して反対の結合の向きを示す。CTモチーフにおいて、ターゲッティングオリゴヌクレオチドは標的プリンに富んだ配列に対して平行である；ＧＴモチーフにおいて、オリゴヌクレオチドは逆平行の向きである(Beal,P.A.ら、Science(1990)251:1360-1363)。
ハイブリダイゼーションのpHが増加するにつれて、CTモチーフの巾のｃ残基により結合の効率は減少する。Ｃ（Ｃ+）のプロトン化互変異性体はフーグスィーン(Hoogsteen）結合における結合の競争種であるが、生理学的pHにおいて低いレベルで存在するのみである。これは4.25であるシトシンのpKaと一致する。塩基の類似体、例えば、５シトシン、pKa4.35(Lee,J.S.ら、Nucleic Acids Res.(1984)12:6603-6614)、８−オキソ−Ｎ6−メチルアデニン(Krawczyk,S.H.,Proc,Natl,Acad.Sci.(1992)89:3761-3764:国際特許出願第PCT／US91／08811号)、シュードイソシチジン(Ono,A.ら、J.Org.Chem.(1992)57:3225-3230;国際特許出願第PCT／US90／03275号)または炭素環式シチジン(Froehler,B.C.ら、J.Am.Chem.Soc.(1992)114:8320-8322;米国特許出願第07/864,873号、引用によってここに加える)は、拡張されたpH範囲にわたってCTモチーフの結合を得るために利用されてきている。
一本鎖および二重らせんの両者の標的配列は、診断、分析、および治療において応用を有する。このような結合を実施すべきある環境下において、生ずる二重らせんまたは三重らせんを長期間にわたって可溶化することは有利である。
標的へのオリゴマーの共有結合の架橋は、可溶化を延長する１つのアプローチを提供する。共有結合の架橋を伴う一本鎖DNAの配列特異的認識は、いくつかのグループについて報告された。例えば、Vlassov,V.V.ら、Nucleic Acids Res.(1986)14:4065-4076は、一本鎖DNA断片と標的配列に対して相補的なヌクレオモノマーのアルキル化誘導体との共有結合を記載している。同一グループによる同様な研究の報告は、Knorre,D.G.ら、Biochimie(1985)67:785-789により報告である。IversonおよびDervanは、また、切断を活性化することができる修飾されたヌクレオモノマーの組み込みにより仲介される一本鎖DNAの配列特異的切断を示した(J.Amer.Chem.Soc.(1987)109:1241-1243)。Meyer,R.B.ら、J.Amer.Chem.Soc.(1989)111:8517-8519は、一本鎖標的ヌクレオモノマー配列に対して相補的なアルキル化剤を使用する標的ヌクレオモノマーへの共有結合の架橋を実施している。プソラレンにより仲介される一本鎖オリゴヌクレオチドへの光活性化架橋は、Lee,B.L.ら、Biochemistry(1988)27:3197-3203により開示された。三重らせん成形プローブにおける架橋の使用は、また、Horneら、J.Am.Chem.Soc.(1990)112:2453-2437に開示された。
一本鎖および二本鎖のオリゴマーへの架橋に対するアルキル化剤としてＮ4，Ｎ4−エタノシトシンの使用が、また、記載された(WebbおよびMatteucci,J.Am.Chem.Soc.(1986)108:2764-2765;Nucleic Acids Res.(1986)14:7661-7674;Shaw,J.P.ら、J.Am.Chem.Soc.(1991)113:7765-7766)。これらの論文は、また、誘導されたシトシンを含有するオリゴヌクレオチドの合成を記載している。MatteucciおよびWebbは、Tetrahedron Letters(1987)28:1469-2472における後の論文において、Ｎ6，Ｎ6−エタノアデニンを含有するオリゴマーの合成および一本鎖DNAへのオリゴヌクレオチドの結合の場合におけるこの残基の架橋の性質を記載している。
最近の論文において、Praseuth,D.ら、Proc.Natl.Acid.Sci.(USA)(1988)85:1349-1353は、一本鎖および二本鎖の両者のDNAへの光活性化可能な架橋剤に接合したオクタチミジレートの配列特異的結合を記載している。
さらに、Vlassov,V.V.ら、Gene(1988)313-322およびFedorova,O.S.ら、FEBS(1988)228:273-276は、オリゴヌクレオチドの５′−リン酸塩を介して連鎖したアルキル化剤を使用する二重らせんDNAのターゲッティングを記載している。
プリン残基が標的の１つの鎖上に濃縮され、次いで反対の鎖上に濃縮される場合を提供するに、三重らせんを得るための結合を実施するとき、逆転した極性のオリゴマーを得ることができる。「逆転した極性」とは、オリゴマーが反対の極性を有する配列、すなわち、プール５′→３′を有する配列、次いで極性３′−５′をもつ配列、あるいはその逆である直列の配列を含有することを意味する。これが意味するように、これらの配列は、効果的に３′−３′インターヌクレオシド接合（しかしながら、連鎖は達成される）、あるいは効果的に５′−５′ヌクレオシド接合と考えることができる連鎖により接合される。このようなオリゴマーは、Capobionco,M.L.ら、Nucleic Acids Res.(1990)18:2661-2669により、管状オリゴヌクレオチドを得るための反応の副生物として示唆された。３′−３′逆位または５′−５′を使用してAT連鎖を固定するヘアピンを成形するようにデザインされた「平行の鎖のDAN」の組成物は、van de Sande,J.H.ら、Science(1988)241:551-557により合成された。さらに、３′−３′連鎖を含有するオリゴマーを使用する三重らせんの成形が記載された(Horne,D.A.およびDervan,P.B.,J.Am.Chem.Soc.(1990)112:2453-2437;Froehler,B.C.ら、Biochemistry(1992)31:1603-1609)。
標的遺伝子の発現を阻害する手段として三重らせん（またはトリプレックス）複合体後の使用は、従来提示された（国際特許出願第PCT／US89／05769号）。三重らせん構造は標的遺伝子の発現を妨害することが示され（国際特許出願第PCT／US91／09321号;Young,S.L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1991)88:10023-10026)、このアプローチの可能性を実証する。
欧州特許出願公開第92103712.3号、Rahim,S.G.ら(Antiviral Chem.Chmother.(1992)3:293-297)、および国際特許出願第PCT／SE91／00653号は、５−位置における不飽和基の存在により特徴づけられるピリミジンヌクレオモノマーを記載している。プロピニルおよびエチニル基は、前記特許出願に記載されている５−位置における誘導体の中に含まれる。
ウラシルの５−位置に不飽和アルキル基を有するヌクレオモノマーの合成は記載された(DeClaercq.E.ら、J.Med.Chem.(1983)26:661-666;Goodchild,J.ら、J.Med.Chem.(1983)26:1252-1257)。５−プロピニル修飾ピリミジンを含有するオリゴマーは記載された(Froehler,B.C.ら、Tetrahedron Letters(1992)33:5307-5310)。
５−プロピニル−２′−デオキシウリジン、５−ブチニル−２′−デオキシウリジンおよび関係する化合物の５′−トリホスフェートへの変換および引き続く大腸菌(E.coli)ポリメラーゼによるこのモノマーのオリゴマーへの組み込みは記載された(Valko,K.ら、J.Liquid Chromatog.(1989)12:2103-2116;Valko,K.ら、J.Chromatog(1990)506:35-44)。この研究は、構造として、ウラシルの５−位置の１系列の置換基を有するヌクレオチド類似体の活性の分析について実施された。大腸菌(E.coli)ポリメラーゼのための基質としてヌクレオチド類似体の活性は検査され、そしてモノマーの疎水性のような特性と相関関係づけられた。この類似体を含有するオリゴマーの性質に関する情報は提示されなかった。
欧州特許出願公開第0492570号（1992年７月１日公開）は、一本鎖ポリヌクレオチドのプローブを使用して標的ポリヌクレオチドを検出する方法を記載しており、ここで挿入分子をリンカーにより結合し、そしてこのリンカーは少なくとも３個の炭素原子および塩基に関してアルファ位置に二重結合を含む。
PCT特許出願WO92／02258号は、５または６位置に置換基、例えば、フェニルを含む、ヌクレアーゼ耐性の、ピリミジン修飾オリゴマーを記載している。５−フェニル−２′−デオキシウリジンは引き続いてオリゴマーの中に組み込まれ、そして一本鎖および二本鎖の両者の標的配列についてこの修飾を含有するオリゴマーの結合アフィニティーを減少することが示された。
アミダイトおよび水素ホスホネートの化学を介するDNA合成は記載された（米国特許第4,725,677号；米国特許第4,415,732号；米国特許第4,458,066号；米国特許第4,959,463号）。
相補的標的核酸配列に対して増強されたアフィニティーを有するオリゴマーは、診断の応用、治療の応用および研究の試薬のための改良された特性を有するであろう。こうして、相補的配列に対して増強された結合アフィニティーをもつオリゴマーが要求されている。本発明のオリゴマーは、二本鎖および／または一本鎖の標的配列に対して改良された結合アフィニティーを有する。
【図面の簡単な説明】
１．本発明の塩基を含有する２量体のシントン。
２．本発明の塩基を含有しかつ５および６構成員のリボアセタール型連鎖を含有する２量体のシントン。
３．本発明の塩基を含有しかつ６および７構成員のリボアセチル型連鎖を含有する２量体のシントン。
４．２′−Ｏ−アリル修飾を含有するモノマーの合成。
５．ｏ−キシレンスイッチバック２量体の合成（合成法＃１）。
６．２′−Ｓ−アルキル修飾を含有するモノマーの合成。
７．３′チオフォルムアセタール連鎖により連鎖された２量体の合成（方法＃２）。
８．３′−チオフォルムアセタール連鎖により連鎖された３量体の合成（方法＃２）。
９．リボアセタール連鎖により連鎖された２量体の合成（方法＃３）。
10．アミダイトまたはトリエステル化学を介するオリゴマーの合成のためのカップリング基。
11．ホルムアセタール連鎖により連鎖された２量体の合成（方法＃２）。
12．（１）水素ホスホネート、（２）アミダイト化学および（３）メチルホスホネート誘導体によりオリゴマーの合成（方法＃１）。
13．アミド連鎖を含有するオリゴマーのためのモノマーの合成（方法＃４）。
14．５−（（１−エチニル）−２ピリミジニル）−２′−デオキシウリジンのヌクレオモノマーの合成。
15．５−（２−ピリジニル）−２′−デオキシウリジンおよび５−（２−ピリジニル）−２′−デオキシシチジンのヌクレオモノマーの合成。
16．５−（２−チエニル）−２′−デオキシウリジン誘導体の合成。
17．アミド置換基の連鎖；反復ヌクレオモノマーの単位および例示のアミド連鎖オリゴマーの構造を含有するオリゴマー。
19．本発明の塩基および例示の２′，５′連鎖；チオホルムアセタールおよびカルバメートの連鎖を含有する２量体のシントン。
構造式
ここに記載する構造式は、括弧内の数字（（１）、（２）など）として表示し、そして化合物は下線の数字（１、２など）として表示する。
発明の開示
本発明は、少なくとも２つ、好ましくは多数のヌクレオモノマーからなるオリゴマーを提供し、ここで少なくとも１つのヌクレオモノマーは式（１）または（２）の塩基からなる：
Figure 0003739785
式中、
Ｘは独立にＯまたはＳであり、
Ｒ2は塩基に結合した炭素原子に接続した少なくとも１つのpi結合からなる基であり、そして
Prは（Ｈ）2または保護基であり、
ただし前記オリゴマーの前記ヌクレオモノマーの少なくとも１つが、ビニル、１−ブテニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニル、１−ヘプテニル、１−オクテニル、１−プロピニル、１−ブチニル、１−ヘキシニル、１−ヘプチニル、または１−オクチニルにより５−置換されたデオキシウリジンからなるとき、前記オリゴマーを構成するヌクレオモノマーの残部はホスホジエステル連鎖した２′−デオキシアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン、チミジンまたはそれらの組み合わせのみから構成されない。
定義
次の定義は、以後においていっそう完全に定義する用語の簡単な摘要である。
ヌクレオモノマー。ここにおいて使用するとき、用語「ヌクレオモノマー」は、（２）第２部分に共有結合で連鎖した（１）塩基からなる部分を意味する。ヌクレオモノマーはヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含する。ヌクレオモノマーは連鎖して、配列特異的な方法で核酸の中の標的または相補的塩基配列に結合するオリゴマーを成形することができる。
「第２部分」は、ここにおいて使用するとき、糖部分の修飾を含有する種、例えば、ヒドロキシル基の１または２以上がハロゲン、複素原子、脂肪族基で置換されているか、あるいはエーテル、アミンなどとして官能化されている種を包含する。ペントース部分はヘキソースまたは別の構造、例えば、シクロペンタン環、６−構成員のモルホリノ環などにより置換されることができる。ヌクレオシドは、ここにおいて定義するとき、また、遊離のカルボキシル基および／または遊離アミノ基および／またはそれらの保護された形態を有するアミノ酸および／またはアミノ酸類似体に連鎖した塩基を包含することを意図する。
塩基。「塩基」は、ここにおいて使用するとき、既知のプリンおよびピリミジンの複素環および本発明のピリミジンばかりでなく、かつまた複素環およびそれらの互変異性体を含有する部分を包含する。プリンは、アデニン、グアニンおよびキサンチンを包含し、そして例示のプリン類似体は８−オキソ−Ｎ6−メチルアデニンおよび７−デアザキサンチンを包含する。ピリミジンは、ウラシルおよびシトシンおよびそれらの類似体、例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラシルおよび４，４−エタノシトシンを包含する。本発明の塩基は、５−位置において誘導されたピリミジンである。誘導体は、１−アルケニル、１−アルキニル、複素芳香族および１−アルキニル−複素芳香族の修飾体である。「１−アルケニル」はオレフィン系の不飽和の（二重結合を含有する）非環式基を意味する。「１−アルキニル」は、アセチレン系不飽和の（三重結合を含有する）アシル基を意味する。「複素芳香族」は、少なくとも１つの複素環式環、５または６環原子を有し、物理的および化学的性質が類似する化合物、例えば、芳香族基を有する化合物を意味する、「複素芳香族」は、また、２環式部分、例えば、ベンズイミダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾキサゾールおよびインドールを包含する、１または２以上の環を有する系を意味する。塩基は、また、複素環、例えば、２−アミノピリミジンおよびトリアジンを包含する。１−アルキニル−複素芳香族は、１−エチニル−ヘテオロアリールを意味し、ここでヘテロアリールは上に定義した通りである。
ヌクレオシド。ここにおいて使用するとき、「ヌクレオシド」は糖または糖類似体に共有結合しかつホスファイトまたはホスフィンを含有することができる塩基を意味する。用語ヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、あるいは塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである他のヌクレオシドを包含する。糖炭素の立体化学は、Ｄ−リボースのそれ以外であることができる。
ヌクレオシドは、糖部分の修飾を含有する種、例えば、ヒドロキシル基の１または２以上がハロゲン、複素原子、脂肪族基で置換されているか、あるいはエーテル、アミン、チオールなどとして官能化されている種を包含する。ペントース部分はヘキソースまたは別の構造、例えば、シクロペンタン環、６−構成員のモルホリノ環などにより置換されることができる。ヌクレオシドは、ここにおいて定義するとき、また、遊離のカルボキシル基および／または遊離アミノ基および／またはそれらの保護された形態を有するアミノ酸および／またはアミノ酸類似体に連鎖した塩基を包含することを意図する。
ヌクレオチド。ここにおいて使用するとき、「ヌクレオチド」は、ホスフェート基またはホスフェート類似体を有するヌクレオシドを意味する。
糖の修飾。ここにおいて使用するとき、「糖の修飾」は２′−デオキシリボース以外の任意のペントースおよびヘキソースの部分を意味する。修飾された糖は、Ｄ−リボース、２′−Ｏ−アルキル、２′−アミノ、２′−ハロ官能化ペントース、ヘキソースなどを包含する。Ｄ−リボースの立体化学以外の立体化学を有する糖も包含される。
連鎖。ここにおいて使用するとき、「連鎖」は、隣接するヌクレオモノマーに共有結合的にカップリングするホスホジエステル部分（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ）−Ｏ−）を意味する。
置換連鎖。ここにおいて使用するとき、「置換連鎖」は、隣接するヌクレオモノマーに共有結合的にカップリングする自然のホスホジエステル基の任意の類似体を意味する。置換連鎖は、ホスホジエステル類似体、例えば、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートおよび非リン含有連鎖、例えば、アセタールおよびアミドを包含する。
スイッチバッグ。ここにおいて使用するとき、「スイッチバッグ」は、逆の極性の少なくとも１つの領域を有するオリゴマーを意味する。スイッチバッグオリゴマーは、また、二重らせんの反対の鎖に結合して、二重らせんの両者の鎖上に三重らせんを成形することができる。逆の極性の領域を接合するリンカーは置換連鎖である。
オリゴマー。オリゴマーは、ここにおいて、連鎖または置換連鎖の部分により互いに共有結合的にカップリングした２またはそれ以上のヌクレオモノマーとして定義される。こうして、オリゴマーは２程度に少ないヌクレオモノマー（２量体）を有することができる。オリゴマーは受容的に結合することができ、こうして、同族の一本鎖または二本鎖の核酸配列と塩基対になることができる。オリゴマー（例えば、２量体〜ヘキサマー）は、また、ここに記載するより長いオリゴマーのためのシントンとして有用する。オリゴマーは、また、非塩基部位およびシュードヌクレオシドを含有することができる。
ブロッキング基。ここにおいて使用するとき、「ブロッキング基」は、保護基、合成のためのカップリング基、PO3 -2、または他の普通の接合体、例えば、固体の支持体として、オリゴマーまたはヌクレオモノマーに共有結合されているＨ以外の置換基を呼ぶ。あう、「ブロッキング基」は、スラングノ学術用語に従い、保護基としてのみと解釈を意図するばかりでなく、かつまた、例えば、カップリング基、例えば、水素ホスホネートまたはホスホアミダイトを包含する。
保護基。「保護基」は、ここにおいて使用するとき、それが結合するＯ原子またはＮ原子が反応または結合に参加することを防止できる任意の基を意味する。ヌクレオモノマーの中のＯおよびＮ原子のためのこのような保護基に記載されており、そしてそれらの導入方法は普通にこの分野において知られている。保護基は、また、カルボン酸、チオールなどにおける反応および結合を防止する。
カップリング基。「カップリング基」は、ここにおいて使用するとき、ヌクレオモノマーの間で連鎖または置換連鎖、例えば、水素ホスホネートまたはホスホアミダイトを発生するために適当な任意の基を意味する。
接合。「接合」は、ここにおいて使用するとき、オリゴマーに末端またはオリゴマーそれ自体内で結合する基を任意の意味する。接合は、固体の支持体、例えば、シリカゲル、調節された孔のガラスおよびポリスチレン；標識、例えば、蛍光、化学発光、放射線、酵素の部分およびリポーター基；オリゴマーの輸送剤、例えば、ポリカチオン、血清タンパク質および糖タンパク質およびポリマーなどを包含する。
pi結合。「pi結合」は、ここにおいて使用するとき、不飽和の共有結合、例えば、二重結合または三重結合を意味する。両者の原子は、炭素であることができるか、あるいは一方は炭素でありそして他方は窒素であることができ、例えば、フェニル、プロピニル、シアノなどであることができる。
シントン。「シントン」は、ここにおいて使用するとき、既知のまたは便利な合成操作により成形および／またはアセンブリングすることができる分子内の構造単位を意味する。
トランスフェクション。「トランスフェクション」は、ここにおいて使用するとき、オリゴマーの細胞の中への増大された送り出しのために適当な方法を呼ぶ。
被検体。「被検体」は、ここにおいて使用するとき、動物、例えば、哺乳動物、とくにヒトを意味する。
発明の説明
修飾された塩基（１）または（２）のいずれかまたは両者を包含するオリゴマーは、それぞれ、一本鎖RNAまたはDNAまたは二重らせんの標的配列との二重らせんまたは三重らせんの成形において増強された結合能力を示す。
前述のある種の５−置換ピリミジンが存在するとき、追加のヌクレオモノマーの修飾は後述するように広く変化することができる。好ましくは、追加の修飾は少なくとも１つの置換連鎖または糖の修飾、例えば、２′−置換デオキシリボースである。
本発明の塩基（１）または（２）の置換、例えば、DNA二重らせんをターゲッティングするオリゴマーの中のチミンリードアウトシトシンのための５−（１−アルケニル）−、５−（１−アルキニル）−、５−（１−複素芳香族）−または１−アルキニル−複素芳香族で置換された塩基は、増強された結合アフィニティーをもつ結合受容オリゴマーを提供する。本発明の５−置換ウラシルまたはチオウラシル塩基の残基によりチミン塩基の残基についての置換あるいは本発明の５−置換シトシン塩基の残基によるシトシンまたは２−チオシトシン塩基の残基についての置換は、生ずるオリゴマーの一本鎖DNAまたはRNA標識への結合の能力を増強する。さらに、５−置換ピリミジン塩基の残基のいくつかは二本鎖DNAとの三重らせんの成形を有意に増強する。
いくつかのＲ2について、オリゴマーの中のＴについての５−Ｒ2置換Ｕ（５−Ｒ2−Ｕ）の置換は、チミンを含有するオリゴマーと比較したとき、三重らせんおよび二重らせんを成形する増強された能力を生ずる。これらのオリゴマーにおける５−Ｒ2−Ｕは、三重らせんの成形において、平行のCT三重らせんのモチーフにおいてハイブリダイゼーションするとき、アデニン−チミン塩基対の中のアデニン残基を認識する。８−オキソ−Ｎ6−メチルアデニン（三重らせんの結合のためのシトシン類似体）および５−Ｒ2−Ｕを有するオリゴマーは、また。CTモチーフにおいて結合する。５−Ｒ2−Ｕおよびグアニンを有するオリゴマーは、CTモチーフを介する二重らせん配合への三重らせんの結合のために適当である（５−Ｒ2−Ｕはアデニンを認識する）。Ｃの代わりに５−Ｒ2−Ｕ置換Ｃ（５−Ｒ2−Ｃ）の置換を含有するいくつかのオリゴマーは、二重らせんDNAに結合するが、対応する位置に５−メチルシトシンを含有する対照のオリゴマーほどよく結合しない。三重らせんの形効率の減少は、置換された塩基のpKaの減少から主として生ずると信じられる。５−メチルシトシンを含有するヌクレオモノマーに相当する５−プロピニル置換ヌクレオモノマーにおいてpKaはわずかに3.30である。
こうして、本発明のオリゴマーは、生理学的pHの条件下に標的DNA二重らせんの主溝における結合により、種々の標的配列、例えば、腫瘍遺伝子またはウイルスの中に見いだされるものと三重らせんを成形することができる。
しかしながら、５−Ｒ2−Ｃについて前述したようにヘテロサイクルのpKaの変更は、一本鎖の標的核酸への結合に有意に影響を与えない。Ｔの代わりに５−Ｒ2置換Ｕおよび／またはＣの代わりに５−Ｒ2置換Ｃを含有する本発明のオリゴマーは、二本鎖標的配列に効率よく結合することに加えて、また、一本鎖RNAに効率よく結合することが発見された。５−Ｒ2−Ｃまたは５−Ｒ2−Ｕを含有するオリゴマーは、後述するように対照オリゴマーにより形成された二重らせんに比較して、増加した熱安定性（Ｔm）を有した相補的一本鎖RNAと二重らせん構造を形成した。
したがって、１つの面において、本発明は、少なくとも１つのヌクレオモノマーが上の式（１）または（２）の塩基からなる、少なくとも２つ、好ましくは多数のヌクレオモノマーからなるオリゴマーに関する。
好ましくは、各ＸはＯである、すなわち、式（１）はウラシルであり、そして式（２）はシトシンである。他の適当なピリミジンは、４−チオウラシル、２−チオウラシル、２，４−ジチオウラシルおよび２−チオシトシンを包含する。
本発明の１つの態様において、Ｒ2はシアノ、Ｃ2-12１−アルケニルまたは１−アルキニルであるか、あるいは環原子の１〜３つがＮ，ＳまたはＯである５〜６環原子を含有するＣ2-12複素芳香族基である。好ましくは、Ｒ2はＣ2-6１−アルケニルまたは１−アルキニルあるいは１つの環原子がＮでありそして必要に応じて第２の環原子がＮ，ＳまたはＯである５〜６環原子を含有するＣ2-8複素芳香族基である。
「１−アルケニル」とは、オレフィン系不飽和の非環式基、例えば、ビニル、１−プロペニル、１−ブテニルを意味し、必要に応じてハロゲンまたはアルキニル基により置換されていてもよい。
「１−アルキニル」とは、アセチレン系不飽和の非環式基、例えば、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニル、１−ペンチニル、１，３−ペンタジイニルなどを意味し、必要に応じてアリールまたはヘテロアリール基により置換されていもよく、例えば、フェニルエチニル、ピリジン−エチニル、ピリミジン−エチニル、トリアジン−エチニル、チオフェン−エチニル、チアゾール−エチニルおよびイミダゾール−エチニルである。
「複素芳香族」とは、物理的および化学的性質が類似する化合物を有する少なくとも１つの複素環を有する化合物、例えば、１〜３つの環原子がＮ，ＳまたはＯである、５〜６環原子および２〜12炭素原子の芳香族基、例えば、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、２−チアゾイル、トリアジニル、２−イミダゾリル、２−オキサゾリル、２−ピリジニル（ｏ−ピリジニル）、３−ピリジニル（ｍ−ピリジニル）、４−ピリジニル（ｐ−ピリジニル）、２−チエニル、２−フラニル、２−ピロリルである、必要に応じて好ましくは環Ｃ上で酸素、１〜４炭素原子のアルキルまたはハロゲンにより置換されていてもよいか、あるいは環Ｎ上で１〜４炭素原子のアルキル置換されていてもよい。ヘテロアリール基上の好ましい置換基は、メチル、エチル、トリフルオロメチル、およびブロモである。
好ましいオリゴマーは、１または２以上の５−Ｒ2−Ｕまたは５−Ｒ2−Ｃ塩基を含有する。
本発明の他の態様において、オリゴマーは式（１）または（２）の少なくとも１つの塩基からなり、ここでＸは独立にＯまたはＳである；そしてＲ2はフェニルエチニル、２−，３−、および４−ピリジン−エチニル、２−，４−および５−ピリミジン−エチニル、トリアジン−エチニル、２−，４−および５−ピリミジニル、２−，４−、および５−チアゾリル、１−メチル−２−イミダゾリル、２−および４−イミダゾリル、２−，４−および５−オキサゾリル、３−ピリジニル、４−ピリジニル、２−ピリジニル、２−および３−フラニル−エチニル、２−および３−チエニル−エチニル、２−および４−イミダゾリル−エチニル、２−，４−および５−チアゾイル−エチニル、２−，４−および５−オキサゾリル−エチニル、２−および３−ピロリル−エチニル、２−および３−チエニル、２−および３−フラニル、２−および３−ピロリル、プロペニル（−CH＝CH−CH3）、ビニルおよび−Ｃ≡Ｃ−Ｚ（ここでＺは水素（Ｈ）またはＣ1-10アルキル、ハロアルキル（１〜６ハロゲン原子をもつＣ1-10またはヘテロアルキル（Ｏ，ＮおよびＳから成る群より選択される１〜３複素原子をもつＣ1-10）である）から成る群より選択される；そして
Prは(H)2または保護基である。
−Ｃ≡Ｃ−Ｚの例は、１−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−CH3）、３−ブテン−１−イニル（−Ｃ≡Ｃ−CH＝CH2）、３−メチル−１−ブチニル（−Ｃ≡Ｃ−CH（CH3）2）、３，３−ジメチル−ブチル（−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（CH3）3）、１−ブチニル（−Ｃ≡Ｃ−CH2−CH3）、１，３−ペンタジエニル（−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−CH3）およびエチニルを包含する。
好ましいハロゲンは、フッ素、塩素および臭素から成る群より選択される。ブロモビニルを含む置換基をオリゴマーの中に含めることができる。
本発明の１つの面は、ヌクレオモノマー、２つの連鎖したヌクレオモノマー（２量体）、３つの連鎖したヌクレオモノマー（３量体）、４つの連鎖したヌクレオモノマー（４量体）、５つの連鎖したヌクレオモノマー（５量体）または６つの連鎖したヌクレオモノマー（６量体）を本発明のより長いオリゴマーの合成において中間体として使用することを包含する。
他の面において、本発明は前述のオリゴマーを一本鎖または二本鎖の核酸標的に結合することによって得られた二重らせんまたは三重らせんに関する。
本発明の合成における他の有用な本発明は、構造式（５）を有するｏ−キシロソ２量体を包含する；
Figure 0003739785
式中、各Ｙは独立にオリゴマーまたはＲ1である；そして各Ｂは独立に塩基であるが、ただし少なくとも１つのＢは式（１）または（２）の塩基であり、ここでＲ2はここにおいて定義した通りである。
また、第１図に示す式（６）の中間体が含まれ、式中ＸはＯおよびＳから成る群より選択される；そして各Ｙ，Ｂ，およびＲ3は独立に選択されそしてここにおいて定義する意味を有する。
本発明のオリゴマーは、また、CTまたはGT三重らせん結合のモチーフを介するDNA二重らせん標的への結合のために適当である。
本発明の新規なオリゴマーは、アンチセンスの治療（ここでオリゴマーは選択された相補的RNA配列とハイブリダイゼーションする）または三重らせんの治療（ここでオリゴマーは選択した相補的DNA配列とハイブリダイゼーション）において有用である。
本発明は、また、本発明の式（１）または（２）の少なくとも１つの塩基の正の修飾および負の修飾からなり、各々が相補的核酸配列に対して相補的なオリゴマーの結合アフィニティーに関する、オリゴマーに関する。正の修飾は、結合アフィニティーに関して加法的より多い程度に負の修飾に反作用する。
本発明の１つの面は、修飾をもたないオリゴデオキシヌクレオチドに関するヌクレアーゼの分解に対して耐性であるオリゴマーに本発明の塩基を含めることである。本発明のヌクレアーゼ耐性は、ヌクレアーゼが存在する条件下に有利に使用される。ある種の応用、例えば、アンチセンスメカニズムを介する遺伝子の発現の修飾のために、本発明のオリゴマーのヌクレアーゼ安定性はオリゴマーの重要な機能的面である。
本発明の他の面は、本発明のオリゴマーからなる薬剤組成物、試薬およびキット、状態、例えば、癌およびウイルスなどを処置する方法に関する。このような状態は、特定の核酸、例えば、DNA二重らせんまたは一本鎖DNAに関連するか、あるいはそれらにより特徴づけられる。
本発明の追加の面は、生物学的（または他の）試料中の特定の一本鎖RNAまたはDNAまたは特定の標的二重らせんの存在、不存在または量を、本発明のオリゴマーを使用して検出して、選択した核酸配列を置換方法を包含する。このような配列は新形成の増殖、ウイルスまたは疾患の状態に関連されることができる。本発明のオリゴマーを含有する試薬およびキットは、（ｉ）組織培養における細胞の増殖を包含するin vitroの細胞の中の遺伝子の発現を変調するために、および（２）標的配列を検出しおよび／または定量するために有用な試薬としてのオリゴマーの円滑な使用を可能とする、本発明の面を表す。
本発明のオリゴマーのいくつかは、本発明の５−置換をもたない未修飾のオリゴマーに比較して、相補的一本鎖および二本鎖の核酸配列に関して増強された結合特性を有することが発見された。三重らせん構造体は、未修飾の対照オリゴマーが効率に劣る、7.0およびそれより高い生理学的レベルのpHにおいて成形することができる。改良された二重らせんの成形がまた認められる。
本発明の特徴は、本発明のオリゴマーが種々の異なる配列から構成することができ、これにより種々の異なる一本鎖または二本鎖の標的配列をターゲッティングするために使用できることである。
本発明の１つの利点は、生理学的pHの条件下に三重らせんを成形できることである。
チミンまたはシトシンを含有するオリゴマーと比較して、本発明の５−Ｒ2置換ウラシルまたはシトシン塩基（１）または（２）を含有するオリゴマーの他の面は、親油性基（Ｒ2）が細胞の透過または吸収を増強できるということに示す。これらの塩基を含有するヌクレオモノマーは、逆相HPLC上の保持時間に基づいて、ウリジン、シチジンまたはチミジン塩基よりいっそう親油性である。
追加のヌクレオモノマーの修飾
ヌクレオモノマーから構成された生物は、本発明の５−修飾ピリミジンに加えて修飾をまた含有することができる。このような追加の修飾の非限定的例は、（ｉ）１または２以上のヌクレオモノマー残基が２′位置において修飾されている、（ii）１または２以上の共有結合の架橋部分が組み込まれている、（iii）逆の極性のリンカーが組み込まれている、（ｉ）置換連鎖がを含まれている、（ｖ）他の塩基の類似体、例えば、８−オキソ−Ｎ6−メチルアデニンがを含まれている、および（vi）接合体、例えば、それぞれ、核酸配列をテーゲッティングする結合アフィニティーを増強するか、あるいはオリゴマーと細胞とのアソシエーションを増強する挿入剤またはポリリジンがを含まれている、オリゴマーを包含する。
一本鎖および二本鎖の標的に対するオリゴマーのアフィニティーを増強する（正の修飾）本発明の塩基（１）および（２）の５−置換の能力は、それらが含有されるオリゴマーのそれ以上の修飾を可能とする。これらのそれ以上の修飾は、アフィニティーを減少するか、あるいはしないことがあるが、また他の有用な性質、例えば、ヌクレアーゼの切断に対する安定性、細胞膜を透過する能力などを付与する。それ以上の修飾（負の修飾）から生ずる結合アフィニティーの減少は、５−置換塩基（１）および（２）により付与される増強されたアフィニティーのために許容される。こうして、本発明のとくに好ましいオリゴマーは、置換連鎖および／または修飾された糖、ならびに本発明の５−置換塩基（１）および（２）を含有することができる。
オリゴマーは、また、これらの５−修飾ピリミジンを含有するヌクレオモノマーの中に、あるいはオリゴマーを構成する他のヌクレオモノマーの中に追加の修飾を含有することができる。
１または２以上の置換連鎖、例えば、サルファイドまたはスルホン連鎖（Benner,S.A.,国際特許公開第WO89／12060号）、スルファメート連鎖（国際特許公開第WO91／15500号）、モルホリノ連鎖オリゴマーの中のカルバメート連鎖(Stirchak,E.P.ら、Nucleic Acids Res.(1989)17:6129-6141)および第１図に示す式（７）のモルホリノオリゴマーの中の関係する連鎖を含有するオリゴマーは、また、包含され、式（７）においてＸ2はCO，CSまたはSO2である；Ｘ3はＯ，Ｓ，NH，NCH3, CH2, CF2またはCHFである；各Ｙは独立にオリゴマーまたはＲ1でありそしてＢは独立に選択されそして前に定義した意味を有するが、ただし少なくとも１つのＢは式（１）または（２）の塩基である。
リボアセタールまたは関係する連鎖、アミド連鎖および２′，５′連鎖は普通に所有された係属中の米国特許出願第07／806,710号、1991年12月12日出願、米国特許出願第07／899,736号、1992年１月28日出願、米国特許出願第07／894,397号および米国特許出願第07／892,902号（各々を引用によってここに加える）に記載されている。
リボアセタールおよび式（８〜15）の関係する連鎖を含有する例示的２量体は第２図および第３図に示されており、ここで各構造式について、
Ｒ1およびＢは独立に選択され、そして上に定義した意味を有する；
Ｒ3は上に定義した意味を有する；
Ｘ3はＯ，Ｓ，NH，NCH3，CH2，CF2またはCHFから成る群より独立に選択される；
Ｘ4はＯ，Ｓ，SO，SO2，CH2, CF2, CS，NHおよびNR4から成る群より独立に選択され、ここでＲ4は低級アルキル（Ｃ1-4；メチル、エチル、プロピル、イソプロピル，ブチルまたはイソブチルである）である；
Ｘ5はＯ，CO，Ｓ，CH2，CS，NHおよびNR4から選択される；
Ｘ6はCH，Ｎ，CF，CCl，およびCR5から成る群より選択され、ここでＲ5はメチルまたは低級アルキル（Ｃ2-4）フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチルまたは低級フルオロアルキル（Ｃ2-4，Ｆ1-5）である；
Ｘ7はＯ，Ｓ，CH2，CO，CF2およびCSから成る群より選択され、
ただし少なくとも１つのＢが上に定義した式（１）または（２）を有する；そして
さらにただし隣接するＸ4，Ｘ5またはＸ7はＯ（すなわち、Ｏ−Ｏ−、過酸化物）ではない。
５構成員の系列の化合物は、１または２以上のリボアセタール連鎖を含有するオリゴマー（式（８），式中Ｘ4はＯであり、そしてＸ5，Ｘ7はCH2であり、そしてＸ6haCHである。
アミド結合を介して連鎖したヌクレオモノマー残基を含有するオリゴマーが、また、含まれる。例示的例は記載された(Mielsen,P.E.ら、Science(1991)254:1497-1500;普通に所有された同時係属米国特許出願第07／889,736号、1992年１月28日出願、および米国特許出願第07／894,397号、1992年６月５日出願（両者を引用によってここに加える）。
オリゴマー
ここにおいて使用するとき「オリゴマー」は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、ポリデオキシリボヌクレオチド（２′−デオキシ−Ｄ−リボースまたはその修飾された形態）、すなわち、DNA、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースまたはその修飾された形態）、すなわち、RNA、およびプリンまたはピリミジン塩基または修飾されたプリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドの任意の他のタイプを包含する。オリゴマーは、ここにおいて使用するとき、また、隣接するヌクレオモノマーが従来記載されているようにアミド連鎖を介して連鎖した化合物を包含することを意図する(Nielsen,P.E.,Science(1991)254:1497-1500)。本発明の塩基を含有するオリゴマーによる結合の増強された能力は、主として塩基単独の機能であると信じられる。このために、オリゴマーの中の通常見いだされる要素、例えば、フラノース環および／またはホスホジエステル連鎖は任意の適当な機能的に同等の要素で置換することができる。「オリゴマー」は、こうして、塩基のスカホールドまたは支持体として働く任意の構造体を包含し、ここでスカホールドは配列依存性の方法で標的核酸への結合を可能とする。現在知られているオリゴマーは、（ｉ）ホスホジエステルおよびホスホジエステル類似体（ホスホロチオエート、メチルホスホネートなど）の連鎖、（ii）非リンのアイソスター（ホルムアセタール、リボアセタール、カルバメートなど）を含有する置換連鎖、（iii）リボースまたはデオキシリボースの代わりにモルホリノ残基、炭素環式残基または他のフラノース糖、例えば、アラビノースまたはヘキソースおよび（iv）アミドを介して連鎖したヌクレオモノマーまたは任意の適当な置換連鎖を介して連鎖した非環式連鎖を有するとして特徴づけることができる４つのグループに定義することができる。
本発明のオリゴマーは本発明および普通のヌクレオモノマーを使用して成功することができ、そして標準の固相（または液相）オリゴマー合成技術（これらは現在商業的に利用可能である）を使用して合成することができる。一般に、本発明のオリゴマーは、工程：保護基を有するヌクレオモノマーまたはオリゴマーのシントンおよび塩基およびヌクレオモノマーまたはオリゴマーにカップリングすることができるカップリング基を合成し；ヌクレオモノマーまたはオリゴマーのシントンをアクセプターのヌクレオモノマーまたはアクセプターのオリゴマーにカップリングし；保護基を除去し；そしてこのサイクルを必要に応じて所望のオリゴマーが合成されるまで反復する工程からなる方法により合成することができる。
本発明のオリゴマーは、40，50または100ヌクレオモノマーより大きい長さを包含する長さを有することができる。一般に、好ましいオリゴマーは２〜30ヌクレオモノマーを含有する。約８〜20ヌクレオモノマーより大きいか、あるいはそれに等しい長さは、治療および診断の応用のために有用である。２，３，４または５ヌクレオモノマーを含有する短いオリゴマーはシントンとして有用である。
ランダム化した配列を有しかつ約６または７ヌクレオモノマーを含有するオリゴマーは、ランダム配合のプライマーを使用するクローニングまたは増幅のプロトコールにおいて使用されるプライマーのために有用であるが、ただしオリゴマーはポリメラーゼまたは逆転写酵素として働くことができる残基を含有しなくてはならない。
オリゴマーは普通のホスホジエステル連絡を含有することができるが、あるいは置換連鎖、例えば、ホスホアミダイト連鎖を含有することができる。これらの置換連鎖は、次の態様を包含するが、これらに限定されない；式−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｓ）−Ｏ−（「ホスホロチオエート」）、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｓ）−Ｏ−（「ホスホロジチオエート」）、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ′2）−Ｘ−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ′）−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒ′）−Ｏ−（「チオアルキルホスホネート」）、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ6）−Ｘ−，−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−，または−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ′2）−Ｘ−，式中Ｒ′はＨ（または塩）またはアルキル（１−12Ｃ）であり、そしてＲ6はアルキル（１−９Ｃ）であり、そして連鎖はヌクレオモノマーの炭素に結合した−Ｏ−または−Ｓ−を通して隣接するヌクレオモノマーに接合されている。ホスホロチオエートおよびホスホジエステルの連鎖は第12図に示されている。とくに、本発明のオリゴマーにおいて使用するために好ましい置換連鎖は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびチオノメチルホスホネートの連鎖を包含する。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート連鎖は、生理学的環境においてオリゴマーに追加の安定性を付与する。同一オリゴマーの中のすべてのこのような連鎖は同定である必要はないが、とくに好ましい本発明のオリゴマーは均一なホスホロチオエート連鎖または均一なメチルホスホネート連鎖を含有する。
製剤学的に許容されうる塩類
任意の製剤学的に許容されうる塩類を使用することができ、そしてこのような塩成形物質はこの分野においてよく知られている。
製薬学的に許容されうる塩類は、好ましくは前記本発明のオリゴマーの金属またはアンモニウム塩であり、そしてアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩；あるいは有利にはアンモニアまたは有機アミン、例えば、モノー、ジーまたはトリー低級（アルキル、シクロアルキルまたはヒドロキシアルキル（−アミン、低級アルキルアルキレンジアミンまたは低級（ヒドロキシアルキルまたはアリールアルキル）−アルキルアンモニウム塩基、例えば、メチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエタノールアミノン、エチレンジアミン、トリスー（ヒドロキシメチル）−アミノエタンまたはベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシドから誘導された容易に結晶化するアンモニウム塩を包含する。本発明のオリゴマーは酸付加塩を形成し、これらは好ましくは治療的に許容される無機または有機の酸、例えば、強い鉱酸、例えば、水素化水素酸、例えば、塩酸または臭化水素酸；硫酸、リン酸；脂肪族または芳香族のカルボン酸またはスルホン酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、脂肪酸、ヒドロキシマレイン酸、プルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、４−アミノ安息香酸、アントラニル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、スルファニル酸またはシクロヘキシルスルファミン酸などの酸付加塩である。
ブロッキング基
ここにおいて使用するとき、「ブロッキング基」は、保護基、合成のためのカップリング基、PO3 -2、または他の便利な接合体、例えば、固体の支持体、標識、抗体、モノクローナル抗体またはその断片などとして、オリゴマーまたはヌクレオモノマーに便利にカップリングする、Ｈ以外の置換基を呼ぶ。ここにおいて使用するとき、「ブロッキング基」はスラングの記述用語に従い保護基のみとして解釈を意図せず、また、例えば、カップリング基、例えば、Ｈ−ホスホネートまたはホスホアミダイトを包含することを意味する。
「保護基」とは、それが結合するＯ原子またはＮ原子が反応または結合に参加することから保護することができる任意の基である。ヌクレオモノマーの中の塩基部分上のＮ原子のためにこのような保護基およびそれらの導入は、従来この分野において知られている。適当な保護基の非限定的例は、ジイソブチルホルムアミジン、ベンゾイルなどを包含する。Ｏ原子のために適当な「保護基」は、例えば、DMT，MMT，またはFMOCである。
適当なカップリング基は、例えば、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホンアミダイト、またはホスホルアミダイトである。使用することができるホスホルアミダイトは、β−シアノエチルホスホルアミダイト（好ましい）を包含する。また、メチルホスホンアミダイト、アルキルホスホンアミダイト（エチルホスホンアミダイトおよびプロピルホスホンアミダイトを包含する）を使用することができる。例示的ホスホルアミダイトを第10−１図および第10−２図に示す。
適当な保護基は、５′末端におけるDMT（ジメトキシトリチル）、MMT（モノメトキシトリチル）またはFMOCおよび／または３′末端における水素ホスホネート、メチルホスホルアミダイト、メチルホスホンアミダイト、β−シアノエチルホスホルアミダイトである。
保護基
保護基、例えば、ジイソブチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジン、ジアルキルアセトアミジンまたはこの分野において知られている他の基を使用して、シトシン複素環のエキソ環式窒素を保護できる。あるいは、シチジン前駆体は保護基を使用しないでエキソ環式窒素において記載された方法によりオリゴマーの中に組み込むことができる(Gryaznov,S.M.ら、J.Am.Chem.Soc.(1991)113:5876-5877;Gryaznov,S.M.らNucl.Acids Res.(1992)20:1879-1882;Kung,P.-P.ら、Tetrahedron Letters(1992)40:5869-5872)。エチニルヘテロアリール置換基としてＲ2を含有する塩基（１）および（２）を有するオリゴマーの合成は、好ましくは、記載されているように５′−ヒドロキシル位置の保護のために９−フルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）を使用して達成される(Lehman,C.ら、Nucl.Acids Res.(1989)17:2379-2390)。
好ましい保護基は、５′末端におけるDMT（ジメトキシトリチル）、MMT（モノメトキシトリチル）またはFMOCおよび／または３′末端における水素ホスホネート、メチルホスホルアミダイト、メチルホスホンアミダイト、β−シアノエチルホスホルアミダイトである。しかしながら、保護基の位置は必要に応じて逆転することができることを意図する（例えば、５′−位置におけるホスホルアミダイトおよび３′−位置におけるDMT）。一般に、本発明のヌクレオモノマーおよびオリゴマーは、関係する式において示すような「ブロッキング基」にこの分野において知られている方法により誘導することができる。
カップリング基
適当なカップリング基は、例えば、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホンアミダイト、またはホスホルアミダイトである。使用することができるホスホルアミダイトは、β−シアノエチルホスホルアミダイト（好ましい）を包含する。また、メチルホスホンアミダイト、アルキルホスホンアミダイト（エチルホスホンアミダイトおよびプロピルホスホンアミダイトを包含する）を使用することができる。例示的ホスホルアミダイトを第10−１図および第10−２図に示す。ここにおいて「アミダイト」化学と呼ぶ、ホスホルアミダイトトリエステル化学を介するオリゴマーの合成のための３′，２′または５′位置において適当な「カップリング基」は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−メトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン、（Ｎ−モルホリノ）−β−シアノエトキシホスフィン、および（Ｎ−モルホリノ）−メトキシホスフィンを包含する(もおれ、M.F.ら、J.Org.Chem.(1985)50:2019-2025;Uznanski,A.W.ら、Tet.Lett.(1987)28:3401-3404;Bjergarde,K.ら、Nucl.Acids Res.(1991)21:5843-5850;Dahl,O.Sulfur Reports(1991)11:167-1929)。関係するカップリング基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−メチル−ホスフィンまたはＮ，Ｎ−ジエチルアミノ−メチル−ホスフィンを、また、メチルホスホネートの調整に使用できる（第10−４図）。メチルホスホネートのオリゴマーは、カップリング基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−メチルホスホンアミダイト、およびＮ，Ｎ−ジエチルアミノ−メチルホスホンアミダイトを使用して普通の合成することができる。本発明のヌクレオモノマーのアミダイトは、普通の方法により達成することができる（例えば、Gryaznov,S.M.ら、Nucl.Acids Res.(1992)20:1879-1882;Vinayak,R.ら、Nucl.Acids Res.(1992)20:1265-1269;Sinha,N.D.ら、Nucl.Acids Res.(1984)12:4539-4557;およびここにおいて引用する他の参考文献）。ここにおいて「トリエステル」化学と呼ぶ、ホスフェートトリエステル化学を介するオリゴマーの合成のための３′，２′（または５′）位置における適当なカップリング基は、２−クロロフェニルホスフェート、４−クロロフェニルホスフェート、２，４−ジクロロフェニルホスフェートおよび２，４−ジプロモフェニルホスフェートのヌクレオチドジエステル誘導体あるいは、ホスホロチオエート連鎖の合成のために、それらのチオノ誘導体を包含する(Marugg,J.E.ら、Nucl.Acids Res.(1984)12:9095-9110;Kemal,P.C.J.ら、Tet.Lett.(1989)30:6757-6760)。これらのカップリング基の構造は第10図に示されており、重量比ＸはＯまたはＳであり、そしてＺ1はＨまたは適当なベンゾトリアゾールである。
オリゴマーまたはそれらのセグメントは便利に合成される。この分野において知られているおよびここに記載する合成法を使用して、本発明の塩基、ならびにこの分野において知られている他の塩基を含有するオリゴマーを、適当に保護されたヌクレオモノマーを使用して合成することができる（第12図参照）。オリゴマーの合成方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Froehler,B.ら、Nucleic Acids Res.(1986)14:5399-5467;Nucleic Acids Res.(19988)16:4831-4839;Nucleosides and Nucleotides(1987)6:Tetrahedron Letters(1986)27:5575-5578;Caruthers,M.H.,Oligodeoxynucleotdes-Antisense Inhibitions of Gene Expression(1989),J.S.Cohen編、CRC Press,Boca Raton,p7-24;Reese,C.B.ら、Tetrahedron Letters(1985)26:2245-2248。メチルホスホンアミダイト化学を介するメチルホスホネート連鎖オリゴマーの合成は、また、記載された(Agrawal,S.ら、Tetrahedron Letters (1987)28:3539-3542;Klem,R.E.ら、国際特許公開第WO92／07864号)。
接合体
また、オリゴマーの「接合体」が含まれる。オリゴマーの「接合体」は、普通にこの分野において認識されているものを包含する。例えば、オリゴマーは種々の部分、例えば、挿入剤、およびDNA二重らせんの小溝と特異的に相互作用する酢酸マグネシウムに共有結合的に連鎖することができる。他の選択される接合体の部分は、標識、例えば、放射性、蛍光性、酵素、または切断リンカーなどを使用する細胞のアソシエーションを促進する部分であることができる。適当な放射線標識は、32Ｐ，36Ｓ，3Ｈおよび14Ｃを包含し、そして適当な蛍光性標識はフルオレセイン、リゾルフィン、ローダミン、BODIPY（分子のプローブ）およびテキサスレッドを包含する；適当な実証例はアルカリ性ホスファターゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼを包含する。共有結合的に連鎖した部分として使用できる他の化合物は、ビオチン、抗体または抗体断片、トランスフェリンを包含し、そしてHIV Tatタンパク質をまた本発明のオリゴマーに便利に連鎖することができる。
これらの追加の部分は任意の便利な連鎖を通して誘導体することができる。例えば、挿入剤、例えば、アクリジンまたはプソラレンを、本発明のオリゴマーに、オリゴマーの５′−位置、RNAの２′−位置において任意の入手可能な−OHまたは−SHを通して連鎖ことができるか、あるいはＯH，NH2，COOHまたはSHをピリミジンの５−位置に挿入することができる。例えば、−CH2CH2NH2，−CH2CH2CH2OHまたは−CH2CH2CH2SHを含有する誘導された形態は５−位置において好ましい。ポリリジンまたはリジンを含む接合体は記載されているように合成することができ、そしてさらにオリゴマーのその標的核酸配列への結合アフィニティーを増強することができる(Lemaitre,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1987)84:648-652;Lemaitre,M.ら、Nucleosides and Nucleotides(1987)6:311-315)。
連鎖または置換連鎖を通して結合されたものを包含する、広範な種類の置換基を結合することができる。オリゴマーの中の−OH部分を、標準の保護基により保護基されたホスフェート基、またはカップリングにより置換して他のヌクレオモノマーへの追加の連鎖を調製することができるか、あるいは接合された置換基に結合することができる。５′末端のOHリン酸化することができる；２′−OHまたは３′末端におけるOH置換基をまたリン酸化することができる。ヒドロキシル基を、また、標準の保護基に誘導することができる。
本発明のオリゴマーは、切断可能なリンカーを使用する細胞のアソシエーションを促進する部分に共有結合的に誘導することができる。このような接合体のために使用するリンカーは、オリゴマー−輸送剤の接合体が細胞の中に入った後、減少するジサルファイド連鎖を含むことができる。適当な分子のリンカーは、例えば、−Ｙ1−Ｘ8CH2CHR7−SS−CHR7CH2Ｘ8−Ｙ1−を包含し、式中各Ｙ1は独立にアルキレン（Ｃ1-6；メチレン、エチレンおよびプロピレンを包含する）、またはCOであり、各Ｘ8は独立にＯ，Ｓ（Ｏ）（Ｏ），Ｓ（Ｏ），NR7，CH2，Ｃ（Ｒ7）2またはCOである；Ｒ7ここで各Ｒ7は独立にＨ、アルキル（Ｃ1-6；メチル、エチルおよびプロピルを包含する）、アリールであり、そして前記リンカーは従来記載された（WO91／14696）。このタイプのジサルファイド含有リンカーはin vivoのコントロール可能なｔ1/2を有し、プロドラッグ／輸送成分としてその使用を促進する。このようなリンカーは、ジサルファイド連鎖のレドックス可能性のために、細胞内の構成に関して細胞外条件下に安定である。
適当な接合体は、また、オリゴマー合成のためのおよび核酸配列の検出を促進するための固体の支持体を包含する。固体の支持体は、シリカゲル、調節された孔のガラス、ポリスチレン、および磁性ガラスビーズを包含するが、これらに限定されない。
糖の修飾
糖上の置換により誘導体を作ることができる。本発明のオリゴマーの最も好ましい誘導体の中には、２′−Ｏ−アリル誘導体が存在する。２′−Ｏ−アリル基の存在は、透過能力およびヌクレアーゼ分解に対する安定性を増強するように思われるが、一本鎖または二重らせんの標的に対するオリゴマーのアフィニティーを減少するように思われない。
さらに、βアノマーについての方法に類似する方法であるが、逆の極性でDNA二重らせんまたは一本鎖RNAにαアノマーは結合するので、オリゴマーはこのエピマーまたはそのドメインを有するヌクレオモノマーを含有することができる(Praseuth,Dら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:1349-1353;Sun,J.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci(1991)88:6023-6027;Debart,F.ら、Nucl.Acids Res.(1992)20:1193-1200)。ここに記載する５−Ｒ2ピリミジンを含有するα−アノマーのオリゴマーは、本発明に含まれる修飾されたオリゴマーの１つのクラスを表す。
置換連鎖
本発明のオリゴマーは、また、一般にこの分野において理解されているように、１または２以上の「置換連鎖」を含有することができる。これらの「置換連鎖」は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、チオノメチルホスホネート、ホスホロジチオエート、リボアセタール、２′，５′連鎖，アルキルホスホネート、モルホリノカルバメート、モルホリノスルファメート，モルホリノスルファミド、ボラノホスフェート（−Ｏ−Ｐ（OCH3）（BH3）−Ｏ−）、シロキサン（−Ｏ−Si（Ｘ4）（Ｘ4）−Ｏ−；Ｘ4はアルキルまたはフェニルである）およびホスホルアミダイト（メトキシエチルアミンなど）を包含し、そして一般に入手可能文献およびその中に引用された参考文献に記載されているように合成される(Sood,A.ら、J.Am.Chem.Soc.(1990)112:9000-9001;WO91／08213;WO90／15065;WO91／15500;Stirchak,E.P.ら、Nucleic Acids Res.(1989)17:6129-6141;米国特許第5,034,506号;米国特許第5,142,047号;Hewitt,J.M.ら、Nucleosides and Nucleotides(1992)11;1661-1666)。ここに開示するオリゴマーにおいて使用できる置換連鎖は、また、次のものを包含する：スルホンアミド（−Ｏ−SO2−NH−）、サルファイド（−CH2−Ｓ−CH2−）、スルホネート（−Ｏ−SO2−CH2−）、カルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−NH−、−NH−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ジメチルヒドラジノ（−CH2−NCH3−NCH3−）、スルファメート（−Ｏ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｎ−；−Ｎ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｎ−）、３′チオホルミアセタール（−Ｓ−CH2−Ｏ−）、ホルムアセタール（−Ｏ−CH2−Ｏ−）、３′−アミン（−NH−CH2−CH2−）、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン（−CH2−NCH3−Ｏ−）および２′５′連鎖（例えば、２′５′カルバメート（２′−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−５′）、５′，２′カルバメート（２′−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５′）、５′，２′メチルカルバメート（２′−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（CH3）−５′）および５′，２′チオホルムアセタール（２′−Ｏ−CH2−Ｓ−５′）。２′５′連鎖は係属米国特許出願第07／892,902号、1992年６月１日出願（引用によってここに加える）。リポアセタール連鎖は普通に所有された係属米国特許出願第690,786号、1991年４月24日出願、係属米国特許出願第763,130号、1991年９月20日出願および係属米国特許出願第806,710号、1991年12月12日出願（引用によってここに加える）において特許請求されている。特記しない限り、置換連鎖、例えば、ホルムアセタール連鎖、−Ｏ−CH2−Ｏ−は左側のヌクレオモノマーの３′または２′炭素および右側のヌクレオモノマーの５′炭素に連鎖されている。ホルムアセタール連鎖（３′，５′）２量体は第１図、式（６）に示されている。こうして、ホルムアセタール連鎖は、３′−Ｏ−CH2−Ｏ−５′または２′−Ｏ−CH2−Ｏ−５′として示すことができる。３′，２′または５′炭素の表示は、リボース、デオキシリボースまたはアラビノース以外の構造が隣接するヌクレオモノマーに連鎖されているとき、それに応じて変更することができる。このような構造は、ヘキソース、モルホリノ環、炭素環式環（例えば、シクロペンテン）などを包含する。
シントンまたはオリゴマーの中のカルバメート、カーボネート、サルファイド、スルホキシド、スルホン、Ｎ−メチルヒドロキシルアミンおよびジメチルヒドラジノ連鎖は記載された(Vaseur,J-J.ら、J.Amer.Chem.Soc.(1992)114:4006-4007;WO89／12060号;Musicki,B.ら、J.Org.Chem.(1990)55:4231-4233;Reynolds,R.C.ら、J.Org.Chem.(1992)57:2983-2985;Mertes,M.P.ら、J.Med.Chem.(1969)12:154-157;Mungall,W.S.ら、J.Org.Chem.(1977)42:703-706;Stirchak,E.P.ら、J.Org.Chem.(1987)52:4202-4206;Wang,H.ら、Tet.Lett.(1991)50:7385-7388;国際特許出願第PCT／US91／03680号)。１または２以上の置換連鎖を、オリゴマーにおいて、ある数の目的で、例えば、相補的標的核酸配列との結合を促進するためにおよび／またはヌクレアーゼに対するオリゴマーの安定性を増加するために利用することができる。
「正の修飾」とは、結合アフィニティーを増加させる本発明の式（１）または（２）の任意の修飾の使用を意味する。
「負の修飾」とは、結合アフィニティーを減少させる式（１）または（２）の塩基からなるオリゴマーの追加のヌクレオモノマーの修飾、あるいは結合アフィニティーを減少することがある置換連鎖の使用を意味する。
例えば、負の置換連鎖の修飾は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、チオノメチルホスホネート、ホスホルアミダイトおよびホスホジエステル連鎖のためのトリエステルから選択される少なくとも１つである。
ヌクレオシド
用語「ヌクレオシド」は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、あるいはプリンまたはピリミジン塩基、または修飾されたプリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである他のヌクレオシドを包含する。糖炭素の立体化学は、１または２以上の残基においてＤ−リボースのそれ以外のものであることができる。ペントース部分をヘキソースにより置換し、そして記載されているようにオリゴマーの中に組み込むことができる(Augustyns,K.ら、Nucl.Acids Res.(1992)18:4711-4716)。また、リボースまたはデオキシリボースの部分が別の構造、例えば、ヘキソースまたは米国特許第5,034,506号に記載されているような６構成員のモルホリノ環により置換された類似体が含まれる。ここに定義するヌクレオシドは、また、アミノ酸あるいは遊離カルボキシル基および遊離アミノ基または保護されたそれらを有するアミノ酸類似体に連鎖したプリンまたはピリミジン塩基を包含する。例示的ヌクレオシドは記載された(Nielsen,P.E.前掲；普通に所有された同時係属米国特許出願第07／889,736号、1992年１月28日提出および同第07／894,397号、1992年６月５日提出、両者の出願を引用によってここに加える)。
「ヌクレオシド」は、また、糖の修飾を含有する部分、例えば、ヒドロキシル基の１または２以上がハロゲン、脂肪族基により置換されているか、あるいはエーテル、アミンなどとして官能化された部分を包含する。このような構造は、ヘキソース、モルホリノ環、炭素環式環（例えば、シクロペンタン）などを包含する。
塩基
「塩基」は、ここにおいて使用するとき、既知のプリンおよびピリミジン塩基および本発明の塩基ばかりでなく、かつまた修飾された複素環式塩基およびそれらの互変異性体を含有する部分を包含する。このような修飾は、アルキル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、あるいは他の複素環を包含する。このような「類似体のプリン」および「類似体のピリミジン」またはプリンまたはピリミジンの類似体の一般にこの分野において知られているものであり、それらのいくつかは化学療法剤として使用される。例示的であるが、非限定的なリストは、次のものを包含する；Ｎ4，Ｎ4−エタノシトシン、７−デアザキサントシン、７−デアザグアノシン、８−オキソ−Ｎ6−メチルアデニン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−プロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ6−イソペンテニル−アデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ6−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンテニルアデニン、シュードウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。これらの塩基の類似体に加えて、Cook,D.Pら、国際特許公開第WO92／02258号（引用によってここに加える）に記載されている６−アザシトシン、６−アザチミジンおよび５−トリフルオロメチルウラシルを含むピリミジン類似体を、本発明のオリゴマーの中に便利に組み込むことができる。
２および／または４位置に硫黄を含有する式（１）または（２）の塩基をオリゴマーの中に組み込み、そして本質的に前述したようにＲ2としてアルキニルで誘導することができる。オリゴマーの中への４−チオウリジンおよび２−チオチミジンの組み込みは記載された(Nikiforov.T.T.ら、Tet.Lett.(1992)33:2379-2382;Clivio,P.ら、Tet.Lett.(1992)33:65/68;Nikiforov,T.T.ら、Tet.Lett.(1992)332817-2820;Clivio,P.ら、Tet.Lett.(1992)33:69-72;Connolly,B.A.ら、Nucl.Acids Res.(1989)17:4957-4974)。
好ましい塩基は式（１）および（２）のものであるが、また、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、５−メチルシトシン、８−オキソ−Ｎ6−メチルアデニン、シュードイソシトシン、および７−デアザキサントシンを包含する。７−デアザキサントシンを含有するGT結合のモチーフを介して二重らせんDNA配列に結合するオリゴマーの合成および使用は、普通に所有された米国特許出願第07／787,920号、1991年11月７日提出（引用によってここに加える）に記載されている。
合成
オリゴマーまたはそれらのセグメントは便利に合成される。この分野において知られておりそしてここに記載する合成方法は、本発明の塩基を含有するオリゴマー、ならびにこの分野において知られている他の塩基を、適当に保護されたヌクレオモノマーを使用して、合成するために使用することができる（第12図参照）。オリゴマーの合成方法は、例えば、次の文献の中に見いだされる:Froehler,B.ら、Nucleic Acids Res.(1986)14:5399-5467;Nucleic Acids Res.(1988)16:4831-4839;Nucleic Acids Res.(1987)6:287-291;Froehler,B.,Tetrahedron Lett.(1986)27:5575-5578:Caruthers,M.H.Oligodeoxynucleotdes-Antisense Inhibitions of Gene Expression(1989),J.S.Cohen編、CRC Press,Boca Raton,p7-24;Reese,C.B.ら、Tetrahedron Letters(1985)26:2245-2248。メチルホスホンアミダイト化学を介するメチルホスホネート連鎖オリゴマーの合成は、また、記載された(Agrawal,S.ら、Tetrahedron Letters(1987)28:3539-3542;Klem,R.E.ら、国際特許公開第WO92／07864号)。
式（１）または（２）の塩基および１または２以上の置換連鎖を含有する本発明のオリゴマーは、所定の置換連鎖の合成について要求される反応条件に従い、４つの一般的方法の１または２以上により合成することができる。第１の方法（＃１）において、式（１）または（２）の塩基を含有するヌクレオモノマーを、標準の合成条件および試薬を使用して、オリゴマーまたはその便利な断片の中に直接組み込む。例示のスキームは第５図および第12図に示されており、そして方法＃１により作ることができる例示の連鎖は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、カーボネート、モノホリノカルバメートおよびスルホネートを包含する。
方法＃２は、適当な前駆体、例えば、５−ブロモまたは５−ヨード前駆体（後述するように）を使用して出発する短いシトシン（２量体、３量体など）の合成を包含し、前記前駆体は引き続いて式（１）または（２）のＣ−５置換基およびオリゴマーの中への組み込むに適当なシントンに変換される。このアプローチは第７図、第８図および第11図の中に例示されており、そしてＮ−メチルヒドロキシルアミン、ジメチルヒドラジノ、スルファメート、カルバメート、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよびカーボネートを包含する連鎖の合成に適する。
合成方法＃３は、引き続いてヨウ素化されるウリジンまたはシチジン（未保護または保護された）を使用して出発する。５−位置におけるＲ2基の導入は、所望の２量体または３量体のシントンへの合成ルート内で達成される。方法＃３は第９図に例示されており、そしてＮ−メチルヒドロキシルアミン、ジメチルヒドラジノ、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、リボアセタール、スルホネート、スルホンアミド、カルバメート、カーボネートおよびボラノホスフェートの連鎖を包含する連鎖の合成に適する。
方法＃４は（１）Ｒ2を含有するウラシルまたはシトシンを使用して出発し、次いで第12図に例示されているようにオリゴマーの中への組み込みに適当なヌクレオモノマー（例えば、アミド連鎖）に変換するか、あるいは（２）グリコシル化またはアルキル化される適当な前駆体、例えば、５−ヨードシトシン、５−ヨードウラシル、シトシンまたはウラシルを使用して出発し、次いでヌクレオモノマーをＲ2を含有する誘導体に変換し、そして所望のシントン（例えば、サルファイド、スルホキシドまたはスルホネート）に変換する。
一般に、特定の２量体、３量体またはより長いシントンを合成するために要求されかつＲ2アルキニル２′−デオキシウリジンまたは２′−デオキシシトシンと適合しないことがある反応条件は、次の通りである：（１）親電子付加反応、あるいはＣ−Ｃ多重結合への親電子付加を促進できる条件（例えば、HCl，HF，BF3，Cl2またはBr2）；（２）Ｃ−Ｃ多重結合の還元を促進できる条件（例えば、Ｈ2／Pd／Ｃを介する水素化または水素化物、例えば、B2H6，BH3・錯塩または１つのクラスとして、水素化物または水素アルミニウム）；（３）遊離基反応を促進する条件（例えば、Cl2＼ｈν、過酸化物またはAIBN）；および（４）Ｃ−Ｃ多重結合の酸化を促進する条件（例えば、例えば、KMnO4，OsO4、アルキルカルボン過酸）。これらの反応条件を含む合成スキームは、方法＃１の使用を妨害することがある。
一般に、５−ヨード−２′−デオキシウリジンまたは５−ヨード−２′−デオキシシチジンなどと適合性でないことがある反応条件は、次の通りである：（１）ヨウ素化アリールの還元を促進する条件（例えば、Ｈ2または水素化物），（２）有機金属試薬により仲介されるアルキル化またはアリール化反応または（３）遊離基反応を促進する条件（例えば、Cl2＼ｈν、過酸化物またはAIBN）。これらの反応条件を含む合成スキームは、方法＃２の使用を妨害することがある。
方法＃３は２′−デオキシウリジンまたは２′−デオキシシチジンを使用して出発し、引き続いて所望の工程においてヌクレオモノマーを５−ヨード（または５−ブロまたは５−トリフレート）誘導体に変換し(Robins,M.J.ら、Can.J.Chem.(1982)60:554-557:Chang,P.K.ら、J.Med.Chem.(1963)6:428-430;Crisp,G.T.ら、Tet.Lett.(1990)31:1347-1350;およびTorrence,P.F.ら、J.Med.Chem.(1979)22:316-319)次いで所望の工程においてＲ2置換基に変換する。あるスキームにおいて、２′−デオキシウリジンを必要に応じて５−Ｒ2−２′−デオキシシトシンに従来記載された方法により変換することは有利である(Divakar,K.J.ら、J.Chem.Soc.Perkin Trans I(1982)p.1171-1176)。これらの反応または条件の１つを所定のオリゴマーまたはその断片の合成のために使用する場合、ヌクレオモノマー例えば、２′−デオキシウリジンを利用し、次いでＲ2誘導体およびそのシチジン誘導体に変換する。
これらの一般的方法により合成した追加の例示的連鎖を、下表Ａに要約する。
Figure 0003739785
Figure 0003739785
表Ａに記載する置換連鎖に加えて、第17図は１系列の反復ヌクレオモノマー単位（17−１）および本発明の塩基類似体を含有できる選択した反復単位を含有する例示のアミド連鎖オリゴマー（17−２，17−３）を示す。第17−１図において、Ｘ9はＳ，Ｏ，SO，SO2，CH2，CF2またはNR10であり、そしてＲ10は（独立に）Ｈ，Ｆ，OH，OCH3，またはCH低級アルキルであるが、ただし隣接するＸ9の両者はＯではない。第17−２図においては、各Ｙは独立に選択され、そして上に定義した意味を有する（例えば、ＹはＨ，オリゴマー、ブロッキング基、例えば、FMOC，tBOC，OH，DMT，MMTまたはオリゴマーの合成に適当なカップリング基である）。このような連鎖を含有するオリゴマーの合成に要求されるヌクレオモノマーは、方法＃４により合成される。
本発明のオリゴマーは、アミダイト、トリエステルまたは水素ホスホネートの調節された孔のガラス方法および条件を包含する、任意の適当な化学により合成することができる。オリゴマーは、好ましくは、適当な出発シントン、例えば、式（３）または（４）のヌクレオモノマーから合成され、式中５′−位置におけるＲ1はDMT，MMT，FMOC（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、PACO（フェノキシアセチル）、シリルエーテル、例えば、TBDMS(ｔ−ブチルジフェニルシリルまたはTMS(トリルメチルシリル)であり、そして３′−位置におけるＲ1はエステル，Ｈ−ホスホネート、アミダイト、例えば、β−シアノエチルホスホルアミダイト、シリルエーテル、例えば、TBDMSまたはTMSまたはｔ−ブチルジフェニルである。あるいは、適当なウリジンまたはシチジンの前駆体、例えば、ブロックされた５−ヨード−２′−デオキシウリジン、５−ヨード−２′−デオキシシチジン、５−ブロモ−２′−デオキシウリジン、５−トリフルオロメタンスルホネート−２′−デオキシウリジン、５−ブロモー２′−Ｏ−アルキルウリジンまたはブロックかつ保護された５−ヨード−２′−デオキシシチジン、５−ブロモ−２′−デオキシシチジン、５−トリフルオロメタンスルホネート−２′−デオキシシチジン、５−ヨード−２′−Ｏ−アルキルシチジン、５−ブロモ−２′−Ｏ−アルキルシチジンを、短いオリゴマー、例えば、２量体、３量体、４量体、５量体またはより長いシントンの中に便利に組み込むことができ、引き続いてこれらを誘導して５−位置にＲ2を生成し、次いで適当なシントンおよびより長いオリゴマーの中に組み込むことができる。
約４またはそれ以上のヌクレオモノマー残基を含有するオリゴマーの合成は、好ましくは、アミダイト、Ｈ−ホスホネートまたはトリエステルの化学ともに使用するために適当な調節された孔のガラスを有するシントン、例えば、モノマー、２量体または３量体を使用して達成される。シントンを使用してオリゴマーをホスホジエステルまたはリン含有置換連鎖（ホスホロチオエート、メチルホスホネート、チオノメチルホスホネート、ホスホルアミダイトなど）を介して連鎖することができる。
他のリンを含有しない置換連鎖の合成は、ここに記載する（第７図〜第10図）適当な前駆体を使用して達成することができ、そしてこの分野において知られている。
これらの非常に便利なかつ現在最も普通に使用されている、固相合成技術を使用することに加えて、オリゴマーは、また、溶液相法、例えば、トリエステル合成を使用して合成することができる。これらの方法は操作可能であるが、一般に、任意の実質的な長さのオリゴマーについて効率に劣る。
中間体または出発物質
他の面において、本発明は、式（３）または（４）のヌクレオモノマーの類似体を包含する、本発明のオリゴマーの中間体に関する：
Figure 0003739785
式中、
各Ｒ1は独立にＨまたはブロッキング基である：
Ｒ2およびＸは上に定義した通りである；
Ｒ3はＨ，OH，Ｆ，NH2，ORまたはSRであり、ここでORはＯ−アリルであるか、あるいはSRはＳ−アリルまたはＣまたはＳ−アルキル（Ｃ1-3；ここでアルキルはメチル，エチルまたはプロピルを包含する）である；そして
Prは（Ｈ）2または保護基である；
ただしＸがＯであり、Ｒ3はＨまたはOHであり、かつ両者のＲ1がＨである場合、Ｒ2は１，３−ペンタジエニル、２−，３−および４−ピリジン−エチニル、２−，４−および５−ピリミジン−エチニル、トリアジン−エチニル、アリールエチニル、２−，４−および５−ピリミジニル、２−および４−イミダゾリル、２−および３−ピロリル−エチニル、２−および３−フラニル−エチニル、２−および３−チエニル−エチニル、２−および４−イミダゾリル−エチニル、２−，４−および５−チアゾリル−エチニルまたは２−，４−および５−オキゾリル−エチニル、４−オキゾリル、３−ピロリル、３−フラニル、３−チエニルであり、そして
ただし式３について、ＸがＯであり、かつＲ1およびＲ3がＨであるとき、Ｒ2はビニル、１−ブテニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニル、１−ヘプテニル、１−オクテニル、１−プロピニル、１−ブチニル、１−ヘキシニル、１−ヘプチニルまたは１−オクチニルではない。
適当な保護基（Pr）は、ジイソプロピルホルムアニジン、ジ−ｎ−ブチルホルムアニジン、ジイソブチルホルムアミジンおよびDMT，MMT，FMOC，ホスホルアミダイト、例えば、β−シアノエチルホスホルアミダイト、水素−ホスホネートおよびメチルホスホルアミダイトを包含する適当なＲ2基を包含する。
好ましい保護されたヌクレオモノマーは、式（３）および（４）のヌクレオモノマーであり、式中ＸはＯであり、５′位置におけるＲ1はDMT，MMTまたはFMOCである；３′位置におけるＲ1はＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィンまたは水素ホスホネートである；Ｒ2は１−プロピニル、３−メチル−１−ブチニル、２−ピロリル、２−チエニル、２−イミダゾリルまたは２−チアゾリルである；そしてPrは（Ｈ）2またはジイソブチルホルムアミジンである。
好ましい態様
本発明の好ましいオリゴマーの１つのグループは、式（16）により表すすることができる；
Figure 0003739785
式中、
各Ｂ，Ｒ1およびＲ3は独立に選択され、そして上に定義した意味を有する；
ｎは０〜98の整数である（０〜28の値は好ましい）；そして
各Ｘ1は独立に−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）−，−Ｐ（Ｏ）（Ｏ）−または−Ｐ（CH3）（Ｏ）−，−Ｐ（CH3）（Ｓ）−であり、
ただし少なくとも１つのＢは上に定義した式（１）または（２）を有する；そして
さらにただし前記オリゴマーの前記ヌクレオモノマーの少なくとも１つがビニル、１−ブテニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニル、１−ヘプテニル、１−オクテニル、１−プロピニル、１−ブチニル、１−ヘキシニル、１−ヘプチニルまたは１−オクチニルにより５−置換されたデオキシウリジンからなるとき、前記オリゴマーを構成するヌクレオモノマーの残部はホスホジエステル連鎖２′−デオキシアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′ーデオキシシチジン、チミジンまたはそれらの組み合わせのみから構成されない。メチルホスホネート、チオノメチルホスホネートまたはホスホロチオエートの置換連鎖はオリゴマーのヌクレアーゼ安定性を増強すると同時に、標的核酸に対するオリゴマーのアフィニティーへの負の衝撃は本発明の５−置換ピリミジンの包含により補償される。
最も好ましいＲ2基は１−プロピニルである。好ましいＲ3基はＨ，OH，ＦおよびＯ−アリルである。
本発明の他の好ましいオリゴマーは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、チオノメチルホスホネートまたはメチルホスホネート以外の置換連鎖を含有する。これらの置換連鎖のとくに有用な形態は、リボアセタール、ホルムアセタールおよび３′−チオフォルムアセタール連鎖を包含し、３′−チオフォルムアセタールは最も好ましい。
ホルムアセタール型置換連鎖を含有するオリゴマーの合成のために、少なくともいくつかのホスホジエステルの代わりに、第１図に示す式（６）の２量体のシントン（式中、置換基Ｂ，Ｘ，Ｒ1およびＲ2は上に定義した通りである）はとくに有用である。
前述のシントンは、まずＢの５−ヨードピリミジンの形態を調製し、次いで、例えば、２量体のシントンをプロピンでパラジウム、CuI，トリエチルアミン、およびDMFの存在下に処理することによって、これらを５−プロピン誘導体に変換することによって得られる。第７図、第８図、第９図および第11図に示す標準の合成技術を使用して、これらのシントンをオリゴマーの中に組み込むことができる。ホルムアセタールおよび３′−チオフォルムアセタールの置換連鎖の合成は、普通に所有された係属米国特許出願第07／874,334号、1992年４月24日提出、および係属米国特許出願第07／690,786号、1991年４月24日提出（これらを引用によってここに加える）に記載されている。ホルムアセタール、３′−チオフォルムアセタール、リボアセタールまたは他の置換連鎖を含有する３量体のシントンは、また、好ましい化合物である。３量体および４量体は、細胞膜を横切る増強された透過を有するオリゴマーの合成のために好ましい。
メチルホスホネートおよびホスホジエステルの連鎖を含有するオリゴマーの合成は、この分野において知られている固相オリゴマー合成技術を使用して実施される。ホスホジエステル連鎖オリゴマーの合成において有用な修飾の記載は、例えば、欧州特許公開第288,163号の中に見いだされる；ここでアミダイト化学を使用する固相自動化合成における酸化工程を任意の工程において独立に調節して、ホスホロチオエートを得ることができる。水素ホスホネート化学を介する、ホスホロチオエートをもつオリゴマーの合成の別の方法は、また、記載された(Froehler,B.ら、Nucleic Acids Res.(1986)14:5399-5467;Froehler,B.ら、Tetrahedron Letters(1986)27:5575-5578)。硫黄化は、記載されているように、試薬、例えば、テトラエチルチウラムジサルファイド、ジベンゾイルテトラサルファイド、チオリン酸ジサルファイドなど、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドを使用して達成することができる(Vu,H.ら、Tet.Lett.(1991)26:3005-3008;Rao,M.V.ら、Tet.Lett(1992)33:4839-4842;米国特許第5,151,510号、同時係属米国特許出願第号、1992年９月12日発行;Iyer,R.ら、J.Org.Chem.(1990)55:4693-4699;Dahl,O.,Sulfur Reports(1991)11:167-192)。これらの硫黄化試薬は、ホスホルアミダイトまたは水素−ホスホネートの化学とともに使用することができる。記載されているように、コントロールされた立体化学を有するホスホロチオエートの合成を使用して、立体規則的な本発明のオリゴマーを発生させることができる（国際特許公開第EPO 506 242号）。チオノメチルホスホネートは、記載されているように、メチルホスホンアミダイトを使用し、次いで硫黄化による(Roelen,H.P.C.F.ら、Tet.Lett.(1992)33:2357-2360)か、あるいは前述の硫黄化試薬を使用して調製される。
共有結合の部分
本発明のオリゴマーのいくつかの中に、オリゴマーと標的配列との間の少なくとも１つの共有結合を成形することができる部分が含められる。多重共有結合は、また、このような部分の多重性を提供することによって成形できる。共有結合は好ましくは標的鎖の中の塩基の残基に対してであるが、また、糖またはホスホジエステルを包含する標的の他の部分を使用して作ることができる。架橋を行う部分の反応の性質は、二重らせんにおける標的の性質を決定する。好ましい架橋する部分は、アシル化剤およびアルキル化剤、および、とくに鎖の中の標的位置との反応を可能とするように、配列特異性を付与する部分に関して位置するものを包含する。
架橋する部分は、便利には、オリゴマーの配列の中に類似のピリミジンおよびプリン残基として配置することができる。この配列は５′末端および／または３′末端、配列の内部の部分、またはそれらの組み合わせであることができる。柔軟性を増大するために末端における配置は好ましい。類似の部分は、また、ペプチドの主鎖に取り付けることができる。
本発明の１つの好ましい態様において、いずれかの末端において架橋する部分を含有するスイッチバッグオリゴマーを使用して、二重らせんの鎖を少なくとも２つの共有結合で架橋することができる。さらに、逆の極性のオリゴマーの配列を複数の架橋する部分と直列に配置して、カルボキシを強化することができる。
本発明において有用であるアルキル化部分の例は、N4，Ｎ4−エタノシトシンおよびＮ6,N6−エタノアデニンを包含する。
塩基は必ずしもプリンまたはピリミジンであることが必要ではないことは明らかである；事実、反応官能性が結合している部分は結合である必要はまったくない。反応性基を取り付ける任意の手段は、位置決めが正しいかぎり、満足すべきものである。
逆の極性
それらの一般的形態において、逆の極性のオリゴマーは、１または２以上の前述のヌクレオモノマーを組み込むことができ、次の式のそれらの長さに沿って少なくとも１つのセグメントを含有する：
Figure 0003739785
ここで−Ｃ−は反対の極性のヌクレオモノマーの配列をカップリングする任意の方法を記号化する(Froehler,B.C.ら、Biochemistry(1992)31:1603-1609;Horne,D.A.ら、J.Amer.Chem.Soc.(1990)112:2435-2437;Beal,P.A.ら、J.Amer.Chem.Soc.(1992)114:4976-4978)。
これらの式において、記号
Figure 0003739785
はオリゴマーのストレッチを示し、ここで左に対してヌクレオモノマーのリボシル残基の５′−ヒドロキシルと、右（すなわち、均一な極性の領域）に対してヌクレオモノマーのリボシル残基の３′−（または２′５′連鎖について２′−）との間で連鎖は首尾一貫して成形され、こうして追加の接合のために自由に一番右のヌクレオモノマーのリボシル残基の５′−ヒドロキシルが残る。同様に、
Figure 0003739785
は反対向きのオリゴマーのストレッチを示し、ここで左のヌクレオモノマーのリボシル残基の３′−ヒドロキシルと右のヌクレオモノマーのリボシル残基の５′−ヒドロキシルとの間に連鎖が成形され、こうして追加の接合のために自由の一番右のヌクレオモノマーのリボシル残基の３′−ヒドロキシルが残る。
−Ｃ−により記号で表われる連鎖を成形して、式（１）における隣接するリボシル残基の５′−ヒドロキシルまたは式（２）における隣接するリボシル残基の３′−ヒドロキシルを連鎖することができるか、あるいは「−Ｃ−」連鎖を隣接するヌクレオモノマーの他の部分と接合させて、逆の極性の鎖を連鎖することができる。
「−Ｃ−」はリンカー部分、または単に共有結合を表すことができる。
逆の極性の鎖の間の連鎖が糖残基を含む場合、３′−または２′−を連鎖の中に含めることができるか、あるいはこの位置のずれかはＲまたはＳのコンフィグレーションであることができることに注意すべきである。コンフィグレーションの選択は、一部分、連鎖の付近におけるオリゴマーの形状寸法を決定するであろう。こうして、例えば、隣接する３′−位置を使用して共有結合を行う場合、連鎖に関係する両者の3H−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドが普通のＲコンフィグレーションである場合、起こるオリゴマーの変形の程度による少ないであろう。それらの両者がＳコンフィグレーションである場合、これは鎖の中に好適な「キンク」を生ずるであろう。
標準のオリゴヌクレオチドの合成技術または他のカップリングを使用してリボシル部分の間の５′−５′または３′−３連鎖を成形することに加えて、逆の極性の２つの鎖を接合する別のアプローチを使用することができる。例えば、逆の極性のオリゴマーの配列の反対末端の２つの添付された塩基を直接にあるいはリンカーを通して連鎖することができるか、あるいは一方の塩基を他方の糖部分に連鎖することができる。連鎖を実施する任意の適当な方法を使用することができる。本発明のスイッチバッグオリゴマーの特徴づける面は、それらが逆の極性の直列の領域を構成し、こうして３′→５′極性の領域の次に５′→３′極性の１つが存在するか、あるいはその逆か、あるいは両者であるということである。
逆の極性をもつセグメントをカップリングする方法に依存して、このカップリングは２量体の挿入により実施することができ、ここで２量体の各構成員の適当な３′−位置または２量体の各構成員の５′−位置は成長する鎖の中の２量体の包含のために活性化されるか、あるいは鎖の極性が同一のままである場合、使用される逆の方法でブロッキングされる縮合するヌクレオモノマーを使用して、普通の合成を続けることができる。この追加のヌクレオモノマーは、また、鎖を伸長するための縮合の前後に含めることができるリンカー部分を含有することができる。
修飾された残基および／または逆の極性を有するオリゴマーの合成は、標準の固相合成法を利用して達成することができる。
一般に、普通の３′→５′または５′→３′を含有するオリゴマーの合成に対する２つの普通に使用されているアプローチが存在し、一方は中間体のホスホルアミダイトを含み、そして他方は中間体のホスホネートの連鎖を含む。ホスホルアミダイトに基づく合成において、カップリングすべき位置にシアノエチルホスホルアミダイトを有する適当な保護されたヌクレオモノマーを、固体の支持体に対して誘導された成長するヌクレオモノマー鎖の遊離のヒドロキシルと反応させる。この反応はシアノエチルホスファイトを生じ、その連鎖は各中間の工程においてシアノエチルホスフェートに酸化しなくてはならない。なぜなら、還元された形態は酸に対して不安定であるからである。カップリングすべき位置にＨ−ホスホネート部分を含有する適当に保護されたヌクレオモノマーを遊離ヒドロキシル基を有する固相誘導ヌクレオモノマー鎖と適当なアクチベーターの存在下に反応させて、酸に対して安定なＨ−ホスホネートジエステル連鎖を得ることによって、Ｈ−ホスホネートに基づく合成はを実施する。こうして、ホスフェートまたはチオホスフェートへの酸化は、オリゴマーの合成の間の任意の点において、あるいはオリゴマーの合成が完結した後、実施することができる。Ｈ−ホスホネートは、また、四塩化炭素の存在下に第１または第２アミンとの反応によりホスホルアミダイト誘導体に変換することができる。２つのアプローチを一般的に示すために、入るヌクレオモノマーを「カップリングホスファイト／ホスフェート」基を有すると見なす。
置換連鎖の型の変動は、たとえば、ヌクレオモノマー部分のチオール誘導体を使用してかつこの分野において知られている方法により、Ｈ−ホスホネートそれ自体よりむしろメチルホスホネートの前駆体を使用することによって達成される。非リンに基づく連鎖、例えば、前述のホルムアセタール３′−チオフォルムアセタール、３′−アミノおよび５′−エーテル型の連鎖をまた使用することができる。
こうして、３′→５′極性を有するオリゴマーのセグメントを得るために、５′−位置において保護されかつ３′−位置にカップリングホスファイト／ホスフェート基を含有するヌクレオモノマーを、その３′−ヒドロキシルを通して固体の支持体にカップリングしたヌクレオモノマーの５′−位置におけるヒドロキシルと反応させる。生ずる縮合したオリゴマーを脱保護し、そして追加の５′−保護された、３′−ホスファイト／ホスフェートカップリングヌクレオモノマーを使用して反応を反復する。逆に、５′→３′極性のオリゴマーのセグメントを得るために、３′−位置において保護されかつ５′−位置にカップリングホスファイト／ホスフェートを含有するヌクレオモノマーを、５′−位置を通して固体の支持体に取り付けられたオリゴマーまたはヌクレオモノマーと反応させ、反応に対して有効な３′−ヒドロキシルを残す。同様に、入るヌクレオモノマーの縮合後、３′−基を脱保護し、そして追加の３′−保護された、５′−カップリングヌクレオモノマーと反応させる。所望の数のヌクレオモノマーが付加されるまで、この配列を続ける。
オリゴマーの鎖の延長を１系列の縮合において前以て決定した配列と一致するように進行させ、縮合の各々は他のヌクレオモノマーの付加を生ずる。カップリングホスファイト／ホスフェートを有するヌクレオモノマーの添加前に、固体の支持体に結合したヌクレオモノマー上の保護基を除去する。典型的には、普通に使用されるジメトキシトリチル(DMT)基の除去は、2.5％ジクロロ酢酸／ジクロロメタンで処理することによって実施されるが、１％ｗ／ｖトリクロロ酢酸／ジクロロメタンまたはZnBr2飽和ニトロメタンも有用である。他の保護基について適当な他の脱保護手順は、当業者にとって明らかであろう。次いで、脱保護された固体の支持体に結合するヌクレオモノマーまたはオリゴマーを、カップリングホスファイト／ホスフェートを含有する適当に保護されたヌクレオモノマーと反応させる。各サイクル後、担体結合ヌクレオモノマーを好ましくは無水ピリジン／アセトニトリル（１：１，ｖ／ｖ）で洗浄し、再び脱保護し、そして縮合反応を要求されるだけ多くのサイクルで完結させて、所望の数の適合した極性のヌクレオシド間の結合を成形し、これらを必要に応じてホスホルアミダイト、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートまたはホスホジエステルに変換する。
１つの態様において、スイッチバッグリンカーを提供するために、保護されたヌクレオモノマーを支持体結合オリゴマーに対して反対の極性で準備する。こうして、例えば、支持体結合オリゴマーが３′→５′である場合、脱保護された５′−ヒドロキシルを３′−保護された、５′−カップリングモノマーと反応させ、そして５′−位置においてカップリングしかつ３′−位置において保護された分を使用して合成を続ける。
他の態様において、スイッチバッグリンカーを提供するために、支持体結合オリゴマーに縮合のためにカップリングする１つの末端（例えば、水素ホスホネート）および保護されたヒドロキシル基（または保護されたチオ基）である他の末端を有するリンカー要素を含有する２量体のシントン、支持体結合オリゴマー上に結合する。保護されたヌクレオモノマーの水素ホスホネートの縮合および脱保護のために使用した条件と同一の条件を使用して、リンカー２量体を縮合しかつ脱保護する。次いで、オリゴマー鎖の引き続く伸長は、鎖の前の部分の合成に使用した方法と反対の方法でカップリングおよび保護されるヌクレオモノマー残基を使用する。
この合成に対する１つのアプローチは第５図に図解されており、ここで鎖の各部分に含まれる２つのヌクレオモノマー残基に既に誘導されたリンカーを使用する。この鎖の５′→３′ヌクレオモノマー部分を、普通に、３′−DMT−５′−カップリングホスフェートヌクレオモノマーを使用して、固体の支持体にカップリングする。スイッチバッグリンカーを２つのヌクレオモノマー残基にそれらの３′−位置を通して誘導する；残りの５′−位置を一方のヌクレオモノマー残基の中の保護基DMTおよび他方の中のホスホネート残基により誘導する。誘導されたリンカーを固体支持された鎖に標準の条件下にカップリングし、次いで普通の方法で脱保護する。それ以上の標準のヌクレオモノマーのカップリングは、鎖を３′→５′の向きに伸長させる。
あるオリゴマーにおいてスイッチバッグを仲介するために使用するとくに好ましい２量体のシントンは、第５図に示すＯ−キシロソリンカー（化合物９および式（21）である。Ｏ−キシロソリンカーは、各キシロース糖の３′−位置においてｏ−キシレンにより互いに連鎖した２つのキシロース−ヌクレオモノマー（18）から成る。スイッチバッグリンカーのシントンを、第５図に示すように、α，α′−オルトジブロモキシレンおよび５′−DMTヌクレオモノマー（18）を使用して合成して２量体（19）得た。この２量体をＨ−ホスホネート（21）に変換し、そして固相合成において使用してオリゴマーを発生させた。塩基（第５図において位置「Ｂ」に）チミン、５−メチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ6−メチルアデニン、シュードイソシトシン、５−ピロピニルウラシルまたはシトシンを含有するリンカーをホモ２量体として合成する。しかしながら、スイッチバッグリンカーの２量体は、また、混合へテロ２量体として合成することができ、このヘテロ２量体はクロマトグラフィーにより分割される。
逆の極性を含有するオリゴマーの調製においてとくに有用なシントンは第１図に示す式（５）を有し、式中、各Ｙおよび各Ｂは独立に選択され、そして前に定義した意味を有し、そして塩基Ｂの一方または双方は必要に応じて本発明の式（１）または（２）の修飾された塩基の残基であることができる。
２′修飾されたオリゴマー
本発明のＣ−５修飾ピリミジンを含有するオリゴマーのいくつかの中に、リボースまたはデオキシリボース糖の修飾が含まれる。２′−Ｏ−メチル−、２′−Ｏ−エチル−および２′−Ｏ−アリルのオリゴマーが合成され、そして一本鎖の相補的核酸配列に結合することが示された(Cotton,M.らNucleic Acids Res.(1989)19:2629-2635;Blencowe,B.J.ら、Cell(1989)59:531-539;Sproat,B.S.ら、Nucleic Acids Res.(1989)17:3373-3386;Inoue,H.ら、Nucleic Acids Res.(1987)15:6131-6148;Morisawa,H.ら、欧州特許出願第0339842号;Chavis,C.ら、J.Organic Chem.(1982)47:202-206;Sproat,B.S.ら、Nucleic Acids Res.(1991)19:733-738)。２′−修飾オリゴマーは、未修飾対照と比較して、比較的ヌクレアーゼ安定性であると報告された。２′フルオロヌクレオモノマーの合成およびオリゴマーの中へのそれらの組み込みは、また、記載された(Codington,J.F.ら、J.Org.Chem.(1964)29:558-564;Fazakerley,G.V.ら、FEBS Lett.(1985)182:365-369)。ここに記載する修飾された塩基を含有するオリゴマーの類似体の合成は、記載した方法に基づくであろう。２′−アミノヌクレオモノマーを含有するオリゴマーの合成は記載された(Pieken,W.A.ら、Science(1991)253:14-317)。
本発明のオリゴマーにおける塩基（１）および（２）の追加の使用において、本発明の５−置換塩基（１）および（２）を含有するヌクレオモノマーの２′−Ｏ−アリル修飾糖の形態はオリゴマーの中に含まれる。他の２′−Ｏ−アリル置換ヌクレオモノマーは、また、オリゴマーの中の他の位置において使用することができる。２′−Ｏ−アリルヌクレオモノマーは標準の方法を使用して調製できる：普通の中間体を通る本発明のピリミジンを含有する２′−Ｏ−アリル誘導ヌクレオモノマーの合成の方法を後述する。こうして、例えば、５−（１−プロピニル）ウリジンをまず５′−および３′−位置においてテトライソプロピルジシロキサン試薬を使用して保護し、次いで４−オキシ位置においてオルト−ニトロフェノールを使用して保護する。次いで、保護されたヌクレオシドをアリルエチルカーボネートで２′−Ｏ−アリル誘導体に変換する；あるいは、この有用な誘導体は２′−Ｏ−アリル誘導体−５−（１−プロピニル）ウリジンまたは対応する５−（１−プロピニル）シチジンに変換する。この変換のための反応順序は第４図に概説されている。
２′−位置において誘導されたヌクレオモノマーは、未誘導の形態と同一の方法でオリゴマーの中に組み込むことができる。
２′−チオアルキルヌクレオモノマーの合成は、第６図に記載するように達成される。このプロトコールはアンヒドロ中間体７の生成を介する２′−チオアルキルピリミジンの合成に有用であり、そして２′−チオアルキルピリミジンは引き続いてチオアルキルヌクレオモノマー（22）に変換される。Ｗと表示される基は、低級アルカン（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはイソブチル）またはアリルを包含する低級アルケンとして定義される。このプロトコールを使用して５′−DMTブロックド５−メチルウリリジン３′−Ｈ−ホスホネートを合成する。出発物質６は５−メチルウリジンから得られた(Markiewicz,W.T.,J.Chem.Res.(M)(1979)0181-0197。５′−および３′−位置における別のブロッキング基、例えば、テトラヒドロピランを、また、使用して同等の出発物質を得ることができる。こうして、第６図に示す方法を使用して、他の修飾されたピリミジンヌクレオモノマー、例えば、２′−チオアルキルシチジン、２′−チオアルキルチミジン、２′−チオアルキル−Ｎ4，Ｎ4−エタノシチジンまたは２′−チオアルキルウリジンの合成に加えて、本発明の修飾された塩基を含有するヌクレオモノマーの２′−チオアルキル誘導体を合成することができる。ヌクレオモノマー（22）を他の５′−および３′−誘導化合物、例えば、MMT，β−シアノエチルホスホルアミダイト、またはメチルホスホルアミダイト−ブロックドヌクレオモノマーへ変換する反応は、適当な試薬を使用して容易に達成することができる。
置換連鎖を含有するオリゴマーのための２量体および３量体のシントン
隣接するヌクレオモノマー類似体の残基に連鎖する置換連鎖を含有するオリゴマーは、好ましくは、出発物質として適当にブロックされた２量体のシントンを使用して合成される。一方または双方の塩基の残基が５−Ｒ2−Ｕまたは５−Ｒ2−Ｃまたは関係する類似体である２量体について、ホルムアセタールまたは３′−チオフォルムアセタールが連鎖した２量体の合成はここに記載するようにして達成される。第１図に示す式（６）のホルムアセタール連鎖を含有する例示の２量体、Ｙ，Ｘ，ＢおよびＲ3をここにおいて定義した通りである。
第７図および第８図は、オリゴマーの合成における中間体のための合成のスキームを示す。両者の図面において、構造Ｕ−Ｉは５−ヨードウラシルを表し、そしてＵ−≡−CH3は５−（１−プロピニル）ウリジンを表す。３′−チオフォルムアセタールの２量体または３量体の合成は、便利に達成される。第７図に示すように、エステル化により３′−位置において保護された、５−ヨードウリジンヌクレオモノマー（25）を、まず、パラホルムアルデヒドとHClの存在下に反応させて、５′−位置に置換基ClCHO2−を含有する誘導されたヌクレオモノマー（26）を得る。このヌクレオモノマーは、例えば、長鎖アルキルまたは芳香族酸、例えば、デシル、ヘキシル、ベンゾイル、またはフェノキシアセチルを使用してエステル化することができる。この第１工程において、３′−エステル化ヌクレオモノマーを不活性溶媒中で過剰のパラホルムアルデヒドで低温において処理し、そして無水HClを反応混合物を通して泡立てて通入する。この溶液は便利に乾燥され、そして溶媒を除去して中間体を得る。
次いで、ヌクレオシドの５′−位置にクロロメチルエーテル（ClCHO2）として示される中間体（26）を不活性溶媒中に溶解する、５′−位置において、例えば、DMTにより保護され、そして塩基、好ましくはジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）と一緒に３′−位置に−SHを有する、第２ヌクレオモノマー（５−（１−プロピニル）ウリジン）の不活性溶媒中の溶液を、また、調製する。クロロメチルエーテル中間体をこの溶液に滴々添加し、そして反応混合物を数時間攪拌する。
反応混合物を水で洗浄し、そして有機層を分離し、そして乾燥して３′−SCH2I−５′連鎖を有しそして上のように５′−および３′−位置において保護された２量体化された生成物得る。生ずる２量体を３′−位置において脱保護し、次いで実施例１において示しかつ説明するようにプロピン誘導体に変換する。２量体を標準のオリゴマーの合成において使用する場合、それを２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン（リン酸化のための（PA）のためにバン・ブーム（van Boom）試薬）を使用して水素ホスホネートに変換する。第８図は３′−チオフォルムアセタール３量体の合成を示す。
リボアセタール連鎖２量体の合成を第９図に示す。５′−DMT，３′−Ｈ−ホスホネート２量体を、直接オリゴマーの中への組み込みのために、普通の方法により使用することができるか、あるいは適当な前駆体を必要に応じて３量体、４量体またはより長いオリゴマーへの変換のために使用することができる。
エチニルヘテロアリールおよびヘテロアリール誘導された塩基の合成
第14図、第15図および第16図は、５位置にエチニルヘテロアリールまたはヘテロアリール基をもつ本発明の塩基を有するヌクレオモノマーの合成のための合成スキームを示す。ヌクレオモノマーを、オリゴマーの中への組み込みのために適当なブロックされたモノマーに普通の方法により変換することができる。
５′−フェニル−２′−デオキシウリジンの合成を、従来記載されているように、フェニルトリメチルスタンナンを使用して達成された(Crisp,G.ら、Tetrahcdron Letters(1990)31:1347-1350)。ブロモピリミジンから得られる出発物質としてピリジニルトリメチルスタンナンまたはピリジニルトリブチルスタンナンなどを使用するプロトコールを使用して、５−（２−ピリジニル）−２′−デオキシウリジンを合成する（実施例15）。ヘテロアリールスタンナンの合成は、便利には記載されているように達成される(Bailey,T.R.Tet.Lett.(1986)27:Jutzi,P.ら、J.Organomctal Chem.(1983)246*61-73)。
ヘテロアリール基、例えば、２−チアゾリル、１−メチル−２−イミダゾリル、２−オキサゾリル、２−フラニルなどをもつ５−置換ピリミジンヌクレオモノマーの合成は、発表されたプロトコールを使用して(Wigerinck,P.ら、J.Med.Chem.(1991)34:2383-2389;Peters,D.ら、Nucleosides and Nucleotides(1992)11:1151-1173)次いで標準の方法により対応するヌクレオモノマーに変換することによって達成できる（実施例16参照）。５−シアノ置換基は記載されているようにして調製し(Inoue,T.ら、Chem.Pharm.Bull.(1978)9:2657-2663)そして、また、記載されているように、出発親電子物質として使用してヘテロアリール置換ヌクレオモノマーを構成することができる(Wigerinck,P.ら、J.Med.Chem.(1991)34:1767-1772)。
エチニルnta誘導体をエチニルトリメチルシランおよび適当なヘテロアリールから記載されているように調製する(Austin,W.B.ら、J.Org.Chem.(1981)46:2280-2286)（実施例14参照）。次いで、脱プロトン化エチニルをヌクレオモノマーの中に標準の手順により導入する（実施例１および14）。
実用性および投与
本発明のオリゴマーは有意な一本鎖または二本鎖の標的核酸への結合活性を有して二重らせん、三重らせんまたは安定なアソシエーションの他の形態を成形することができるので、これらのオリゴマーは１または２以上の遺伝子、例えば、多数の異なる病理学的状態に関連する遺伝子の発現に関連する疾患の診断および治療において有用である。治療的応用は、病理学的条件の確立または維持に関連する遺伝子の発現を特異的に阻害（またはそれらの遺伝子によりエンコードされるRNA配列の翻訳を特異的に阻害）するためにオリゴマーを使用できる。ターゲッティングすることができる遺伝子によりエンコードされるRNAの遺伝子の例は、酵素、ホルモン、血清タンパク質、付着分子、リポーター分子、サイトカイン、腫瘍遺伝子、成長因子、およびインターロイキンをエンコードするものを包含する。標的遺伝子またはRNAは、病理学的状態、例えば、炎症状態、心臓血管の障害、免疫反応、癌、ウイルスの感染、細菌の感染などに関連する状態に関連させることができる。
本発明のオリゴマーは、in vivoおよびex vivoの両者の治療的応用のために適当である。ex vivoの適応は、白血病またはウイルスの感染のような状態における骨髄または末梢血液のような細胞の処置を包含する。標的遺伝子または癌の処置のための標的として働くことができる遺伝子によりエンコードされるRNAは、腫瘍遺伝子、例えば、ras，k-ras，bcl-2，c-myb，bcr，c-myc，c-ablまたは過度に発現した配列、例えば、mdm2、オンコスタチンＭ、IL−６（カポージ肉腫）、HER-2およびトランスロケーション、例えば、bcr／ablを包含する。ウイルス遺伝子の配列またはそれらの遺伝子によりエンコードされるされるRNA、例えば、ポリメラーゼまたはCMV，HSV-1，HSV-2，HTL-1，HTL-2，HBV，HPV，VZV、インフルエンザウイルス、ライノウイルスなどの逆転写遺伝子は、また、適当な標識である。特異的に結合するオリゴマーの応用は、他の治療的処置と関連して使用することができる。本発明のオリゴマーの他の治療的適応は、（１）炎症を仲介するときある役割を演ずる遺伝子、例えば、IL−１レセプター、IL−１，ICAM−１またはＥ−選択の発現を変調することによる炎症応答の変調および（２）（ａ）成長因子またはミトジェン因子、例えば、非筋肉ミオシン、myc，fos，PCNA，PDGFORFGFまたはそれらのレセプター、または（ｂ）細胞増殖因子、例えば、c-mybの発現を変調することによる血管成形後における、動脈閉塞（再狭窄）このような状態における細胞の増殖の変調を包含する。他の適当な細胞外増殖因子、例えば、TGFα，IL−６，γINF、タンパク質キナーゼＣを乾癬または他の状態の処置のためにターゲッティングすることができる。さらに、EGFレセプター、TGFαまたはMHCアレルを自己免疫疾患においてターゲッティングすることができる。
本発明のオリゴマーの細胞の中へのデリバリーは、リン酸カルシウム、DMSO、グリセロールまたはデキストランのトランスフェクション、エレクトロポレイションを包含する任意の適当な方法によるか、あるいはカチオン性、アニオン性および／または中性の脂質組成物またはリポソームの使用により記載されている方法によって増強することができる（国際特許公開第WO90／14074号、国際特許公開第WO91／16024号、国際特許公開第WO91／17424号、米国特許第4,897,355号）。オリゴマーは、カチオン性脂質、例えば、DOTMAとの複合化により細胞の中に導入することができ、次いでこのカルボキシを細胞と接触させる。適当なカチオン性脂質は次のものを包含するが、これらに限定されない：Ｎ−（２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシル（）−プロプ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（DOTMA）およびその塩類、１−Ｏ−オレイル−２−Ｏ−オレイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモウムおよびその塩類および１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパンおよびその塩類。
本発明のオリゴマーの増強されたデリバリーは、また、（ｉ）ウイルス、例えば、センダイウイルス(Bartzatt,R.,Biotechnol.Appl.Biochem.(1989)11:133-135)またはアデノウイルス(Wagner,E.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89:6099-6013;（ii）化合物、例えば、ポリリジン、プロタミンまたはＮ１，Ｎ12−ビス（エチル）スペルミンを使用するポリアミンまたはポリカチオン接合体(Wagner,E.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1991)88:4255-4259;Zenke.Mら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1990)87:3655-3659;Chank,B.K.ら、Biochem.Biophys.Res.Comm.(1988)157:264-270;米国特許第5,138,045号；（iii）化合物、例えば、リポスペルミンを使用するリポスペルミンカルボキシ(behr,J.-P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1989)86:6982-6986;Loeffler,J.P.ら、J.Neurochem.(1990)54:1812-1815);（iv）アニオン性リン脂質、例えば、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジン酸またはホスファチジルエタノールアミンを包含する化合物を使用するアニオン性、中性またはpH感受性脂質(Lee,K.-D.ら、Biocheim.Biophys.Acta(1992)1103:188-192;Yoshimura,T.ら、Biochem.Int.(1990)20:697-706)；（ｖ）トランスフェリンまたはビオチンのような化合物との接合体または（vi）被検体におけるオリゴマーの薬力学的性質を増強する血清タンパク質（アルブミンまたは抗体を包含する）、糖タンパク質またはポリマー（ポリエチレングリコールを包含する）のような化合物との接合体の使用により仲介することができる。ここにおいて使用するとき、トランスフェクションは細胞の中へのオリゴマーのデリバリーに適当である任意の方法を呼ぶ。トランスフェクションのプロトコールにおいて使用できる脂質のような試薬またはウイルスのような因子を、ここにおいて「透過増強因子」と集合的に呼ぶ。細胞の中へのオリゴマーのデリバリーは、他の核酸、例えば、（ｉ）１または２以上のタンパク質またはタンパク質断片をエンコードする発現可能なDNA断片あるいは（ii）１または２以上のタンパク質またはタンパク質断片をエンコードする翻訳可能なRNAとの共トランスフェクションを介することができる。
こうして、オリゴマーは細胞の中へのオリゴマーのデリバリーを増強する任意の適当な配合物混入することができる。適当な製剤配合物は、また、化合物を細胞または組織の中に局所的により送り出す応用において普通に使用されるものを包含する。ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、アゾン、ノンオキソニル−９、オレイン酸、DMSO、ポリアミンまたはリポポリアミンのような化合物をオリゴマーを含有する局所的調製物において使用できる。
本発明のオリゴマーは、遺伝子の発現を望む研究または生産の目的のための試薬として便利に使用することができる。いずれかのメカニズムにより標的遺伝子の発現を効率的または特異的に阻害する入手可能な試薬は、現在、非常にわずかである。従来標的遺伝子の発現を阻害すると報告されてきているオリゴマーは、しばしば非特異的作用を有し、および／または非常に低いレベル（未阻害レベルの約40％）に標的遺伝子の発現を減少しない。本発明のオリゴマーは、比較すると、マイクロインジェクションのアッセイにおいて0.05μＭ程度に低いIC50値をもつ極端な効力を有する。これらの効力のレベルは、標的遺伝子の発現の効率よい阻害をもつと同時に細胞への有意な非特異的作用を回避して、細胞へのオリゴマーの適用を可能とする。これにかんがみて、本発明のオリゴマーは、遺伝子の機能をプロービングしかつ一本鎖または二本鎖の核酸の役割をプロービングするために使用される試薬の独特のクラスを表すことが明らかである。
こうして、ここの記載する結果は、タンパク質がDNA配列によりエンコードされそしてタンパク質がRNA配列から翻訳される被検体または細胞の中の選訳した１または２以上のタンパク質の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、本発明のオリゴマーを細胞の中に導入し；そしてオリゴマーがDNAまたはRNAと三重らせんを成形するか、あるいはDNAまたはRNAと二重らせんを成形するようにし、これにより１または２以上のタンパク質の発現を阻害するからなる。本発明の方法およびオリゴマーは、原核生物および真核生物の両者の細胞、例えば、細菌、寄生生物、酵母および哺乳動物細胞の中の標的遺伝子の発現を変調するために適当である。
後述する結果（実施例６および７）がが実証するように、オリゴマーは、アンチセンスのメカニズムにより遺伝子の発現を阻害するために使用するとき、RNアーゼＨ「受容」またはRNアーゼ「非受容」種であることができる。修飾、例えば、２′−置換（２′−Ｏ−アルキルなど）またはある種のアンチャージ連鎖を有するオリゴマーは、RNアーゼＨにより認識され、および／またはそれにより作用される基質として通常非受容性である。RNアーゼＨの受容能力は、RNA-オリゴマー二重らせんの中の標的RNAを分解することによって、アンチセンスのオリゴマーの機能を促進することができる(Dagle,J.M.ら、Nucl.Acids Res(1990)18:4751-4757;Walder,J.A.ら、国際特許公開第WO89／05358号）。この酵素はRNA-DNA二重らせんにおいてRNAを切断する。
RNアーゼＨの受容能力を保持するために、オリゴマーはその中に位置する３またはそれ以上の受容性の隣接する連鎖のRNアーゼＨ受容ドメインを必要とする(Quartin,R.S.ら、Nucl.Acids Res.(1989)17:7253-7262)。ヌクレアーゼ消化に対して耐性オリゴマーのデザインは、ヌクレアーゼ耐性を実行するための末端の連鎖、鎖および／または塩基の修飾を有するであろう。こうして、オリゴマーは５′末端および／または３′末端のいずれかまたは両者に修飾されたヌクレオモノマー残基を有すると同時に内部のRNアーゼＨ受容ドメインを有するようにデザインすることができる。
RNアーゼＨ受容能力を保持する例示的オリゴマーは、一般に、均一な極性を有し、そして３′末端にオリゴマーをヌクレアーゼ消化に対して安定化する約２〜約12ヌクレオモノマー、および３′末端および５′末端の間のRNアーゼＨ受容性ドメインとして機能する約３〜約26ヌクレオモノマーからなる。このようなオリゴマーについての変動は、（１）１または２RNアーゼＨ受容連鎖からなるより短いRNアーゼＨ受容ドメイン、（２）12，20またはそれ以上までの置換連鎖またはヌクレオモノマーからなるより長いRNアーゼＨ非受容ドメイン、（３）30，40またはそれ以上までの連鎖からなるより長いRNアーゼＨ受容ドメイン、（４）３′末端または５′末端における単一のみのRNアーゼＨ受容ドメインをもつオリゴマー、あるいは（５）２以上のRNアーゼＨ受容ドメインを有するオリゴマーを包含する。RNアーゼＨ受容能力は、また、１つの考えとして、逆の極性の１または２以上の領域を有するオリゴマー、環状のオリゴマーおよび他の型のオリゴマーに適用される。
約８程度に少ないヌクレオモノマーを含有するオリゴマーは、標的核酸配列と二重らせんまたは三重らせんの構造の形成により１または２以上の標的タンパク質の発現を阻害するために使用できる。しかしながら、二重らせんまたは三重らせんの形成を介して標的タンパク質の発現を阻害するために使用する線状オリゴマーは、好ましくは約12〜約20のヌクレオモノマー残基を有する。
本発明の塩基を含有するオリゴマーは、記載されているように普通の環化することができる（国際特許公開第WO92／19732号；Kool,E.T.,J.Amer.Chem.Soc.(1991)113:6265-6266;Prakash,G.ら、J.Amer.Chem.Soc.(1992)114:3523-3527)。このようなオリゴマーは一本鎖または二本鎖の核酸の標的への結合のために適する。環状オリゴマーは種々のサイズを有することができる。約22〜50ヌクレオモノマーのサイズ範囲のこのようなオリゴマーは、便利に調製することができる。環状オリゴマーは、記載されているようにオリゴマーの結合ドメインを分離するループ領域の中に約３〜約６ヌクレオモノマー残基を有することができる(prakash,G.前掲)。オリゴマーはリガーゼによるか、あるいは５′末端および３′末端の糖および／または塩基を通る連鎖を介して化学的手段により末端のホスフェートを通して酵素的に環化することができる。
オリゴマーは、変調転写(Maher,L.J.ら、Science(1989)245:725-730)または翻訳（下の実施例７）のための核酸結合性タンパク質の相互作用を阻害することによって、標的遺伝子の発現を変調するために使用できる。こうして、オリゴマーは、核酸結合性タンパク質（リボソーム、RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ、転写開始因子、転写を増加または減少する転写因子、タンパク質−ホルモン転写因子などを包含する）と競争する配列特異的因子として適当である。こうして、適当にデザインされたオリゴマーを使用して、発現の抑制のために転写因子を使用するメカニズム、例えば、調節部位へまたはその付近への結合によるか、あるいは選択したリプレッサータンパク質それ自体の発現の抑制により、標的タンパク質の合成を増加することができる。
本発明のオリゴマーは、２次または３次の構造、例えば、シュードノットまたはシュード−ハーフ−ノットを含有するようにデザインすることができる(Ecker,D.J.ら、Science(1992)257:958-961)。このような構造は、対応する未修飾のオリゴマーより安定な２次または３次の構造を有することができる。このような構造体の増強された安定性は、単一のオリゴマーにおける自己相補性の領域の間におけるか、あるいは所定の構造を形成する２またはそれ以上のオリゴマーの間の相補性の領域の間における、増加した結合アフィニティーに頼るであろう。このような構造体は、HIV Tatタンパク質（TARに結合するタンパク質）による結合を妨害するために、HIV TAR構造体のような構造体をまねるために使用することができる。高等の核酸構造体、例えば、ステム、ループ、ヘアピン、ノットなどを反応う他の転写または翻訳の因子とともに、同様なアプローチを使用することができる。あるいは、本発明のオリゴマーを使用して、核酸構造体へのタンパク質の結合を（１）妨害または（２）増強する方法として、このような構造体を（１）崩壊するか、あるいは（２）前記前記に結合することができる。
アンチセンスまたは三重らせんの治療におけるそれらの使用に加えて、本発明のオリゴマーは、また、二重らせんの核酸における１つの鎖の直接の置換により機能する治療剤または診断剤として適用することができる。自然の二重らせん、例えば、染色体のDNAまたは二重らせんのウイルスDNA，RNAまたはハイブリッドDNA／RNAの中の鎖の置換は、それらの相補的標的配列に対する高い結合アフィニティーをもつオリゴマーについて可能である。この使用法によるオリゴマーの治療的応用（ここにおいてＤ−ルーピングまたは「Ｄ−ルーピング治療」と呼ぶ）は、その相補的配列に対する自然のDNAまたはRNAのアフィニティーが二重らせんの中のDNAまたはRNAの鎖を効率よく置換するために十分に大きくないので、従来不可能であった。Ｄ−ルーピングにより機能するオリゴマーの治療的効能は、核酸標的に関連するした正常の生物学的機能の変調を生ずる相補的配列に対する高いアフィニティーの結合から生ずる。標的核酸のタイプは、次のものを包含するが、これらに限定されない：（ｉ）遺伝子配列、例えば、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接合、プロモーター／エンハンサー領域および５′または３′の非翻訳領域、（ii）機能するために２次構造体を利用する核酸の領域（例えば、HIV TARステム−ループ要素またはtRNA）、（iii）構造的な機能を働く核酸、例えば、テロマーまたはセントロマーおよび（ｉ）任意の他の二重らせん領域。離散した機能的ドメインをもつオリゴマーを合成できることは明らかである、ここでオリゴマーの１つの領域はＤ−ルーピングにより標的に結合するが、隣接する領域は、例えば、三重らせんを形成するか、あるいはアプタマーとしてタンパク質に結合することによって、標的分子に結合する。あるいは、Ｄ−ルーピングオリゴマーは、オリゴマーが結合する鎖をスイッチングすることによって（すなわち、１つの鎖に結合するオリゴマーの１つの領域および相補的鎖に結合する他の領域を有することによって）各鎖に二重らせんで結合することができる。結合のモード（すなわち、三重らせんまたはＤ−ループ）を命令するコントロール要素はオリゴマーの配列であり、そして固有のアフィニティーはオリゴマーの中に構成される。ワトソン−クリック（Watson-Crick）二重らせんの結合における塩基の認識のルールは、フーグスティーン（Hoogesteen）調節三重らせんの結合におけるものと異なる。このために、オリゴマーの塩基配列を使用して、オリゴマーが利用すう結合ルールのタイプを命令することができる。
Ｄ−ループの構造は自然において酵素仲介プロセスにより形成される(Harris,L.D.ら、J.Biol.Chem.(1987)262:9285-9292)か、あるいはDNAの複製が起こる領域に関連する(Jacobs,H.T.ら、Nucl.Acids Res.(1989)17:8949-8966)。オリゴマーの結合から発生すうＤ−ループは、１または２工程のプロセスから生ずることができる。標的鎖の直接の置換は、単一の結合の事象によりＤ−ループを発生する。しかしながら、Ｄ−ルーピングは、また、Ｄ−ループに導く鎖の置換の事象を促進する三重らせんを形成することによって起こることができる。
変更された特性をもつ種をデザインするために、本発明の塩基を含有するリボザイムをデザインすることができる。一本鎖を切断するリボザイム(Robertson,D.L.ら、Nature(1990)344:467-468)が記載された。リボザイムのための治療的適用は仮定された(Sarver,N.ら、Science(1990)247:1222-1225;国際特許公開第WO91／04319号)。リボザイム機能のために必要な２次または３次の構造は、適当なオリゴマーの配列により影響を受けることがある。例えば、本発明の塩基を含有するターゲッティングドメインを有するリボザイムはより高いアフィニティーを有すると同時に、標的配列のための塩基対の特異性を維持する。本発明の塩基はそれらの相補的配列に対して高いアフィニティーをもつために、リボザイムの中のより短い認識ドメイン（製造における利点）をデザインすることができ、これはいっそう好適な代謝回転に導く（リボザイム機能における利点）。
治療的応用において、オリゴマーは適当な標的遺伝子の発現を阻害することによって、種々の状態を処置するために適当な方法で利用される。このような治療のために、オリゴマーを投与の種々のモードで配合することができ、このようなモードは全身的、局所的または局在化された投与を包含する。技術および配合は、一般に、Remington's Pharmceutical Scences,Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、最近の版、の中に見いだすことができる。オリゴマーの活性成分は、一般に、投与のモードの性質および投与の形態に依存して、担体、例えば、希釈剤または賦形剤と組み合わせ、このような希釈剤または賦形剤は充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、または滑剤を包含することができる。。典型的な投与の形態は、錠剤、粉末、液体の調製物、例えば、懸濁液、乳濁液および溶液、顆粒、カプセル剤および坐剤、ならびに注射用の液状調製物、例えば、リポソーム調製物を包含する。
全身の投与のために、注射は好ましく、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を包含する。注射のために、本発明のオリゴマーは液体の溶液、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えば、ハンク溶液で配合される。さらに、オリゴマーは固体の形態で配合し、そして使用直前に再溶解または懸濁させることができる。凍結乾燥した形態をまた包含される。全身的投与のための使用できる投与量は、好ましくは約0.01mg／kg〜50mg／kgの範囲であり、１日１回または２回投与される。しかしながら、異なる投与のスケジュールは、（ｉ）標的DNAまたはRNAの活性を阻害すうときの個々のオリゴマーの効能、（ii）所定の標的遺伝子に関連する病理学的疾患の状態のひどさまたは程度、あるいは（iii）所定のオリゴマーの薬力学的挙動に依存して利用することができる。
全身的投与は、また、経粘膜的または経皮的手段によることができるか、あるいは化合物は経口的に投与することができる。経粘膜的または経皮的投与のために、透過すべき障壁に対して適当な浸透剤を配合物の中に使用する。このような浸透剤は一般にこの分野において知られており、そして、例えば、経粘膜的投与のための胆汁塩類およびフシジン酸誘導体を包含する。さらに、洗浄剤を使用して透過を促進することができる。経粘膜的投与は、例えば、鼻の噴霧、または坐剤の使用により行うことができる。オリゴマーは普通の経口的投与の形態、例えば、カプセル剤、錠剤またはトニックに配合される。
局所的投与のために、本発明のオリゴマーは、この分野において一般に知られているように、軟膏、軟膏剤、ゲル、またはクリームに形成される。眼の応用、例えば、ウイルスの感染のための本発明のオリゴマーの配合物は、この分野において知られている標準の組成物に基づく。
治療的使用に加えて、本発明のオリゴマーは、それらが特異的に結合する標的核酸配列の存在または不存在を検出する診断試薬として使用できる。本発明のオリゴマーの増強された結合アフィニティーは、プライマーまたはプローブとしてのそれらの使用のための１つの利点である。診断試験は、二重らんせんまたは三重らせんの形成を通してハイブリダイゼーションにより実施することができ、次いで二重らせんまたは三重らせんの形成を普通の手段により検出する。例えば、オリゴマーを放射性、蛍光性、または発色性標識で標識化し、そして固体の支持体に結合した標識の存在を検出することができる。あるいは、二重らせんまたは三重らせんの存在は、これらの形態を特異的に認識する抗体により検出することができる。プローブとしてこのようなオリゴマーを使用するアッセイを実施する手段は一般に知られている。
三重らせんの形成による診断剤として修飾された塩基を含有するオリゴマーの使用は有利である。なぜなら、三重らせんは温和な条件下にドメインし、こうして被験標本を厳しい条件に実験しないでアッセイを実施できるからである。細菌、真菌または原生動物の配列の同定のためのRNAの検出に基づく診断アッセイは、実験室において成長した試料または生物からのRNAの単離をしばしば必要とし、これは、RNAが偏在するヌクレアーゼに対して極端に感受性であるので、労力を要しかつ時間を消費する。
オリゴマーのプローブは、また、追加の修飾、例えば、修飾された糖および／または置換連鎖組み込むことができ、ここでこのような修飾はオリゴマーをことにヌクレアーゼ安定性として、こうして通常ヌクレアーゼ活性を含有する細胞または組織抽出物の存在下に実施するアッセイのために有用である。末端の修飾を含有するオリゴマーは、特異性を損失しないで、相補的配列に結合するそれらの能力をしばしば保持する(Uhlmannら、Chem.Reviews(1990)90:543-584)。前述したように、本発明のプローブは、また、別の鎖への特異的結合を可能とするリンカーを組み込むことによって、このようなリンカーを含有することができる(Froehler,B.C.ら、Biochemistry(1992)31:1603-1609);Horneら、J.Amer.Chem.Soc.(1990)112:2435-2437)。
ある種の共有結合の架橋剤をまた含有するプローブの中への本発明の塩基類似体の組み込みは、診断または検出のアッセイにおいて感受性を増加しかつバックグラウンドを減少する可能性を有する。さらに、架橋剤の使用は、新規なアッセイの変更、例えば、（１）プローブの識別を増加するための架橋の使用、（２）バックグラウンドを減少するための変性洗浄工程の組み込み、および（３）標的の中の２次構造を減少しかつプローブの特異性を増加するために、ハイブリッドの溶融温度またはその付近におけるハイブリダイゼーションおよび架橋を実施すること、を可能とするであろう。ハイブリダイゼーションの条件の変更は従来記載された(Gamperら、Nucleic Acids Res.(1986)14:9943)。
本発明のオリゴマーは、オリゴマーまたは検出すべきオリゴマー核酸を記載されているように固体の支持体に共有結合的に取り付ける方法を使用する診断のアッセイにおける使用に適する（米国特許第4,775,619号）。オリゴマーは、また、記載された方法に従い標的配列を増殖するポリメラーゼ連鎖反応技術に頼る診断のアッセイにおける使用に適する（欧州特許公開第0 393 744号）。５−修飾ピリミジンを含有する本発明のオリゴマーは、ポリメラーゼ連鎖反応法において使用するポリメラーゼ、例えば、Taqまたはベント（VentR）ポリメラーゼと適合する。こうして、本発明のオリゴマーはPCRプロトコールにおけるプライマーとして利用することができるか、あるいは５−位置にＲ2を有しトリホスフェートピリミジンモノマーは好熱性物質（Taqまたはベント（VentR））または他の源（大腸菌（E.coli）、ヒト、ライノウイルスなど）から誘導されたDNAまたはRNAポリメラーゼにより基質として利用して、種々の診断のプロトコールにおいて本発明のオリゴマーを発生させることができる。モノマーのトリホスフェートの合成は既知の方法により達成される(Otvos,L.ら、Nucl.Acids Res.(1987)15:1763-1777)。
オリゴマーは、離散した配列であるプライマーとして、あるいはランダム配列をもつプライマーとして有用である。ランダム配列のプライマーは、一般に、約6または7ヌクレオモノマーの長さである。このようなプライマーは種々の核酸の増幅のプロトコールにおいて使用することができる（PCR、リガーゼ連鎖反応など）またはクローニングのプロトコールにおいて使用することができる。本発明の５−置換体は、一般に、プライマーとして機能するオリゴマーの能力を妨害しない。３′末端の残基以外の部位に２′−修飾、オリゴマーをRNアーゼＨ非受容性とするか、あるいはそうでなければヌクレアーゼ安定性とする他の修飾を有する本発明のオリゴマーは、細胞抽出物またはヌクレアーゼを含有する他の溶液においてRNAまたはDNA配列のためのプローブまたはプライマーとして有利に使用することができる。こうして、標的核酸を含有する試料とオリゴマーを混合し、次いでオリゴマーを標的核酸とハイブリダイゼーションさせ、そしてPCR，LCRまたは他の適当な方法により標的核酸を増幅することによって、試料の中の核酸を増幅するプロトコールにおいてオリゴマーを使用することができる。
キレート剤、例えば、EDTA，DTPAまたは１，２−シアミノシクロヘキサン類の類似体に対して誘導したオリゴマーを、記載されているように種々のin vitroの診断アッセイにおいて利用することができる（米国特許第4,772,548号、米国特許第4,707,440号および米国特許第4,707,352号）。あるいは、本発明のオリゴマーは、架橋剤、例えば、５−（３−ヨードアセトアミドプロプ−１−イル）−２′−デオキシウリジンまたは５−（３−（４−ブロモブチルアミド）プロプ−１−イル）−２′−デオキシウリジンで誘導し、そして記載されているように種々のアッセイの方法またはキットにおいて使用することができる（国際特許公開第WO90／14353号）。
前述の用途に加えて、遺伝子の発現を阻害するオリゴマーの能力を、in vitro系において被検体の細胞の中の発現のレベルを測定するか、あるいは組換え系において適当な方法により評価することができる(Graessmann,M.ら、Nucleic Acids Res.(1991)19:53-59)。
ここにおいて引用したすべての参考文献を、それらの全体において、引用によってここに加える。
下記の実施例によって、本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されない。使用した数（例えば、量、温度など）に関して精度を保証することに努力したが、多少の実験誤差および偏りを考慮すべきである。特記しない限り、部は重量部であり、温度はセ氏であり、そして圧力は大気圧またはその付近である。
実施例１
５−（１−プロピニル）−２′−デオキシウリジンＨ−ホスホネートのモノマーおよび類似体を含有するオリゴマーの合成
50mlの丸底フラスコに、次の成分を入れる：
ａ）708mg（２mmol）の５−ヨードdU
ｂ）10mlの無水DMF
ｃ）76mg（0.4mmol）のCuI
ｄ）555μｌ（４mmol）のEt3N
ｅ）231mg（0.2mmol）の（Ph8P）4Pd
ｆ）室温において攪拌しながらプロピンガスで飽和する（ほぼ10分）
２時間後、さらにプロピンガスを泡立てて通入し、そして反応混合物を室温において一夜攪拌する。次の朝、さらにプロピンを泡立てて通入し、そしてさらに２時間攪拌する。反応混合物に、ドウウェックス（Dowex）イオン交換樹脂（HCO3型）、10mlのMeOHおよび10mlのCH2CL2を添加し、そして１時間攪拌する。樹脂を濾過し、MeOHで洗浄し、そして上澄み液を蒸発させる。シリカゲルのクロマトグラフィーにより、517mg（1.94mmol，97％収率）の生成物が得られた。参照：Hobbs,J.Org.Chem.(1989)54:3420-3422。
精製した物質を５′DMTで保護し、そして記載されているようにホスフィチル化し（Morugg,J.E.ら、Tetrahedron Letters(1986)27:2661-2664)そして記載されているように固相合成において使用した(Froehler,B.C.ら、米国特許第4,959,463号;Froehler,B.C.ら、Tetrahedron Letters(1986)27:5575-5578)。
次の表示法を使用して、以下の実施例において表示した番号のオリゴマーの中の塩基を表す：Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ、およびＵはそれらの普通 意味を有する。Ｃ′＝５−メチル−２′−デオキシシチジン、ＣO＝５−（１−プロピニル）−２′−デオキシシチジン；ＵO＝５−（１−プロピニル）−２′−デオキシウリジン。
実施例２
二重らせんDNAに結合する５−プロピニルウラシル残基を含有するオリゴマー（ON）を使用する三重らせん構造体の形成
これらのオリゴマーを次のようにして合成した：
Figure 0003739785
各オリゴマー（ON）を、標的配列５′AGAGAGAGAGAAAAA ３′を含有する二重らせんDNAとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは140mM KCl2，５mM MgCl2，５mM Na2HPO4，pH6.6の中で実施した。各オリゴマーと標的配列との間に形成した生ずる三重らせんの熱安定性Ｔmを決定した。次のＴm値が得られ、ON−１（対照オリゴマー）は42.1℃であった。ON−２は48.1℃であり、そしてON−３は55℃であった。ON−２およびON−３の増加したＴmは期待されず、そして形成した三重らせんが対応する対照の三重らせん構造体よりいっそう安定であることを実証した。
実施例３
５−プロピニルウラシルまたは５−プロピニルシチジンを含有するオリゴマーの一本鎖RNAへの結合
オリゴマーを次のようにして合成した：
Figure 0003739785
オリゴマーを一本鎖標的RNA配列５′AAAAAGAGAGAGAGA ３′と、140mM KCl，5mM MgCl2，５mM Na2HPO4，pH6.6の中でハイブリダイゼーションさせた。二重らせんについて次のＴm値が得られた；ON−１（対照）は65.6℃であり、ON−３は74.0℃であり、そしてON−４は73.0℃であった。ON−３およびON−４と形成した二重らせんは、対照オリゴマーよりもいっそう安定性であった。驚くべきことには、ON−３およびON−４は、形成した二重らせんが対応二重らせん構造体よりもいっそう安定であることを実証すう、増加したＴm値を与えた。
実施例４
高いpHにおける三重らせん構造体の形成
対照としてON−１およびON−５，５′UOC′UOC′UOC′UOC′UOC′UOUOUOUOUO ３′を使用して、高いpHにおける三重らせんの形成は実証された。オリゴマーを二重らせん標的DNAと実施例２に記載するようにハイブリダイゼーションしたが、ただし緩衝液はpH7.4であった。次いで、三重らせんのＴm値を決定した。ON−１は27.1のＴmを有したが、ON−５は51.5のＴmを有した。こうして、５−プロピニルウラシルを含有するオリゴマーは高いpHレベルにおいて三重らせんを形成することができたが、対照オリゴマーは生理学的温度より低い温度においてのみ三重らせん構造体を形成した。
決定の追加の組、デオキシウリジンの５−置換基が、プロピニルの代わりに、３−メチルブチニル（ON−5A）または３，３−ジメチルブチニル（ON−5B）であるON−５の修飾された形態において、二重らせんおよび三重らせんの溶融温度への同様な作用が観察された。結果を下表１に示す。
Figure 0003739785
実施例５
５−（３−メチル−１−ブチニル）−２′−デオキシウリジンＨ−ホスホネート、類似体を含有するオリゴマーの合成およびオリゴマーを使用する三重らせん構造体の形成
５−（３−メチル−１−ブチニル）−２′−デオキシウリジンＨ−ホスホネートを５−ヨードウリジンから実施例１において５−（１−プロピニル）−２′−デオキシウリジンＨ−ホスホネートについて本質的に記載したようにして合成したが、ただしプロピンの代わりに５当量の３−メチル−１−ブチン液体を使用した。次いで、シリカゲルで精製した物質を５′−MMT，３′−Ｈ−ホスホネートモノマーに変換し、そして固相合成において使用して次にようなオリゴマーを発生させた（実施例２に記載するようにチミンおよび５−メチルシトシンを含有する対照として、ON−１を使用した）：
Figure 0003739785
Ｕ′と表示する塩基の残基は５−（３−メチル−１−ブチニル）ウラシルに相当する。オリゴマーを、標的配列、５′AGAGAGAGAGAAAAA ３′を含有する二重らせんDNAとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは実施例２に記載する緩衝液の中でpH6.2上に実施した。ON−１は51.0℃のＴmを有したが、ON−６のＴmは55.2℃であり、そしてON−７のそれは55.0℃であった。
実施例６
二重らせんおよび三重らせん構造体の安定性および標的遺伝子の発現の阻害
熱安定。追加のオリゴマーを、DNAまたはRNA標的とハイブリダイゼーションさせて、それぞれ、三重らせんおよび二重らせんを形成した後、熱的変性または安定性（Ｔm）に関して試験した。使用したDNA標的は、自己相補的領域を含有しそしてヘアピンの末端に４ヌクレオチドのループを有するオリゴマーであった。標的は次の通りであった：
Figure 0003739785
三重らせんの結合についてのアッセイは140mM KCl／５mM NaHPO4／５mM MgCl2，pH6.60の中で実施し、そしてすべてのオリゴマーの最終濃度は約２μＭであった。
前述のON−１を対照として使用した。
被験オリゴマー８〜10はチミンについて５−プロピニルウラシルそしてメチルシトシンについて５−プロピニルシトシンの置換基を含有する。
Figure 0003739785
得られた結果が示すように、三重らせんの形成に関して、対照ON−１は43.4℃のＴmを与えた；ON−８または55.5℃の高いＴmを与えた；そしてON−９は26.3℃のＴmを与えた。ＵOを含有するON−８は、ON−１に関して、2.4℃のＴmの増加／置換（ΔＴm，6.6＝＋12.1℃）を示し、そしてＣOを含有するON−９は、ON−１に関して、3.4℃のＴmの減少／置換（ΔＴm，6.6＝−17.1℃）を示した。第３鎖が２′−デオキシシチジンを含有する三重らせんのＴmはpH依存性であり、そして異なるpH(5.8〜7.4)におけるＴmを使用して複合体のpH依存性を検査した。すべてのONでは、プロットの傾斜は比較的一定に止まった（−18〜−20℃／pH単位）。
ON−９の低いＴmは、ON−１およびON−８に関して、複素環の塩基性により説明することができる。ＣOおよびＣ′の塩酸塩の滴定によりに、５−プロピン分析ＣOのpKa（3.30±0.05）は５−メチル誘導体Ｃ′（4.35±0.05）より1.05単位低いことが示された。三重らせんの形成におけるプロトン化の重要性が実証され、そして前述の結果が示すように、シトシンの核塩基の塩基性の減少は複合体の安定性に劇的な作用を有する。驚くべきことは、シトシン（ＣOおよびＣ′）のpKaにおける大きい差はＴm／pHのプロットの傾斜に対して有意な作用をもたない。
オリゴマー／RNAの二重らせんの形成に関すると、対照ON−１は65.5℃のＴmを有し、ON−８は74.0℃のＴmを有し、ON−９は73.0℃のＴmを有し、そしてON−10は90℃より大きいＴmを有した；ＵOを含有するON−８は1.7℃／置換のＴmの増加を生じ、そしてＣOを含有するON−９は1.5℃／置換の増加を生ずる。これらの条件下で、ＵOおよびＣOとの完全な置換を含有するON−10は90℃より大きいＴm（ほぼ1.7℃／置換）を有し、これらの置換の結合アフィニティーの増加が加法的であることを示す。これらの結果が示すように、二重らせんの複合体はＣOおよびＵOとの置換により大きく安定化されそして、したがって、これらの類似体は有用なアンチセンスONの新規なクラスを表す。
追加の修飾としてホスホロチオエートのヌクレオチド内の連鎖を含有するオリゴマーにおいてＣOとＵOとの組み合わせを使用して、結合アッセイを実施した。ホスホロチオエート連鎖はオリゴマーをヌクレアーゼ安定性するが、未修飾ホスホジエステル連鎖に関して相補的標的配列に対する結合アフィニティーを減少する。この分野において知られている他のホスホジエステル連鎖の類似体、例えば、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホルアミダイトおよびトリエステルの連鎖は同様な制限に悩まされる。予期せざることには、結合アフィニティーを増強する複素環の修飾（ここにおいて正の修飾と定義する）、例えば、ＵOまたはＣO、およびアフィニティーを減少する変更（ここにおいて負の修飾として定義する）を含有するオリゴマーは、負の修飾のみを含有するオリゴマーに関して、改良された結合（すなわち、両者の加法的作用−正および負−により予測されるより大きい結合アフィニティー）を有することが発見された。驚くべきことには、プロピンの修飾はホスホロチオエート連鎖の負の結合作用と予期されない程度に反作用する。すなわち、ＴおよびＣ′を含有するオリゴマーについて、ホスホジエステルとホスホロチオエートとの間のΔＴmは14℃（0.7℃／置換）であるが、ＵOおよびＣOを使用するときのΔＴmは6.0℃（0.3℃／置換）である。これらの結果は、負の修飾（置換連鎖、例えば、ホスホロチオエート）と正の修飾（塩基の類似体、例えば、５−置換ピリミジン）との間の相乗的効果を明瞭に示し、ここで正の修飾は、結合アフィニティーに関して加法的であるよりも大きい程度に補償した。得られた結合の結果（ホスホジエステル連鎖に関するΔＴm）を、下表２に示す。
Figure 0003739785
Ｔ抗原（TAg）に相当する標的RNAを使用する二重らせんの形成に関してin vivoで得られた追加のデータは、標的へのオリゴマーの結合が本発明の５−置換オリゴマーについて配列特異的であることを示す。追加のオリゴマー21および22を調製した；ON−22は、前述したようにＴ抗原のコーディング領域をターゲッティングするようにデザインしたON−21の不規則な形態である。
Figure 0003739785
オリゴマーをホスホジエステル（ON−21，ON−22）およびホスホロチオエート（ON-21A，ON-22A）の形態で試験した；そしてON-21BおよびON-22Bは２′−Ｏ−アリルＴおよびＣ′オリゴマーである。結果を表３に示す。
Figure 0003739785
不規則な形態と不規則でない形態との間のＴmの差は、使用したピリミジンおよび連鎖の置換を無視すると、おおよそ同一である。
標的遺伝子の発現の阻害
Graessmann,M.ら、Nucleic Acids Res.(1991)19:53-59に記載されているin vivoのアンチセンスアッセイの変更において、Ｔ抗原（TAg）をターゲッティングするようにデザインした追加のオリゴマーを、また、ＵOおよび／またはＣOならびに修飾されたヌクレオチド内の連鎖を含有するように修飾した。このアッセイはSV40 Ｔ抗原のための発現ベクターを使用する。コーディング領域における配列をターゲッティングするようにデザインしたオリゴマー（ON−11〜ON−17）を使用した。このアッセイにおいて使用したオリゴマーは、次の通りであった。
Figure 0003739785
ON18および19は不一致の対照であり、そして肉太の文字で示す配列の不一致をもつON15において見いだされる同一の塩基組成を有する。相補的RNAをもつオリゴマーのＴmを前述したようにして決定した。細胞の中のオリゴマーのヌクレアーゼ安定性およびＴ抗原の合成を阻害するオリゴマーの能力を、また、決定した。結合したRNAにRNアーゼＨ感受性を付与するON11〜ON17の能力を、また、決定し、そして各オリゴマーはRNアーゼＨ感受性を付与することが発見された。アンチセンスの合成のプロトコールは、実施例７において詳述されている。結果を表４に示す。
Figure 0003739785
理解されるように、ホスホロチオエート連鎖をホスホジエステルで置換すると、標的RNAに対するオリゴマーのアフィニティーは減少するが、細胞の中のオリゴマーのヌクレアーゼ安定性は増加する。チミンおよびシトシン塩基を本発明の５−置換塩基で置換すると、オリゴマーのアフィニティーは増加する。オリゴマーの増加した濃度（ジエステル、ON−13）において、オリゴマーのアフィニティーの増加は検出可能なＴ抗原合成の阻害に導いた。修飾された塩基を含有するホスホロチオエート類似体は十分に安定であり、そしてＴ抗原の合成の阻害を実行するために十分なアフィニティーを有する。IC50値の増加はON−15に関してON18およびON−19のＴmの減少に関連し、不一致の数が増加するとき、これらのオリゴマーが標的配列へ効果的に結合するていどは低くなった。これらの結果は、本発明のアンチセンスのオリゴマーにより標的遺伝子の発現の配列特異的阻害を実証する。
TAg合成の阻害に加えて、β−ガラクトシダーゼRNAに対して相補的である、ホスホロチオエートのオリゴマー、ON20，５′UOUOGC′C′GUOUOUOUOC′AUOC′AUOUOUOAAUO ３′は、2.5μＭのIC50で配列特異的方法でβ−ガラクトシダーゼを阻害することができた。ＴおよびＣ′をもつON20A，ON20は、配列特異的方法でβ−ガラクトシダーゼの発現を阻害しなかった。
実施例７
標的遺伝子の発現のアッセイの方法および阻害
アッセイの方法。アンチセンスのオリゴマーを、マイクロインジェクションの法を使用してin vivoの生物学的効能について評価した。このプロトコールは、従来記載された方法と異なり、トランスフェクションした遺伝子の発現についての内部の対照として働く追加の接合した遺伝子を使用する(Graessman,M.ら、Nucleic Acids Res.(1991)19:53-59)。TAg RNAに対して異なる領域にターゲッティングするアンチセンスのオリゴマーの変化する量と一緒に、TAg発現するpSV40プラスミドの５〜10コピー／細胞を使用して、マイクロインジェクションを実施した。接合マーカー、例えば、40コピーのプラスミド／細胞を使用し、ここでこのマーカーはRSVプロモーターのコントロール下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子またはSV40のコントロール下にクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有した。マーカー遺伝子は、遺伝子の発現の阻害の特異性を示すことができるように、容易に測定可能なタンパク質を発生する遺伝子である。アンチセンスのオリゴマーは、マーカー遺伝子のタンパク質生産物を生産し続ける細胞の能力に影響を与えない。適当なマーカー遺伝子は、クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは細胞表面の抗原、酵素またはアッセイ法が既知であるマーカーを発生する。アンチセンスのオリゴマーを使用しない対照実験において、マイクロインジェクションした細胞の100％はマイクロインジェクション後4.5時間でβ−ガラクトシダーゼタンパク質を発現したが、マイクロインジェクションした細胞のほぼ60％は、二重標識の免疫蛍光標識化技術により検出して、TAg抗原を発現した、TAg RNAの中の標的配列は、転写開始AUGコドンからほぼ150塩基のコーディング配列、５′−非翻訳領域における配列およびAUGコドンにおける配列を含んでいた。５nM〜25μＭのオリゴマー濃度において９〜20塩基の長さのアンチセンスのオリゴマーを検査し、そして化合物をインジェクション後、4.5〜72時間範囲の時間においてアッセイした。本質的に記載されているような条件を使用してCV１またはRat２細胞をマイクロインジェクションした(Graessman,M.ら、前掲)。
標的配列の結合および標的遺伝子
阻害。ホスホジエステルのアンチセンスのオリゴマー（ON−11）を対照として使用して、オリゴマー（５′ATTTTC′TTC′ATTTTTTC′TTC′３′）を系統的に変化させた。同一オリゴマーのホスホロチオエート類似体（ON−12）をまた調製したが、これは変更した塩基をもたなかった。普遍的に置換された本発明の塩基を有する対応するオリゴマーを、ホスホジエステル（ON−13）およびホスホロチオエート（ON−14）の両者の形態で調製した；最後に、ホスホロチオエート連鎖をホスホジエステルで置換すると、標的RNAに対するアフィニティーは減少するが、ヌクレアーゼ安定性は増加する。Ｔ抗原の発現の経時的分析において、ON−13（ＵOおよびＣOを含有するホスホジエステル連鎖オリゴマー）は、25μＭの濃度において細胞の中にマイクロインジェクションした後、６時間まで検出可能な活性を有することが示された。対照的に、ON−14（ON−13と同一の配列をもつＵOおよびＣOを含有するホスホロチオエート連鎖オリゴマー）は、25μＭのオリゴマーを細胞の中にマイクロインジェクションした後、48時間まで活性であった。
９マー（５′COUOUOCOAUOUOUOUO３′）および11マー（ON−17）の両者のホスホロチオエートは、本発明の５−置換塩基を含有するとき、Ｔ抗原の合成を阻害することができた。しかしながら、９マーは比較的弱い配列特異的阻害活性を有した。
また、前述のアッセイにおいてmRNAのCAP部位付近におけるＴ抗原の５′−非翻訳領域に結合するようにデザインしたオリゴマー（５′UT）、および開始コドンの領域に結合するようにデザインしたオリゴマーを試験した。これらのオリゴマーは下に示す配列を有する：
Figure 0003739785
チミンおよび５−メチルシトシン塩基から構成された５′UTおよびAUGオリゴマーのホスホロチオエートの形態を使用して、20μＭにおいて検出可能な阻害を実施することができた。しかしながら、５−プロピニルウラシルが系統的にチミン残基で置換されたホスホロチオエート類似体は、１μＭにおいて100％の阻害を示した。
５′−非翻訳領域領域にＴ抗原の標的配列を使用するこのアッセイ系による他の実験において、ＣOがＣと置換しそしてＵOがＴと置換した完全に置換したヌクレオモノマーを含有するオリゴマーにおいて、２′−Ｏ−アリル置換を含有する以外のホスホジエステル連鎖を含有する本発明の修飾されたオリゴマーの置換は、Ｔ抗原の合成を阻害することができることが証明された。表５は５′UTオリゴマーを使用して得られた結果を示す。オリゴマー１〜４は上に示した配列を有する20マーであった。オリゴマー５は上に示した下線を施した配列およびチミジンと置換した５−プロピニルウリジンおよびシチジンと置換した５−プロピニルシチジンを有した。
Figure 0003739785
表５に示すように、ホスホルアミダイトの主鎖または２′−Ｏ−アリル置換と一緒にＵOおよびＣOを含む種々の組み合わせは阻害を提供した。オリゴマー５はRNアーゼＨの基質ではないが、TAg発現が観察された。オリゴマー５により仲介される阻害は、２′−Ｏ−アリル修飾が付与する高いアフィニティーおよびヌクレアーゼ安定性から生ずると信じられる。完全なまたは部分的な２′−Ｏ−アリル修飾を含有するオリゴマーの中へのＵOおよび／またはＣOの組み込みは、標的遺伝子の発現を阻害するために使用できるオリゴマーを提供するであろう。
前述の５′UT，AUGコドン領域およびエクソンの中の配列に加えて、TAgのイントロン／エクソンの接合部、エクソン／エクソンの接合部におけるおよびイントロンの中のTAg配列を、標的配列に従いＵOおよび／またはＣOで完全に置換された15マーのホスホロチオエートのオリゴマーを使用してターゲッティングした。オリゴマーは約50％〜約70％のＵOおよび／またはＣO塩基をオリゴマーの中に含有した。オリゴマーのすべてはTAg合成を効果的に阻害した。これらの結果が示すように、高いアフィニティーのオリゴマーはRNA全体を通じた位置において遺伝子の発現を阻害することができ、こうしてTAg RNAの中に存在した２次構造にかかわらず有効であった。
実施例８
鎖の中へのオリゴマーのデリバリー
実施例７に記載する方法を使用して、ON−15をＴ抗原（TAg）の阻害について試験した。ON−15を組織培養培地の中の50μＭの細胞外濃度においてCV１細胞と24時間インキュベーションし、次いでTAgおよびβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドをマイクロインジェクションした。インジェクション後、4.5時間に、細胞を固定し、そしてTAg発現について染色した。TAg発現を効率よく阻害するマイクロインジェクションしたON−15との比較により、細胞外培地の中のインキュベーションしたON−15は非常に効率が低く、TAg合成の阻害は検出することができなかった。５′末端においてフルオレセイン−アミノヘキサノール（Ｆ１−ON−15）で誘導したON−15を50μＭの細胞外濃度で使用して、この実験を反復し、ON−15を細胞と24時間インキュベーションした。0.5μＭの細胞外濃度のＦ１−ON−15をTAgおよびβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドと一緒に、対照細胞の中にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションしたＦ１−ON−15は核の中に局在化したが、細胞外培地に添加したＦ１−ON−15はエンドソームおよびリソソームに似る細胞質の隔室の中に局在化した。CV１，Rat２，HeLa，SKOV-３，BUD-８，BC3H1およびccd45sk細胞系を使用して、結果の同一パターンが得られた。本発明のオリゴマーは異なる哺乳動物種において活性であり、こうして種に無関係に遺伝子の発現を変調するために適する。
商業的に入手可能なカチオン性脂質調製物、リポフェクチン(LipofectinR)(BBL-ギブコ、カタログNo.8292SA)を使用して、Ｆ１−ON−15およびON−15を細胞の細胞質の中に送り出した。オプチメン(Optimem)(BBL-ギブコ）の中の10μＭのリポフェクチン(LipofectinR)濃度を製造業者の使用説明書に従い使用した。DOTMAはリポフェクチン（LipofectinR）の中に存在する脂質である。細胞をＦ１−ON−15−脂質またはON−15−脂質の調製物を含有するオプチメン(Optimem)の中で４時間インキュベーションし、次いで標準の培地（CV１細胞について10％FBSを含むDMEM）の中で細胞を16時間インキュベーションした。処理した細胞の免疫蛍光分析により、細胞の約90％は核の中に局在化したＦ１−ON−15を含有することが示された。脂質−オリゴマーの複合体どのインキュベーション後、細胞の中にTAgおよびβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドをマイクロインジェクションすることによって、細胞の中へのON−15のデリバリーをアッセイした。ON−15は、10μＭの濃度でリポフェクチン（LipofectinR）を使用するより、５nM低いIC50でTAg発現を阻害した。こうして、カチオン性脂質（例えば、リポフェクチン（LipofectinR））と複合化したオリゴマーの調製物は、標識、例えば、フルオレセインおよび／または５−修飾ピリミジン、例えば、ＵOまたはＣOを含有するオリゴマーを細胞の細胞質に送り出すことができ、オリゴマーの中に組み込まれた修飾、例えば、塩基類似体または標識はカチオン性脂質−オリゴマー複合体の形成を妨害したいことが示された。
別のプロトコールにおいて、Ｆ１−ON−15をまた細胞の中にDMSOを使用してトランスフェクションのプロトコール塩基送り出した。１％DMSOおよび１μＭ Ｆ１−ON−15を含有するDMEM−10％FBS培地の中で、CV１細胞を37℃において４時間インキュベーションした。蛍光微鏡検査により、オリゴマーは処理した細胞の約20％の核の中に局在化することが実証された。
商業的に入手可能なアミノヘキサンアミダイト（グレン・リサーチ(Glen Research)をON−15の５′−OHに標準のカップリング条件下にカップリングすることによって、Ｆ１−ON−15を合成した。次いで遊離アミンをフルオレセイン-NHSエステル（モレキュラー・プローブ(Molecular Probes)）に連鎖してＦ１−ON−15を発生させた。フルオレセイン遊離オリゴマーの合成は、また、フルオレセインアミダイトまたはフルオレセイン-CPGを製造業者の使用説明書に従い（グレン・リサーチ）使用して達成することができる。
実施例９
オリゴマーの合成のための２′−Ｏ−モノマーの合成
５−プロピニル−２′−Ｏ−アリルウリジンの調製
ヌクレオモノマー。343mg（0.50mmol）の14（第４図）を無水CH3CN（５ml）中に溶解し、そしてこれに２−ピリジンアルドキシム（67mg，0.55mmol）および１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（75μｌ，0.6mmol）を室温において添加した。18時間後、反応混合物をEtOAcで希釈し、そして水性クエン酸（0.1Ｍ）で洗浄した。水性層をEtOAcで抽出し、一緒にした有機層を飽和水性NaHCO3（３回）で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、そして蒸発させた。残留物をEtOAc（５ml）中に溶解し、そしてこれに１Ｍ TBAF／THF（1.5ml，1.5mmol）を添加し、この溶液を１時間攪拌し、そしてEtOAcで希釈した。この溶液を飽和水性NaHCO3（２回）で洗浄し、一緒にした水性層を乾燥（Na2SO4）し、そして蒸発させた。残留物を無水ピリジン（10ml）から抽出し、無水ピリミジン（５ml）中に溶解し、そしてこれに塩化ジメトキシトリチル（200mg，0.6mmol）を添加し、そしてこの溶液を18時間攪拌した。反応混合物をほぼ２mlに蒸発させ、CH2Cl2で希釈し、飽和水性NaHCO3で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、そして蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー（EtOAc／ヘキサン、１／１）により精製すると、197mg（0.32mmol，64％）の第４図に示す６が得られた。
５−プロピニル−２′−Ｏ−アリルシチジンの調製
ヌクレオモノマー。343mg（0.50mmol）の14を無水CH3CN(10ml)中に溶解し、そしてこの溶液をパール・ボンベ（Parr Bomb）に移し、０℃に冷却し、そしてNH3で飽和した。これを80℃の浴の中に24時間（75psi）入れ、に関するに冷却し、そして蒸発乾固した。残留物を無水DMF（10ml）から蒸発させ、無水DMF（５ml）中に溶解し、そしてこれにジイソブチルホルムアミドジメチルアセタール（0.2ml，0.84mmol）を室温において添加した。18時間後、H2O（25μｌ）を添加し、この溶液を蒸発させ、EtOAc（５ml）中に溶解し、これに１Ｍ TBAF／THF（1.5ml，1.5mmol）を添加した。１時間後、反応混合物EtOAcで希釈し、飽和水性NaHCO3で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、そして蒸発させた。残留物を無水ピリジン（10ml）から蒸発させ、無水ピリジン（５ml）中に溶解し、そしてこれに塩化ジメトキシトリチル（200mg，0.6mmol）を添加し、そしてこの溶液を５時間攪拌した。反応混合物をほぼ２mlに蒸発させ、CH2Cl2で希釈し、飽和水性NaHCO3で洗浄し、乾燥（NA2SO4）し、そして蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー（EtOAc／ヘキサン、２／３〜３／２）により精製すると、242mg（0.32mmol，64％）の第４図に示す８が得られた。
実施例10
ホルムアセタール２量体の合成
第11図は、ホルムアセタール連鎖５−プロピニル−２′−Ｏ−デオキシウラシル２量体を得るために使用した合成のスキームを示す。この合成プロトコールは、示すように５−ヨードウラシル前駆体の変換により２量体のレベルでプロピニル置換基を導入した。同様なプロトコールを使用して３量体、４量体、５量体またはより長い５−ヨード前駆体を５−プロピニル生成物に同様な方法で変換することができる。この合成方法は５−プロピニル生成物の予期せざるほどに高い収率を与えた。
実施例１１
３′−チオフォルムアセタール２量体の合成
（26）の調製：（25）をCH2Cl2中に懸濁させ、そしてパラホルムアルデヒド（1.6当量）を添加し、この懸濁液を0℃に冷却し、そしてHCl（無水）をこの溶液に約10分間通入した。この懸濁液を密閉し、そして０〜５℃において４時間貯蔵した。生ずる溶液を乾燥し、濾過し、そして蒸発させると、（26）が得られた。
10の調製：３−デオキシ−３′−チオアセチル−５′−ジメトキシトリチル−５−プロピニル−デオキシウリジンを、Ｏ2で前以てフラッシュしたフラスコの中のメタノール性アンモニア中に溶解し、そしてこの溶液を密閉し、そして１時間攪拌した。溶媒を除去し、そして残留物をEtOAc中に溶解し、そしてNaHSO3およびブラインで洗浄した。有機相を乾燥し、蒸発させ、そしてシリカゲルのクロマトグラフィー（MeOH／CH2Cl2）により精製した。生じるジサルファイドをジオキサン／H2O中に溶解し、次いでｔ−ブチルホスフィン（1.0当量）を添加し、そしてこの溶液を30分間攪拌した。溶媒を除去し、そして粗製化合物10を（27）の調製に直接使用した。
（27）の調製：化合物10（1.1当量）をDMF中に溶解し、そしてDIPEA（ジイソプロピルエチルアミン、2.5当量）を添加し、そしてこの溶液をアルゴン雰囲気下に0℃に冷却し、この溶液を10時間攪拌し、希釈し、H2Oに対して抽出し、乾燥し、蒸発させて、そしてシリカゲルのクロマトグラフィー（MeOH／CH2Cl2）により精製した。
11の調製：（27）をメタノール性アンモニア中に溶解し、そして密閉したフラスコの中で室温において３時間攪拌した。溶媒を除去し、そして精製し（シリカゲル、MeOH／CH2Cl2（０〜４％MeOH）そして導入されたプロピン部分は実施例１に記載した。
11Ａの調製：11を標準の手順によりホスフィチル化した。
実施例12
５−（２−ピリジニル）−２′−デオキシウリジンおよび５−（２−ピリジニル）−２′−デオキシシチジンの合成
２−トリメチルスタンニルピリミジン。無水エーテル（25ml）中の15.6mlの1.6Ｍ ｎ−ブチルリチウム（25.1mmol）の溶液をアルゴン雰囲気下に−78℃において攪拌し、そしてこれに無水エーテル（12.5ml）中の２−ブロモピリジンの溶液を添加した。生ずるオレンジ色溶液を２時間攪拌し、そしてTHF（26.0mmol，26および1.0Ｍ）中の塩化トリメチルを10分かけて添加した。反応混合物を−78℃において１時間攪拌し、次いで１時間かけて室温に加温し、そして濾液を蒸発させた。蒸留すると、3.1ｇ（51％）の標題化合物が無色の液体として得られ、これを受容フラスコの中で固化した。沸点65℃／２mmHg；文献の沸点75℃／４mmHg。
５−プロピニル−２′−デオキシウリジン。25mlのセイヨウナシ形状のフラスコの中に、５−ヨード−２′−デオキシウリジン（0.354ｇ，1.0mmol）、２−トリメチルスタンニルピリミジン（0.84ｇ，3.5mmol）、塩化ビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（II）（0.070ｇ，0.1mmol）を入れた。反応混合物を60℃に15時間加熱し、次いで90℃に１時間加熱した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルのクロマトグラフィー（CH2Cl2中の10％CH3OH（１％NH3））により精製すると、0.253ｇ（83％）の標題化合物が白色固体として得られた、融点201−203℃。
５−（２−ピリジニル）−２′−デオキシシチジン。25mlのセイヨウナシ形状のフラスコの中に、５−ヨード−２′−デオキシシチジン（0.425ｇ，1.2mmol）、２−トリメチルスタンニルピリミジン（1.4ｇ，5.8mmol）、塩化ビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（II）（0.084ｇ，0.12mmol）を入れた。反応混合物を60℃に15時間加熱し、次いで90℃に１時間加熱した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルのクロマトグラフィー（CH2Cl2中の10％CH3OH（１％NH3））により精製すると、0.173ｇ（47％）の標題化合物が白色固体として得られた、融点197−198℃。
実施例13
５−（チエニル）−５′ジメトキシトリチル−２′−デオキシウリジンの合成
２−トリメチルスタンニルチオフェン。無水THF（50ml）の中のチオフェン（2.1ｇ，25mmol）の溶液に、−38℃においてペンタン中のｔ−ブチルリチウム（1.6Ｍ，16.0ml，25.6mmol）を30分かけて滴々添加した。この溶液を−38℃において１時間攪拌し、次いで−78℃に冷却した。THF中の塩化トリメチル錫（１Ｍ，25.3ml，25.3mmol）を30分かけて滴々添加した。次いで、この混合物を−78℃において２時間攪拌し、次いで室温において15時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、そして生ずる黄色固体をエーテル中に取り、水で洗浄し、そして乾燥（Na2SO4）し、次いで蒸発させると、淡褐色液体が得られ、これは放置すると固化した。
５−（２−チエニル）−２′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシウリジン。50mlのフラスコの中に５−ヨード−３′−トルオリル−２′−デオキシウリジン（2.15ｇ，2.77mmol）、２−トリメチルスタンニルチオフェン（1.85ｇ，7.5mmol）、塩化ビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（II）（0.196ｇ，0.28mmol）を入れた。反応混合物を73℃に18時間加熱し、次いで室温に冷却した。生ずる黒色沈澱を濾過し、そしてTHFで洗浄した。溶媒を蒸発させ、そして緑色の残留物を酢酸エチル（100ml）中に溶解し、水（50ml）で洗浄し、そして乾燥（Na2SO4）した。溶媒を蒸発さ、そして残留物をジオキサン／濃度NH4OH（１／１，80ml）中に取り、室温において18時間攪拌し、そして蒸発させた。シリカゲルで精製すると、0.430ｇ（25％）の５−（２−チエニル）−２′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシウリジンが得られた。
実施例14
５−（（１−エチニル）−２−ピリミジニル）−２′−デオキシウリジンの合成
２−ヨードピリミジン。液体HI（28.0ml，212mmol）を０℃において激しく攪拌し、そして固体２−クロロピリミジン（7.0ｇ，61mmol）をゆっくり添加し、こうして温度が８℃を越えて上昇しないようにした。反混合物を５℃において１時間攪拌し、固体炭酸カリウム（14.7ｇ，106mmol）を注意して0.5時間かけて添加し（10℃以下の温度）そして反応混合物を少量の固体の亜硫酸ナトリウムの添加により脱色した。この溶液をエーテル（５×50ml）で抽出し、乾燥（Na2SO4）し、蒸発させ、そして残留物をヘキサンから再結晶化すると、7.11ｇ（56％）の標題化合物が得られた、融点29−30℃。
２−（（トリメチルシリル）エチニル）ピリミジン。50mlのフラスコの中に、２−ヨードピリミジン（20.ｇ，9.7mmol）、ヨウ化銅（Ｉ）（9.5mg，0.05mmol）、トリエチルアミン（0.7ml，5.0mmol）、塩化ビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（II）（0.07ｇ，0.1mmol）および無水ジオキサン（10ml）を入れた。反応混合物60℃に18時間攪拌し、次いで95℃において８時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をCH2Cl2（200ml）中に溶解し、H2O（40ml）で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、そして蒸発させた。生成物をシリカゲルのクロマトグラフィー（CH2Cl2）により精製すると、1.06ｇ（60％）の標題化合物が得られた。
２−エチニルピリミジン。無水エタノール（９ml）中の２−（（トリメチルシリル）エチニル）ピリミジン（1.06ｇ，6.0mmol）の溶液に、固体炭酸カリウム(0.083ｇ，6.0mmol)を添加し、そして反応混合物を2.5時間攪拌した。この固体を濾過により除去し、メタノール（10ml）で洗浄し、、そして上澄み液を蒸発させた。残留物をCH2Cl2（30ml）中に溶解し、飽和NaHSO3で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、そして蒸発させた。シリカゲルのクロマトグラフィー（CH2Cl2中の１〜２％CH3OH）により精製すると、0.400ｇ（64％）の標題化合物が得られた。これを実施例１におけるように５−ヨード−２′−デオキシウリジンにカップリングし、そして保護されたＨ−ホスホネートに変換した。
実施例15
Ｕ O および３′−チオフォルムアセタールまたはホルムアセタール連鎖を含有するオリゴマーの結合
次のオリゴマーを合成した。特記しない限り、すべての連鎖はホスホジエステルである。記号●は３′−チオホルムアセタール連鎖（３′，５′）を示し、そして記号○はホルムアセタール連鎖（３′，５′）を示す。
Figure 0003739785
オリゴマーをDNAまたはRNA標的とハイブリダイゼーションして、それぞれ三重らせんまたは二重らせんの構造体を形成した後、オリゴマーを熱的変性（Ｔm）または安定性に関して試験した。使用したDNA標的は、自己相補性領域を含有しかつ示すようにヘアピンの末端に４ヌクレオチドのループを有するオリゴマーであった。標的は次の通りであった：
Figure 0003739785
140mM KCl／５mM Na2HPO4／１mM MgCl2の中でpH＝7.2において一本鎖RNAまたはDNA（二重らせんのハイブリダイゼーション）についておよびpH＝6.6において二重らせんDNA（三重らせんのハイブリダイゼーション条件）について、結合についてのアッセイを実施した。すべてのオリゴマーの最終濃度は約２μＭであった。オリゴマーを使用して得られたＴmのデータを表６に示す。
Figure 0003739785
実施例16
５−（２−ピリジニル）−２′−デオキシウリジン（Ｕ P ）または５−（２−ピリジニル）−２′−デオキシシチジン（Ｃ P ）および５−（２−チエニル）−２′−デオキシウリジン（Ｕ T ）を含有するオリゴマーの結合
次のオリゴマーを合成した。すべての連鎖はホスホジエステルであった。
Figure 0003739785
オリゴマーをssDNAまたはssRNA標的とハイブリダイゼーションして二重らせんを形成し、そしてdsDNAとハイブリダイゼーションして三重らせん形成した後、オリゴマーを熱的変性（Ｔm）または安定性に関して試験した。使用したDNA標的は自己相補性領域を含有しかつ示すようにヘアピンの末端に４ヌクレオチドのループを有するオリゴマーであった。標的は次の通りであった：
Figure 0003739785
140mM KCl／５mM Na2HPO4／１mM MgCl２の中でpH＝7.2において一本鎖RNAまたはDNA（二重らせんのハイブリダイゼーション）についておよびpH＝6.6において二重らせんDNA（三重らせんのハイブリダイゼーション条件）について、結合についてのアッセイを実施した。すべてのオリゴマーの最終濃度は約２μＭであった。オリゴマーを使用して得られたＴmのデータを表６に示す。
Figure 0003739785
実施例17
５−（１−プロピニル）−２′−デオキシウリジン（Ｕ O ）およびカルボン酸５−メチル−２′デオキシシチジン（Ｃ＃）または８−オキソ−Ｎ 6 −メチル−２′−デオキシアデノシン（Ｍ）を含有するオリゴマーの結合
次のオリゴマーを合成した。すべての連鎖はホスホジエステルであった。
Figure 0003739785
オリゴマーを二重たせんDNAを結合して三重らせん構造体を形成した後、フットプリント分析によりデオキシアデノシン消化を使用して、オリゴマーを標的配列に関して試験した。ハイブリダイゼーションは、140mM KCl，10mM NaCl，１mM MgCl2，１mM塩酸スペルミン、MOPS pH7.2の中で標的DNAを使用してほぼ１nMにおいてを使用して37℃において約１時間インキュベーションした。標的配列は次の通りであった：
Figure 0003739785
配列はクローニングベクターから誘導されたゲル精製した370bpの制限断片上に含有された。ON−１およびON−32の濃度は、0.01〜10.μＭの間で変化した。ON−１およびON−32を使用して得られたヌクレアーゼ保護の結果は、同一標識についてのON−１のアフィニティーより約1000倍大きいである二重らせんDNAについての結合アフィニティーを有することを示した。
ON−32およびON−34の標的配列は次の通りであった：
Figure 0003739785
この配列は制限酵素の消化により線状化されたプラスミドの中に含有されていた。配列はIL−１遺伝子のプロモーター領域の中に見いだされる。三重らせんの結合についてのアッセイは、104mM KCl／10mM NaCl／１mM MgCl2／１mM塩酸スペルミン／20mM MOPS pH7.2の中で実施した。標的の最終濃度は約２nMであったが、ON−33およびON−34は0.1〜10.0μＭの間で変化した。0.1μＭにおいて完全なヌクレアーゼ保護を与えるON−33、および0.1μＭよりかなり下の濃度において完全なヌクレアーゼ保護を与えるON−34を使用して得られたヌクレアーゼ保護の結果は、同一標的についてのON−33のアフィニティーの約10倍より大きいか、あるいはそれに等しい二重らせんDNAについての結合アフィニティーをON−34が有することを示した。
これらのオリゴマーを使用して得られた結果が示すように、本発明の塩基は他の三重らせん結合受容塩基の類似体と適合性であり、こうして必要に応じて三重らせん受容塩基および塩基類似体を使用して高いアフィニティーのオリゴマーをデザインすることができる。
実施例18
５−（１−プロピニル）−２′−Ｏ−アリルウリジン（Ｕ X ）または５−（１−プロピニル）−２′−Ｏ−アリルシチジン（Ｃ X ）を含有するオリゴマーを使用する二重らせんの形成
次のオリゴマーを合成した。すべての連鎖はホスホジエステルであった。ヌクレオモノマーは実施例９に記載されているようにして調製した。５−メチル−２′−Ｏ−アリルウリジン（Ｔ′）および５−メチル−２′−Ｏ−アリルシトシン（Ｃ″）をＵXおよびＣXに加えて使用した。
Figure 0003739785
オリゴマーをRNA標的とハイブリダイゼーションして二重らせんの構造体を形成した後、オリゴマーを熱的変性（Ｔm）または安定性に関して試験した。標的は次の通りであった：
Figure 0003739785
140mM KCl／５mM Na2HPO4／１mM MgCl2の中でpH＝6.6において二重らせんの結合についてのアッセイを実施した。すべてのオリゴマーの最終濃度は約２μＭであった。オリゴマーを使用して得られたＴmのデータを表８に示す。
Figure 0003739785
これらの分析から得られた結果が証明するように、本発明の塩基を修飾された糖と結合受容性オリゴマーの中で組み合わせることができる。２′−Ｏ−アリル糖の修飾および本発明の塩基のために増強された結合は、修飾単独と比較して、有意に増加した結合アフィニティーを与える。２′−Ｏ−アリル修飾は、RNアーゼＨのための基質としてオリゴマーを非受容性とする。こうして、２′修飾および本発明の塩基を含有するオリゴマーにより結合されたRNAは、ヌクレアーゼを含有する細胞抽出物の中のRNA配列のためのプローブとして有利に使用することができる。
実施例19
Ｕ O を含有するオリゴマーおよびＵ O を含有するスイッチバッグリンカー（Ｘ O ）を使用する三重らせんの形成
次のオリゴマーを合成した。すべての連鎖はホスホジエステルであった。
Figure 0003739785
使用したDNA標的配列は次の通りであった：
Figure 0003739785
標的配列をTAg遺伝子のイントロンの中に導入し、そして約２nMにおいて線状化制限断片としてDNアーゼ保護分析において使用した。スイッチバッグリンカーのシントン（ＸO）は第５−１図に示す構造９を有し、そして標準のＨ−ホスホネート化学によりON−41およびON−42の中に組み込んだ。スイッバッグリンカーは２ヌル塩基対（それらとハイブリダイゼーションしなかった標的の中の塩基対）に関連した。100nMより低い濃度においてON−41またはON−42を使用して、標的配列の完全なDNアーゼ保護が得られた。
これらの結果が証明するように、本発明の塩基はスイッチバッグリンカー、例えば、ここに記載するｏ−キシロースリンカーと適合性である。
実施例20
Ｕ O およびホスホロチオエート連鎖を含有オリゴマーを使用する三重らせんの形式
実施例16に記載するようにON−５およびON−５のホスホロチオエートの形態を使用して、三重らせんの形成は証明された。結果が示すように、ON−５は55.8℃のＴmを有し、そしてホスホロチオエート誘導体は44.9℃のＴmを有する。こうして、本発明の塩基と組み合わせて、ホスホロチオエート連鎖を含有するオリゴマーは三重らせんの形成において結合受容性である。
最も実際的かつ好ましい態様であると考えられるものにおいて、本発明を示しかつ説明した。しかしながら、本発明の範囲内でそれから逸脱することができ、そして変更はこの開示読むと当業者とって明らかであろうことが認識される。

Claims (19)

  1. 少なくとも２種のヌクレオモノマーを含んで成るオリゴマー及び医薬的に許容できるその塩であって、前記ヌクレオモノマーの少なくとも１種が、下記式＜１＞又は（２）の塩基：
    Figure 0003739785
    〔式中、個々のＸは独立してＯ又はＳであり；
    Ｒ2は１−プロピル、３−メチル−１−ブチニル、３，３−ジメチルブチニル、２−ピリジニル及び２−チエニルから成る群から選択され；そして
    Prは（Ｈ）2又は保護基である〕を含んで成り、
    但し、前記オリゴマーのヌクレオモノマーの少なくとも１種が、Ｒ2が１−プロピニル、３−メチル−１−ブチニル、又は３，３−ジメチルブチニルであるデオキシウリジンを含んで成るとき、前記ヌクレオモノマーを含んで成る前記オリゴマーの残りがホスホジエステル連鎖した２′−デオキシアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン、チミヂン又はそれらの組合せのみから構成されないことを特徴とするオリゴマー。
  2. 少なくとも１つの連鎖が置換３′，５′又は２′，５′連鎖であり、但し、いかなる２′，５′連鎖もリンを含有しない請求の範囲第１項記載のオリゴマー。
  3. 前記置換連鎖が、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、リボアセタール、アミド、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、チオノメチルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、及び３′−チオホルムアセタールから成る群から選択される請求の範囲第２項記載のオリゴマー。
  4. カチオン性脂質により複合体化される請求の範囲第１項記載のオリゴマー。
  5. ヌクレアーゼ耐性ドメインを含んで成る、５′−及び３′−端で２〜12個の置換結合又はヌクレオモノマー、及び少なくとも１種のRNアーゼ受容ドメインを含んで成り、そして前記ヌクレアーゼ耐性ドメイン間に存在する３〜26個の置換結合又はヌクレオモノマーをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載のオリゴマー。
  6. 固体支持体、ラベル、又はＣ1-12アミンリンカーに接合される請求の範囲第１項記載のオリゴマー。
  7. 下記式（16）：
    Figure 0003739785
    〔式中、
    個々のＲ1は独立してＨ，PO3 2-又はブロッキング基であり；
    個々のＲ3は、Ｈ，OH，Ｆ，NH2, OCH3, OC2H5, OC3H7, SCH3, SC2H5, SC3H7,Ｏ−プロペニル及びＳ−プロペニルから成る群から独立して選択され；
    個々のＸ1は独立して、−Ｐ(Ｓ)(Ｏ)−，−Ｐ(Ｏ)(Ｏ)−，−Ｐ(Me)(Ｏ)−及び−Ｐ(Me)(Ｓ)−から成る群から選択された置換連鎖であり；
    Prが保護基であり；
    ｎが０〜98の整数であり；そして
    Ｂがプリン又はピリミジン塩基であり、但し、少なくとも１つのＢが下記式（１）又は（２）：
    Figure 0003739785
    （式中、個々のＸは独立してＯ又はＳであり；
    Ｒ2は１−プロピニル、３−メチル−１−ブチニル、３，３−ジメチルブチニル、２−ピリジニル及び２−チエニルから成る群から選択され；そして
    Prは（Ｈ）2又は保護基である）で表わされるものである〕で表わされるオリゴマーであって、
    但し、前記オリゴマーのヌクレオモノマーの少なくとも１種が、Ｒ2が１−プロピニル、３−メチル−１−ブチニル、又は３，３−ジメチルブチニルであるデオキシウリジンを含んで成るとき、前記ヌクレオモノマーを含んで成る前記オリゴマーの残りがホスホジエステル連鎖した２′−デオキシアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン、チミヂン又はそれらの組合せのみから構成されないことを特徴とするオリゴマー。
  8. 少なくとも１つのＲ1がＨ，PO3 2-, DMT, MMT, Ｈ−ホスホネート、メチルホスホンアミダイト、メチルホスホラミダイト、β−シアノエチルホスホラミダイト又はアルキルホスホラミダイトである請求の範囲第６項記載のオリゴマー。
  9. 少なくとも１つのＲ3がＨ，OH，Ｆ，Ｏ−アリル、Ｏ−メチル又はＯ−エチルである請求の範囲第６項記載のオリゴマー。
  10. カチオン性脂質により複合体化される請求の範囲第６項記載のオリゴマー。
  11. 下記構造式（３）又は（４）：
    Figure 0003739785
    〔式中：
    個々のＸは独立してＯ又はＳであり；
    個々のＲ1は独立してＨ又はブロッキング基であり；
    Ｒ2が１−プロピニル、３−メチル−１−ブチニル、３，３−ジメチルブチニル、２−ピリジニル及び２−チエニルから成る群から選択され；
    Prは（Ｈ）2又は保護基であり；そして
    Ｒ3が、Ｈ，OH，Ｆ，OCH3, OC2H5, OC3H7, SCH3, SC2H5, SC3H7，Ｏ−プロペニル及びＳ−プロペニルから成る群から選択され、
    但し、Ｒ3がＨ又はOHであり、そして両Ｒ1がＨである場合、Ｒ2は、１−プロピニル、３−メチル−１−ブチニル、又は３，３−ジメチルブチニル〕で表わされるヌクレオモノマー。
  12. ブロッキング基がDMT, MMT, FMOC, Ｈ−ホスホネート、メチルホスホンアミダイト、メチルホスホラミダイト又はβ−シアノエチルホスホラミダイトである請求の範囲第１１項記載のヌクレオモノマー。
  13. Ｒ3がＨ，OH，Ｏ−アリル、Ｏ−メチル、Ｏ−エチル又はＦで、Ｒ2が１−プロピニル、１−ブチニル又は２−チアゾリルである請求の範囲第１２項記載のヌクレオモノマー。
  14. ３′位でのＲ1がＨ−ホスホネート、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノメトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−モルホリノ−β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−モルホリノ−メトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメチル−ホスホンアミダイト、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−メチルホスホンアミダイト、ビス−モルホリノ−ホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−β−シアノエチルメルカプトホスフィン、２−クロロフェニルホスフェート、４−クロロフェニルホスフェート、２，４−ジクロロフェニルホスフェート、２，４−ジブロモフェニルホスフェート、２−クロロフェニルチオホスフェート、４−クロロフェニルチオホスフェート、２，４−ジクロロフェニルチオホスフェート及び２，４−ジブロモフェニルホスフェートから成る群から選択される請求の範囲第１２項記載のヌクレオモノマー。
  15. 下記式（６），（７），（８）又は（９）：
    Figure 0003739785
    〔式中、
    ＸはＯ及びＳから成る群から選択され；
    Ｘ2は、CO, CS及びSO2から成る群から選択され；
    Ｘ3はＯ，Ｓ，CH2, CF2及びCFHから成る群から独立して選択され；
    Ｘ4は，Ｏ，Ｓ，SO, SO2, CH2, CO, CF2, CS, NH及びNR4（式中、Ｒ4はＣ1-4の低級アルキル）〕から成る群から独立して選択され；
    Ｘ5はＯ，CO，Ｓ, CH2, SO2, CO, NH及びNR4から成る群から選択され；
    Ｘ6はCH, Ｎ，CF, CCl、及びCR5（式中、Ｒ5はＣ1-4の低級アルキル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル又はＣ2-4及びＦ1-5の低級フルオロアルキルである）〕から成る群から選択され；
    Ｘ7はＯ，Ｓ，CH2, CO, CF2及びCSから成る群から選択され；
    個々のＹは独立してオリゴマー又はＲ1（式中、Ｒ1はPO3 2-又はブロッキング基である）であり；
    個々のＲ3はＨ，OH，Ｆ，NH2, OCH3, OC2H5, OC3H7, SCH3, SC2H5, SC3H7, Ｏ−プロペニル及びＳ−プロペニルから成る群から独立して選択され；
    個々のＢは独立してプリン又はピリミジン塩基であり、但し、少なくとも１つのＢは式（１）又は（２）：
    Figure 0003739785
    （式中、個々のＸはＯ又はＳであり；
    Ｒ2は１−プロピニル、３−メチル−１−ブチニル、３，３−ジメチルブチニル、２−ピリジニル及び２−チエニルから成る群から選択され；そして
    Prは（Ｈ）2又は保護基である）であり；そしてさらに、但し、Ｘ5及びＲ7の両者ともがＯであることはない〕で表わされるダイマー。
  16. Ｒ1がPO3 2-, DMT, MMT, Ｈ−ホスホネート、メチルホスホラミダイト又はβ−シアノエチルホスホラミダイト−である請求の範囲第１５項記載のダイマー。
  17. 少なくとも１種の選択されたタンパク質がDNA配列によりコードされ、そしてそのタンパク質がRNA配列から翻訳される人体以外の細胞において、前記タンパク質の発現を阻害するための方法であって、
    前記細胞中に請求の範囲第１項記載のオリゴマーを導入し；そして
    前記オリゴマーの前記DNA又はRNAとの三重鎖又は前記DNA又はRNAとの二重鎖の形成を可能にし、それによって前記タンパク質の発現が阻害される段階を含んで成る方法。
  18. 前記オリゴマーが、リン酸カルシウムトランスフェクション、DMSOトランスフェクション、デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、カチオン性脂質トランスフェクション、アニオン性脂質トランスフェクション又はリポソームトランスフェクションから成る群から選択された方法により前記細胞中に導入される請求の範囲第１７項記載の方法。
  19. 人体以外の細胞中に請求の範囲第１項記載のオリゴマーを導入するための方法であって、
    複合体を形成するために前記オリゴマーと透過増強剤とを混合し；そして
    前記複合体と前記細胞とを接触することを含んで成る方法。
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